JPS63287489A - 組換えｄｎａ、その製法、真核性又は原核性代謝産物及び遺伝子工学的に製造した蛋白質の獲得法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分舒〕 本発明は、組換えＤＮＡ　％その製法及びこれｔ真核性
又は原核性代謝産物又は遺伝子工業的に製造した蛋白質
全書るために使用することに関する。　゛ 〔従来の技術〕 代謝産物及び蛋白質の遺伝子工学的製造の重要性は近年
とみに高１ってきている。従来は非常に煩雑な方法でか
つ少量で車端可能な、従って高価な物質例えばインター
フェロン、インク−ロイキン（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ
　）、インシュリン等を大工業的規模で製造して医薬に
使用することができるにすぎなかった。しかし使用セル
ライン中でこの檀の物質を製造した後に、これらの単離
は部分的に非常に費用がかかる。それというのも生成し
た物質を遊離するためには細胞を先ず破壊せねばならず
、次いで培地から精製する必要があり、その際会ての細
胞断片及び細胞成分？＋離せねばならないからである。

この細胞のｆｉｌ！ｌ１１いわゆる溶解（Ｌｙｓｉｓ　
）　ｕ多くノ方法で＊ｍすることができる。すなわち溶
解作用を有する酵素、例えばリソチーム全使用すること
ができるし、又は細胞を浸透圧の適用によってか又は超
音波又はその他の生化学的又に物理的方法はよって分解
することができる。

しかし特定の幌の特異的な溶解又は部分的に透過性にし
た膜からの物質の流出（Ａ＋、ｐｓｃｈｌｅｕｓｕｎｇ
）が有利であろうし、その際物質の製造を連続的に続行
することが可能になるであろう。

従って遺伝子工学的に製造した生成物を流出又は細胞の
溶解によって獲得するために、付加的に特定の膜に対す
る４？異性を有するか又は相応する生成物に特異的な細
胞１を透過性にすることによって流出を可能にする、で
きるだけ強力な８解作用を有する蛋白質を使用するのが
非常に有利でちる。同様にこの種の溶解作用を有する蛋
白質を細胞の外から供給する必要がなく、既 この蛋白質１ｆｔ即に細胞中で所望の時点で生成しつる
のが有利であろう。

〔発明が解決しようとする課題〕

従って本発明の課題は、これらの要求をみたす蛋白質を
コードする組換えＤＮＡを開発することであシ、その使
用によって遺伝子工学的にｌ遺された生成物の獲得が容
易になる。

〔課題を解決するための手段〕

列及びＭＳ２ファージのＬ蛋白質のＣ末端膜透過性ドメ
インをコードするＤＮＡ配列を有し、２つのファージの
ＤＮＡ配列が親水性のフレキシデルなアミノ酸配列をニ
ーｒするＤＮＡ配列によって結合していることを特徴と
する組換えＤＮＡによって解決される。

一本鎖ＤＮＡ　−ファージφＸ１７４及び一本鏑ＭＡ−
ファージＭＳ２は、各々ファージコードされた酵解性蛋
白質、すなわちＥ蛋白質（φＸ１７４）及びＬ蛋白質（
ＭＢ２）？！−含有する。

これら２種類の溶解性蛋白質は比較的小さく、その全ア
ミノ酸配列で公知である。このアミノ酸配列を第２図に
表す。これからＥ蛋白質がアミノ酸９１個の長さであシ
、Ｌ蛋白質がアミノ酸７５個の長さである。しかし２種
類の溶解作用を有する蛋白質は酵素活性を有しない。従
ってこれらの蛋白質は嘆の６解を自己溶解工程と関連し
た膜構造の破壊によって生じると考えられる・溶解活性
は、プレシー（Ｂｌに１３１　）及びルビツツ（Ｌｕｂ
ｉｔｚ　）　Ｊ、　Ｇｅｎ、　Ｖｉｒｏｌ、　６６　：
１２０９〜１２１３（１９８５）及びシューラ−（８ｃ
ｈｕｌｌｅｒ　）　Ａ、その他Ｎｕｃ１．　Ａｃ１ｄｓ
　Ｒｅｓ。

１５：４１４３〜４１５３（１９８５）膜透過性のＮ末
端部位のＥ−蛋白質に１１シて記載している・更にマラ
テア（Ｍａｒａｔｅａ　）その他Ｇｏｎｅ４０　：　３
９〜６４（１９８５）及び／ｆツクレイ（Ｂｕｃｋｌｅ
ｙ　）及びハヤシ（Ｈａｙａａｈｉ　）　Ｍｏｌ。

Ｇｏｎｏ、　Ｇｅｎｅｔ、、　２０４　：　１２０〜１
２５　（１９８６）により確認されたように、この機能
性のためには、蛋白質のＣ末端部にオリ♂マー化作用を
有する構造の存在が必要であると考えられる。コンぎニ
ーター計算から出された蛋白質構造の予想から、Ｌ蛋白
質に関しては逆の作用方向が考えられる。従って溶解活
性に作用するドメインはＬ蛋白質のＣ末端部に限定され
る〔バーク７−ト（Ｂｅｒｋｈｏｕｔ　）その他、Ｇｅ
ｎ　３７　：　１７１〜１７９（１９８５））。

本発明による組換えＤＮＡは、Ｅ蛋白質のＮ末端の単独
では溶解作用を有さない部分及びＬ蛋白質の同じく単独
では溶解作用含有さないＣ末端膜透過性部分から成る融
合蛋白賞金製造することを可能にし、これは融合蛋白質
として（その際２つのファーソーＤＮＡ配列は親水性の
フレキシゾルなアミノ酸配列によって結合している）出
発蛋白質自体より著しく強力な溶解活性を有する。

本発明の有利な態様は、特許請求の範囲に記載しである
。特に有利な組換えＤＮＡは、φＸ１７４ファージのＥ
蛋白質の１〜５４のアミノ酸をコードするＤＮλ配列及
びＭＳ２ファージのＬｆｆｌ白質の２１〜７５のアミノ
酸をコードするＤＮＡ配列を有し、その際これらのＤＮ
Ａ配列は５個のリンカーアずノｆｉｋコードするその他
のＤＮＡ配列によって結合している。

特に有利には組換えＤＮＡは、Ｗ、１図に記載されてい
るように、アミノ酸鎖をコードするＤＮＡ配列を有する
◎ この櫨の組換えＤＮＡはベクター中に組込まれて存在し
てよい。その際ベクターとして有利にはプラスミド又は
ファージｒツム°を使用する。

有利にはファーシーＤＮＡ−配列の前に、組換えＤＮＡ
の発現を制御するプロモーターが存在する。

その際プロモーターとしては原核性又は真核性のプロそ
一ター、特にｖ４整可能なプロモーターが好適である。

ラムダ−ゾロ％−タ＋、ｌａｃ″″ゾロそ一ター又はＧ
ａｌ　１０−プロモーターが有利である。

本発明のもう１つの目的物は、ファージ配列の前に付加
的にジグ′ナル配列をコードするＤＮＡ配列を有する組
換えＤＮＡである。表出される蛋白質中にシグナル配列
が存在することによって、これに特定の嗅に対する特異
性を伝達することができる。

本発明のもう１つの目的物は、第１図に記載されている
ようなアミノ酸配列をコードする組換えＤＮＡを有する
ことｔ特徴とするシラスミドｐＲＭ１７、ＤＡＭ　４０
９２　Ｐである。

本発明による組換えＤＮＡ　’ｉ製造するための本発明
による方法は、自体公知の方法で相応するＤＮＡ　配列
ｆ：φｘ１７４ファージの二本鎖ＤＮＡ形及びＭＢ２　
　ＭＡファージのＤＮＡ−コピーから単離し、相互に所
望の順序で連結することｔ特徴とする。

このようにして製造した組換えＤＮＡを次いでベクター
に挿入するが、その際ベクターとしては有利にはシラス
ミド又はファージグツムを使用する。更にベクター中に
ファーシーＤＮＡ−配列の前に付加的に真核性又は原核
性のデーモーターを挿入するのが有利である。特に有利
にはその制御下に異種遺伝子を表出することができるプ
ロモーターを即に含有するベクターを使用する。

組換えＤＮＡ　を製造する場合にファーシーＤＮＡ−配
列の面に付加的にシグナル配列をコードするＤＮＡ配列
を挿入するのが有利である。

シラスミドｐＲＭ１７、Ｄ８Ｍ　４０９２　Ｐは、第４
図によるオリ？ヌクレオチドｔ　Ｘｂａ　Ｉ　／　Ｈ１
ｎｄ■で切断し九ゾ２スミドｐｓＵ７２９　（Ｎｕｃｌ
。

Ａｃ１ｄｓ　ｌｊ＋ｅ＋ｍｓ　１５巻、４１４５〜４１
５３頁、１９８５年）中に挿入することによって製造さ
れるが、その際前以ってプラスミドｐ８Ｕ７２９のｘｂ
ａ　Ｉ位’ｒｌｌＪ以ってＤＮＡ−ポリメラーゼｌ（ク
レノウ−７ラグメｙ　）　（Ｋｌｅｎｏｖ−Ｆｒａｇｍ
ｅｎｔ））でふさぐ。

本発明のもう１つの目的は、真核性又は原核性代諸産物
又は遺伝子工学的に製造した蛋白質を、組換えＤＮＡに
よりコードされる溶解性蛋白質の発現によって発現のた
めに使用された細胞又は微生物の膜又は細胞壁を部分的
又は完全に溶解することによって獲得するために、組換
えＤＮＡ又はシラスミドｐＲＭ１７、ＤｓＭ４０９２　
Ｐを使用することである。

その際有利には溶解性蛋白質の発現は、調整可能なプロ
モーターの制御下に所望の時点で惹起されろ。これは、
細胞を先ず特定の生育相まで成育させることを可能にし
、それによって所望の代謝産物又は遺伝子工学的に製造
した蛋白質の製造をできる限）有効に、溶解性蛋白質の
発現を惹起する仁とくよって細胞Ｉｌ七部分的にか又は
完全に溶解する前に、実施することができ、それによっ
て所望の生成物を培地に到達させることができ、そこか
ら所望の生成物を難なく単離することができる。

プロモーターとしては原則的には全ての誘導可能な（制
御可能な）デーモーターが好適である。このための例は
リプレッサーとしてＣ１８５７を有するプロモーターλ
ＰＩ、又はλＰＲＣＧｅ！１Ｌ１３５巻（１９７９年）
５９〕及びリプレッサーとしてＬａｃ　■Ｑ又はＬａｃ
　！Ｑ”を有するプロモーター−オペレーター一部分Ｌ
ａｃ　ＰＯ（Ｍｏ１．−Ｇｅｎ。

Ｇｏｎｅｔ、　１８５善（１９８２年）４９３〜４９７
〕である。

（に溶解性蛋白質中のシグナル配列の存在によって特定
の膜の特異的な溶解が達成される。

これによって特に小器官膜（Ｏｒｇａｎｅｌｌｅｎｍｅ
ｍ−ｂｒａｎ　）　、例えばリソソーム、ミトコンドリ
ア又は葉緑体の溶解も惹起しうる。その際溶解性の融合
蛋白質のＮ末端部の前に、特定の模に特異的であり丁度
この膜への融合蛋白質の組込みを惹起するそれ自体公知
のシグナル配列が付加される。

特定の特異的な膜のごく部分的な溶解によって、代ｍ産
物又に蛋白質の流出が達成され、それによって生成され
る細胞を殺す必要なしに連続的に製造を続行することが
可能である。次いで製造された代浦曜物を成育培地から
簡単に単離することができ、煩雑な細胞成分の分離はも
はや必要ではない。

次に添付図面につき本発明を詳説する：第１図：　Ｅ−
Ｌ−ハイブリッド蛋白質のアミノ酸配列。

第２図：φＸ１７４ファージのＥ蛋白質及びＭＳ２ファ
ージのＬ蛋白質のアミノ酸配列。

第３図ニブラスミドル９Ｂ１２（−鵠、φｘ１７４遺伝
子Ｅ遺伝子部１．１７　（←→；ＭＳ２−遺伝子Ｌ）、
ｐＲＭ　１７７　（ト４へｌ；組換え＋１１−　Ｌ−遺
伝子）、ｐ８Ｕ　７３０−１　（０−Ｏｐ組換えＥ−り
一遺伝子のＥサブユニット）及びｐＲＭ１９（０−０；
組換えＢ−Ｌ−遺伝子のＬサブユニット）の発現下のＥ
・コリー株に１２、ＰＣ２４７９、ＤＡＭ　４０８９の
成★ 第４図：遺伝子ｍ−Ｌ（ｐＲＭ１７）又は短縮遺伝子り
中の遺伝子−り一部分配列のオリがヌクレオチド配列。

次に実施例につ竜本発明を詳説する。

例　　１ ｐ囮１７の製造 シラスミドｐＲＭ　１７のキメ２遺伝子！−Ｌは、ＭＳ
２ファージの遺伝子りのアミノ酸コドン２１〜７５に：
相応する〔プレマント（Ｂｅｒｅｍａｎｌ）、Ｍ、Ｎ、
　＆　Ｔ、デル−メンタール（Ｂｌｕｍｅｎｔｈａｌ　
）、１９７９Ｃｅ１１１８：２５７〜２６６］オリゴヌ
クレオチド配列（遺伝子−Ｌ一部分配列、第４図）を、
シラスミドｐ８υ７２９の充填したＸｂａ　を部位に挿
入することによって得られる。

この配列の５／　ＧはＭＳ２バクテリオファージの配列
のヌクレオチド１７３６に相応し、３′Ａはヌクレオチ
ド１９０５−に相応する［フィールス（Ｆｉｅｒｓ　）
その他、１９７６、ネイチャー（Ｎａｔｕｒ＠　）　２
６０巻、５００〜５０７］。このシラｘ（ド（ｐ８ｔＪ
　７２９　）は、Ｐｈ１Ｘ　１７４部分配列ｎｔ　４４
７〜７２９　ｋシラスミ）”ｐＥＩｏｌＦ）　ＥｅＯＲ
Ｉ　／　８ｍａ　１部に挿入することによって構成され
た（シエーラーその他、１９８５、Ｎｕｃｌ。

Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　　ｉ　　３．４１４３〜４１５
３）、ｐＲＭ１７中のオリゴヌクレオチド配列の配向け
、このシラスミド上に含有されるＰｈ１Ｘ　１７４遺伝
子Ｅ部分配列（コドン１−５４）に相応する５′−３′
である。遺伝子Ｅ部分配列と遺伝子り部分配列間のポＩ
Ｊ　リンカ−配列は、 ５’　　ＧＧＧ　　ＧＡＴ　　ＣＣＴ　　ＣＴＡ　　Ｇ
５’（）　　　Ｄ　　　Ｐ　　　Ｌ　　（Ｇ）に相応す
る。

例　　２ ｐＲＭ　Ｉ　Ｂの製造 オリゴヌクレオチド配列（遺伝子−り一部分配列、第４
図）とシラスミドｐＰＬｃＡＴ　１０の充填Ｂａｎ　Ｈ
Ｉ位に挿入することによって〔スタンセｙ　ス（５ｔａ
ｎＳ８ｅｎＳ　）その他１９８５、Ｇｅｎｅ３６．２１
１〜２２３〕シラスミドｐＲＭ　１８が得られる＠ｐＲ
Ｍ　１８中のオリゴヌクレオチドの配向は、シラスミド
上に含有されるソボソーム結合部位及びＡＴＧ開始コド
ンのＢａｍ　ＨＩ部位のぎ位に相応する５’　−３’で
ある。短縮されたＬ蛋白質に寄与し、遺伝子−Ｌ一部分
フラグメントのオリゴヌクレオチド配列の前に存在する
シラスミド配列は、 ５’　　ＡＴ（）　　ＧＡＴ　　Ｃ５’Ｍ　　　Ｄ　　
（Ｒ） である。

例　　３ シラスミドコードされたＥ−１Ｌ−及びＥ−Ｉ。

−蛋白質によるＥ・コリー細胞の溶解 溶解作用を有するＥ％Ｌ蛋白質及び本発明による組換え
ＤＮＡから製造し九Ｅ−Ｌ−蛋白質によるＥ・コリー細
胞の溶解ｉ、Ｅ−：ｙリー株に１２　　ｐｃ２４７９、
Ｄ８Ｍ　４０８９で調べた。

その際本発明によるシラスミドｐＲＭ　１７　、ＤＳＭ
４０９２Ｆ以外に、シラスミドｐ８Ｂ　１２　、Ｄ８Ｍ
４０９１　Ｐ（これはφＸ１７４遺伝子Ｅを有する）〔
ジャーナル　オデ　ジェネラル　ミクロバイオロジー（
Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｍｉｃｒｏｂ
ｉ−ｏｌｏｇｙ　）　１３１巻（１９８５）、１１０７
〜１１１４）、プラスミドｐＭＳ　１．１７、ＤＡＭ　
４０９４Ｐ（これはＭＢ２−遺伝子りを有する）〔ネイ
チャー３０５巻（１９８３）７４１〜７４３頁〕、７°
２スミドｐ８７１７３０−１　、ＤＳＭ　４０９５　ｐ
（これは本発明による組換え遺伝子のＥサブユニットを
有する）　ＣＮｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１５
巻（１９８５）４１４３−４１５３）反びシラスミドＩ
）ＲＭ１８、ＤＳＭ　４０９３　Ｐ　（これは組換えＥ
−Ｌ−遺伝子のＬ　−ＤＮＡ−サブユニットを有する）
を使用した。その際シラスミドコードさ８５７、Ｇｅｎ
ｅ　５巻（１９７９年）５９ｍ照〕。

シラスミドの表現を惹起するために代数的に生育する培
養の成育温度’に２８℃８℃カミ２℃に高めた。培養の
成育ｉ”　５８０　ｎｍでスペクトル分光光度法により
行った。この実験の結果１制３図に示す。その際０分の
時点で温度は２８℃から４２℃への上昇を示す。

【図面の簡単な説明】

第１図はＥ−Ｌ−ハイブリッド蛋白質のアミノ酸配列で
示す図、第２図はφｘ１７４ファージのＥ蛋白質及びＭ
Ｓ２ファージのＬ蛋白質のアミノ酸配列を示す図、纂３
図はプラスミドｐ８Ｂ　１２　（Ｊｈ−４、φＸ１７４
遺伝子”　）　、ｐＭＢｌ、１７（・−・；ＭＢ２−遺
伝子Ｌ）、ｐＲＭ１７ｙ／（Ｈ；組換えＥ−Ｌ−遺伝子
）、ｐ８Ｕ７３０１（ｏ−４８組換えｇ−Ｌ−遺伝子の
Ｅ−サブユニット）及びｐＲＭ１８（Ｏ−Ｏ；組換えＥ
−Ｌ−遺伝子のＬ−サブユニット）の発現下のＥ−コリ
ー株に１２、ＰＣ２４７９、Ｄ８Ｍ４０８９の成育を示
す図、第４図は、遺伝子Ｅ−Ｌ　（Ｊ）ＲＭ　１７　）
又は短縮遺伝子Ｌ　（ｐＲＭ　１８　）の遺伝子り部分
配列のオリがヌクレオチド配列會示す図である。 （五≦ ＦＩＧ、３ 時間（分）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、φＸ１７４ファージのＥ−蛋白質のＮ末端膜透過性
   ドメインをコードするＤＮＡ配列及びＭＳ２ファージの
   Ｌ−蛋白質のＣ末端膜透過性ドメインをコードするＤＮ
   Ａ配列を有し、両方のファージのＤＮＡ配列が親水性の
   フレキシブルなアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列に
   より結合していることを特徴とする、組換えＤＮＡ。 ２、φＸ１７４ファージのＥ−蛋白質のアミノ酸１〜５
   ４をコードするＤＮＡ配列、ＭＳ２ファージのＬ蛋白質
   のアミノ酸２１〜７５をコードするＤＮＡ配列を有し、
   これらのＤＮＡ配列が５つのリンカーアミノ酸をコード
   するＤＮＡ配列によって結合していることを特徴とする
   請求項１記載の組換えＤＮＡ。 ３、【遺伝子配列があります】、で示 されるアミノ配列をコードするＤＮＡ配列を有すること
   を特徴とする請求項１及び２のいずれか１項に記載の組
   換えＤＮＡ。 ４、ベクターに組込まれて存在することを特徴とする請
   求項１から３までのいずれか１項に記載の組換えＤＮＡ
   。 ５、ベクターがプラスミド又はファージゲノムであるこ
   とを特徴とする請求項４に記載の組換えＤＮＡ。 ６、ファージ−ＤＮＡ−配列の前に原核性又は真核性の
   プロモーター、特に表現を制御する調整可能なプロモー
   ターを有することを特徴とする、請求項１から５までの
   いずれか１項に記載の組換えＤＮＡ。 ７、プロモーターがラムダ−プロモーター、ｌａｃ−プ
   ロモーター又はＧａｌ１０−プロモーターであることを
   特徴とする請求項６に記載の組換えＤＮＡ。 ８、ファージ配列の前に付加的にシグナル配列をコード
   するＤＮＡ配列を含有する請求項１から７までのいずれ
   か１項に記載の組換えＤＮＡ。 ９、請求項３項による組換えＤＮＡを有することを特徴
   とするプラスミドｐＲＭ１７、ＤＳＭ４０９２Ｐ。 １０、公知方法により相応するＤＮＡ配列をφＸ１７４
   ファージの二本鎖ＤＮＡ形及びＭＳ２ＲＮＡファージの
   ＤＮＡコピーから単離し、相互に所望の順序で連結させ
   ることを特徴とする請求項１から３項までのいずれか１
   項に記載の組換えＤＮＡの製法。 １１、請求項１０により単離し、連結したＤＮＡ配列を
   ベクターに挿入することを特徴とする請求項４及び５に
   記載の組換えＤＮＡの製法。 １２、ベクターとしてプラスミド又はファージにノムを
   使用することを特徴とする請求項１１に記載の方法。 １３、ベクターにファージ−ＤＮＡ−配列の前に付加的
   に真核性又は原核性のプロモーターを挿入することを特
   徴とする。請求項６に記載の組換えＤＮＡの製法。 １４、その制御下に異種の遺伝子を表現することができ
   るプロモーターを既に有するベクターを使用することを
   特徴とする請求項１３に記載の方法。 １５、ファージ−ＤＮＡ−配列の前にシグナル配列をコ
   ードするＤＮＡ配列を挿入することを特徴とする請求項
   ８に記載の組換えＤＮＡの製法。 １６、真核性又は原核性の代謝産物又は遺伝子工学的に
   製造した蛋白質を、組換えＤＮＡによりコードされる溶
   解性蛋白質の発現により発現に使用される細胞又は微生
   物の細胞壁の部分的又は完全な溶解によって獲得するた
   めに、請求項１から８までのいずれか１項記載の組換え
   ＤＮＡ及び請求項９に記載のプラスミドｐＲＭ１７、Ｄ
   ＳＭ４０９２Ｒを使用することを特徴とする、真核性又
   は原核性の代謝産物及び遺伝子工学的に製造した蛋白質
   の獲得法。 １７、溶解性蛋白質の発現を調整可能なプロモーターの
   制御下に所望の時点で惹起することを特徴とする、請求
   項１６に記載の方法。 １８、シグナル配列の存在によって特定の膜の特異的な
   溶解を達成することを特徴とする請求項１６及び１７の
   いずれか１項に記載の方法。 １９、小器官膜の溶解を生じることを特徴とする請求項
   １８に記載の方法。