JPS63291523A - ウシ胚増殖法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は１９８６年１２月３１日に同時に出願した米国
特許出願番号第９４８，２６９号に部分的に連続してい
る。

１朋の分野 本発明は一最にウシ胚の増殖法、好ましくは供与ウシ胚
を除核受容卵ｆＨ１ｆｌ胞に移植する方法に関する。

先ｊ１１ＬＬに閃まＺｊｌｇ） 動物育種の分野では遺伝的改良及び選択に関する技術の
進歩が絶えず求め続けられている。乳牛に特定しても、
例えば遺伝的に優れた種牛及び人口受精を広範囲に用い
て牛乳生産量を大幅に増加させてきた。今日乳牛は３０
年前と比較して殆ど２倍もの牛乳を生産する。更にクロ
ーニングによって潰れた又は遺伝的に操作した胚を増殖
させて遺伝的改良が達成できる。

遺伝的に優れた系統の牛を生産するのに胚移植を行うこ
とが、今や実際に受は入れられるようになった。胚のク
ローニングとクローン化した胚の移植が可能になって、
多数の遺伝的に同一な動物の生産が可能になる。ウシ胚
は現在発育中の胚を外科的に二分することで漸くクロー
ン化出来る。

しかしこの方法によって製造できるクローンの数は２な
いし４個に限られ、それ以上になると二分した胚は成育
不能になる。多細胞胚から複数の胚単−細胞への核移植
をすればこの限界は乗り越えられる可能性があり、多数
の同一動物の生産が可能になる。

核移植は１９３９年、Ｃｏ＋Ｉａｎｄｏｎ及びｄｅＦｏ
ｎｂｒｕｎｅによってアメーバの一種Ａ　ｍ７　ｅ　ｒ
　ｏ　ｎ　ｕ　ｃ　ｌ　ｅ　ｕ　ｓで初めて成功した（
’Ｇｒｅｆｆｅ　Ｎｕｅｌｅａｒｉｒｅ　Ｔｏｔａｌｃ
、　Ｓｉｍｐｌｅ　ｏｕ　Ｍｕｌｔｉｐｌｅ、　Ｃｈｅ
ｚ　ｕｎｅ　ＡＩＲｉｂｅ、”　Ｓｏｅ、　Ｂｉｏｌ。

１３０：　７４４．１９３９）　、続いて１９５２年、
Ｂｒ１ｇｇ５及びＫｉｎｇが、殿様蛙の一種Ｒａｎａ　
ｐｉｐｉｅｎｓで核移植に成功した（Ｔｒａｎｓｐｌａ
ｎｔａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｌｉｖｉｎｇ　Ｎｕｃｌｅｉ　
ｆｒｏｍＢｌａｓｔｕｌａ　Ｃｅ１ｌｓ　１ｎｔｏ　Ｅ
ｎｕｃｌｅａｔｅｄ　Ｆｒｏｇ’ｓ　Ｅｇｇｓ−Ｚｏｏ
ｌｏｇｏｙ　３８：　４５５−４６３．１９５２）　、
Ｂｒ１Ｂｓ及びＫｉｎｇが成功した核移植法は、 １）受容卵母細胞の活性化、 ２）除核、即ち受容卵母細胞からの染色体の除去又は不
活性化、そして ３）完全分解分割球（即ち原腸胚形成に先立つ胚分割に
よって得られる１個の細胞）を胞胚又は早期原腸段階胚
で移植、除核卵母細胞に戻す、事から成っている（上記
文献参照）。

Ｅｌｓｄａｔｅ他は、′＾Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｏ
ｆ　ｔｈｅ　Ｔｅｅｈｎｉｑｕｅ　ｆｏｒ　Ｎｕｃｌｅ
ａｒ　Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ　ｉｎ　Ｘｅｎ
ｏｐｕｓ　１ａｅｖｉｓ”、　　Ｊ、　　Ｅｍｂｒｙｏ
ｌ、　　ｅｘｐ、　　Ｍｏｒｐｈ、　　８（４）：　　
４３フー１９６０（アフリカッメガエルにおける核移植
技術に関する記載）で紫外線を照射して卵前核を不活性
化しそして未受精卵母細胞を活性化している。アホロー
トル（ａｘｏｌｏｔｌ）では、紫外線照射によって削減
した卵核の染色体に電気ショック与えると活性化する事
が報告されている（Ｂｒｉｎｇｓ、　Ｒ，、ｅｔａｌ、
、”Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｎｕｃｌ
ｅｉ　ｏｆ　Ｖａｒｉｏｕｓ　ＣｅＩＩ　ＴｙｐｅＳｆ
ｒｏ＋ｉ　Ｎｅｕｒｕｌａｅ　ｏｆ　ｔｉｄｅ　Ｍｅｘ
ｉｃａｎ　Ａｘｏｌｔ。

１（八ｍｂｙｓｔｏｍａ　　論ｅｘｉｃａｎｕｍ）、　
　Ｄｅｖｅｌｏｐ、　　Ｂｉｏｌ、　　１０：２３３、
　（１９６４）　（メキシコサンショウウオの神経胚か
らの各種細胞の核移植）、核を含む完全分解分割球をマ
イクロピペットの小口を通して除核卵母細胞へ移動させ
る方法が、これら核移動技術総てで共通に行われる。

マウスの核移転には２つの技術が用いられて来ている。

　ＩＩＩ鵠ｅｎｓｅｅ及びＨｏｐｐｅは全く外科的な手
法を用い、マイクロピペットを原形質膜を経て前核段階
胚の細胞質中に挿入し、核の除去及び挿入を行った。　
　（ＩＩ慎ｅｎｓｅｅ、　Ｋ、　ａｎｄ　ｔｌｏｐｐｅ
、　Ｐ、　Ｃ，、”Ｎｕｃｌｅａｒ　Ｔｒａｎｓｐｌａ
ｎｔａｔｉｏｎ　ｉｎ　Ｍｕｓ　５ｕｓｅｕｌｕｓ　（
マウスにおける核移植）　：　Ｄｅｖｅｌｏ、ｐ＋＊ｅ
ｎｔａｌ　Ｐｏｔｅｎｔｉａｌｏｆ　Ｎｕｃｌｅｉ　ｆ
ｒｏｍ　Ｐｒｅｉ＋＊ｐｌａｎｔａｔｉｏｎ　Ｅｍｂｙ
ｒｏｓ　（移植前胚からの核の発生の可能性）　”、　
Ｃｅ１ｌ　２３：　９゜１９８１）　６ＭｃＧｒａｔｈ
及び５６１ｔｅｒは非分断的な核移植を報告した［Ｍｃ
Ｇｒａｔｈ、　Ｊ、　ａｎｄ　５ｏｆｔｅｒ　Ｄ、、　
”Ｎｕｃｌｅｓｒ　Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ　
ｉｎ　ｔｈｅ　Ｍｏｕｓｅ　Ｅｍｂｒｙｏ　ｂｙ　Ｍｉ
ｅｒｏｓｕｒｇｅｒｙ　ａｎｄ　Ｃｅ１ｌ　Ｆｕｓｉｏ
ｎ　　（顕微鏡手術及び細胞融合によるマウス胚におけ
る核移植）’、５ｃｉｓｌｉｃｅ　２２０：　１３００
．１９８３）　、核は膜結合前核核体として胚の原形質
腹這浸透せずに単離された。そうして得られた核は、５
ｅｎｄａ　ｉウィルスを融合開始剤として使用して核融
合によって受容細胞に挿入された。少量の５ｅｎｄａ　
ｉウィルス懸濁液を、供与核単離後吸引し、そしてウィ
ルス懸濁液及び前核核体を連続して受容胚の囲卵腔に注
入した。せいぜい、１！　Ｉｍｅｎｓｅｅ及びＨｏｐｐ
ｅ　（上記文献参照）の顕微鏡外科的方法は約３０ない
し４０％の効率であり、一方ＭｅＧｒａｔｂ及び５ｏｆ
ｔｅｒ（上記文献参照）の非分断的方法は９０％以上の
効率であった。これらの技術は、胚盤胞段階の胚を製造
するのに成功しているが、同段階の胚は妊娠迄は発達し
続けない。ｉ　ｌ　Ｉｍｅｎｓｅｅ及び１（ｏｐｐｅが
３匹の生きたマウスを作ったという報告は疑問視されて
いる。

その後桟を除核前核接合体に移動させて、胚盤胞段階の
胚及びマウスが生ずるのは、供与細胞も又前核又は極く
早期の２細胞段階にある時のみである事が報告された［
ＭｃＧｒａｔｈ、　Ｊ、　ａｎｄ　５ｏｆｔｅｒ。

Ｄ、、　”Ｉｎａｂｉｌｉｔｙ　ｏｆ　Ｍｏｕｓｅ　Ｂ
ＩａｓＬｏｍｅｒｅ　ＮｕｃｌｅｉＴｒａｎｓｆｅｒｒ
ｅｄ　ｔｏ　Ｅｎｕｅｌｅａｔｅｄ　Ｚｙｇｏｔｅｓ　
ｔｏ　ＳｕｐｐｏｒｔＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　Ｉｎ　
Ｖｉｔｒｏ”、　５ｃｉｅｎｃｅ　２２６：１３１７−
１３１９゜１９８４；　　５ｕｒａｎｉ、　Ｍ、＾、Ｈ
，ｅｔ　ａｌ、、、　”Ｎｕｃｌｅｉ　Ｔｒａｎｓｐｌ
ａｎｔａｔｉｏｎ　ｉｎ　ｔｈｅ　Ｍｏｕｓｅ：　１Ｉ
ｅｒｉｔａｌ＋ｌｅ　Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ　Ｂｅｔｗ
ｅｅｎ　ｌ’ａａｔｅｒｎａｌ　Ｇｅｎｏｍｅｓ　ａｆ
ｔｅｒ　Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎｏｆ　ｔｈｅ　Ｅｍｂｒ
ｙｏｎｉｃ　Ｇｅｎｏｍｅ　（胚ゲノム活性化後におけ
る雄性ゲノム間の遺伝的な相違）”、　Ｃｅ１ｌ。

４５：　　１２７−１３６．　１９８６；　　ａｎｄ　
ｆｌｏｂｌ、　　Ｊ、Ｍ、　　ｅｔ　　ａｔ、。

Ｎｕｃｌｅａｒ　Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ　　
ｉｎ　Ｍｏｕｓｅ　ＩＥｎｂｒｙｏｓ：＾ｓｓｅｓｓｍ
ｅｎｔ　ｏｆ　Ｒｅｃｉｐｉｅｎｔ　Ｃｅ１ｌ　Ｓｔａ
ｇｅ　（マウス胚における核移植：受容細胞段階の調査
）　”、　Ｂｉｏｌ。

Ｐｒｅｐｒｏｄ、　３４：　７３３−７３９．１９８６
１゜最近羊での核移植法が報告された［Ｗｉｌｌａｄｓ
ｅｎ。

Ｓ、Ｈ，、”Ｎｕｃｌｅａｒ　Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａ
ｔｉｏｎ　ｉｎ　５ｈｅｅｐ　Ｅｍｂｒｙｏｓ　（ヒツ
ジ胚における核移植）　”、　Ｎａｔｕｒｅ　３２０：
６３−６５．１９８６３　、その中で活性化及び融合に
電気泳動を使用、そして受容体として中間■段階の卵母
細胞を使用した事が記載されている。これらの実験の結
果クローン保革が誕生した。しかし今［］までウシでの
核移植については、何も発表されて居ない。

杢１１５ヶ鼠旬− かくして本発明の目的はウシ胚をクローン化する為の有
用な方法を提供するにある。

本発明のもう一つの目的はウシ胚を核移植によってクロ
ーン化する方法を提供するにある。

本発明の更にもう一つの目的は、供与ウシ胚からの核を
除核受容ウシ卵母細胞へ、核又は完全分割球を移植する
為の方法を提供するにある。更にもう一つの目的は遺伝
的に同一な牛を多数発生させる方法の使用に関する。

これら及びその他の目的は以下の詳細な説明及び特許請
求の範囲によってより明らかになろう。

核移植法は、受容卵母細胞からの核分離、供与胚細胞の
膜結合核の除核受容卵母細胞の囲卵腔中への導入、供与
膜結合核及び除核受容卵母細胞それぞれの細胞質膜の配
向、そして卵母細胞活性化そして供与膜結合核の除核受
容卵母細胞中への融合の電気的誘発からなる。供与細胞
又は核の除核ウシ卵母細胞への核移植を成功させるには
、活性化における卵母細胞の条件及び活性化及び融合段
階を実行する方法が重要である。

九肌外圧員１皿」一 本発明は、核移植によるウシ胚クローン化の一連の操作
段階に関する０本方法には受容卵母細胞から核を分離す
る非分断的方法、供与胚から膜結合核の、供与細胞から
め核の分離、又は分割球それ自体の分離による単離が含
まれる。供与核は次いで受容卵母細胞と結合され、電気
的に誘導して細胞融合を行い、それによって核を供与胚
細胞から受容細胞中に導入する。ウシ胚クローン化法は
基本的には以下の５段階、即ち １）核移植に適当な受容胚又は卵母細胞の選択、２）除
核、即ち受容卵母細胞から核物質の分離、３）供与胚の
膜結合核の除核受容卵母細胞への導入、 ４）供与膜結合核及び受容卵母細胞の細胞融合の為の配
向、そして ５）電気泳動による供与核を囲む膜の受容卵母細胞膜へ
の融合及び受容卵母細胞の活性化、からなる。

ここで示した方法全体は、多数の遺伝的に同一な胚、そ
してそれは究極的には遺伝的に同一な動物を生産する為
の核移植による胚（そして牛）のクローン化又は増殖法
を示している。

ここで受容細胞として使用する卵母細胞は、生卵器から
発生し、続いて減数分裂して成熟卵になる１個の細胞を
意味する。全ての卵母細胞が、等しく効率的なウシの核
移植に′Ｍｔ適な細胞ではない事が発見された０本発明
の目的には、ｉｎ　ｖｉｖｏ又はｉｎ　ｖｉｔｒｏいず
れかで成熟した中期■段階卵母細胞が最適である事が判
った。成熟中期■段階卵母細胞は非過剰排卵又は過剰排
卵した雌牛又は米産雌牛から発情後又はヒト絨毛性生殖
腺刺戟ホルモン（ｈＣＧ　）又は類似のホルモンを注射
してから３５ないし４８時間後に外科的な手法によって
集めることが出来る。あるいは又、未成熟卵母細胞を屠
殺された雌牛又未産雌牛から得られた卵巣ｒ胞から吸引
して回収し、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで適当なホルモン処理及
び培養を行って成熟させる事が出来る。

供与細金杯は外科的に回収した輸卵管からフラッシング
によって又は公知の技術によって子宮から非外科的にフ
ラッシングして得る事が出来る。供与胚の発達段階は２
ｍ胞ないし３２細胞段階、即ち細胞分化が余り起こって
いない段階でなければならない、１６ないし３２細胞段
階にある供与胚は脹脛（ｂｌａｇｔｕｌａ）と言うより
はむしろ桑実胚（ａ＋ｏｒｕｌａ）　ｅと４做されてい
る。それにも拘わらず、ここでは金杯という用語が胚を
指すのに使用され、卵割球（ｂｌａｓｔｏｍｅｒｅ）と
いう用語は、原腸形成前の胚から得られた単一細胞を指
すのに用いられる。

供与細胞の核は、本発明の方法で、最適に使用できる様
に膜が結合していなければならない。この様な膜結合核
は完全卵割球からなるか、又は核体（ｋａｒｙｏｐｌａ
ｓｔ）からなっており、吸引して得られた核を含む細胞
の小部分（５ｕｂｓｅｔ　）又は少量の原形質膜が結合
した細胞質である。

ウシ細胞の顕微操作はＭｃＧｒａｔｈ及び５ｏｆｔｅｒ
の方法（上記文献参照）と同様にして行った。同文献に
は顕微操作技術の詳細が述べられている。顕微操作は外
径約１２０μ翰、内径的２５ないし３５ミクロンの細胞
把持ピペット及び、外径が２５ないし３５ミクロンで先
端を斜めに鋭く切った除核移植ピペットを用いて行う、
成熟卵母ＭＡｊ泡は最初に、７．５μｇ／ｍｌ濃度のサ
イトカラシンＢで処理するか、又は作用が似ている微小
管抑制剤を、除核移植ピペットを透明帯を経て挿入する
のに十分な濃度で使用し、細胞質の一部を原形質膜が切
断しないように分離する。成熟卵母細胞は最初細胞法把
持ピペットで軽く吸引して把持する０次いで除核移植ピ
ペットを卵母細胞の透明帯を経て中期■段階突起点又は
第１極体の隣接点に、川■ち中期染色体に隣接する位置
に挿入する。ピペットは原形質膜には入らない様にする
。ピペットを吸引し、細胞突起をピペット中に引き入れ
、中期■段階突起の場合突起全体及び周辺の細胞質を、
又は第１極体の場合、極体と周辺の細胞質をピペットに
含ませる。この方法によって中期染色体全部をピペット
内に吸引する様にする。ピペットをサクションで吸引し
ながら、原形質膜を引き伸ばし、そして密閉し反応能力
のある原形質膜を除核卵母細胞上に残す。

供与胚は、移植ピペットの大きさによってサイトカラシ
ンＢで処理しても良いし又はしなくても良い。３０ミク
ロン以十のピペットを使用する時は卵割球は裂断を避け
るために処理することが薦められる。供与胚細胞の核は
核を含む卵割球の一部を吸引し、そして核体を作るか、
又は卵割球全体を吸引して移植する。＃Ｉ１１胞全体全
全体するのが好ましい、ｐＡ膜結合核吸い込んだ移植ピ
ペットは受容除核卵母細胞の透明帯を通って挿入され、
そして膜結合核は、その膜が透明帯の下で受容卵母細胞
の原形質膜に接する様にピペットから押し出される。膜
結合核の除核受容卵母細胞への融合及び同時に行う受容
卵母細胞の活性化は、市販されている、以下に述べるよ
うな電気融合装置を用いた単一２対電極電気泳動で実施
する。供与胚核と除核受容卵母細胞との電気融合の前に
細胞膜を電場中で配向させる事が必要である。ここで用
いられる配向という用語の定義は、これら２個の細胞を
、２個の膜即ち融合する供与核含有体の原形質膜と受容
卵母細胞の原形質膜との接触平面が電場に対して直角に
成るように置く事である。配向を任意にすると融合成功
率が著しく減少する事が分かった。もし細胞を融合膜が
電場に対して平行になるように、又は略４５゛になるよ
うに配向させると、融合成功率は減少する。配向調整（
ａｌ　ｉｇｎｍｅｎｔ　）は電気的に又は機械的に行う
、２個の細胞の不均衡が大きくなければ、小さな配向調
整交流電圧（１，０００Ｋｌｌｚで約５ボルト／ｍ１）
を短期間（１０秒）負荷すれば、細胞を再配向させて膜
を並置させられる。パルスを繰り返す場合が必要な場合
も有り１１）る。もし細胞の大きさが大きく変わる時は
機械的に操作して膜の配向を適宜行わなければならない
場合もある。膜結合核の除核ウシ卵母細胞への挿入は、
直流電流で、非電気伝導性、即ち非イオン性の細胞融合
培地、例えばマンニトール溶液又はチンマーマン（Ｚｉ
ｍＩＩｌｅｒ…ａｎ）細胞融合培地を用いた２対電ｌｊ
ｉ電気泳動（ｄｉｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ　）
によって行う０Ｍ合は細胞膜が破れ、適当に配向して互
いに向き合っている２個の細胞の間に孔が出来て起こる
。２個の細胞の間に形成された細孔即ち小さな通路は、
通路の表面曲率が高く従ってｊＩ！に大きな張力がかか
る為熱力学的に不安定である。

そして不安定である為に通路は合体し拡大し、２個の膜
は単一細胞を形成する。

このようにして製造した単−細胞膜クローン体はｉｎ　
ｖｉｖｏ又はｉｎ　ｖｉｔｒｏで桑実胚又は金杯段階ま
で培養するのが好ましい。例えばクローン体は羊の輸卵
管又は適当な培地中で培養する事が出来る。

次いで胚はウシ又はその他の動物の子宮に、適当な発情
段階で移植する事が出来る。移植の方法は公知であり、
肝移植の分野で実際に行われている。

これら移植体が子宮又はその代用体中で妊娠を開始する
の１％である。これら妊娠か誕生する仔牛は供与細胞が
単−胚又はそのクローン体と遺伝的に同一である。

以下の実施例は本発明を更に説明するものである。但し
本発明はそれらに制限されない。

中期段ｐｌ　（ｍｅｔａｐｈａｓｅ−ｓａｇｅ　）卵母
細胞及びそれより後期段階のウシ供与胚は発情開始後３
６ないし１０８時間で屠殺された非過剰排卵又は過剰排
卵した雌牛又は米産雌牛の輸卵管から得た。これら動物
はクロプロステノールナトリウム（ｅ　１ｏｐｒｏｓｔ
ｅｎｏｆ　ｓｏｄｉｕｍ）　（”Ｅｓｔｒｕｍａｔｅ−
旧Ｉｅｓ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社（Ｓｈａｗｎｅ
ｅ　Ｋａｎｓａｓ　ＵＳ八）の登録商標）を２回注射（
合計２　ｃｃ）　して発情期を揃え、４０ｍｇノＦＳｌ
ｌ　−Ｐ（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ　Ｃｏｒｐ、社製（ｏＩＩ
ｌａｈａ、　Ｎｅｂｒａｓｋａ、　ｔｌｓ＾））で４日
間処理して過剰排卵させるのが好ましがった。核移植実
験では受容体としてｉｎ　ｖｉｖｏ又は１ｎｖｉｔｒｏ
で成熟させた中期■段階受容卵付細胞そして供与体とし
て２−細胞ないし３２−細胞段階の胚を用いた。

胚ハンドリング　び　１　” 胚はＢａｖｉｓｔｅｒ他ドＤｅｖｅｌｏｐ＋５ｅｎｔ　
ｏｆ　ＰｒｅｉｍｐｌａｎａＬｉｏｎ　Ｅｍｂｙｒｏｓ
　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｇｏｌｄｅｎ　１ｌａａｓｔｅｒ　ｉ
ｎ　ａ　Ｄｅｆｉｎｅｄ　Ｃ１ｕｔｕｒｅ　Ｍｅｄｉｕ
ｍ　（一定培地中でのゴールチンハムターの移植前胚の
発達）　”　、　Ｂｉｏｌ、　Ｒｅｐｒｏｄ、。

２８　：　２３５．１９８３］によるＴＬ　Ｈｅｐｅｓ
緩ｆＦＩ液改質のＴｙｒｏｄｅｓ培地中で回収し、操作
した。胚は顕微操作前の１０分閘及び操作中サイトカラ
シンＢ　（７，５μｇ／＋ｅｌ濃度）を含む培地内に置
いた。培地にはデミコルシンも添加した（０．１μ［１
／＃ｌｌ＞。ウシにおける細胞融合条件を試験する為に
、少量の細胞原形質を受容卵母細胞から分離し、囲卵腔
に再挿入した。

核移植する為に、前核受容胚を最初、Ｗａｌｌ他ビＤｅ
ｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｐｏｒｅｉｎｅ　Ｏｖａ　
ｔｈａｔ　ｗｅｒｅ　ＣｅｎｔｒｉｆＢｅｄ　　ｔｏ　
Ｉ’ｅｒ＋＊ｉｔ　Ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ
　　Ｐｒｏｎｕｃｌｅｉａｎｄ　Ｎｕｃｌｅｉ　（遠心
分離し前核及び核を見えるようにした豚卵の発達）　”
、　’Ｂｉｏ１．　Ｒｅｐｒｏｄ、　３２：６４５゜１
９８５）に従って１５．００にで３分間遠心分離し、前
核を見えるようにした。

受容卵母細胞は口径２５ないし３５ミクロンの移植ピペ
ットを用いて極体と並んだ細胞原形質の約１／２を吸引
して除核し除核膜結合卵母細胞を残した。後期段階供与
胚からの核は核とそれを囲む膜結合細胞原形質の一部を
卵割球がら吸引するが又は完全卵割球を吸引して分離し
た。顕微操作は外径約１２０ミクロン、内径約３０ミク
ロン、斜めに鋭利な切断した口を有する把持ピペット及
び外径約２５ないし３５ミクロンの移植］ピペットを用
いて行った。核を含む完全卵割球は供与胚から分離し、
Ｍｅにｒａｔｈ及び５ｏｆｔｅｒ　（上述文献参照）の
方法によって受容卵母細胞の囲卵腔に挿入した。

Ｉｎ　ｖｉｔｒｏで発達を見た胚は、胚は寒天中に入れ
、卵管−子宮接合部の上部に結紮したヒツジ輸卵管に移
植した。移植５日後に胚を回収し、その発達情況を見た
。発達能力を更に受容雌牛の移植した２個の胚について
も試験した。

細胞融合 ２種類のウィルスを使用するウィルス細胞融合法及び電
気融合法を、以上述べてきた方法によって調製された供
与及び受容胚細胞の融合で試験した。　Ｃｅ１ｅｓ及び
Ｒｕｄｄｌｅ　［”Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　５ｅ
ｎｄａｉＶｉｒｕｓ　ｆｏｒ　ｃｅｌｌ　ｆｕｓｉｏｎ
　（細胞融合の為のセンダイウィルスの製造）　”、　
Ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ　２：１０３．１９７３］に従ってセ
ンダイウィルスを培養した。センダイウィルスの力価は
モルモット赤血球で試験した所、６．４００ないし９，
６００赤血球凝集単位／１であった。

このウィルスは一緒に実施したマウス胚核移植実験では
９０％以上の融合率を与えた。その他にｃ、　Ｊ。

Ｌｅｔｅｈｗｏｒｔｌ＋［ＬｅＬｃｈｗｏｒｔｈ　　ａ
ｎｄ　　ＬａＤｕｅ、　　”１ｌｏｖｉｎｅ１１ｅｒｐ
ｅｓ　Ｍａｎ＋ｅｉｌｌｉｔｉｓ　ｉｎ　’ｒｗｏ　Ｎ
ｅｗ　Ｙｏｒｋ　Ｄａｉｒｙ　Ｈｅｒｄｓ（２集団のニ
ューヨーク酪牛におけるヘルペス乳頭炎）”、ｊ、＾ｍ
ｅｒ、　Ｖｅｔ、　Ｍｅｄ、＾５ｓｏｃ、　１８０　：
９０２、１９８２］から得たウシヘルペスウィルス１（
ＮＹＩ株）を試験した。ウシヘルペスウィルスは約１０
’ＴＣＩＤ、。７石１の力価を有し、１００倍濃縮され
た。

このウィルスはウシの組織培養細胞では容易に細胞融合
を起こす０両ウィルスはＭｃＧｒａｔｈ及び５ｏｌｔｅ
ｒが述べている様に使用した（上述文献参照）。

これら融合ウィルスを使用して細胞原形質を成熟ウシ胚
に融合させようとしたが成功しなかった。

従って以下に述べる融合は全て電気融合法を用いて行っ
た。

２種類の培地、即ちＴＩ　Ｈｅｐｅｓ培地及びＺｉｍｍ
ｅｒｍａｎａｌ胞融合培地（ＧＣＡ　Ｃｏｒｐｏｒａｔ
ｉｏｎ社製、Ｃｈｉｃａｇ。

ＩＬ　ｕｓ＾）についてその融合率を比較した。細胞融
合後卵母細胞は５％の炭酸ガスを含む湿潤空気雰囲気の
中で、流動パラフィン下１５０μｍの改１Ｔｙｒ。

ｄｅｓ媒質滴中に入れ、そして定期的に融合情況を調べ
た。無傷膜結合核の活性化及び除核卵母細胞への融合は
チンマーマン細胞融合培地中、にＣＡ　Ｃｏｒｐｏｒａ
Ｌｉｏｎ社（Ｃｈｉｃａｇｏ、　ＩＬ　ＵＳＡ）製チン
マーマン電気融合装置を使用した２対電極電気泳動法に
よって実施した０Ｍ合室は、ガラススライド上間隔１１
１１−の２個の平行電極からなる。装置は以下の様に１
ｌｌｌ製する。

融合電圧：　　１００−１２０ボルト（直流）電圧間隔
：　　１　　＋ａｍ 配向調整電圧：　１−５ボルト（交流）配向調整振動数
：　　１，０ＯＯＫＩ（ｚパルス期間：　　１０−４０
マイクロセ力ンド融合後配向ｔｌ！整時間：　５秒 配向″Ａ整パルスは、ウシ細胞中の受容卵母細胞膜に隣
接して置いた卵割球又は核体が小さいと殆ど配向に成功
しない事が分かった。それ故配向は大部分機械的に行っ
た。膜結合核部ち卵割球又は核体と除核卵母細胞は、把
持ピペットを使用して両者の配向を調整し、融合パルス
が膜結合核の膜と除核卵母細胞膜との境界面を直角に流
れるようにした。得られた胚は改質Ｔｙｒｏｄｅ培地５
０μｍ滴中で１８ないし２４時間ｉｎ　ｖｉｔｒｏ培養
し、次いで寒天塊中に入れ、受容母体例えば雌羊の結紮
輸卵管に移植した。

衷１１Ｌ−し 最初に細胞配向が融合率に及ぼす効果を２細胞マウス胚
を用いて試験した。供与膜結合核及び卵母細胞は１，０
ＯＯＫＨｚ、５ボルト以下の交流パルスで配向した。配
向に続いて細胞を１００ボルトの直流融合パルスに２０
マイクロセカンド当てた。ウシ細胞融合では供与細胞が
小さいと細胞に十分な極性を与えられず、交流パルスで
方向調整が出来ないことが判った。それ故ウシ細胞は把
持ピペットを使用して機械的に配向させた。

電気融合で検討した条件項目は、ｌａ街液の種類、パル
ス電圧、パルス期間、及び細胞配向性である。

表１に挙げたように、電解質を含まないチンマーマン細
兜融合培地（８／９．８９％）が、ＴＬ　Ｈｅｐｐｅ（
１／９．１１％）より高い融合率を与えた。１００ボル
ト及び１２０ボルトのパルス電圧の間には明確な差は認
められなかった。

表　　　１ 融合培地　パルス電圧　融合／全数　融合率（％）（４
０マイクロ七〇＞Ｆ） ＴＬ　　１ｌｅｐｐｅ　　　　　１００Ｖ　　　　　　
　　　Ｏ１５０ＴＬ　　）Ｉｅｐｐｅ　　　　　１２０
Ｖ　　　　　　　　　１／４　　　　　　　　　２５チ
ンマーマン１００Ｖ　　　　　５１５　　　　１００チ
ン？−？　ン１２０Ｖ　　　　　３／４　　　　７５表
２に示すように、２０及び４０マイクロセカンドのパル
ス期間は同等の融合率を与えたが、１０マイクロセカン
ドはそれ程効果的ではなかった。

友−−１ パルス電圧パルス期間　融合／全数　融合率（％）マイ
クロ七カシＦ １００Ｖ　　　　　　　　　　　　４０　　　　　　　
１４／１８　　　　　　　　７８１００Ｖ　　　　　　
　　　　　　２０　　　　　　　１５／１９　　　　　
　　　７９１００Ｖ　　　　　　　　　　　　１０　　
　　　　　　　Ｚ／１０　　　　　　　　２０夾遣１ 前核を分離しそして再挿入した胚の発達をｉｎ　ｖｉｔ
ｒｏで検討し、核挿入ウシ胚の生存能力を試験した。核
再挿入した２９個の胚のうちの９個が７−ないし１２−
細胞迄発達したが、６個は４−ないし６細胞迄であった
。そしてそれ以外は、４８時間の１ｎｖｉｔｒｏ培養で
１ないし３個の細胞にしがならなかった。

次いで供与胚細胞の前核段階卵は細胞への核移行につい
て検討した。下記の２箇所に示す表３は核移植体及び対
照胚の、年輪卵管で５日間発達させた後の発達情況を示
している。対照胚は同じ日に雌牛から回収した胚であり
、その多くは核移植胚の反対側の輸卵管に移植された。

宍　　３ 供与核受容細胞原形質移行数　全回収数　空帯（％） 前核　　　　前核　　　　７１　　３８（５４）　　９
（１３）対照　　　　　　　　　　４９　　３０（６１
）　　Ｏ（０）２．４゜ ８−細胞　　　前核　　　　１８　　１０（５８）　　
３（１７）対照　　　　　　　　　　２３　　１９（８
３）　　Ｏ（０）供与核１−３細胞４−６細胞７−９細
胞１０−１６桑実胚細胞　金杯 （％）　　（％）　　（％）　（％）　（％）前核　　
１４（４８）　　３（１０）　　３（１０）　　２（７
）　　５（１７）対照　　　　１２（４０）　　　２（
））　　　　２（７）　　　３（１０）　　１１（３）
）２．４− ８−細胞　７（１００）　　Ｏ（０）　　ｏ（０）　　
Ｏ（０）　　Ｏ（０）対照　　８（４２）　　１（５）
　　１（５）　　１（５）　　８（４２）（％は年輪卵
管から回収された無傷胚の数を基準にしている。） 対照胚は前核ないしは８−４１１１胞段階のものであっ
て、必ずしも核移植胚と同段階には無かった。それ故細
胞段階での直接比較は出来なかった。しかし、対照群は
屠殺動物から回収後生存しそして発達した胚が実９質に
運ばれ室温で数時間そのまま維持出来る事を示した。核
を分離しそして再挿入した前核胚も年輪卵管中で桑実胚
あるいは金杯に迄発達した。前核再挿入から発達した胚
の中の２個は受容雌牛に移植され、正常な仔牛が生まれ
た。

前核を、２−１４−１または８−細金杯で置換した胚は
非削を１回または２回道しか行わながった。

全部の胚を寒天中に入れたが、大部分が寒天被覆による
保護状態が得られなかった。しかし対照胚は無傷で回収
され、移植、顕微繰作した胚の約１５％が透明帯が空洞
であった。

これらの実験から核は前核ウシ細胞及びうまく挿入され
た核物質から分離出来る事が結論付けられた。核細胞と
受容卵母細胞との間の細胞融合は非イオン的な培地中で
可能であり、もし供与細胞と受容卵母細胞との層境界面
が融合電気パルスの方向に対して直角に向けられるなら
ば最適化となった。

Ｘ１漕Ｂ 本実施例では供与細胞を、発情後２ないし５日後に層殺
して得た４−ないし３２−細胞段階の金杯から選んだ、
受容卵母細胞は、層殺して得た卵子をＣｒ１ｔｓｅｒ他
［”１ｎｆｌｕｅｎｃｅ　ｏｆ　Ｃｕｍｕｌｕｓ　Ｃｅ
１ｌ＾５ｓｏｃｉａｔｉｏｎ　Ｄｕｒｉｎｇ　Ｉｎ　Ｖ
ｉｔｒｏ　Ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｂｏｖｉｎｅ
Ｏｏｃｙｔｅｓ　ｏｎ　Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　Ｄｅｖｅ
ｌｏｐｍｅｎｔ　（ウシ卵母細胞のｉｎ　ｖｉｔｒｏ成
熟間に胚発達に及ぼす卵細胞会合成層の影’ｆｌ　）　
”、　Ｂｉｏｌ、　ｏｆ　Ｒｅｐｒｏｄ、　３４　：　
５ｕｐｐｌ。

１．Ｐ、１９２　（八ｂｓｔｒａｃｔ　Ｎｏ、　２８６
）　、　１９８Ｂ）によって、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで２２
ないし２６時間成熟させるが、又は発情後３６時間後に
屠殺して回収した卵母細胞を１ｎｖｉｖｏで成熟させて
得た１−５１の枦胞から吸引した。

受容卵母細胞は非圧を、１Ｉ１１１？／ｍｌのウシこう
がんヒアルロニダーゼを含むｒＡＬＰ　−１１ｅｐｅｓ
ｇ街培地中で１０分間撹拌して分離した。

上記した方法で、成熟卵母細胞を除核し、ある場合は極
体とそれに隣接する細胞原形質だけを分離するか、又他
の場合には細胞原形質の約半分を分離する。除核及び核
移植は４．５μｇ／ｍ１ｆｉ度のサイトカラシンＢ中で
行った。核を有する供与非削球は、供与胚から吸引し、
除核受容卵母細胞の囲卵腔に注入した。細胞活性化及び
融合はチンマーマン細胞融合培地中で２対電極電気泳動
で、上記した方法に従って行った。融合した胚は、寒天
塊に埋め込む前に、改質Ｔｙｒｏｄｅ培地中で１培地−
し１８時間培養し、そして雌羊の結紮輸卵管に移植した
。

Ｉｎ　ｖｉｖｏで５日間培養してから、胚を回収し評価
した。その結果、受容卵母細胞が約半分の細胞原形質を
件って分離され、供与非削球が４−ないし１６−細金杯
の場合、融合効率が上昇することが判った。この受容／
供与組み合わせによる融合効率は３４２例中２３７例で
成功し、融合率は６９％であった。桑実胚又は金杯迄ｉ
ｎ　ｖｉｖｏで発達させた場合の融合効率は受容卵母細
胞をいずれの方法で調製してもあまり変わらなかった（
３．７％及び１．９％）。

しかし、桑実胚又は金杯迄の発達は、原形質を約半分分
離した場合でもｉｎ　ｖｉｔｒｏで成熟させた卵母細胞
（１，９％）と比較してｉｎ　ｖｉｖｏ成熟卵母細胞（
２７％）の方が良がった。明らかにｉｎ　ｖｉｔｒｏ成
熟卵母細胞は正常に発達出来るようにうまく適切に成熟
しない、桑実胚又は金杯迄発達した胚は発達が正常の様
である。桑実胚又は金杯段階胚の１４個が非外科的に、
適当な発情段階でウシの子宮に、通常行われている肝移
植によって移植された。４個の胚が受胎され、その内３
個が母牛の胎内で成育した。２個から正常な仔牛が誕生
した。残りの２個は妊娠２５日目及び９０日目に流産し
た。

本実施例から４−ないし１６−細胞供与胚細胞を受容卵
母細胞に移植するのが生存可能な胚を作り出す事になり
、ひいては仔牛の誕生につながる事が明らかになった。

こうした結果は核移植が、遺伝的に同一な胚を増殖させ
、多数の遺伝的に同一な仔牛を生産する事が可能である
事を示唆している。

以上本発明を幾分詳細に述べたが、これをある程度変え
たりあるいは改質しても、それらが本発明の特許請求の
範囲の中にあるのは明白である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、供与ウシ胚からの核を受容卵母細胞へ移植する方法
   であって、 （ａ）供与胚の細胞から膜結合核を分離し、 （ｂ）受容卵母細胞から核染色体物質を除去して（除核
   受容卵母細胞を調製し）、 （ｃ）得られた供与膜結合核を、その膜がともに、除核
   受容卵母細胞の膜に隣接して置き、そして （ｄ）これら膜結合核と除核受容卵母細胞との両者の膜
   を電気的に融合させて同供与胚からの核を含む胚単細胞
   を形成する ことを特徴とする方法。 ２、該膜結合核が完全卵割球であることを特徴とする特
   許請求の範囲第１項記載の方法。 ３、該膜結合核が卵割球から吸引された核体であること
   を特徴とする特許請求の範囲第１項記載の方法。 ４、段階（ｄ）の前に、膜結合核と除核受容卵母細胞を
   、両者の膜の接触平面が、段階（ｄ）での電流方向に対
   して直角になる様に置くことを特徴とする特許請求の範
   囲第１項記載の方法。 ５、該供与ウシ胚細胞が４細胞ないし３２細胞胚である
   ことを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の方法。 ６、段階（ｃ）の前に、該膜結合核と該除核受容卵母細
   胞を維持溶液中に入れることを特徴とする特許請求の範
   囲第１項記載の方法。 ７、該維持溶液がヘペス（Ｈｅｐｅｓ）緩衝液で改質し
   たタイロード（Ｔｙｒｏｄｅ）培地であることを特徴と
   する特許請求の範囲第６項記載の方法。 ８、該供与ウシ胚及び該受容卵母細胞とを段階（ａ）の
   前にサイトカラシンＢを含む溶液に約１０分間入れるこ
   とを特徴とする特許請求の範囲第７項記載の方法。 ９、該受容卵母細胞が中期II段階の卵母細胞であること
   を特徴とする特許請求の範囲第１項記載の方法。 １０、該受容卵母細胞が、同卵母細胞の極体に近い細胞
   質を約半分吸引した、半除核膜結合卵母細胞を残すこと
   によって除核された特許請求の範囲第１項記載の方法。 １１、該受容除核卵母細胞が囲卵腔を含み、そして該膜
   結合核が同除核卵母細胞の囲卵腔に挿入される特許請求
   の範囲第１項記載の方法。 １２、段階（ｄ）が、ガラススライド上の２個の平行電
   極からなる融合室中で実施される特許請求の範囲第１項
   記載の方法。 １３、段階（ｄ）の前に、該供与膜結合核及び該除核受
   容卵母細胞を非イオン性細胞融合媒質中に入れる特許請
   求の範囲第１２項記載の方法。 １４、該細胞融合媒質がチンマーマン細胞融合媒質であ
   る特許請求の範囲第１３項記載の方法。 １５、特許請求の範囲第１項記載の核移植法によって製
   造されたウシ胚。 １６、（ａ）供与多細胞ウシ胚の単細胞から、膜の結合
   した１個の核を単離し、 （ｂ）受容卵母細胞を除核し、 （ｃ）供与膜結合核を、除核受容卵母細胞の囲卵腔に導
   入し、 （ｄ）供与核に結合している膜と除核受容卵母細胞との
   間で電気的に細胞融合を誘発し、 （ｅ）段階（ｄ）で得られた電気的に誘発融合した胚を
   インビトロで培養し、そして （ｆ）段階（ｅ）の培養胚を受容母牛の卵管に移植する
   、 ことを特徴とするクローン化ウシ胚の製造法。 １７、段階（ａ）が単一卵割球を、膜結合供与核として
   使用される完全卵割球とともに供与胚から分離すること
   から成る特許請求の範囲第１６項記載の方法。 １８、段階（ａ）が１個の核を含む膜結合核体を供与胚
   の１個の細胞から吸引することから成る特許請求の範囲
   第１６項記載の方法。 １９、段階（ｄ）の前に、膜結合核及び卵母細胞を、両
   者の膜の接触平面が段階（ｄ）の電気融合パルスがその
   境界面の方向に対して直角に負荷されるように、一定の
   方向に向ける特許請求の範囲第１６項記載の方法。 ２０、膜結合核及び除核受容卵母細胞を機械的な操作に
   よって配向させる特許請求の範囲第１９項記載の方法。 ２１、段階（ｅ）で該胚をインビトロで約１８ないし２
   ４時間培養する特許請求の範囲第１６項記載の方法。 ２２、該供与ウシ胚が４−細胞ないし３２−細胞段階の
   胚である特許請求の範囲第１６項記載の方法。 ２３、該膜結合核を供与ウシ胚の細胞から、斜めに鋭く
   切った口を有する核吸引移植用ピペットを用いて吸引す
   る特許請求の範囲第１６項記載の方法。 ２４、核吸引移植用ピペットが約２５ないし３５ミクロ
   ンの外径を有する特許請求の範囲第２３項記載の方法。 ２５、特許請求の範囲第１６項記載の方法によってクロ
   ーン化されたウシ胚。 ２６、特許請求の範囲第２５項記載のウシ胚を受容動物
   の子宮に移植し、受胎妊娠させて生まれたウシ類動物。 ２７、特許請求の範囲第２５項記載のウシ胚を一頭又は
   それ以上の受容動物の子宮に移植し、受胎妊娠させて生
   まれた２頭又はそれ以上の遺伝的に同一な仔牛であって
   、その際、該胚を調製するのに使用される膜結合核が同
   一の供与多細胞ウシ胚又はそれからクローン化して製造
   したウシ胚から分離されたものであることを特徴とする
   仔牛。