FR2609045A1 - Procede pour transplanter un noyau d'un embryon de bovin donneur dans un ovocyte receveur, et embryon de bovin produit par ce procede - Google Patents

Abstract

L'INVENTION CONCERNE UN PROCEDE POUR TRANSPLANTER DES NOYAUX D'EMBRYON DONNEUR DE BOVIN DANS DES OVOCYTES ENUCLEES RECEVEURS. SELON L'INVENTION, LE PROCEDE COMPREND LES ETAPES SUIVANTES : A) ISOLER UN NOYAU ENTOURE D'UNE MEMBRANE A PARTIR D'UNE CELLULE DE L'EMBRYON DONNEUR; B) RETIRER LE MATERIEL CHROMOSOMIQUE NUCLEAIRE DE L'OVOCYTE RECEVEUR (POUR PREPARER UN OVOCYTE ENUCLEE RECEVEUR); C) PLACER LE NOYAU DONNEUR ENTOURE D'UNE MEMBRANE AYANT SA MEMBRANE ADJACENTE A CELLE DE L'OVOCYTE ENUCLEE RECEVEUR; ET D) FUSIONNER ELECTRIQUEMENT LES MEMBRANES DU NOYAU ENTOURE D'UNE MEMBRANE ET DE L'OVOCYTE ENUCLEE RECEVEUR POUR FORMER UNE CELLULE UNIQUE EMBRYONNAIRE AVEC UN NOYAU PROVENANT DE L'EMBRYON DONNEUR. L'INVENTION S'APPLIQUE NOTAMMENT POUR LA MULTIPLICATION ET LE CLONAGE D'EMBRYONS DE BOVIN PAR TRANSFERT NUCLEAIRE.

Description

La présente invention concerne généralement un procédé pour la

multiplication des embryons de bovin et plus précisément un procédé de transplantation de noyaux d'embryons de bovin donneur dans des ovocytes énucléés receveurs, qui sont des ovocytes dont les noyaux ont été retirés. Des recherches de pointe en amélioration génétique et en techniques de sélection sont en cours dans le domaine de l'élevage. En référence plus précisément aux vaches laitières, par exemple, des améliorations significatives de la production de lait ont été faites avec l'utilisation

à grande échelle de pères ou taureaux génétiquement supé-

rieurs et avec l'utilisation de l'insémination artificielle.

Aujourd'hui, les vaches laitières produisent approximative-

ment deux fois plus de lait qu'elles ne le faisaient il y a 30 ans. D'autres améliorations génétiques ont pu être réalisées par la multiplication des embryons manipulés

génétiquement ou des embryons supérieurs, par clonage.

La transplantation d'embryons chez les bovins est devenue maintenant une pratique répandue pour contribuer à la production d'une réserve génétique supérieure. Le clonage des embryons ainsi que la capacité de transplanter

les embryons clones rend possible la production de multi-

ples animaux identiques génétiquement. Cependant, des embryons de bovin peuvent être clones actuellement, seulement par bissection chirurgicale d'un embryon en développement, et le nombre de clones qui peuvent être produits par cette méthode est limité à deux ou quatre avant que les embryons divisés en deux parties égales deviennent non viables. La transplantation nucléaire à partir d'un embryon pluricellulaire en une pluralité de cellules uniques embryonnaires offre la possibilité de surmonter cette limitation et permet la production d'un

grand nombre d'animaux identiques multipliés.

Un transfert nucléaire a été pour la première fois réalisé dans l'Amoeba sphaeronucleus en 1939 par Comandon et de Fonbrune ("Greffe Nucléaire Totale, Simple ou

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Multiple, Chez une Amibe", Soc. Biol.130:744, 1939).

Ceci a été suivi en 1952 par un transfert nucléaire réussi dans le Rana pipiens par Briggs et King ("Transplantation of Living Nuclei from Blastula Cells into Enucleated Frogs' Eggs,", Zoology 38:455-463, 1952). Le procédé pour des transferts nucléaires réussis, selon Briggs et King (ci-dessus), comprend les étapes suivantes: 1) l'activation d'un ovocyte receveur; 2) l'énucléation, le procédé de retrait ou d'inactivation des chromosomes de l'ovocyte receveur; et 3) le transfert de tout un blastomère lysé (une cellule résultant de la division embryonnaire avant la gastrulation) muni d'un noyau, à partir d'une blastula ou d'un embryon d'un premier stade gastrula, dans l'ovocyte

énucléé.

Elsdale et al ("A Description of the Technique

for Nuclear Transplantation in Xenopus laevis," J. Embryol.

exp. Morph. 8(4):437-444, 1960), ont utilisé une irradia-

tion aux ultraviolets pour, dans une première étape, inactiver le pronucleus de l'oeuf et pour activer l'ovocyte non fécondé. Dans l'axolotl, l'activation a été apportée par choc électrique et les chromosomes du noyau de l'oeuf ont été éliminés par une irradiation aux ultraviolets, (Briggs, R., et al, "Transplantation of Nuclei of Various Cell Types from Neurulae of the Mexican Axolotl (Ambystoma mexicanum)," Develop. Biol. 10:233, 1964). Le transfert de tout un blastomère lysé contenant un noyau, dans l'ovocyte énucléé au moyen d'une petite micropipette de perçage, était une méthode habituelle de transfert

nucléaire concernant toutes ces techniques.

Deux techniques ont été utilisées pour le transfert nucléaire dans la souris. Illmensee et Hoppe ont utilisé

un procédé totalement chirurgicale dans lequel une micro-

pipette a été insérée à travers la membrane plasmatique etdanslecytoplasme d'un embryon du stade pronucleus pour retirer la substance nucléaire et pour l'insertion (Illmensee, K. et Hoppe, P. C., "Nuclear Transplantation

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in Mus musculus: Developmental Potential of Nuclei from Preimplantation Embryos," Cell 23:9, 1981). McGrath et Solter ont rapporté un procédé continu de transplantation de noyau (McGrath, J. et Solter D., "Nuclear Transplantation in the Mouse Embryo by Microsurgery and Cell Fusion," Science 220:1300, 1983). Des noyaux ont été retirés comme des nucléoplastes de pronucleus entourés d'une membrane

sans pénétration de la membrane plasmatique de l'embryon.

Le noyau a été inséré dans une cellule receveuse par fusion cellulaire, en utilisant le virus de Sendai comme agent de fusion. Un petit volume d'une suspension du virus de Sendai a été aspiré après le retrait du noyau donneur et la suspension du virus ainsi que les nucléoplastes du pronucleus ont été injectés séquentiellement dans l'espace périvitellin de l'embryon receveur. Au mieux, le procédé microchirurgical de Illmensee et Hoppe (donné ci-dessus) a été efficace à environ 30-40% alors que le procédé en continu.de McGrath et Solter (décrit ci-dessus) était efficace à plus de 90%. Ces techniques ont été couronnées de succès pour produire des embryons du stade blastocyste qui ne continuent pas leur développement à terme. Des rapports citant que Illmensee et Hoppe ont produit trois

souris vivantes, ont été mis en question.

Il a été rapporté plus tard que des embryons du stade blastocyste et des souris ont été produits en transférant des noyaux dans des zygotes de pronucleus énucléés seulement lorsque le stade de la cellule donneuse était également un stade de pronucleus ou un tout premier stade à deux cellules (McGrath, J. et Solter, D., "Inability of Mouse Blastomere Nuclei Transferred to Enucleated Zygotes to Support Development In Vitro, " Science 226:1317-1319, 1984; Surani, M. A. H. et al, "Nuclear Transplantation in the Mouse: Heritable Differences Between Paternal Genomes after Activation of the Embryonic Genome," Cell, 45:127-136, 1986; et Robl, J.M. et al, "Nuclear Transplantation in Mouse Embryos: Assessment of

Recipient Cell Stage," Biol. Reprod. 34:733-739, 1986).

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Récemment, un procédé pour la transplantation nucléaire dans le mouton a été rapporté (Willadsen, S. M., "Nuclear Transplantation ir Sheep Embryos", Nature 320:

63-65, 1986) qui décrit l'utilisation d'une biélectro-

phorèse pour l'activation et la fusion, et l'utilisation d'ovocytes en métaphase II comme receveurs. Ces expériences ont entraîné la naissance de veaux clones. Cependant, jusqu'à ce jour, aucune publication sur les procédés de

transfert nucléaire chez les bovins, n'existe.

Un objet de la présente invention est alors de fournir un procédé utilisable pour cloner des embryons

de bovin.

Un autre objet de la présente invention est de fournir un procédé pour cloner des embryons de bovin

par transfert nucléaire.

Encore un autre objet de la présente invention est de fournir un procédé pour transplanter le noyau ou tout un blastomère avec son noyau à partir d'un embryon de bovin donneur dans un ovocyte énucléé de bovin receveur. Un objet connexe de l'invention est l'utilisation du procédé pour la génération de bovins multipliés

identiques génétiquement.

L'invention sera décrite en plus de détail en

se référant à la description détaillée qui est la

suivante. La présente invention concerne un procédé pour transplanter des noyaux dans des embryons de bovin. Les noyaux sont retirés d'un embryon de bovin donneur sans pénétration de la membrane plasmatique et sont insérés dans des ovocytes receveurs par une fusion cellulaire

induite électriquement.

Le procédé de transfert nucléaire entraine le retrait du noyau de l'ovocyte receveur, l'introduction du noyau entouré d'une membrane de la cellule de l'embryon donneur dans l'espace périvitellin de l'ovocyte énucléé

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receveur, l'orientation des membranes plasmatiques respectives du noyau donneur entouré d'une membrane et de l'ovocyte énucléé receveur, et l'induction électrique pour l'activation de l'ovocyte et pour la fusion du noyau donneur entouré d'une membrane dans l'ovocyte énucléé receveur. Les conditions de l'ovocyte au moment de l'activation et la manière dont les étapes d'activation et de fusion sont réalisées, sont critiques pour un transfert nucléaire réussi des cellules ou des noyaux

du donneur dans les ovocytes énucléés de bovin.

La présente invention a pour objet une série d'étapes qui aboutissent collectivement dans le clonage

des embryons de bovin par transplantation nucléaire.

Le processus comprend un procédé continu de retrait du noyau de l'ovocyte receveur et de l'isolation d'un noyau à partir d'un embryon donneur, entouré par une membrane, soit par retrait du noyau de la cellule donneuse ou par isolement d'un blastomère même. Le noyau donneur est ensuite joint à l'ovocyte receveur et une fusion cellulaire induite électriquement est utilisée pour introduire les noyaux de la cellule de l'embryon donneur dans la cellule receveuse. Le procédé de clonage d'embryons de bovin suit un processus de cinq étapes fondamentales qui sont les suivantes: 1) sélectionner un embryon receveur adéquat ou un ovocyte pour un transfert nucléaire; 2) énucléer, c'est-à-dire, retirer la substance nucléaire de l'ovocyte receveur; 3) introduire le noyau entouré d'une membrane de l'embryon donneur, dans l'ovocyte énucléé receveur; 4) orienter le noyau donneur entouré d'une membrane et l'ovocyte receveur pour la fusion cellulaire; et ) fusionner la membrane entourant le noyau donneur avec la membrane de l'ovocyte receveur et activer

l'ovocyte receveur par biélectrophorèse.

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Tout le processus divulgué ici peut être décrit comme un clonage ou comme une multiplication d'embryons (et de bovins) par un transfert nucléaire, pour la production d'embryons multiples identiques génétiquement, et par la suite, d'animaux. Le terme "ovocyte",tel qu'utilisé ici pour la cellule receveuse, correspond à une cellule qui se développe à partir d'une oogonie et qui subissant une méiose, devient un ovule mature. Il a été trouvé que tous les ovocytes n'ont pas la même capacité cellulaire pour une transplantation nucléaire efficace chez les bovins. Dans le but de la présente invention, des ovocytes du stade métaphase II, mis à maturité soit in vivo soit in vitro, ont été trouvés comme optimum. Des ovocytes matures du stade métaphase II ont été prélevés chirurgicalement soit chez des vaches

ayant subi une superovulation ou n'ayant pas subi de super-

ovulation ou chez des génisses 35 à 48 heures après le début de l'oestrus ou après une injection d'hormone

gonadotrophine chorionique (hCG) ou une hormone similaire.

De façon alternative, des ovocytes immatures peuvent être prélevés par aspiration de follicules ovariens obtenus chez des vaches ou des génisses abattues et ils sont ensuite

mis à maturité in vitro par un traitement hormonal appro-

prié et mis en culture.

Les embryons cellulaires donneurs peuvent être obtenus à partir d'un nettoyage d'oviductes prélevés chirurgicalement ou peuvent être obtenus à partir d'un nettoyage non chirurgical de l'utérus selon des pratiques connues dans l'art. Le stade de développement des embryons donneurs doit aller du stade de deux cellules à trente-deux cellules, c'est-à-dire avant une différenciation cellulaire significative. Des embryons donneurs des stades de seize à trente-deux cellules sont parfois dénommés morula plutôt que blastula. Cependant, le terme blastula sera utilisé ici en référence à l'embryon et le terme blastomère sera utilisé en référence à une cellule unique d'un embryon

donné quelconque avant la gastrulation.

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Le noyau de la cellule donneuse doit être entouré d'une membrane pour être utilisé de façon optimale dans ce procédé. Un tel noyau entouré d'une membrane peut

consister soit en un blastomère entier ou en un nucléo-

plaste qui est une sous-unité cellulaire aspirée contenant un noyau et une petite quantité de cytoplasme entouré

par une membrane plasmatique.

La micromanipulation des cellules de bovin est réalisée selon une voie similaire aux procédés de McGrath et Solter (décrits ci-dessus), qui sont incorporés ici

pour les détails de la technique de micromanipulation.

La micromanipulation est réalisée en utilisant une pipette maintenant une cellule, ayant un diamètre externed'environ micromètres et un diamètre interne d'environ 25 à 35 micromètres, et en utilisant une pipette de transfert et d'énucléation biseautée et affilée ayant un diamètre externe d'environ 25 à 35 micromètres. Des ovocytes matures doivent être d'abord traités avec de la cytochalasine B à environ 7,5 microgrammes par millilitre, ou avec un inhibiteur de microtubule similaire efficace à une concentration suffisante pour permettre à la pipette de transfert et d'énucléation d'être insérée à travers la zone pellucide pour entraîner le retrait d'une portion du cytoplasme sans, à aucun endroit, vraiment couper la membrane plasmatique. L'ovocyte mature est dans un premier temps mis en place par une légère succion au moyen de la pipette tenant la cellule. La pipette de transfert et

d'énucléation est ensuite insérée à travers la zone pellu-

cide de l'ovocyte à l'endroit du renflement de la méta-

phase II ou à l'endroit adjacent au premier corps polaire, c'est-à-dire dans un emplacement destiné à être adjacent aux chromosomes de la métaphase. La pipette ne doit pas pénétrer la membrane plasmatique. L'aspiration appliquée dans la pipette extrait un renflement cellulaire qui pénètre dans la pipette, qui contient, dans le cas du renflement de la métaphase II, le gonflement en entier et le cytoplasme environnant, ou, dans le cas du premier

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corps polaire, le corps polaire plus le cytoplasme environnant. Ce procédé est destiné à extraire tous les chromosomes de la métaphase dans la pipette. Lorsque la pipette est retirée, avec la succion maintenue, la membrane plasmatique est étirée et ensuite soudée à elle- même en laissant ainsi une membrane plasmatique suffisante

sur l'ovocyte énucléé.

Les embryons donneurs peuvent être traités avec de la cytochalasine B, ou non, selon la taille de la pipette de transfert. Lorsqu'une pipette de moins de microns est utilisée, le traitement est recommandé pour empêcher la rupture du blastomère. Les noyaux des cellules de l'embryon donneur sont transférés soit en aspirant une partie du blastomère qui contient le noyau,

créant ainsi un nucléoplaste, soit en aspirant le blasto-

mère en entier. L'aspiration de la cellule entière est préférée. La pipette de transfert portant le noyau aspiré entouré d'une membrane, est ensuite insérée dans la zone pellucide de l'ovocyte énucléé receveur, et le noyau entouré d'une membrane est déposé sous la zone pellucide avec sa membrane contiguë à la membrane plasmatique de

l'ovocyte receveur.

La fusion du noyau entouré d'une membrane avec l'ovocyte énucléé receveur et l'activation simultanée de l'ovocyte receveur sont réalisées par une étape unique de biélectrophorèse utilisant un matériel d'électrofusion

disponible sur le marché, qui est décrit ci-dessous.

Avant l'électrofusion du noyau de l'embryon donneur avec l'ovocyte énucléé receveur, il est nécessaire d'orienter les membranes cellulaires dans le champ électrique. Le mot "orientation" tel qu'utilisé ici est défini comme la disposition de deux cellules de telle façon que le plan de contact des deux membranes, c'est-à-dire, de la membrane plasmatique du corps portant le noyau donneur et de la membrane plasmatique de l'ovocyte receveur, qui seront fusionnées ensemble par la suite, soit perpendiculaire au champ électrique. Il a été trouvé qu'une orientation

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au hasard entraîne une diminution marquée de la vitesse de fusion. Si des cellules sont orientées de telle façon

que la fusion des membranes soit parallèle, ou approxima-

tivement à 45 , par rapport au champ électrique, la vitesse de fusion diminuera. L'alignement doit être réalisé électriquement ou mécaniquement. Si la taille des deux cellules n'est pas trop disproportionnée, un petit voltage en courant alternatif pour l'alignement (- 5 volts par millimètre à 1.000 KHz) pendant un temps court (10 secondes), entraînera la réorientation des cellules avec leurs membranes

accolées. Des impulsions répétées peuvent être nécessaires.

Si les cellules ont une très grande taille, une manipula-

tion mécanique est demandée pour orienter correctement

les membranes.

La réelle insertion d'un noyau entouré d'une membrane dans l'ovocyte énuclée de bovin, est réalisée par un procédé de biélectrophorèse de fusion cellulaire, en utilisant un courant continu et en utilisant un milieu de fusion cellulaire non conducteur c'est-à-dire non ionique, tel qu'une solution de mannitol ou un milieu de fusion cellulaire de Zimmerman. Le phénomène de fusion est le résultat d'une rupture de la membrane cellulaire et de la formation d'un pore entre des cellules accolées correctement orientées. Les pores, ou les petits canaux,

créés entre les deux cellules sont instables thermodynami-

quement à cause de la courbure de surface élevée des

canaux et de la haute tension associée dans la membrane.

Cette instabilité entraîne le mélange des canaux et leur dilatation jusqu'à ce que les membranes forment une

cellule unique.

Les clones de cellules uniques embryonnaires

produites selon la description donnée ici sont de préfé-

rence mis en culture, soit in vivo soit in vitro, au stade morula ou blastula. Par exemple, les clones peuvent être mis en culture dans des oviductes de mouton ou dans un milieu de culture approprié. Les embryons peuvent ensuite être transplantés dans les utérus des bovins, t U2609045 ou d'autres animaux appropriés, à un stade adéquat de l'oestrus. Les procédés de transplantation sont connus

et couramment pratiqués dans le domaine de la transplanta-

tion d'embryons. Un pourcentage de ces transplants initiera des gestations chez des mères porteuses. Des veaux en vie nés de ces gestations, seront identiques génétiquement pour les cellules donneuses qui provenaient

d'un embryon unique ou d'un clone de ce dernier.

Les caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront plus clairement dans les exemples détaillés qui suivent donnés uniquement à titre illustratif et

n'étant pas limitatifs.

Les expériences sont conduites de la façon suivante. Des ovocytes du stade métaphase et des embryons donneurs de bovin de stade plus tardif ont été obtenus à

partir d'oviductes de vaches abattues ayant subi une super-

ovulation ou n'ayant pas subi de superovulation ou encore à partir de génisses à environ 36 à 108 heures après le début de l'oetrus.De préférence, les animaux ont subi une synchronisation pour l'ovulation avec deux injections de cloprosténol sodium (au total 2 cc) ("Estrumate," marque enregistrée de Miles Laboratories, Shawnee, Kansas) et ces animaux ont subi une superovulation avec un traitement

de quatre jours de 40 mg de FSH-P (Schering Corp.) Labora-

tories, Omaha, Nebraska). Les expériences de transplanta-

tion nucléaire ont utilisé des ovocytes receveurs du stade métaphase II qui ont été mis à maturité in vivo ou in vitro, comme receveurs, et des embryons du stade de

2 cellules à 32 cellules,comme donneurs.

Des embryons ont été prélevés et manipulés dans un milieu Tyrodes modifié tamponné TL Hepes préparé selon Bavister et al, "Development of Preimplantation Embryos

of the Golden Hamster in a Defined Culture Medium," Biol.

Reprod., 28:235, 1983). Les embryons ont été placés dans un milieu contenant de la cytochalasine B (7,5 microgrammes/

ml) dix minutes avant et pendant la micromanipulation.

De la démicolcine (0,1 microgramme/ml) a été également ajoutée au milieu. Pour tester les conditions de fusion cellulaire chez les bovins, un petit cytoplaste a été retiré de l'ovocyte receveur, puis réinséré dans l'espace périvitellin. Pour la transplantation nucléaire, des embryons receveurs du stade pronucleus ont d'abord été

centrifugés suivant un procédé selon Wall et al, (Develop-

ment of Porcine Ova that were Centrifuged to Permit

Visualization of Pronuclei and Nuclei," Biol. Reprod.

32:645, 1985) à 15.000 G pendant 3 minutes pour permettre

la visualisation des pronuclei.

Des ovocytes receveurs ont été énucléés par aspira-

tion d'environ la moitié du cytoplasme juxtaposé au corps polaire au moyen d'une pipette de transfert de 25-35 microns,

en laissant ainsi un ovocyte énucléé entouré d'une membrane.

Des noyaux des embryons donneurs d'un stade plus avancé ont été retirés par aspiration du noyau et d'un peu de cytoplasme environnant entouré luimême d'une membrane, à partir d'un blastomère ou par aspiration d'un blastomère entier. La micromanipulation est réalisée en utilisant une pipette de maintien ayant un diamètre externe d'environ microns et un diamètre interne d'environ 30 microns et en utilisant une pipette de transfert et d'énucléation biseautée et affilée ayant un diamètre externe d'environ 25-35 microns. L'ensemble des blastomères, contenant des noyaux, ont été retirés des embryons donneurs et ont été insérés dans l'espace périvitellin des ovocytes receveurs

suivant la méthode de McGrath et Solter-.

Dans ces embryons dans lesquels le développement in vitro devait être surveillé, des embryons ont été placés dans 50 microlitres de gouttes de milieu Tyrodes modifié sous huile paraffine dans 5% de C02 humidifié dans l'air à 97,5 C. Le développement des embryons dans les oviductes de mouton était également surveillé. Des embryons ont été placés dans des blocs d'agar puis transférés dans des oviductes de mouton qui ont été ligaturés au dessus de la jonction des trompes utérines. Cinq jours après le transfert, les

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embryons ont été prélevés et le développement a été évalué. La capacité de développement a été ensuite testée chez deux embryons en les transférant dans une vache receveuse. Un procédé de fusion à partir de virus (en utilisant deux virus différents) et un procédé d'électrofusion ont été testés pour la fusion de cellules d'embryon receveuses et donneuses, préparées comme il est décrit ici. Le virus de Sendai a été mis en croissance et inactivé par le procédé de Giles et Ruddle ("Production of Sendai virus for cell fusion," In vitro 2:103, 1973). Le titre en virus

de Sendai était entre 6.400 et 9.600 unités/ml d'hémo-

agglutination comme testé sur les globules rouges de cochon d'Inde. Ce virus a donné plus de 90% de fusion dans des expériences concomitantes de transplantation nucléaire d'embryons de souris. L'autre virus qui a été testé était le virus I de l'herpès bovin (Souche NYL) obtenu par G. J. Letchworth (Letchworth et LaDue, "Bovine Herpes Mammillitis

in Two New York Dairy Herds," J. Amer. Vet. Med. Assoc.

180:902, 1982). Le virus de l'herpès bovin avait un titre

d'environ 107 TCID50/ml et a été concentré 100 fois.

Ce virus entraîne facilement la fusion cellulaire des cellules en culture du tissu de bovin. Les deux virus

ont été utilisés comme décrit par McGrath et Solter (dé-

crits ci-dessus). En tentant de fusionner des cytoplastes en embryons matures de bovin, aucun succès n'a été obtenu en utilisant des virus de fusion. Par conséquent, tous

les essais futurs de fusion ont été réalisés par électro-

fusion. Deux types de milieux, le Milieu de Fusion TL Hepes

et le Milieu de Fusion Cellulaire Zimmerman (GCA Corpora-

tion, Chicago, IL), ont été comparés pour leur effet sur la vitesse de fusion. Des cellules provenant d'embryons ont été lavées dans le milieu puis placées dans la chambre

de fusion avec le milieu approprié. En suivant le traite-

ment de fusion, des ovocytes ont été placés dans le milieu Tyrodes modifié, dans 50 microlitres de gouttes, sous huile

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paraffine dans 5% de C02 humidifié dans un incubateur

à air, et ont été surveillés périodiquement pour la fusion.

L'activation et la fusion des noyaux intacts, entourés d'une membrane, avec les ovocytes énucléés, ont été réalisées dans un milieu de fusion cellulaire Zimmerman par biélectrophorèse en utilisant un instrument

d'électrofusion Zimmerman, GCA Corporation, Chicago, IL.

La chambre de fusion consistait en deux électrodes

parallèles séparées de 1 mm sur une lame porte-objets.

L'instrument a été réglé selon les conditions suivantes: Voltage de fusion: 100-120 volts (courant continu) Distance entre les électrodes: 1 mm Voltage d'alignement: 1-5 volts (courant alternatif) Fréquence d'alignement: 1.000 KHz Durée de l'impulsion: 10-40 microsecondes Temps d'alignement après la fusion: 5 secondes

L'impulsion d'alignement s'est montrée quasi-

totalement sans succès dans l'alignement de petits blastomères ou de nucléoplastes placés de façon adjacente à la membrane de l'ovocyte receveur dans les cellules de bovin. Par conséquent, l'alignement est en général effectué mécaniquement. Le noyau entouré d'une membrane, c'est-àdire le blastomère ou le nucléoplaste, et l'ovocyte énucléé sont alignés mécaniquement à l'aide d'une pipette de maintien de telle façon que l'impulsion de fusion passe perpendiculairement à travers la jonction située entre la membrane entourant le noyau et la membrane de l'ovocyte énucléé. Les embryons sont ensuite cultivés in vitro pendant 18 à 24 heures dans 50 microlitres de gouttes d'un milieu Tyrodes modifié, puis sont placés dan.s des blocs d'agar pour le transfert vers l'oviducteligaturé

d'une mère receveuse telle que par exemple, une brebis.

EXEMPLE 1

L'effet de l'orientation des cellules sur la vitesse de fusion a été testé au départ sur des embryons de souris à deux cellules. Des noyaux donneurs entourés d'ne membrane et des ovocytes ont été alignés avec une

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impulsion de courant alternatif de 1.000 KHz et jusqu'à volts. En suivant l'alignement, les cellules ont été exposées à une impulsion de fusion en courant continu de volts pendant 20 microsecondes. En fusionnant les cellules de bovin, il a été trouvé que la petite taille de la cellule donneuse ne fournissait pas aux cellules une polarité suffisante pour permettre l'alignement au moyen d'une impulsion en courant alternatif. Donc, les cellules ont été alignées mécaniquement à l'aide d'une

pipette de maintien.

Les conditions testées pour l'électrofusion ont été le type de tampon, le voltage de l'impulsion, la durée de l'impulsion et l'alignement cellulaire. Comme il est illustré dans le Tableau I ci-dessous, le milieu de fusion cellulaire Zimmerman non électrolyte a donné une vitesse de fusion plus grande (8/9; 89%) comparé au milieu TL Hepes (1/9; 11%). Aucune différence évidente n'a été détectée

entre les impulsions de 100 et 120 volts.

TABLEAU 1

Milieu de Voltage de Fusionnées/ % de fusion l'impulsion Total fusion (40 microsecondes) TL Hepes 100V 0/5 0 TL Hepes 120V 1/4 25 Zimmerman 100V 5/5100 Zimmerman 120V 3/4 75 Les durées de l'impulsion de 20 et 40 microsecondes ont donné des vitesses de fusion équivalentes alors que 10 microsecondes n'étaient pas aussi efficaces comme le

montre le Tableau 2.

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TABLEAU 2

Voltage de Durée de Fusionnées/ % fusion-

l'impulsion l'impulsion (psec.) Total nées V 40 p sec 14/18 78 V 20 p sec 15/19 79 lOOV 10 p sec 2/10 20

EXEMPLE 2

Le développement des embryons dans lesquels les pronuclei ont d'abord été retirés et ensuite réinsérés, a été testé in vitro pour analyser la viabilité des embryons de bovin insérés de façon nucléaire. Sur 29 des embryons réinsérés de façon nucléaire, neuf se sont développés jusqu'au stade de 7 à 12 cellules et 6 se sont développés jusqu'au stade de 4 à 6 cellules, et les embryons restants étaient entre le stade 1 à 3 cellules

après une culture in vitro pendant 48 heures.

Puis, des tests ont été effectués sur des trans-

ferts nucléaires réels à partir de cellules d'embryon donneur dans des ovocytes d'un stade pronucleus. Le

Tableau 3, en deux parties ci-dessous, montre le développe-

ment d'un transplant nucléaire, et des embryons témoins après un développement de cinq jours dans un oviducte de mouton. Les embryons témoins consistaient en des embryons récupérés à partir de vaches le même jour et dans la plupart des cas ont été transférés dans l'oviducte

opposé à celui des embryons de transplant nucléaire.

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TABLEAU 3

Nombre Donneur Receveur Nombrede total de Zone nucléaire cytoplasmique transférés récupérés (%) vide(%) Pronucleus Pronucleus 71 38(54) 9(13) Témoin 49 30(61) 0( 0) Stade 2, 4 ou 8 cellules Pronucleus 18 10(56) 3(17) Témoin 23 19(83) 0( 0) ' Stade Stade Stade Stade Morula 1-3 4-6 7-9 10- 16 ou

Donneur Cellules Cellules Cellules Cellules Blasto-

nucléaire (%) (%) (%) (%) cyste(%) Pronucleus 14( 48) 3(10) 3(10) 2( 7) 5(17) Témoin 12( 40) 2( 7) 2( 7) 3(10) 11(37) Stades 2, 4 ou 8 cellules 7(100) 0( 0) 0( 0) 0( 0) 0( 0) Témoin 8( 42) 1( 5) 1( 5) 1( 5) 8(42) (Les pourcentages sont basés sur le nombre d'embryons intacts

récupérés dans les oviductes de mouton).

Des embryons témoins étaient du stade pronucleus au stade à huit cellules et n'étaient pas nécessairement du même stade que des embryons de transplant nucléaire, par conséquent, des comparaisons directes n'ont pas pu être

faites entre les différents stades de cellules atteints.

Cependant, les groupes de témoins ont bien indiqué que des embryons ont survécu et se sont développés après avoir été

récupérés d'animaux abattus, transportés dans des laboratoi-

res et maintenus à température ambiante pendant plusieurs heures. Des embryons du stade pronucleus dans lesquels les noyaux avaient été retirés et réinsérés,se sont également développés en morula et blastocystes dans l'oviducte de mouton. Deux des embryons qui se sont développés à partir d'une réinsertion au stade pronucleus, ont été transférés

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dans une vache receveuse et ont tous les deux conduit à la naissance de veaux normaux. Des embryons dans lesquels des pronuclei ont été remplacés par des noyaux des embryons du stade de 2, 4 ou 8 cellules ne se sont pas développés au delà d'une première et seconde division. Bien que tous les embryons furent enfoncés dans

l'agar, la plupart ont été récupérés sans les blocs d'agar.

Les embryons témoins ont tous été récupérés intacts;

cependant, environ 15% des embryons micromanipulés trans-

férés ont été récupérés avec une zone pellucide vide.

A partir de ces expériences, il a été déterminé que des noyaux pouvaient être retirés des cellules de bovin au stade pronucleus et que de la matière nucléaire pouvait être insérée avec succès. La fusion cellulaire entre des cellules nucléaires et des ovocytes receveurs était possible dans des milieux non ioniques et était optimisée si la limite des membranes entre la cellule

donneuse et l'ovocyte receveur était orientée perpendicu-

lairement à la direction de l'impulsion de fusion

électrique.

EXEMPLE 3

Dans cet exemple, des cellules donneuses ont été sélectionnées pour être des embryons blastula du stade 4 à 32 cellules obtenus à partir d'animaux abattus 2 à 5 jours après l'oestrus. Des ovocytes receveurs ont été aspirés à partir de follicules de 1-5 mm obtenus à partir d'ovaires récupérés dans les abattoirs et mis à maturité in vitro pendant 22 à 26 heures par un procédé

selon Critser et al. ("Influence of Cumulus Cell Associa-

tion During In Vitro Maturation of Bovine Oocytes on Embryonic Development," Biol. of Reprod. 34:Suppl. 1 p. 192 (Abstract NI 286), 1986) , ou des ovocytes mis à maturité in vivo ont été récupérés chez des animaux abattus 36 heures après le début de l'oestrus. Des ovocytes receveurs

ont été dépouillés de leur disque proligère par tourbillon-

nage pendant 10 minutes dans un milieu tamponné TALP-Hepes

contenant 1 mg/ml de hyaluronidase de testicules de bovins.

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Dans le procédé décrit ci-dessus, des ovocytes matures ont été énucléés, en enlevant, dans certains cas, le corps polaire et uniquement le cytoplasme adjacent,

et dans d'autres cas, environ la moitié du cytoplasme.

L'énucléation et le transfert ont été réalisés dans 7,5 microgrammes par millilitre de cytochalasine B. Des blastomères donneurs, avec des noyaux, ont été aspirés à partir des embryons donneurs et injectés dans l'espace périvitellin des ovocytes énucléés receveurs. L'activation et la fusion ont été réalisées par bioélectrophorèse dans un milieu de fusion cellulaire de Zimmerman, dont le procédé a été décrit ci-dessus. Des embryons après la fusion ont été cultivés pendant 16 à 18 heures dans un milieu Tyrodes modifié avant d'être enfoncés dans des plaquettes d'agar et transférés dans l'oviducte

ligaturé d'une brebis.

Après cinq jours de culture in vivo, les embryons ont été récupérés et évalués. L'évaluation des résultats a indiqué une efficacité croissante de la fusion o l'ovocytereceveur avait eu environ la moitié de son cytoplasme retirée et o le blastomère donneur était un

embryon du stade cellulaire de 4 à 16 cellules. L'effi-

cacité de cette combinaison donneur/receveur était de 237 sur 342, ou 69% de fusion réussie. L'efficacité du

développement in vivo jusqu'au stade morula ou blasto-

cyste n'était pas significativement différente selon que l'ovocyte receveur était préparé par l'une ou l'autre des méthodes (3,7% et 1,9%). Cependant, le développement jusqu'au stade morula ou stade blastocyste était meilleur pour des ovocytes mis à maturité in vivo (27%) comparé à des ovocytes mis à maturité in vitro (1,9%) même lorsque

ces ovocytes avaient eu environ la moitié de leur cyto-

plasme retirée. Apparemment, les ovocytes mis à maturité in vitro n'ont pas mûri correctement. Les embryons qui se sont développés jusqu'au stade morula ou blastocyste sont apparus normaux dans leur développement. Quatorze des embryons du stade morula ou blastula ont été transplantés de façon non chirurgicale dans des utérus de bovins à un stade approprié de l'oestrus comme il est couramment opéré avec des transplants d'embryons. Des gestations ont été initiées dans le cas de quatre embryons, et ont été réalisées dans trois vaches porteuses. Deux d'entre elles ont donné naissance à des veaux normaux. Les deux embryons restants ont avorté entre le 25ème jour et le

ème jour de la gestation.

A partir de cet exemple, il apparaît que le trans-

fert des noyaux des cellules d'embryon donneur à un stade de 4 à 16 cellules dans des ovocytes receveurs peut entraîner la création d'embryons viables et, par la suite, peut entraîner des naissances. Ces résultats suggèrent que le transfert nucléaire peut être utilisé pour multiplier des embryons identiques génétiquement de façon à ce que la production de troupeaux de bovins identiques

génétiquement devienne possible.

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Claims (7)

R E V E N D I C A T I 0 N S

1.- Procédé pour transplanter un noyau à partir d'un embryon de bovin donneur dans un ovocyte receveur comprenant les étapes suivantes: (a) isoler un noyau entouré d'une membrane à partir d'une cellule de l'embryon donneur; (b) retirer le matériel chromosomique nucléaire de l'ovocyte receveur (pour préparer un ovocyte énucléé receveur); (c) placer le noyau donneur entouré d'une membrane ayant sa membrane adjacente à celle de l'ovocyte énucléé receveur; et (d) fusionner électriquement les membranes du noyau entouré d'une membrane et de l'ovocyte énucléé receveur pour former une cellule unique embryonnaire avec un noyau provenant

de l'embryon donneur.

2.- Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le noyau entouré d'une membrane est un blastomère entier ou un nucléoplaste aspiré à partir d'un blastomère. 3.- Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend de plus avant l'étape (d), l'étape d'orienter le noyau entouré d'une membrane et l'ovocyte énucléé receveur de telle façon que le plan de contact de leurs membranessoit perpendiculaire à la direction du courant

électrique de l'étape (d).

4.- Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'ovocyte receveur est un ovocyte du stade

de métaphase II.

5.- Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'avant l'étape (d), ledit noyau donneur entouré d'une membrane et ledit ovocyte énucléé receveur sont

placés dans un milieu de fusion cellulaire non ionique.

21 - u2609045 6.- Embryon de bovin produit par un procédé de

transfert nucléaire selon la revendication 1.

7.- Procédé pour produire des embryons de bovin clones comprenant les étapes de: (a) isoler un noyau, entouré par une membrane, à partir d'une cellule unique d'un embryon multicellulaire donneur de bovin; (b) énucléer un ovocyte receveur; (c) introduire le noyau donneur entouré d'une membrane dans l'espace périvitellin de l'ovocyte énucléé receveur; (d) induire électriquement la fusion cellulaire entre la membrane entourant le noyau donneur et l'ovocyte énucléé receveur; (e) cultiver in vitro l'embryon fusionné induit électriquement obtenu à l'étape (d); et (f) transférer l'embryon cultivé de l'étape (e)

dans l'oviducted'une mère animale porteuse.

8.- Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que l'étape (a) comprend le retrait d'un blastomère

unique à partir de l'embryon donneur avec tout le blasto-

mère servant comme noyau donneur entouré d'une membrane ou l'aspiration d'un nucléoplaste entouré d'une membrane contenant un noyau à partir d'une cellule d'un embryon

donneur.

9.- Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce qu'avant l'étape (d), le noyau entouré d'une membrane et l'ovocyte sont orientés avec le plan de contact de leurs membranes dans une orientation sélectionnée de telle façon que l'impulsion de fusion électrique de l'étape (d) est appliquée perpendiculairement à la direction de ce plan de contact. 10.Embryons de bovin clones obtenus par le

procédé selon la revendication 7.