JPS60500701A - 変形されたシグナルペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 この発明は分子生物学に関し、そしてさらに詳しくは組換ＤＮＡの分野に関する 。この発明は特に、変形されたシグナルペプチドの製造方法、及び形質転換され た宿主により生産される外来１ｑ遺伝子生成物の分泌を増加するために有用な変 形されたシグナルペプチドに関する。この発明はさらに、組換ＤＮＡ　ｈａ列を 生体内で造成する方法に関する。

背景技術 蛋白質の合成は細胞内で行われるが、ある種の蛋白′Ｉヶは細胞外で機能する。

こえしらの細胞ｌ／Ｉ蛋白Ｔ［は分泌さハるｉＨ白質と狩＼される。分泌される 蛋白質の多くはまず細胞内で前駆体又はプレー蛋白質の形で発現される。これら のプレー蛋白質は、シグナル配列又はリーダー配列（あるいはシグナルペプチド ）と称される付加されたアミノ末端延長部を含有する。

シグナル配列は、制限的な細胞膜への、及び／又はそれを通しての付加されたペ プチドの輸送において本質角な役割を演する。

シグナル配列をコードするＤＮＡは、組換発現ベクターに導入することができる 。このようなベクターを使用して適合性の宿主生物を形質転換し、該宿主２ 生物に外来性遺伝子生成物を生産せしめることができる。細菌は化学的に明瞭な 培地において比較的容易に増殖することができるため、宿主生物としてしばしば 細菌が使用される。この生物の増殖は急速であり、そして生成物を高収量で得る ことができる。

所望の遺伝子生成物を生産するために適当な宿主細菌が形質転換された場合、こ れらの遺伝子生成物が−くリプラズム空間又は培地中に分泌されるのであれば、 これらの遺伝子生成物を容易に検出し、そして精製することができる。所望の遺 伝子生成物が培地中に分泌されることにより、該生成物を回収するために宿主生 物を破壊する必要性が回避される。さらに、幾つかの外来性遺伝子生成物は宿主 生成に対して毒性効果を有する。このような遺伝子生成物が宿主中に蓄積される のではなく分離されれば、こルらの生成物が正常な細胞機能を妨害することはな いであろう。

ある場合には、シグナル配列は分泌中又は分泌後に蛋白質分解的に切断されて成 熟蛋白質生成物が生じ、この生成物はこれが通過する制限的細胞膜から離れる。

他の場合には、シグナル配列はやはシ切断されるが、成熟蛋白質のアミン末端へ の脂質の共有結合を導く変形がさらに生ずるため、成熟蛋白質はす（Ｅｓｃｈｅ ｒｉｃｈａ　ｃｏｌｔ　）リポ蛋白質がこのような膜結合蛋白質の例であｆｉ、 Ｅ、コリβ−ラクタマーゼがシグナル配列の切断後膜から離れる蛋白質の例であ る。この結果、成熟β−ラクタマーゼはＥ、コリベリプラズマ空間に分泌される 。このような分泌された蛋白質はエキソプロティンと称される。しかしながら他 の蛋白質、例えばこの明細書においてベニシリナーゼとも称するパシルス・リケ ニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ　）β−ラクタマ ーゼはプロセシングされて２つの異る成熟蛋白質に彦ることができ、その一方は 分離されるエキソプロティン形であシ、他方は膜結合リポ蛋白質形である。被ニ シリナーゼのリポ蛋白質形においては、Ｋニンリナーゼシグナル配列の３４アミ ノ酸中最初の２６アミノ酸がシグナルペプチドの実際の輸送部分のようである。

残りの８アミノ酸の幾つか又はすべてが、１ゾグナルベプテドの輸送部分のカル ボキシ末端アミノ酸の幾つかと共に、＋）　ｙｌ’！蛋白質形の形成に関与する ようである。

完全には理解されていないが、成熟蛋白質（リポ蛋白質、形）が細胞膜に結合す る機作は、シグナルペプチド内又はその近傍に位置する部位における脂質結合の 形成を含むよってある。脂質の結合が蛋白質を細胞膜内に係留するようである。

シグナル配列と、膜結合形を形成することができる成熟蛋白質との連結領域にあ る特定のアミノ酸配列が、膜結合リポ蛋白質の形成を導く化学的変形に関与する 細胞物質のだめの認識部位として機能すると信じられる。これらの特定の化学的 変形は、脂肪酸とシグナル配列部分との共有結合を含むと考えられる。ペリプラ ズム空間又は増殖培地中に分泌される非結合エキソゾロティンの量が増加するよ うに認識配列を変形するととができれば、ある場合には、リポ蛋白質の形成を促 進することができるシグナル配列の有用性を改良することができよう。このよう な変形されたシグナル配列は、言う寸でもなく、形成される膜、結合す号？蛋白 質の量の減少を導くであろう。

発明の開示 この発明は、細菌蛋白質又はさらに−１投的には組換ＤＮＡ配列を用いる形質転 換によって合成される外来性（プチドを生産する細菌宿主によるある■のにプチ ドの分泌の効率を改良することを目的とする。

これら所望の蛋白質と連結されているシグナルペプチドのための野性型コード配 列を変形することによって、これらの蛋白質を細胞質膜を通して培地へ（グラム 陽性細菌の場合）又はペリプラズム空間へ、そしである場合には培地へ（グラム 陰性細菌の場合）ノ輸送におけるシグナルペプチドの効率を増強することができ た。天然においては、細胞蛋白質を膜に輸送することができ、そして該蛋白質が 該膜にリポ蛋白質として結合するのを促進する野性型のシグナル配列が用いられ る。所望の蛋白質を膜に輸送するシグナルペプチドの能力を維持しながら膜結合 を促進する能力を阻害することによって、このシグナルペプチドを、分泌におい て一層効率的に用いることができる。

従って、一つの観点においてこの発明は、改良された新規な「エキソ−シグナル 」ベゾチドをコートゞするＤＮＡ配列に関し、該エギソーングナルにゾチドは対 応する野性型シグナルペプチドのシスティン残基の代りにアミノ酸Ｘを含有する アミノ酸配列を有し、該野性型シグナルペプチドは（ａ）膜結合リポ蛋白質を形 成することができ、そして（ｂ）１個のシスティンを含む促進領域を含有し、Ｘ は膜結合リポ蛋白質の形成のために機能せず、そしてＸによシ置き換えられるシ スティンは（ｂ）の促進領域中のシスティンである。

他の観点においてこの発明は、エキソーシグナルベ′プチドに機能的に連結され た所望の蛋白質を含んで成る融合ペプチドをコードするＤＮＡ配列、該融合にゾ テドを生産することができる発現ベクター、該ベクターによシ形質転換された細 胞、並びに該形質６ 転換された細胞を培養することにより生産されるエキソ−シグナルペプチド及び 融合啄プチドに関する。

この発明はさらに、コード配列、ベクター及び形質転換された生物を用いること により分泌を改良する方法、並びに生体内組換によりＤＮＡ配列を変形するだめ の新規な方法に関する。

図面の簡単な説明 第１図は、システィン２７からセリン、７への変異の造成を示すコドンの図解で あシ； 第２図は、ｐｅｎｌＦノロモーター及び／グナル配列に接する便利な制限酵素部 位を、５°する一群のプラ５スミドのヌクレオチドの図解であり； 第：３図は、ヘテロがイユゾレ、クス形成及び生体内組換によるｐＳＹＣ７４８ の造成を示すコドンの図解であり： 第４図は、シラスミドｐｓＹｃ７０９の適切々様子を示し： 第５図は、所望の蛋白質として±ｎＰ成熟蛋白質（大エキノペニシリナーゼ）の コード配列を含有するこの発明のベクターに対応するコドン及びアミノ酸配列を 示し；そして 第６図は、所望の蛋白質としてｈＧＨ成熟蛋白質のコード配列を含有するこの発 明のベクターに対応するコドン及びアミノ酸配列を示す。

発明の実施の態様 この明細書において、シグナルペプチド、リーダーペプチド、シグナル配列、及 びリーダー配列なるるアミン末端蛋白質延長部を意味する。

一般に、この配列は親水性の幾分荷電したＮ末端アミノ酸配列、及びそｆｌ、　 Ｋ続＜１０〜２５個のほとんどが中性で疎水性のアミノ酸からなる「疎水性コア ー」、及び場合によっては追加のカルｉｌ？ギシ末端配列であって分泌されるべ き蛋白質に連結されているものにより特徴付けらＩｌ、る。疎水性コアーのＣ末 端に近いアミノ酸及び疎水性コアー内のアミノ酸の短い連鎖が、リボ蛋白質の膜 への結合の促進に関与しているようである。この発明の「エキンーシグナル」ペ プチドにおける置き換えられるシスティンはこの「促進配列」中のものであシ、 野性型シグナル配列中の他のシスティン残基は、この発明の「エキソ−シグナル 」ペプチドにおいて置き換えられる必要がない。

所望の蛋白質の分泌は、該蛋白質のＮ末端に隣接する部位における８切断を必要 とする。この切断はアラニン残基の次で生ずると一般に信じられており、そして 確かに、切断のためにアラニン残基の存在が必要でちると信じられる。しかしな がら、このことは証明されておらず、そしてこの発明のエキソ−シグナルペプチ ドにおいては、所望の蛋白質のＮ末端近くでの効果的な切断を許容する任意のア ミノ酸配列を使用することができる。

「エキソ−シグナルにプチド」（又はエキソ−シグナル配列）は　、＋０１Ｊペ プチド又は蛋白質の分泌を行うことができ、このカル７１？キン末端からの延長 部を４’ｆ’７成−４゛る１つのベプチ１゛である。この究明のエキンーシダツ ルペゾチ１゛の各々は、野外２１！Ｉ配列のシスティン残Ｉｌ腰・うτ他の゛ア ミ７ノ酸によ＃）置き換えられているン・ＩＬｌ、１．どｌるｊｌ！Ｆ性ｊｌｉ ｌｊの７′グナＪレペプチ１゛コこ１死する。この発明にｒ、いて有用ｉ　ｒ　 、ｈｔ　Ｉ、’ｉ；、する野性Ｊｌｌすの」シグナルペプチドは、Ｈ！！能的に 連結されたポリペプチド又はＮｌｉ白１ｊｆｈを膜結合す、ｊＱ蛋白質として膜 に会合せしめることがてきることが組直系において見出されているものである。

このような対応する野性型シグナルペプチドの例とし２てルリケニホルミス・々 ニンリナーゼリーグー配列を挙げることができる。

この発明のエキソ−シグナル配列が対応する野性型配列は、種変化、変異（意図 的及び自発的）、及び翻訳における誤！９等により、わずかな変化を受ける。す なわち、「野性型シグナル配列」は特定の細菌株について決定されたものとして 公表されている正確なアミノ酸配列に必然的に限定されるのではなく、野性型配 列の活性を実質上保持している任意の類似の配列を包含する。

前記のように、これらの野性型配列は、付加ペプチドの膜への一体化に関連する と考えられる「促進領域」を含有する。例えば、Ｂ、ＩＪケ−ホルミスにニンリ ナーセ°シグナルに１）′−いて、ンダナル化前、駆体の２３〜２７位にアミノ 酸列Ｌｅｕ　−Ａｌａ　−Ｇｌｙ　−Ｃｙｓが見出され、ノブナル化前駆体から 生ずる１模に１１合蛋白質は前記のＣｙｓから始１トる（対応するエギノゾロテ ・ｒンは３５位から始ｒトるが）。この領域は、つｔする膜結ｆン蛋白質＆ン二 扛゛〔丁、シ］１牙Ｔ＞′＋、、−′と（て、１グ月ヴ１．清含」ａ白質を部分 的Ｖこ包含してｉｒす、１１４″１への７清合を促、ｆムするようである。この 発明のｉＦ２白質の生成のためにｌき換えが必要なのはこの領域のシスティンで ある。

さらに、「対応する」なる詔は、必然的に完全に同一ではないが実質上類似する ことを意味する。

「対応する」野性型シグナルにゾチドの該当するシスティンに代るアミノ酸残基 を有するこの発明のエキノーシグナルペプチドは、（システィン残基を除き）野 性型／グナル配列と実質上相同な配列を有するが、所望の蛋白質の放出のための 適切な切断部位が存在する限り、例えばわずかに長く又は短かくてもよく、ある いは追加の変形を有していてもよい。

この明細書において例示する構成は、この発明のエキソーシグナルペプチドに対 して、所望の蛋白質の分泌を行う際のこのペプチドの有用性を破壊しない追加の 変形を行うことができることを示している。

例えば、これらのペプチドは、対応するｐｅｎ　Ｐ配列のアミノ酸２９−３４に 類似するアミノ酸の除去により；対応するｐｅｎ　Ｐ　’）−グー配列のアミノ 酸２３及び２４に類似するアミノ酸間にジペプチドｐｒｏ　−Ａｓｐを挿入する ことにより；所望の蛋白質のＮ末端に先行するＡｌａの挿入により；又は対応す るｐｅｎ　Ｐリーダー配列の２８位におけるＡｌａ残基をｐｒｏ残基により置き 換えることにより：あるいはこれらの結合ぜに」：り変形することができる。

ナーゼ遺伝子、又は文脈から明らかな場合にはこれに対応する蛋白質を意味する 。ｐｅｎ　Ｐのヌクレオチド配列は、Ｋｒｏｙｅｒ　Ｊ、及びＣｈａｎｇ　Ｓ　 、　Ｇｅｎｅ　１５　：３４３−３４７（１９８１）；並びにＮｅｕｇｅｂａｕ ｅｒＫ、ｒ　Ｓｐｌｅｎｇｅｌ　Ｒ，、及び５ｃｈａｌｌｅｒ　Ｈ，ｒ　Ｎｕｃ ｌｅｉｃにより公表されている。

脈によシ示されている場合には、「融合ペプチド」又は「融合蛋白質」なる語は 、所望の蛋白質配列に連結されているシグナル配列又はその部分を含んで成るポ リペプチド又は蛋白質を意味する。融合ｄ　フチド及び融合蛋白質なる語は相互 交換可能に使用される。この明細書において「所望の蛋白質」なる語は、ポリペ プチド又は蛋白質をコードするＤＮＡ配列を含む組換ベクターによシ形質転換さ れた原核性宿主により生産されるポリペプチド又は蛋白質を意味する。この蛋白 質は、この原核生物又は他の原核生物により通常生産されるもの又υよ外来性の ものであってもよい。

この明細書において使用される「膜結合」なる語は膜上での又は膜中への係留を 意味する。

この明細書において使用するｒ　ｈＧｌ（ｊはヒト成長ホルモンを意味し、そし てｒＩＬ−２Ｊ’は任意の分離源からのインターロイキン−２を意味する。

「誘導体プラスミド」は、組換中に生成する結果物を意味する。この組換から生 ずる誘導体シラスミドは、その生成のために使用された親プラスミドと機能的に 同等であるとは限らない。

「機能的に連結された」なる語は、複数の配列がそれらの正常な機能が維持され るように並置（ｊｕｘｔａｐｏｓｉｔｉｏｎ　）’されていることに関して用い る。

すなわち、コード配列に機能的に連結されたプロモーター又は制御配列はコドン の転写及び翻訳を行い、所望の蛋白質に機能的に連結されたシグナル配列は、該 所望の蛋白質の分泌又は膜結合を行う。所望のペプチドに機能的に連結されたエ キソ−シグナル配列は該所望のペプチドの分泌を行う。

この明細書において、「コドン」は、（１）ポＩＪ　＜ブチ゛ド中のアミノ酸に 翻訳されるｍＲＮＡ中のり月？ヌクレオチドのトリプレット、又は翻訳の開始も しくは停止のためのニー１゛、あるいは（１１）遺伝子中のデオキシリボヌクレ オチドのトリプレットであって、その相補的１リプし・７トがｍＲＮＡ中のりボ ヌクレオチドのトリプレットに転写され、今度はこれが７１？リペプチド中のア ミノ酸に翻訳さ力、るもの、又は翻訳の開始又は停止のためのコードのいずれか を意味する。従って、例えば、５′−ＴＣＣ−３’、及び５’　−ＵＣＣ−３’ はいずれもセリンのための「コドン」である。

この明細書において「ヌクレオチド」、「デオキシヌクレオチド」、及び「デオ キシリボヌクレオチド」はいずれもデオキシリボヌクレオチドを意味スるＯ ｒ　ｄＮＴＰ　Ｊ又はｒ　ＮＴＰ　Ｊは、デオキシリボヌクレオチドトリホスフ ェートのいずれか、すなわちＡＴＰ　。

ＧＴＰ　、　ＣＴＰ　、又はＴＴＰを意味する。

ｒ　ｂｐ　Ｊは塩基対を意味り、、そして「ｋｂｐ」はキロ塩基対を意味する。

「７ｆ！リペプチド」は、′２個又はそれよシ多くのアミノ酸を有する任意のベ ープチドを意味し、そして、蛋白質を包含する。

「コード配列」又はｒ　ｌＤＮＡコード配列」はポリペプチドをコードするＤＮ Ａ配列を意味する。

Ｂ、一般的記載及び好捷しい態様 この発明の方法は、遺・伝工学及び分子クローニングの技法を用いる。遺伝子工 学及び分子クローニングの一般的技法は、Ｍａｎｉａｔｉｓ　Ｔ、　＋　Ｆｒ１ ｔｓｃｈ　Ｅ：、　Ｆ、、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ＤＮＡ　、　（Ｗｕ　Ｒ， 編）、アカデミツクプレス、ニー−ヨーク（１９７，’ｌ）に記載されている。

これらの技法を用いることによって、膜結合リポ蛋白質を形成することができる タイプの野性型シグナルペプチド配列から誘導される変形された（エキソ−シグ ナル）−２プチド配列を生成せしめるための手段が提供される。この明細書にお いて、ｒ、、、から誘導される」なる記載は野性型シグナル配列に対応する変異 を受けたシグナル配列又は合成シグナル配列を含む意味に用いる。前に検討した ように、野性１４ 型配列は疎水性部分のカルボキシ末端の近傍に促進領域を含む。この促進領域中 に単一ンスティン部分が存在し、このシスティンの存在は膜結合ＩＪ　、３ｆ蛋 白質の形成のために必要である。エキソーングナルペプチドをコードするこの発 明のＤＮＡ配列において、このシスティンのコドンは、膜結合リポ蛋白質の形成 のために機能しないであろうシスティン以外Ｉのアミノ酸のコドンによって置き 換えられる。

この発明は、野性型シグナル配列に対応する前記のごとく変形された「エキノー ングナル」ペゾアドを開示する。この野性型シグナル配列は膜結合ＩＪ　、Ｐ蛋 白質を形成することができる。このような野性型配列には、原核生物中（（火熱 （ｔこ見出される配列、及ニシリナーゼシグナル配列が、膜結合リポ蛋白質をキ ソーシグナルペゾチド配列を得るためのこの発明の実施において特に好ましい。

膜結合リポ蛋白質を形成することができそしてこの発明のエキソ−シグナル被ゾ チドに対応する野性形シグナルペプチドは促進領域又は促進配列を含有すると信 じられる。例えば、ｐｅｎ　Ｐ蛋白質恍おけるこの配列中にはアミノ酸Ｌｅｕ　 −Ａｌａ　−Ｇｌｙ　−Ｃｙｓが含まれ、そしてアミノ酸部位２４−２７に位置 する。／スティン残基を含むこの促進領域は、脂肪酸をペン０チ１部分に結合せ しめるであろう共有結合の形成に該アミノ酸が関与することを許容する。Ｌｅｕ 　−Ａｌａ　−Ｇｌｙ　−Ｃｙｓからなるこれと同じテトラアミノ酸配列が、膜 結合りＩ蛋白質を形成することができる幾つかのシグナルペゾチドに訃いて見出 される。

この発明のエキンーングナルペプチドは、促進アミノ酸配列中のゾステ・インの コト８］をＤＮＡ配列中のシスティン以外のアミノ酸のご１トン−Ｃ置き換える ことによって形成される。ここで該／スティン以外のアミノ酸は膜結合リポ蛋白 質の形成のために機能しないアミノ酸である。好ましいコ１゛ンは、炭素原子数 ３個未満の中性側鎖を有するアミノ酸のコドンである。システィンをコードする コドンをセリンのコドンによって置き換えるのが特に好まし、い。ＤＮＡ中のヌ クレオチド置換は当業者に知られている方法を用いて行うことができる。この方 法には、米国特許第４．３５１．、９０１号に開示されている単一ヌクレオチド 変換法が含まれる。ヌクレオチド置換を行うた６ めのさらに好ましい方法は、プライマー指令突然変異誘発法（ｐｒｉｍｅｒ　ｄ ｉｒｅｃｆｅｄ　ｍｕｔａｇｅｎｉｓｉｓ　）である０を参照のこと。一層好ま しいプライマー指令突然変異誘発法を用いる場合、１４き換えられるべきシステ ィンを包囲しそして含有するシグナルペプチドの領域中のアミノ酸量をコードす るＤＮＡ配列を決定し、ぞしてこの配列に基いて約１０〜２５ヌクレオチドの合 成ヌクレオチド断片を当業者に知られている方法を用いて合成する。このような 方法には、ＮａｒａｎｇＳ、　Ａ、　＋　ｌｌ５ｉｕｒ＋ｇ　ｌＴ、Ｍ、　Ｉ及 びＢｒｏｕｓｓｅａｕ　Ｒ，＋　Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ　Ｅｎｚｙｒｎｏｌｏｇｙ 　、（ｉ　８　：　り　０　−　９　８　＋　（Ｗｕ　Ｒ，ｌ’：ｆｇ　）　、 ｊ′カブゝミ、クツ°レス（１９７９）の小スホトリエスフル法、並びにさらに 好ましくはＭａｔｔｅｕｃｃｉ及びＭ、　ＣａｒｕｔｈＣｒｓ　＊　Ｊ、　Ａｍ ｅｒ、　Ｃｈｅｍ、　Ｓｏｃ、　＋　１０３　＋３１８５−３１　り　４　（１ ９８１）の方法が含寸れる。

最も好−ましくはこの合成は、自動アナライザー、例えばカリポルニア、サンラ ファ、：Ｃ）しのビオサーチ社（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ　Ｉｎｃ、　）によって製 造されたＭｏｄｅｌ　ＳａｍＱｎｅ自動合成機自動合成石う。

合成ヌクレオチド断片は、置き換えられるべきシスティンを含む領域ｒｈのシダ ナルペゾチド用ＤＮＡコード配列の１つの鎖に相補的であり、そして変形された シグナル被プチドのための全長コード配列を合成するためのプライマーとして機 能する。さら（て具体的には、変形されるべきシグナル配列として好ましいｐｅ ｎ　Ｐシグナル配列を使用する１つの具体例においては、合成りＮＡ断片は２５ −２９位の５個のアミノ酸をコードするコドンに対応する。イβし、この合成プ ライマー中の中央のヌクレオ−７”　）ゝは、ｐｅｎＰ鋳型中の対応するヌクレ オチドと相補的でない不適ｉ１Ｅヌクレオチド（ｍｉｓｍａｔｃｈｃｄ　ｎｕｃ ｌｅｏｔｉｄｅ　）　ｆイイするであろう。ｐｅｎ　Ｐ以外の野〆［：型シグナ ル配列、例−ｉｌ、２９ｉ（ｉ９８］　）］を使用する場合、合成プライマーは こ；ｈ　ｌ’）のシグナル配列中の５形さＪｌ−るべき、・ステイノコｌ゛ンの ７泊域に−１）・いてｌ’ｌ’　（’ｌソ（ｌｊヌクレオチ１゛と相補的でない 不適正ヌクレオヂ１゛を含イ〕オミノ酸位置２７位に７ステインをニーｉ゛する コドン（ＴＧＣ）を含有する。変形さ、＋７−たｐｅｎ　Ｐ　’／グナル配、列 がアミノ酸位置２７位にセリンを含有する場合、合成断片は対応する部位にＴＣ Ｃ配列を含有し、そしてシスティンではなくセリンをコードする。この発明の方 法の実施に２いては、変形されるべきノグナル配列を、これを含有する生物又は プラスミドから分離する。野性型ｐｅｎ　Ｐシグナル配列は、適切な制限酵素を 用いてｐＯＧ２１６５のごときプラスミドから分離することができる。シラスミ ドｐＯＧ２１６５はヨーロノ／Ｎ特許出願公開第０．０３６．２５９号に記載さ れている。さらに好１しくは、この配列はプラスミドｐＳＹＣ３１０−２から分 離する。野性型シグナル配列のためのコード配列を含有するＤＮＡ配列を精製し た後、この断片を、コリファージＭ１３ｍｐ９のごとき単鎖ＤＮＡファージの複 製形（ＲＦ　）に連結する。Ｚｏｌｌｅｒ及びＳｍ１ｔｈ　（１９８２）、前掲 ；　Ｖｉｅｒａ　Ｊ、　＊及びＭｅｓｓｉｎｇＪ、、Ｇｅｎｅ　、　１９　：２ ５９−２６８（１９８２）；並びにＭｅｓｓｉｎｇ　Ｊ、、及びＶｉｅｒａ　Ｊ 、　＋　Ｇｅｎｅ　、　１９　：２６９−２７６（１９８２）を参照のこと。Ｍ ］３ｍｐＱ、及び密接に関連するＭ１３ｍｐ８は、ベセスダリザーチラボラトリ ーズ社（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　ＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓＩｎ ｃ、　）ガイゼルブルグ、メリーランドから入手できる。野性型シグナル配列の 遺伝子を担持するコリファージＤＮＡの組換体をＥ、コリＪＭＩＯＩ又はＥ、コ リＪＭ１０３に形質転換し、次にこれを培養して単鎖ＤＮＡを有するファージを 得る。この単鎖ＤＮＡを分離する。

不適正ヌクレオチドを担持する合成ヌクレオチド断片を、ＡＴＰ及びＴ４ポリヌ クレオチドキナーゼを用いて５′−燐酸化（Ｍａｎｉａｔｉｓ等、前掲、１２３ 頁参照のこと）した後、野性型ｐｅｎ　Ｐ　！Ｊ−ダー配列を担持する鋳型単鎖 ファージＤＮＡにアニーリングする。次にアニールした合成断片を、相補鎖ＤＮ Ａの試験管内合成を開始するためのプライマーとして使用する。ファージＤＮＡ 鋳型上でのＥ、コリポリメラーゼ■のＫｌｅｎｏｗ断片を用いるプライマー延長 反応により相補（マイナス）鎖を合成する。Ｔ　４　ＤＮＡ　ＩＪが一ゼの存在 下でのこの反応において、ＤＮＡ分子の断片は二重鎖の共有結合的に閉環された レラックスサークルに転換される。これらの分子を、ポリメラーゼにより不完全 に延長された他の分子及びプライマーの不完全なキナーゼ反応のために連結され なかった他の分子から分離する。こｉ％らの分子はアガロ−スケ８ル電気泳動又 はアルカリ性ン・−−クロース勾配遠心（、、Ｚｏｌｌｅｒ及びＳｍｊｔｌ＋　 （１９８２）、前掲〕により分１）ｉｆｆする。

次に、精製された共有結合閉環二重鎖Ｅ）ＮＡを用いてコンピテントＥ、コリ細 胞、好１しくはＥ、コリＪＭ１０３を形質転換する。変形されたシグナル配列を 有する蛋白質をコードする遺伝子を担持するファージを含有する形質転換体を同 定し、そして分離する。二重鎖ファージＤＮＡがシグナル配列中に意図された変 異を有することは、変異に基く制限エンドヌクレアーゼ切断部位の付加又は欠損 について分析することによシ、変異したことが期待される遺伝子領域のＤＮＡ０ の配列決定により、あるいは突然変異誘発に使用した合成オリコゝヌクレオチド プライマーを放射性ラベルした形でゾロープとして用いるＤＮＡ−オリゴヌクレ オチドバイブリド形成により、確認することができる。Ｚｏｌｌｅｒ及びＳｍ１ ｔｈ　（１９８２）前掲を参照のこと。シグナル配列中にシスティンからセリン への変異を有する遺伝子を含有するファージの断片を取り出す。これは制限エン ドヌクレアーゼによってファージを切断することによって行うのが好寸しい。

この断片を精製し７た後適当なりローニングベクターてクローニングする。この クローニングは、このプラスミド中にあらかじめクローニングされていた、シグ ナル配列中に変異を有しない野性型遺伝子を含有する断片と古き換えること、に よって行う。

特にことわらない限り、［ケ゛ル溶出（ｇｅｌｅｌｕｔｉｏｎ　）　ＪによるＤ ＮＡ断片の分離はすべてアクリルアミドケゞルを用いる電気溶出（ｅｌｅｃｔｒ ｏｅｌｕｔｉｏｎ　）によって行った。この方法は、アガ゛ロースの代りにアク リルアミドを用いた点を除き、Ｍａｎｉａｔｉｓ等（１９８２）、前掲、１６４ 頁における方法と実質上同じである。

特にことわらない限り、ｒＴ４リガーゼ」はＴ４ＤＮＡリガーゼを意味する。

特にことわらない限り、Ｅ、コリ菌株の形質転換はすべてＣｏｈｅｎ等ｓ　Ｐｒ ｏｃ、　Ｎａｔ’ｌ　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　、　６９　。

２１１０（１９７３）の方法により行い、そして主ズブチリス菌株の形質転換は すべてＡｎａｇｎｏｓｔｏｐｏｕｌｕｓ及び５ｐｉｚｉｚｅｎ　、　Ｊ、Ｂａｃ ｔｅｒｉｏｌ、　＋　８±、（１９６１）の方法に従って行う。

特にことわらない限シ、この明細書において言及する制限酵素及び他の酵素はニ ューイングランドビオラプス（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ　）　 （ベベリー、マサチニーセッッ）、又はベセスダリザーチラ７にラドリーズ（ガ イゼルブルグ、ツリーランド）から入手し、そして供給者の説明書に従って使用 した。

この発明の方法によって製造さ７ｔ１．るエキソーングナル波プチドは、促進領 域中に含７Ｆ才しるシスデーインの代シにアミノ酸Ｘ１すなわちシスディン以夕 １のアミノ酸を含有するであろう。シグナルペプチド配列のアミノ酸位置２７位 にセリンを含有する変形されたＢ、リケニホルミスペニンリナーゼ（ｐｅｎ　Ｐ 　）　シグナル配列が特に好ましい。アミノ酸位置２７位におけるセリンは、野 性型Ｂ、リケニホルミスｐｅｎＰシグナル配列中のアミノ酸位置２４−２７から の保存された（　ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ　）促進Ｌｅｕ　−Ａｌａ　−Ｇｌｙ　− Ｃｙｓ領域内に存在するシスティンにとって代るものである。

野性型Ｂ、リケニホルミスｐｅｎ　Ｐシグナル配列中のアミノ酸位置２７位のシ スティンの代りにこの位置に２２ アラニンを含有する変形されたｐｅｎ　Ｐシグナル配列もまた好ましい。

この発明はさらに、ヘテロデープレックス形成及びそれに続く生体内組換により ＤＮＡ塩基配列を変える方法を開示する。部分的に異るが実質上相同な構造を有 する２種類の親シラスミドのそれぞれを、他方の７０ラスミド上の切断部位から 少なくとも２０ｂｐ離れた部位（類似する部位から測定する）において処理され るプラスミドを切断するｆｔ１ｌｌ限酵素を用いて消化し、そし５てＳ１ヌクレ アーゼを用いて＝Ｆ滑末端化することに」＝す、各シラスミドをＦ　ｉ’ｉ’ｒ 末端を有する線状体に転換する。平滑末媒化された線状ＤＮＡ　４２分離し、ぞ して力（（作為的なアニーリング及び両ｆＱｉ化を許容することによって、２神 角の四１〕０ラスミ１ゞ１−の相互に毘るＤＮＡ配列部分に対応する単鎖ＤＮＡ 配つ・す部分を含むであろうヘテロデージレックスを形成せしめる。親シラスミ ドを切断するために使用した酵素は類似する部位から離れた部位で切断を行うか ら、ヘテロデープレ、クスはこの距離に対応する延長された接着末端を有し、そ して環化することができろ。

ホモデープレックスは接着末端を有しないから環化することができない。次に、 このヘテロデープレ。

クスを形質転換可能な宿主に導入し、そしてこの形質転換可能な宿主として再環 化されたヘテロデーゾレノクスのＤＮＡ配列部分の生体内組換を完成せしめ、こ うすることによって２種類の親プラスミド上に担持されている異るＤＮＡ配列部 分の組換を含む誘導体シラスミドを生成せしめる。次に、組換られたシラスミド を所望の組換を相持する誘導体プラスミドについてスクリーニングし、これを用 いてコンピテント及び感受性宿主生物を形質転換する。

さらに幾分詳細に説明すれば、この発明のこの態様の実施においては一対の親シ ラスミドを用いる。

族プラスミドは相互に実質上相同な構造を有するが、それぞれは、他方の頃似す る部分とわずかに胃るＤＮＡ配列を有する。例えば、族プラスミド（Ａ）は所望 の遺伝子生成物をコードする配列（ｙ）を含有する。親。

プラスミド（Ａつはプラスミド責んと実質的に川ｉｎｌ　ｊｃ配列を有するが、 （ｙ）に類似する部分に異る配列（Ｚ）を陰有する。一対の族プラスミド（Ａ） 及びいつのぞｒしそれを制限酵素により線状化する。これら２種類のプラスミド 上の類似する位置から少なくとも２０ｂｐｔｔ＋’ｆｆれた制限部位を選択する 。制限酵素消化により申鎖端が生ずる場合は、ホモデュプレックス環化を回ｉす るために、Ｓｌのごとき単鎖特異的ヌクレアーゼを用いて、又は修復反応、例え ばＥ、コ’）　ＤＮＡポリメラーゼＩ　Ｋｌｅｎｏｗ断片と必要なｄＮＴＰとを 用いる修復反応により、末端を平滑化する。次に、溶融（ｍｅｌｔｉｎｇ）及び アニーリングにより二重鎖分子を形成する。ホモテｓ−７’レックス分子と称す る分子は族プラスミド（５）又は族プラスミド（Ａつのいずれか一方のみからの ＤＮＡ鎖を含有する。ヘテロデープレックス分子は族プラスミド（Ａ）からのＤ ＮＡ及び族プラスミド（Ａ′）からのＤＮＡを含有し、そして２つの消化部位間 の領域により形成される接着末端のために環化するであろう。

こ瓦らの環化された形において、これらは宿主を効率的に形質転換することがで きる。ホモデージレックス分子はその平滑末端が連結しないために環化すること ができず、このため宿主を効率的に形質転換シナい。ヘテロデープレツクスにお ける各親鎖上のユニーク配列、例えば（ｙ）及び（Ｚ）（不適正配列）は、形剥 転換さｔ′１−た細胞（′こおける主体内炸復活性の結果とｌ−て誘導体シラス ミドに導入し、又は誘４１体シラスミドから除去することができる。これらの生 体内修復過程が突出している尾部を除去し、ギ一・７ゾを満たし１、ループを除 去し、そして不適正（ｍ　ｉｓｍａ　ｔ　ｃ　ｈ　）を修正する。さらに、親プ ラスミド間の対立遺伝子の異差に基く不対合（ｍ１ｓｐａｉｒ　）配列を誘導体 プラスミド中に導入するとともできる。

この発明のこの方法は、試験管内での制限断片の直接的連結のみに頼ることなく 生体内においてプラスミド中の新規な組換配列の形成を可能にする。この発明の この観点の好捷しい形態においては、一方ノフラスミドからのＤＮＡの単鎖と他 方のプラスミドからのＤＮＡ単鎖とがアニールするのに十分な配列の相同性を含 有する族プラスミドが選択される。族プラスミドはそれぞれ、他方の親シラスミ ド上に見出されないユニーク配夕ＩＪを含有するであろう。親プラ。

スミｌ″ＤＮＡは当業者に知られている技法を用いて分離されるであろう。この ような技法には、塩化＋７ウムグラノエイト、並びにＩｓｈ　−Ｈｏｒｏｗｉｃ ｚ　Ｄ、及びＢｕｒｋｅ　Ｊ、Ｒ，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒ ｃｈ　９　：　２９８９−２９９８　（］　９８　］、　）の小スケール法が含 まれる。

各族プラスミドは適化な制限酵素によって明断さ才しる。このような酵素の使用 は当君者に良くう、［１ら）ｔでいる。これらの酵素は、ニー、−イングラン１ ゛ビオラプス（Ｎａｗ　Ｐ′：ｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ　）又はベセスグ リザーチラ７ｊ？う１ゝす〜ズ（Ｂｅ　ｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａ ｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　）のごとき供給源から購入し、そして供給者の明細に従 って使用することができる。

ヘテロデーゾレノクスを調製するために、線状化されたプラスミドＤＮＡが学鎖 突出端を含有する場合にはまずこれを適当な緩衝液中８１ヌクレアーゼのごとき 酵素で処理することにより、制限酵素消化から生ずることがある単鎖尾部を消化 し、こうすることによってホモデープレックスの再環化を回避する。

２６ Ｓ１ヌクレアーゼによる処理に続き、プラスミドＤＮＡを抽出し、そして沈澱せ しめる。次に、このプラスミドＤＮＡを適当なアニーリング緩衝液に再懸濁する 。両方の親ＤＮＡを含有する溶液をＤＮＡの鎖全分離するのに十分な時間にわた って加熱する。次に、加熱された溶液を室温において徐々に冷却し、分離された ＤＮＡ単鎖を相互にアニールせしめ、そして環化せしめる。鎖の分離及びアニー リングのために、ができる。アニーリング及び環化の後、このＤＮＡを用いて、 形質転換可能な宿主を形質転換する。環化するヘテロテ゛−プレックスのみが十 分な頻度で形質転換するであろう。突出尾部（接着末端の非用向延長部が存在す る場合に生ずる）及び−・テロデー、フレックス中の単鎖ギャップは、説明した ように、形質転換された細胞中で除去又は修復されるであろう。

この生体内組換によシ、新らしい組換誘導体プラスミドが形成されるであろう。

族プラスミド間の対立遺伝子の相違に基く不適正対配列もまた、この発明のへテ ロデージレックス形質転換法によシ高頻度で組換誘導体プラスミドに導入され得 る。所望の組換誘導体プラスミドを担持するクローンを分離する。

組換誘導体シラスミドを分離し、そ１．てこれを用いて、形質転換可能な宿主を 形質転換する。

この発明の特定の具体例を次の例により概略的に記載する。この例は例示を目的 とするものであって、請求の範囲を限定することをなんら意図するもので列中の アミノ酸２３〜２７位の欠失変異の造成１５　：３４３−３４７（１９８１）、 並びにＮｅｕｇｅｂａｕｅｒ　Ｋ、　＋　Ｓｐｒｅｎｇｓｌ　Ｒ，＊及び５ｃｈ ａｌｌｅｒ　■Ｌ　ｒＮｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ、Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　９　： 　２５７７−２５８９（１９８１）を参照のこと。ｒ）ＮＡ配列データによシ、 ｐｅｎ　Ｐ遺伝子中に２個のみのＨｈａ　Ｉ　（ＧＣＧＣ）認識配列が、２３位 のアミノ酸のコドン（第２４位のコドンの第１ヌクレオチドと共に）の位置、及 び２７位のアミノ酸の最後の２個のヌクレオチドと２８位のコドンの最初の２個 のヌクレオチドとの位置に存在する。’ｐｅｎ　Ｐ遺伝子中のこれら２個のＨＭ 　Ｉ部位は２４１〜２７位におけるＬｅｕ　−Ａｌａ　−Ｇｌｙ　−Ｃｙｓ配列 の縁に位置し、ここで２７位のＣｙｓはその硫黄において膜結合形の酵素におい てグリセリドによシ修飾される。膜結合蛋白質中グリセリドによシ修飾され８ るＣｙｓを伴うこれと同じＬｅｕ　−Ａｌａ　−Ｇｌａ　−Ｃｙｓ配列が幾つか のリポ蛋白質のシグナル被プチド中に見出される。Ｓ、アウレウスＰＣＩのベニ シリナーゼは類似のＬｅｕ　−Ｓｅｒ　−Ａｌａ　−Ｃｙｓ配列を有し、Ｃｙｓ は膜結合形においてグリセリド修飾される。Ｎ１ｅｌｓｅｎ及びＬａｍｐｅｎ　 ｒ　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　＋　２５７　＋　４４９０−４４９５（１ ９８２）を参照のこと。

を寸ず発生せしめることを決定し、た。このことは、Ｅ、コリ細胞及びＢ、ズブ チリス（Ｂ、　５ｕｂｔｉｌｉｓ　）細胞の両者において複製するプラスミドＴ ）ＳＹＣ４２３と称するプラスミ１゛を使用することにより可能となった。

ｐｓＹｃ３１０−２からのｐｓＹｃ４２３の造成はＭｅ　ｌａｕｇｈｌ　ｉｎ等 、Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　、　１０　ｒ　３９０５−３９ １８（１９８２）に記載されている。プラスミドｐＳＹＣ４３２ばＢ、リケニホ ルミスｐｅｎ　Ｐの完全なコード配列を担持するが、そのプロモーターを欠いて いる。

プラスミドｐＳＹＣ４２３上の±１Ｐ配列は、縁部に旦ドｐＳＹＣ４２３をまず Ｈｈａ　Ｉ酵素により消化し、そして次に３′突出末端を、４種類のデオキシリ ボヌクレオチドトリホスフェートの存在下でＥ、コリＤＮＡｆ！リメラーゼエ山 来Ｋｌｅｎｏｗ断片を用いて平滑化した。この方法は当業者に良く知られており 、そして文献、例えばＭａｎｉａｔｉｓ　Ｔ、　＋　Ｆｒ１ｔｓｃｈ　Ｅ、Ｆ、 　＋及びＳａｍｂｒｏｏｋ　Ｊ。

できる。プラスミドｐＳＹＣ４２３からの平滑末端化されたＨｈａ　Ｉ断片をさ らにＥｃｏ　ＲＩ酵素及びＢａｍ　Ｈ１酵素により消化した。これらの酵素は二 一一イングランドビオラブス（ベベリー、マザチ＝−セッッ）から得、そして製 造者の指示に従って使用した。ｐｅｎＩ’遺伝子の５′部分（３３７ヌクレオチ ド）を含有する一スの代りにアクリルアミ１゛を使用してｉ’を製した。

溶出により精製した。別の実験において、ｐＳＹＣ４２３上の大旦ｃｏ　ＲＩ　 −Ｂａｍ　ＨＩ断片も精製し、そして前記２つのｐｅｎ　Ｐ由来断片に連結した 。得られた、プラスミド−ｐｓＹｃ５６２と称するプラスミドは、Ｌｅｕ　−Ａ ｌａ−Ｇｌｙ　＋　ＣｙＳのコード配列（野性型Ｂ、リケニホルミスｐｅｎ　Ｐ 上の２３−２７位の遺伝子）にわたる欠失を含む。野性型配列中の２８位にもＡ ｌａが存在する３０ ので、この欠失ｉｄ　２４．−２８位の欠失と同じであると考えることもできる 。ｐＳＹＣ５６２の残りの部分はシラスミドｐＳＹＣ４，２３上のそれと同じで ある。この欠失化し、末端をラベルし、そしてその配列を分析した。

Ｇ１１ｂｅｒｔ　Ｗ、及びＭａｘａｍ　Ａ、　、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎ ｚｙｍｏｌｏｇｙ６５　：　４９９−５６０　（Ｇｒｏｓｓｍａｎ　Ｌ、及びＭ ｏ１ｄｙｅＫ、　Ｊ、　、編）、アカデミツクプレス（１９８０）を参照のこと 。この結果により、この配列が、２；３位から２７荀寸でのアミノ酸残り、（の 欠失を含むことが確認さｔした。この変異をｐｅｎＰ５”ル、り２４２８と称す びデルタ２４２８変異に先行する部分コード配列を３有するコ３１３ｂｐのμヱ ＲＩ　−Ｐｓｔ　ｒ断片＜ト）０ラスミドｐＳＹＣ３］０−２　（ｐＳＹＣ４２ ３の親）から精製した。シラスミドｐｓＹｃ３１０−２はＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ 　Ｊ、Ｒ，、Ｃｂａｎｇ　Ｓ。

Ｙ、及びＣｈａｎｇ　Ｓ、　ｙ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃ ｈ　１０　：３９０５−３９１．９　（１９８２）により記載されている。次に 、この断片を、小Ｅｃｏ　ＲＩ−Ｐｓｔ　Ｉ断片の代りにプラスミドｐＳＹＣ５ ６２のＥｃｏ　ＲＩ−及びＰｓｔ　Ｉ　−消化ＤＮＡと連結した。アンピノリン に耐性のＥ、コリ形質転換体を選択し、そして代表的なプラスミドｐｓＹｃ６１ ７をさらに検討し、た。種々のエンドヌクレアーゼを用いる断片化・ぐターンの 分析に基いて、プラスミドｐｓＹｃ６１７ば、断片切り換え実験から期待される ようにｐｅｎ　Ｐデルタ２４２８中に１５塩基対の欠失が存在する点を除き、シ ラスミドｐＳＹＣ３１０−２と同一であることが見出された。ｐｓＹｃ６１７中 のｐｅｎＰデルタ２４２８の部分を第５図に示す。

た場合、成熟ベニンリナーゼのほとんどＩべてが細胞内に残害し、又は４１１１ 　＋１ｆａ　’ｉ（膜に結合し７六二。非常に低レベルのエギノペニ／リナーー ービのみがヘリフ″うイｌ、空間中に検出された（すなわちυ透圧ショックによ り放出された）。こうして、Ｉｌｌリフごホルミ１スノグナル配列のアミノ酸２ ７位のシスティンを含有する保存された配列の欠失が細胞外酵素の産生を妨害す ることが結論付けられた。同様の結果が、ｐｓＹｃ６１７によって形質転換され たＢ、ズブチリスＢＤ２２４についても″得られた。例１３を参照のこと。

アミノ酸２７位におけるシスティン−セリン変異、２ 及びエニＰＳ２７遺伝子を相持するプラスミドｐｓＹｃ６６０の造成 り、　ＩＪケニホルミスベニンリナーゼ（ｐｅｎ　Ｐ　）遺伝子は配列決定され ている。Ｋｒｏｙｅｒ　Ｊ、及びＣｈａｎｇ　Ｓ。

（１，９８１，）前掲、並びにＮｅｕｇｅｂａｕｅｒ　Ｋ、等、（１，９８］、 　）、前掲を参照のこと。このシグナル配列ば、アミノ酸２７位のシスディンを コードするコドンＴＧＣを含有する。２７位のシスティン残基ば、被ニシリナー ゼの膜結合リポ蛋白質形の形成に導く配列の部分として修）’ｉＪｉさｉする。

Ｎ１ｅｌｓｅｎ　Ｊ、　Ｂ、　Ｋ、　＋３５１１、−３５１５（１，９８’１． ）；並びにＬａｉ　Ｊ、Ｓ。

５ａｒｖａ、ｓ　Ｍ、　、　Ｉｌｒａｍｍａｒ　Ｗ、　Ｊ、　＋　Ｎｅｕｇｅｂ ａｕｃｒ　’ｒ（、及びＷｕ参照のこと、この生合成過程を特異的に変えるため 、及びＪ、り多くの蛋白質を細胞から分泌さえ１．る細胞外型に切り替えるため （Ｂ、ズブチリスのごときグラム陽性細菌の！易合）、又はペリプラズム空間に 分泌される型に切り替えるため（Ｅ、コリのごときグラム陰性細菌の場合）、こ の位置のシスティンをコードするペニンリナーゼシグナル配列遺伝子中の配列を 変異せしめることが必要である。

その単純さと効率の故に、システィンからセリンへの変異の造成のためにプライ マー指令突然変異誘発法ＣＺｏｌｌｅｒ　Ｍ、Ｊ、　、及びＳｍ１ｔｈ　Ｍ、　 ＋　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ　１０　：　６４８７−６５ ００　（１９８２）を用いた。野性型にニシリナーゼ（ｐｅｎ　Ｐ　）遺伝子配 列を含有するＤＮＡ断片を分離した。特に、ヲ０ラスミドｐＳＹＣ３１０−２か ら且匹ｄ１０部位及び１四Ｔ（１部位間に位置するＤＮＡ断片を切り出した。Ｍ ｃＬａｕ）ｒｈｌ　ｉｎ等）（１９８２）、前掲を参照のこと。ｐｓＹｃ３１０ −２は、に１断片上にＢ、リクニ７Ｊルミスフ　４　！ｌ／Ｃ山来の野１ｉ１Ｅ プシスミドからＬＪｊり取られ得ることを理解するであろう。このようなプラス ミドの１つは１１．７″ブチリスプラスミドｐＯＧ２１６５である。ｐＳＹＣ３ ＬＯ−２由来の切り出されたＨｉｎｄ　ＩＩＩ　−１３ａｒｎ　ＨＩ　ＤＮＡ断 片をアクリルアミドケ゛ル溶出により精製し、そして次にコリファージＭ１３ｍ ｐ９の複製型（ＲＦ　）　ＤＮＡに連結した。Ｖｉｅｒａ　Ｊ。

及びＭｅｓｓｉｎｇ　Ｊ、　Ｇｅｎｅ　１９　：　２５９−２６８　（］、９８ ２）；並びにＭｅｓｓｉｎｇ　Ｊ、及びＶｉｅｒａ　Ｊ、　＋　Ｇｅｎｅ　１９ 　：　２６９−２７６（１９８２）を参照のこと。

３４ 断片を、ベセスダリザーチラボラトリーズ社（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒ ｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　Ｉｎｃ　）　Ｐ、Ｏ。

Ｂｏｘ　５７７　、ガーイザーブルグ、メリーランドから得する組換ファージ、 すなわち組換ファージＭ１３−ＣＭＩにより形質転換されたクローンを同定し、 そしてこのクローンから単鎖ファージＤＮＡを調製した。

使用した方法は、Ｚｏｌ　ｌｃｒ　Ｍ、　Ｊ、及びｓｍｉｔｈＭ。

Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　１　０　：　（’ｒ　／Ｉ　 ８　７　−　（５５００（＋　９　ｓ　２　）に記載さオしていろ。

Ｎａｒａｎｇ　Ｓ、Ａ、　＋　Ｈｓｉｕｎｇ　Ｉ−ｒ、Ｍ、　、’ｇｔ−びＢｒ ｏｕｓｓｅａｕ　Ｒ，。

Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　６８　：　９０−９７　（Ｒ， Ｗｕ。

編）アカデミ、クプレス（１９７９）のホスホトリエステル法により作らｈた１ ５ヌクレオチｌゝ合成断片５’　−ＧＴＴＡＧＣＧＧＡＴＣＣＴＧＣ−３’の５ ′−末端をＡＴＰ及びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼによりまず燐酸化し、そし て次にプライマーとして使用して、鋳型Ｍ１３−ＣＭＩ　ＤＮＡにアニールした 後相補鎖の試験管内合成を開始した。Ｔ　４１Ｊガーゼの存在下、４種類すべて のｄＮＴＰと共にＤＮＡポリメラーゼＩ　Ｋｌｅｎｏｗ断片を用いてプライマー を延長した。このプライマーは、２５〜２９位の５個のアミノ酸のコドンに対応 するｐｅｎ　Ｐシグナル配列遺伝子セグメントのアンチ−センス鎖と相補的であ るが、この合成プライマーの中央のヌクレオチドは不適正ヌクレオチドであり、 野性聖人が、２７位におけるシスティン（ＴＧＣコドン）からセリン（ＴＣＣコ ドン）への転換を生じさせる。第１図は、ＣＭｌ１２７から５ｅｒ２７への変異 の造成の過程を例示する。

コードされたペプチド上での変化は、本来的に、システィン２７上の−ＳＨ基か らセリン２７上の一〇Ｈ基への転換である。ヌクチオナ１″ルベルにおい−（、 変異体は変異原においてＢａｍ　Ｉ−ＩＩ部位（ＧＧＡＴＣＣ）を獲得し、そし て−世すＩ　（ＧＣＧＣ）を喪失する。新しいＢａｍ　ＨＩ部位の存在は、「Ｇ からＣへの」、ヌクレオチド変異を担持する変異体を同定するだめの表現型とし て使用した。

６ システィンからセリンへの変異の造成において、相補鎖（負鎖）は、Ｅ、コ！Ｊ 　ＤＮＡポリメラーゼ■のＫｌｅｎｏｗ断片を用いて、Ｍｌ３−ＣＭｌ　ファー ジ鋳型上でのノライマー延長反応によシ合成した。Ｚｏｌｌｅｒ　Ｍ、Ｊ。

及びＳｍ１ｔｈ　Ｍ、、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　１ ０　：　６４８７−６５００（１９８２）を参照のこと。Ｔ　４−　ＤＮＡリガ ーゼの存在下、この反応において、ＤＮＡ分子の断片は二重鎖共有結合閉環リラ ックスサークルに転換した。これらの分子を、ポリメラーゼによシネ完全に延長 され、又はノ０ライマーの不完全なキナーゼ反応のために連結されなかった他の 分子から分離した。分離はアガロ−スケゝル電気泳動により行った。これは、２ μｇ／ｒｎ／、の臭化エチノウｌ、の存在下転８係ア〃゛ロースケゞルに反応混 合物を適用することにより行った。共有結合的に閉環された環状ＤＮＡを含有す るバンドを切シ出し、そしてＤＮＡを回収した。

精製された、共有結合的に閉環された二重鎖ＤＮＡを用いて、Ｍ　］’３ファー ジＤＮＡについての標準的形質転換法により、Ｅ、コリＪＭ　１０３のコンピテ ント細胞を形質転換した。ＪＭ１０３細胞は、ベセスダリザーチラボラトリーズ 社、　Ｐ、０．　Ｂｏｘ　５７Ｌガイザーブルグ。

マリ−ランドから得た。さらに、一般的にはＶｉｅｒａＪ、及びＭｅｓｓｉｎｇ 　Ｍ、、　Ｇｅｎｅ　１９　：　２５９−２６８（１９８２）　；並びにＭｅｓ ｓｉｎｇ　Ｊ、及びＶｉｅｒａ　Ｊ、　Ｇｅｎｅ　１９　：２６９−２７６（１ ９８２）を参照のこと。合計３６個のファージゾラークを分離し、そしてファー ジ生成細胞からのＲＦＤＮＡを、Ｉｓｈ　−Ｈｏｒｏｗｉｃｚ及びＢｕｒｋｅの 迅速シラスミドスクリーニング法により分析した。Ｉｓｈ−Ｈｏｒｏｗｉ　ｃｚ Ｄ−Ｌ及びＢｕｒｋｅ　Ｊ、Ｆ、＋　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａ ｒｃｈ　９：２９８９−２９９８　（１９８１）を参照のこと。シネＨＩ制限エ ンドヌクレアーゼによる消化の後、３６個のＤＮＡ標品の１つ（Ｍｌ　３　ｐｅ ｎＰＳ２７と命名する）が、電気泳動後のアガロースダル上に２個の断片をもた らし、このクロー／（Ｍｌ３とＰＳ２７）の遺伝子配列中に１ＧからＣへの」変 異が導入されているととが示された。

他の標品はＢａｍ　ｆｉＩエンドヌクレアーゼによる１個ノ切！！Ｊｉを示し、 親Ｍ１３−ＣＭＩ　ＤＮＡがこの座ＶＣオイテ変異していなかったことが示され た。変異体Ｍ１　加ＳＳ　７７からのＤＮＡの、Ｈｈａ　Ｉ及びＢａｍ　ｆＩＩ エンドヌクレアーゼを用いる前記以外の分析により、期待されまた配列の変化が 示された。この変異の直接的配列分析により配列の変化がさらに確認された。

置する。これらの部位の位置についてはＭｅ　Ｌａ　ｕ　ｇ　ｈ　１．ｉ　ｎ等 、　（１９８２）　、前掲を参照のこと。この制限ＤＮＡ断片をＭ１３！己ＰＳ ２７のＲＦ　ＤＮＡから分離した。この［変３８ えば三機能グラスミドｐＯＧ２１６５　、又はｐｓＹｃ３１０−２　Ｋ、野性型 ｐｅｎＰ配列の対応断片に代えてクローニングすることができた。

「変異体」ｂ上ｒ　−ｗ　ｎ断片をＭ１陣ヨＰＳ２７のＲＦ　ＤＮＡから分離し 、そして標準的方法を用いて、野性型配列中の対応する。ぬ已−１−、山−１Ｉ Ｉ断片の代りにクローニングした場合、ｐｓＹｃ６６０と称するプラスミドが得 られた。

シラスミドｐｓＹｃ６６０は遺伝子ｐ　ｅ　ｎ　Ｐ　Ｓ　２７を含有し、このも のは第５図に示すようにｐｅｎＰ　／グナル配列の２７位のアミノ酸にシスティ ンからセリ／への変異Ｂ、リケニホルミスフグナル１′記ダ１１中のアミノ酸２ ７（ｒＬ　Ｖこおけるシスティンからアラニン−＼の変異、及びｐｅｎＰＡ２７ 遺伝子を担持するシラスミドｐｓＹｃ６６０Ａの造成 例２に概略を記載した方法に従って、アミノ酸２７位におけるシスティンからア ラニンへの変異を造成することが可能である。野性型ｐｅｎＰ配列はアミノ酸２ ７位のシスティンをコードするコドンＴＧＣを含有するセリン２７変形シグナル ペゾチドコード配列はアミノ酸２７位のセリンをコードするコドンＴＣＣを含有 する。ｐｅｎＰＳ２７中のＴＣＣセリンコドンをＧＣＴ３９　１ｔｉＭ％ｆ　Ｇ Ｏ−５００７０１０２）コドンに転換することにより、アラニンをコードするコ ドンが形成される。

セリン、７−変形ｐｅｎＰシグナル配列をコードするＤＮＡ配列はＭ１３二１Ｐ Ｓ２７フアージ上に位置する。

前記の例２を参照のこと。配列５’　−ＴＧＴＴＡＧＣＡＧＣＴＣＣＴＧＣＡＡ 　−３’を有する合成プライマーを合成する。

この合成プライマーの調製は、Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ及びＣａｒｕｔｈｅｒｓ　（ １９８１）　＋前掲、の方法により、自動オリゴヌクレオチド合成機〔ビオサー チ社（ＢｉｏｓｅａｒｃｈＩｎｃ、　）　、サンラフアニル、カリホルニア製の ＭｏｄｅｌＳａｍ　Ｏｎｅ　：］において行う。プライマーを５７−燐酸（ＩＬ し、そして鋳型Ｍ　Ｌ　３　巴ＰＳ　２．　ＤＮＡにアニールした陵、相補鎖の 試験管内合成を開始−Ｊるために使用する。

この）０ライマーは２５〜２９位の５個のアミノド０２のコドンに対応する変形 された（Ｓｅｒ２７）シグナル配列遺伝子セグメントのアンチセンス鎖に相補的 丁あるが、との合成プライマー中の５７−末端から１ｏ　、６目のヌクレオチド 、及び５′−末端から８番目のＡが不適正ヌクレオチドであって、ｕＰＳ２７遺 伝子鋳型中の対応するヌクレオチドと相補的でない。ｐ　ｅ　ｎ　ＰＳ　７７遺 伝子中への不適正配列の導入により、２７位におけるセリン（ＴＣＣコドン）か らアラニン（ＧＣＴコドン）への転換が生じ、ファージＭｉ３　ｐｅｎＰＡ２７ 中にｐ　ｅ　ｎ　ＰＡ　２７と称する変異体遺伝子が生ずる。ファージ０ 片をｐｅｎＰＡ２７のヱｓｔ　Ｉ−シ已■断片で置き換えることによりプラスミ ドｐＳＹＣ６６０Ａが生ずる。このプラスミドのｐｅｎＰＡ７７遺伝子の部分を 第５図に示す。

Ｅ、コリ及びＢ、ズブチリスにおけるｐＳＹＣ３１０−２Ｊ二のｐｅｎＰから発 現されるベニンリナーゼのノＰ−センテーノに比べて、Ｉ）ＳＹＣ６６０Ａ　Ｊ 二のピュＰＡ２７遺伝子から発現されるペニシリナーゼのより高いｉ’？−セン テ−ノが、それぞれＦ〕、コリ及びＢ、ズブチリスにおいて分ｈｅされるであろ う。

Ｉ）ｅｎＰＡ２．　（’ζよりもたらされるジグ犬ルペプチド中のＡｌａ−２’ ７から下流のアラニンの後に融合したポリ即ゾチドは、ｐｅｎＰによりもたらさ れる野性型／グナルにゾチド中の３４位におけるアラニンの後の同じポリ被プチ ド」：り高い効率で分泌されるであろう。

−及びシグナルペプチドコードＤＮＡ配列の緑に便利な制限部位を有する一連の プラスミドの造成、グラスミドｐＤＨ５５０８゜ ３．１１ケニホルミスからのベーシリナーゼｐｅｎＰ遺伝子は配列決定されてい る。配列データーは、４４６塩基対のＨｐａｌ断片を示しＣＫｒｏｙｅｒ　Ｊ、 及びＣｈａｎｇ　Ｓ。

（１９８１）前掲；並びにＧｒｄｙ　Ｏ，及びＣｈａｎｇ　ｓ、ＩＪｏｕｒｎａ ｌ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ　１４５　：　４２２−４２８（１９８１）を参 照のこと〕、この断片はｐｅｎｐフ０ロモーター、及びシグナルペプチドの３４ 個を含む最初の７２個のアミノ酸のコード配列を含んで成る。

ｐｅｎＰ遺伝子遺伝子細のＡｖａ　１部位が存庄するＣＣＴＣＧＧＧ　、　Ｋｒ ｏｙｅｒ　Ｊ、及びＣｈａｎｇ　Ｓ、　（１９８］、）　、前掲を参２１６５　 、又はｐＴＩ（２（Ｋｒｏｙｃ　ｒ及びＣｈａｎｇ　（１９８１）前掲上に存在 するＪから生ずるｆ（ｐａ　Ｉｆ　−Ａ■ｌ断片とｐＢＲ：３２２から生ずる大 腸Ｉ−か＋ａ　Ｉ　ｌｌ’ｆｉ片を連結し、こうして得られたプラスミドにより Ｅ、コリに一１２／Ｃ８ｌ［１２を形質転換し、そしてアンピシリ／＃ｊ性形質 転換体を選択することにより、ｐＯＧ２２５４と称するグラスミドが造成される 。

第２図に示すように、シラスミドｐＯＧ２２５４は、縁部にＨｐａ１１部位及び 、／４ｖａ　Ｉ部位を有するｐｅｎＰ遺伝子由来の配列を含有する。Ａｖａ　１ 部位からＣ１ａ　１部位までの領域を含むｐＯＧ　２２５４中の配列の残りの部 分はｐＢＲ３２２に由来する。プラスミドｐｏｃ　２２５４を１個の、公＋ａ　 １部位において線状化した。線状化されたＤＮＡ１０　：　２０６５−２０８４ 　（１９８２）により特定された条件下で処理した。Ｅｘａ　ｌｌ’ｌ酵素は二 重鎖ＤＮＡの末端領域を単鎖末端に転換する。異る時間において反応混合物から サンダルを取シ出し、そしてＥｘａ　ｍヌクレアーゼ活性を消失せしめ、そして これらのサンダルを一緒にした。次に、これらのＤＮＡ標品を単鎖特異的ヌクレ アーゼ８１　（ベセスダ・リザーチ・ラボラトリーズ比から入手し、供給者の説 明書に従って使用）で処理した。Ｓ１ヌクレアーゼ処理により末端から単鎖ＤＮ Ａが除去され、そして平滑末端分子が生ずる。

及びＳｌで処理されたＤＮＡ断片から小断片が生じ、このものは啄ニシリナ〜ゼ 遺伝子のブロモ−ター及びベニシリナーゼ遺伝子の種々の長さのアミン末端コー ド領域を含有する。これらのＤＮＡ断片をゲル上で両分した。約３００〜４００ 塩基対のＤＮＡ断片をグルから溶出し、そしてクローニング実験に使用した。

これらの短い約３００〜４００　ｂｐのＤＮＡ断片の各各は一端にＥｃｏ　ＲＩ により生じた末端を有し、そして他端に平滑末端を有する。これらのＤＮＡ断片 をクローニングするため、ｐＢＲ３２２をＣ１ａ　ｌ酵素で消化した〔２３位； この部位はテトラサイクリン耐性遺伝子領域に存在する。５ｕｔｃｌｉｆｆｅ　 Ｊ、Ｇ、＋　Ｃｏ１ｄ　Ｓ　ｒｉｎこの処理されたＤＮＡをＥｃｏ　ＲＩで消化 し、Ｅｃｏ　Ｒ１末端及び平滑末端を含有する大断片を生成せしめた。

ｐＢＲ３２２からのこの大断片をケ゛ルから精製し、そして上記の様にしてｐＯ Ｇ２２５４由来の４ニシリナーゼ遺伝子から誘導された約３００〜４００　ｂｐ の小断片と混合した。ＤＮＡを連結し、そし−？：　Ｅ、：ｆｆすに−１２／ｃ ｓ　４　Ｌ　２を形質転換するのに用いた。テトラサイクリンに耐性の形質転換 体をプレート上で選択し、この形質転換体が相持する組換プラスミドを分離し、 そしてＥｃｏ　ＲＩ及びＨｉｎｄｌｌｌを用いる消化にょ９特徴付けた。

これにより、これらが予想通シ３００〜４００塩基対の範囲のぜニシリナーゼ遺 伝子由来挿入部を有することが示された。

異なるクローンから幾つかのシラスミドＤＮＡを分離し、そしてｐｅｎＰ配列と ｐＢＲ３２２配列との間の連結領域におけるヌクレオチド配列をＭａｘａｍ及び Ｇ１１ｂｅｒｔの方法を用いて分析した。Ｇ１１ｂｅｒｔ　Ｗ、及びＭａｘａｍ 　Ｈ・Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　６５　：　４９９−５６ ０　（Ｇｏｓｓｍａｎ　Ｌ。

及びＭｏ１ｄａｖｅ　Ｋ、Ｊ、編）アカデミツクプレス（１９８０）を参照のこ と。ｐＤＨ５４５２と称するプラスミドの１つが、ｐｅｎＰの３５位のアミノ酸 のＴＣＧコドンに対応するヌクレオチドＴまでの欠失がＥｘｏ　ＩＩＩ及びＳ１ ヌクレアーゼにより生じている配列を有していた。この：う５位のアミノ酸はＳ ｅｒであり、そして蛋白質の大細胞夕ｉ形のＮ末端アミノ酸である。このＴを、 配列ＣＧＡを有するｐＢＲ３２２由来の修復されたＣｌａｌ部位・＼の連結に」 ：り連結した。連結配列ＴＣＧＡは制限酵素Ｔａｑ　ｌの認識部位に対応する。

フ０ラスミドｐｌ：）Ｈ５４５２を第：２）ｑｌに示す。Ｔａｑ　ｌ制限酵素を 用いる消化によりＣＧ突、′」１端が生ずる。シラスミドｐＤＨ５４５２のＤＮ Ａ金Ｔａｑ　ｌ酵素で消化し、そして５′突出端を、ＤＮＡポリメラーゼＩ　Ｋ ｌｅｎｏｗ断片、ｄ　ＣＴＰ及びｄＧＴＰにより、標準的条件を用いて満たし、 そして次に旦江Ｒ１酵素により再度消化する。ｐｅｎＰのブロモ−ター及びシグ ナル配列を含有する■ＲＩから修復された１ツＩまでの断片を、ケゝルからの溶 出によシこの調製物から精製し、そしてｐＢＲ３２２にクローニングした。ベク ターｐＢＲ３２２ＤＮＡを隻すｄ［ｌ酵素により消化し、そしてＤＮＡポリメラ ーゼＩ　Ｋｌｅｎｏｗ断片及びｄＮＴＰを用いて標準的条件下で修復しておいた 。Ｅｃｏ　ＲＩで消化した後、このＤＮＡ断片をｐＤＨ５４５２からの望ましい 質転換した。表現形質としてアンピシリン及びテトラサイクリンに耐性の１つの 形質転換体を分離した。

この形質転換体からのプラスミドＤＮＡを分離し、そして分析した。このシラス ミドをｐＤｆ（５５０１と称する。

修復されたＴａｑ　１部位を修復されたＨｉｎｄ　Ｉ１１部位に連結した。新し い連結配列は次の配列ＣＴＣＧＡＧを有する。

この配列の内、ＣＴＣＧはｐＤＨ５４５２から誘導され、そしてＡＧ残基はｐｏ Ｒ３２２の修復されたＩ−１ｉ　ｎ　ｄ　ＩＩＩがら誘導された。この−、キザ ヌクレオチド配列ＣＴＣＧＡＧは制限れる。プラスミドｐＤＨ５５ｆ）１を第２ 図に示す。

ｐｅｎＰシグナル配列の末端に追加のｆｌｊｌｌ限酵素認識配列を形成するため に、グラス、ミド＋ｐＤＨ５５０ｐを造成した。このプラスミドを造成するため 、ｐＤＨ５５０１がらのグラスミドＤＮＡをＮａｅ　ｌ酵素で消化した。この酵 素は、ｐＢＲ３２２由来の領域中の４つの位置、すなわち４０３．７７０．９３ ０、及び１２８４における配列を認識する［　５ｕｔｃｌｉｆｆｅ　Ｊ、Ｇ、、 　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ素による消化によって平滑末端配列Ｇ ＣＣ−３’、及び４６ ５’−ＧＧＣが残る。Ｎａｅ　（テ消化されたｐＤＨ５５０１ＤＮＡをＸｈｏ　 ｌ酵素によりさらに消化した。次に、これを単鎖特異的ヌクレアーゼＳ１で処理 した。このヌクレアーゼは突出端を除去することによってＸｈｏ　Ｉ部位におけ る平滑末端断片を生成せしめる。これは、ごＰシグナル配列中３４位のアミノ酸 のヌクレオチド配列に対応する配列ＧＣＣを残す。Ｎａｅ　ｌ　、　ＸＩリー１ ゜Ｓｔスクレアーゼ処理ＤＮＡ　（ＤＮＡの濃度１０μみ郁において）Ｔ４リガ ーゼにより連結した後、得られたシブラスミドを用いてＥ、コリに一１２／’Ｃ ３・１１２を形質転換しｌこ。ｐＤＨ５５０８と称するプラスミド−２有するア ／［？ンリン耐性−テトラザイクリン感受性の形質転換体をイ４Ｉた。ｐｌ）Ｈ ５５０８ノ１ｆｉｌｌ限分析は、これが２個ノ上り１部Ｋｔｌを有することを示 し、下流（Ｆ２ｃｏ　Ｒ［部位から時計方向）の１つは、最初ｐＢＲ３２２中の １２８４位に位置していた　Ｎａｅ　１部位に対応する。−１−ｘ流のシュ１部 位は、最初ｐＢＲ３２２中の９３０位に位置していたＮａｅ　１部位に連結され たＳ１処理工Ｘｈｏ　１部位により生じた連結配列に対応する。ｐＤＨ５５０８ 上のユニークＥｃｏ　ＲＩ部位と、これから下流の第−Ｎａｅ　１部位との間に 位置する配列は、被ニシリナーゼの諷Ｐプロモーター及びシグナル配列を含有す るｐＤＨ５５０１由来の配列である。このＮａｅ　１部位は配列ＧＣＣＧＧＣを 有し、この配列はＮａｅ　ｌ酵素、及びｈ”酵素のいずれによっても切断され得 る。プラスミドｐＤｆ（５５０８を第２図に示す。

従ってｐｅｎＰプロモーター及びシグナル配列の縁部に便利な制限部位を有する 一連のプラスミドが造成された。プラスミドｐＤＨ５４５２は、シグナル４プチ ドのコード配列に続いてＴａｑ制限部位、及びＨｉｎｄｌｌｌ制限部位を有する 。プラスミドｐＤＨ５５０１はシグナル配列に続いてＸｈｏ　１部位及びＴａｑ 　Ｉ部位を有し、そしてプラスミドｐＤＨ５５０８はベニ／リナーゼのシグナル 配列に続いてＮａｅ　１部位及びＩ（ｐａ　１１部位をイユする。

第２図を参照のとと。

例　■ ヒト成長ホルモン（ｈ　ＧＨ）　ｃ　ＤＮＡのクローニング、及Ｏ・プラスミド ｐｓｙｃ　７０９の造成。

ヒト成長ホルモンｍＲＮＡの分離源としてヒＩ・脳下垂体を用いた。ｍＲＮＡを 分離するために１吏用した方法ｄ、Ｍａｎｉａｔｉｓ　Ｔ、　、Ｆｒ１ｔｓｃｈ 　Ｅ、Ｆ、　、及びＳａｍｂｒｏｏｋ　Ｊ、　＋Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎ ｉｎｇ　：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌの第６章＋　Ｃｏ１ｄ　 Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　（１９８２）（／（記載 されている方法である。ｃＤＮＡを公表されている方法に従って調製し、そして Ｍａｎｉａｔｉｓ　Ｔ、　、Ｆｒ１ｔｓｃｈ　Ｅ。

Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　（１９８２）に概略記載されている方法を用８ いてプラスミドｐＢＲ３２２にクローニングした。次に、ｐＢＲ３２２プラスミ ドＤＮＡをＰｓｔ　ｌ酵素によｐ消化した。次に、ｄＧＴＰの存在下でターミナ ルトランスフェラーゼを用いてこのベクターＤＮＡに尾部形成した。

このＧＴＰ−尾部形成りＮＡを、ｄ　ＣＴＰにより尾部形成しておいた二重鎖ｃ ＤＮＡにアニールせしめた。アニールしたＤＮＡを用いて旦ヨシ２　Ｋ−１，２ ７ＭＭ　２９４を形質転換した。

プラスミド中にｈＧＨｃＤＮＡ配列を担持する（　ｐ２０ｃ４と称する）テトラ サイクリン耐性でアンピシリン感受性の形質転換体（クローン２０Ｃ４と称する ）を同定した。このシラスミドｐ２０ｃ４は、制限酵素加ｆ（Ｉ及びＳａｍ　＋ によって消化され得るｈＧｆ（遺伝子挿入部を含有する。この２つの酵素は６８ ８塩基対の断片に一層しさせる。この断片は、Ｍａｒｔｉａｌ　Ｊ、Ａ、、Ｈａ ｌｌｅｗｅｌｌ　Ｒ，Ａ、、Ｂａｘｔｅｒ　Ｊ、Ｄ、　、及びＧｏｏｄｍａｎ　 Ｉ−ＬＭ、　、　５ｃｉｅｎｃｅ　２０５　：　６０２”６０７　（１９７９） により発表された断片の部分と同一である。Ｍａｒｔｉａｌ　ＪＡ・・Ｈａｌｌ ｅｗｅｌｌ　Ｒ，Ａ、、Ｂａｘｔｅｒ　Ｊ、Ｄ−、及びＧｏｏｄｍａｎ　Ｈ。

Ｍ、　、　５ｃｉｅｎｃｅ　２０５：６０２−６０７　（１９７９）により発表 された部位と一致する内部制限部位、すなわちＰｓｔ　Ｉ、Ｐｖｕ　ｌｌが見出 されたので、２０Ｃ４はｐ２０ｃ４上にヒト成長ホルモンをコードするｃＤＮＡ を有するものと結論された。

クローン２０Ｃ４からシラスミドを分離した。このグラスミドＤＮＡをシェＨ１ 酵素で消化した。Ｂａｍ　ＨＩｌ酵素このプラスミドを２つの位置で切断する。

１つのＢａｍ　ＨＩ部位はｐＢＲ：３２２由来配列中のテトラサイクリン（１ｅ １）遺伝子を切断し、そして他方はｃＤＮＡ配列を切断する。消化されたＤＮＡ を、Ｎａｒａｎｇ等（１９７９）前掲のホスホトリエステル法にエリ調製されそ して５’−ＴＴＣＣＣＡＡＣＣＡＴＴ　−３’の配列を有する合成オリコゞヌク レオチドと混合した。この１２−マー配列はｈＧＨ配列中のコード配列と一致す る。これは成熟ｈＧＨ蛋白質配列ＣＭａｒｔｉａｌ　Ｊ、Ａ、　、Ｈａｌｌｅｗ ｅｌｌ　Ｒ。

Ａ、、Ｂａｘｔｅｒ　Ｊ、Ｄ、　、及びＧｏｏｄｍａｎ　Ｈ，Ｍ、　、　Ｓｃ　 １ｅｎｃｅ２０５　：　６０２−６０７　（１９７９）　’：］の最初の４個の アミノ酸、すなわちフェニルノ′ジニンーゾローリ／−７レメニンーイノロ・ｆ ンン（円〕ｅ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−１１ｅ　）のコドンに対応する。ヒト成長ホル モンをコードするＩ）ＮＡ配列を、さらに操作するために一層便利な構造に転換 するために、１２−マーのプライマーをＢａｍ　ｌ−１１−消化ｐ２０ｃ４シラ スミドＤＮＡと混合した。

この転換のために使用した方法は、Ｇｏｅｄｄｅｌ　Ｄ、Ｖｏ、５ｈｅｐａｒｄ 　Ｈ，Ｍ、　、　Ｙｅｌｖｅｒｔｏｎ　Ｅ、　、Ｌｅｕｎｇ　Ｄ、　、及びＣｒ ｅａ　Ｒ’、　、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　８　：　４ ０５７−４０７４（１９８０）に記載されている。本質的には、プライマーを用 いて、Ｇｏｅｄｄｅｌ　Ｄ、Ｖ、　、５ｈｅｐａｒｄ　Ｈ，Ｍ、、Ａｃ１ｄｓ　 Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　８　：　４０５７−４０７４　（１９８０）がインターフェ ロン遺伝子の改変において行ったのと同様にして、ヒト成長ホルモン遺伝子を新 しい配列に変えた。

プライマー及びシラスミドＤＮＡを含有する混合物を加熱によって変性し、そし てＧｏｅｄｄｅｌ等（１９８０）前掲に記載されているようにしてＥ　コリＤＮ ＡポリメラーゼＩ　Ｋｌｅｎｏｗ断片及びｄＮＴＰを用いて処理した。次に、Ｄ ＮＡをＳａｍ　Ｉ酵素によ勺消化した。Ｓｍａ　ＩはｈＧＨ遺伝子をこの遺伝子 の３′−末端において切断する［　Ｍａｒｔｉａｌ等（１９７９）前掲を参照の こと〕。この断片は、成熟ヒト成長ホルモン蛋白質のフェニルアラニン（ｐｈａ ）の第一コトンから出発し、そしてｈＧＨ遺伝子のコード配列の少し後の３′− 末端において終るヌクレオチ［パ配列を有するＣ　Ｍａｒｔｉａｌ等（１９７９ ）前掲〕。

この断片をクローニングするために使用したベクター　ＤＮＡはｐＬＰ　１２０ １である。ン０ラスミドｐＬＰ　１２０１はシラスミドｐＤＨ５０６０から誘導 し、後者は、ｐＢＲ３２２及びパシルスプラスミドｐＯＧ　１１９６の両者を坦 ■で消化しそして連結して成る複合プラスミドから誘導した。要約すれば、プラ スミドｐＤＨ５０６０は、±Δ■部位の１つがｐＤＨ５０６０から除去されてい る点を除きｐＬＰ　１２０１と同じである。除去されたＨｉｎｄｍ部位は、ｐＯ ｏ　１１９６　Ｋ由来すルｐＤＨ５０６０（Ｄ部分中のそれである。ｐＤＨ５０ ６０をＨｉｎｄＩ［ｌにより部分消化した。突出端を満たし、そして連結した。

得られたシラスミドによシＥ、コリに一１２／Ｃ８４１２を形質転換した。

形質転換体をアンピシリン及びテトラサイクリンに対する耐性によシスクリーニ ングした。選択された細胞は、ｐＤＨ５０６０中のｐＢＲ３２２断片に由来する １個のＨｉｎｄ工■部位を有するシラスミドｐＬＰ　１２０１を含むことが見出 された。プラスミドｐＬＰ　１２０１をＨｉｎｄ　ＩＩＩ酵素及びＮｒｕＩ酵素 によ９消化した。この両者はｐＢＲ３２２由来の配列を切断した。線状化された ＤＮＡを４種類のｄＮＴＰの存在下でＤＮＡポリメラーゼ■Ｋｌｅｎｏｗ断片に よりさらに処理して平滑末端化断片を生成せしめた。このように処理されたｐｔ 、ｐ　１２０１からの大断片をり８ル上でＮ製し、そして次に、Ｍａｎｉａｔｉ ｓ等（１９８２）前掲により記載された≦Ｆ滑末端連結条件を用いて、前記の処 理されたヒト成長ホルモン配列と連結した。得られたシラスミドを用いてＥ、コ リに〜１２　Ｃ８４１２株を形質転換した。表現形質においてアンピシリン耐性 であってテトラサイクリン感受性である形質転換体を制限分析によりさらに特徴 付けた。

１つのクローンがｐＳＹＣ７０９と称するシラスミドを有し℃いた。このグラス ミドを第４図に示す。ｐｓｙｃ７０９は、ｈＧＨ遺伝子をベクターＤＮＡに連結 するクローニングの結果としてユニークＨｉｎｄ　ｍ部位を有する。

このプラスミドはさらにユニークエＥｃｏ　ＲＩ部位を有す２ る。Ｅｃｏ　ＲＩ部位及びＨｉｎｄ　Ｉｎ部位の両者は切断することができ、そ して新しい断片を挿入することができ、そしてこれはヒト成長ホルモン遺伝子の コード配列の上流に位置するであろう。この構成はその後の発現作用を促進する 。

例　■ ベニシリナーゼシグナル啄ノチド及び成熟ｈＧＨｉ　伝子間の融合遺伝子を含有 するプラスミドの造成。シラスミドｐｓｙｃ　７２８及びｐｓｙｃ　７４４゜成 熟ｇＧＨ遺伝子をコードする配列を含有するプラ、ｘ　ミドｐＳＹＣ７０９の造 成を例■に記載する。このノラスミ１゛はＢ、ズブチリス、及びＥ、コリの両者 中で複製する。２個のユニーク部位、すなわちＥｃｏ　ＲＩ部位及び±ｎｄ　１ １１部位がｈＧＨ遺伝子の」−流に存在する。、プラスミド１）ＳＹＣ７０９を ＩＴｉｎ＋（Ｉ］ｌ酵素にＰ、勺消化した。

次に、サンプルの半分を、１１種類のｄＮＴＰの存在下でｐ２．−ｘ　ＩＪ　Ｄ ＮＡポリメラ〜七Ｉ　Ｋｌｅｎｏｗ断片で処理することにより末端を満たし、調 製物の他の半分はＳ１ヌクレアーゼで消化することによって単鎖突出端を除去し た。次に、画調製物を制限酵素旦姐ＲＩによりさらに消化した。これらの処理か ら生成した大ＤＮＡ断片を０．８％アガロースゲル上で両分し、そして電気泳動 により精製した。これらの方法によって調製されたこれらの標品は、（４）±！ Ｒ工によシ生成した末端、及びｆ（ｉｎｄ　ｎｌにより生成し満たされた末端を 含有するｐｓｙｃ　７０９０大断片；及び（Ｂ）　士ヱＲＩにより生成し端を含 有するｐｓｙｃ　７０９の大断片である。

別の実験において、ｐｅｎＰプロモーター、及びシグナル被プチドのコード配列 を含有するＤＮＡ断片を調製した。し１■に記載したシラスミドｐＤＨ５５０８ を１つの実験においてＮａｅ　Ｉで消化した。他の実、験においては、該シラス ミドをＨｐａ　Ｉｆで消化し、そしてＨｐａＩＩ　？Ａ化温調製物８１ヌクレア ーゼで処理して、突出末端を除去することによって平滑末端を生成せしめた。

次に、これらのＤＮＡ調製物を酵素Ｅｃｏ　ＲＩによりさらに消化し、た。被ニ シリナーゼプロモーター、及ヒシグナル４プチドをコードするＤＮＡ配列を含有 する断片を、２種類のｐＤＨ５５０８消化物のそれぞれからグル上での両分によ ！ｌｌ精製した。と王ＲＩ消化及１びＮａｅ　Ｉ消化により生成したｐｅｎＰ断 片を用いてプラスミドｐｓｙｃ　７４４を造成した。Ｅｃｏ　Ｉ酵素及びＨｐａ 　［１酵素により生成した断片を用いてプラスミドｐｓｙｃ　７２８を造成した 。

シラスミドｐｓｙｃ　７２８を造成するため、大断片（前記のようにして調製さ れたｐｓｙｃ　７０９の大断片）、及びｐＤＨ５５０８からのＥｃｏ　ＲＩ　− Ｈｐａ　ＩＩ　ｐｅｎＰ断片を使用した。これらの断片を一緒に連結し、そして 得られ５４ たグラスミドをＥ、コリに−１２／ＣＳ　４．１２細胞に形質転換した。ｐＤＨ ５５０８からのユニＲＩ　−Ｎａｅ　Ｉニゴ断片、及びＢ断片（前記のようにし てｐｓｙｃ　７０９から調製されたもの）を同様にして使用した。これらの断片 を連結し、そしてＬ三’Ｊ　Ｋ−１２／ＣＳ　４．１２細胞に形質転換した。

これらの実験からアンピシリンに耐性を有する形質転換体を選択し、そして精製 した後ＤＮＡを分析した。

第一の実験から生成した１つのクローンはｐＳＹＣ７２８と称するシラスミドを 含有しており、そして第二の実験からの１つのクローンはｐｓｙｃ　７４４と称 するプラスミドを含有していた。と扛らはｈＧＩ−Ｔ遺伝子への５′領域が変化 している点を除き、ノ°ラスミドｐｓＹｃ７０９につい−Ｃ第・１図に示したの と本質上同じ構造を有し。

ていた。ｐｓＹｃ７０９のものとＥｃｏ　ＲＩ　−、Ｈｉ　ｎｄ　Ｉ１１部位領 域が、両ノラスミドにおいては、啄ニンリナーゼの配列及び／グナルにフ０チド を含む断片Ｖこより置き換えられた。プラスミドｐＳＹＣ７２８についでは（第 ６図に示すように）　二Ｐ　−ｈ　ＧＨ連結部にも・ける配列はＧＣＡ、ＧＣＴ ＴＴＣである。ＧＣＡは、シグナルペプチド中の最後（３４位）のアミノ酸のコ ドンに対応する。修復されだＨｉ　ｎ　ｄ　Ｉ１１部位由来のＧＣＴはアラニン （Ａｌａ）をコードする。ＴＴＣは成熟ｈＧＨのＮ−末端Ｐｈｅをコードする。

配列ＧＣＡＧＣはＤ王４　ＨＩ制限酵素により認識されるので、プラスミドｐＳ ＹＣ７２８をＦｎｕ　４　ＨＩ酵素により消化した。シグナルペプチドニー１゛ 配列中期待される位置におけるこの酵素についての部位存在が同定された。この ことは、ｐｓｙｃ７上の融合ｐｅｎＰ−ｈＧＨ遺伝子が上記のような、そして第 ６図に示す期待された連結部配列を有することを証明するものである。

シラスミドｐｓｙｃ　７４４については、配列が正しいことを証明するために異 る方法を使用した。このものは、ｐｅｎＰ−ｈＧＨ遺伝子連結部に期待される配 列ＧＡＡＴＧＣＣＴＴＣを有し、この配列はシグナルペプチドの３２位の最後の ヌクレオチド、３３位の全コドン、及び：３４位の全コドン、並びに成熟ｈＧＨ 蛋白質について配列中の最初のコドンに相当する。制限酵素Ｘｍｎ　ＩはＧＡ、 ＡＮＮＮＮＴ、ＴＣ配列を認識するので、フ０ラスミドｐｓＹｃ７４４をＸｍｎ 　Ｉ酵素で消化した。制限部（！ｒのａ在が予定のｆ〃置に見出された。このこ とｉＪ２、−上に示したそして第６図に示すＰＳＹＣ７４４中の配列を実証すル 波プチドのため配列を担持する７°ラスミドｐＳＹＣ７２０の造成。

プラスミドＰＳＹＣ６６０（例■）をＢａｎ　ＨＩ酵素により消化した。この酵 素は、シグナルペア０ヂドの２６位及び２７位のアミノ酸のコドンに対応する位 置を切６ 断する。ＤＮＡ末端をＤＮＡポリメラーゼＩ　Ｋｌｅｎｏｗ　断片及びｄＮＴＰ により修復し、そして次に旦ｃｏ　ＲＩ酵素により消化した。二二Ｐニア″ロモ ーター、及びシグナルにプチドのための配列の一部分を含有する断片をケゞル溶 出により精製し、そしてＩ）ＳＹＣ７０９（例■）の断片と連結した。この断片 は、ｐｓｙｃ　７０９を±ｎｄ　Ｉｌｌ酵素で消化し、そしてに１ｅｎｏＷ断片 及びｄＮＴＰにより満たずことにより平滑末端化し、そしてＥｃｏ　ＲＩにより 消化することによって調製したものである。ｐｓＹｃ６６０由来のニＲ１−修復 二ｆ（Ｉ　Ｌ２８２７含有断片と、ｐｓＹｃ７０７の）く二ＲＩ−ｊω復匝皿Ｉ ＩＩ断片との連結をＴ　４１Ｊガーゼを用いて行い、そしてこの混合物を用いで Ｆ〕、コリコンピテントＣ８４］、２細胞を形ノア７］、転換し、／こ。

７０５　ス：’　Ｆ　１）ＳＹＣ７２０をイ］するアン上０ンリン１ｌｌｉ！件 １ｊ、；　’１転換体をさらＱζ特徴付け／３：ｏこのものは、二■）ブ°ロモ ーター、及びｐｅｎＰＳ、、７遺伝子由来の、変形された７ケ゛ナルにプチドの 最初の２８アミノ酸の／こめのコドン並０・りζこれに続く成熟成長ホルモン蛋 白質中に存在する円］ｅ−Ｐｒｏ　・配列のためのコドンを担持する。

ｐｓｙｃ　７２０中の融合遺伝子のシグナル配列−ｈＧＨ連結部領域を第６図に 示す。

例　ＶＩ［［ シグナルペプチドのためのＤＮＡ配列を担持する融合遺伝子を形成するだめの生 体内組換の使用。プラスミドｐＳＹＣ７４８及びｐ　ＳＹＣ７７８゜融合遺伝子 にシスティン　−セリン、７変異を導７ 人するために、一対の親プラスミドからの単鎖ＤＮＡ間で作られたヘテロデュプ レックスを形質転換して生体・内で組換体を調製する方法を用いた。

ｐｅｎ　Ｐの野性型シグナル配列＆　Ｑ’　ｈＧＨの蛋白質配列をコードする融 合遺伝子をＪｌ持するシラスミドｐＳＹＣ７２８及びｐｓＹｃ７４１Ｉの造成を 例ＶＩ　Ｋ記載する。

Ｓ　ｅ　ｒ　２７変異をイｊする変形されだｐｅｎＰからのシグナルペプチド： −１−ド配列を用いて同様の借成物を゛調製した。これらかプラスミドｐｓＹｃ ７７８及びｐＳＹＣ７４８であり、これらはそれぞれプラノ、ミドｐＳＹＣ７２ ）３及びｐｓＹｃ７／ＩＩ＋から８秀、！！ｊ−てれる。これらのシラスミドを 第６図に示す。これらのプラスミドを造成するために、ヘテロデープレックス化 さｔ′１だプラスミド中での生体内遺伝的組換を許容する方法を用いた。これを 達成するためにプラスミドｐｓＹｃ７１６及びｐＳＹＣ７４２を作シグナル配列 （５ｅｒ２７変異）を含有する断片をプラスミドｐＢＲ３２２にクローニングす ることによってグラスミドｐｓＹｃ７１６を造成した。ｐ　ＢＨ３２２ベクター ＤＮＡをまずＣ１ａ　Ｉ酵素及びＥｃｏ　ＲＩ酵素によ９消化し、次にこのＤＮ Ａを４種類のｄＮＴＰの存在下でＤＮＡポリメラーゼＩ　Ｋｌｅｎｏｗ断片によ シ修復することによってＤＮＡ断片上に平滑末端を形成した。別の実験において 、ｐｅｎ　ＰＳ２７におけるＣ７０２７から５ｅｒ２７への変異が導入されてい る点を除きプラスミドｐＳＹＣ３１０−２［ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ等（１９８２ ）前掲参照のこと〕　と含む多くの部位をこのシラスミドにおいて認識する。

Ａｖａ　Ｉは、ｐｅｎＰ遺伝子中の６１位のアミ′ノ酸及び６２位のアミノ酸の コドン対応するコード配列中に位置する［　Ｋｒｏｙｅｒ　Ｊ、、及びＣｈａｎ ｇ　Ｓ、　（１９８１）前掲〕。次に、消化されたＤＮＡ断片をＤＮＡポリメラ ーゼＩ　Ｋｌｅｎｏｗ断片によシ修復してすべての断片上に平滑末端を形成した 。ｐｅｎ　Ｐプロモーター、及び最初の６２アミノ酸のコード配列を含む断片を ケゝル上での画分の後に分離した（グル溶出を使用）。このようにＤＮＡポリメ ラーゼＩ　Ｋｌｅｎｏｗ断片とｄＮＰＴとによシ平滑末端化しておいたｐＢＲ３ ２２ＤＮＡに連結した。生成したプラスミドをＥ、コリに一１２／Ｃ８４１２細 胞に形質転換し、そしてこれからアンピシリン耐性であシ且つテトラサイクリン 耐性である形質転換体を分離し、ｐｓＹｃ７１６と称するプラスミドを同定した 。

このプラスミドはｐＢＲ３２２配列を含有するが、　（修それに接して、ｐｅｎ 　ＰＳ２７の５７−末端から５′側のＥｃｏ　ＲＩ部位、及びＨｉｎｄ　ｌ１１ 部位を有する。

シラスミドｐｓＹｃ７４２を造成するために、ゾラスミーゼの最初の６２アミノ 酸のコード配列を含有する断片と連結した。連結、及びコンビテン）Ｃ８４１２ 細胞への形質転換の後、１つのペニシリン耐性形質転換体からの精製されたプラ スミドＤＮＡ　（グラスミドｐＳＹＣ７４２と称する）は予想通シの構造を有す る。

ｐｓＹｃ４２１中のＥｃｏ　ＲＩ部位とＨｉｎｄ　■部位との間に位置する短配 列はｐｓＹｃ７１６に由来するものであってμ＝ｎ　ＰＳ２７配列を含有し、そ して大Ｅｃｏ　ＲＩ　−Ｈｉｎｄ　ＤＩ断片はｐｓＹｃ７０９に由来する。

親プラスミドｐＳＹＣ７４２をＨｉｎｄ　［［酵素によシ完全消化し、そしてＳ Ｌヌクレアーゼで処理することによって突出端を除去して末端を平滑末端化した 。

別の実験において、第２の親プラスミドであるプラスミドｐｓＹｃ７４４をＥｃ ｏ　ＲＩ酵素で消化し、そしてＳ１ヌクレアーゼで処理することによって平滑末 端化した。これら２つの平滑末端化された線状ＤＮＡをおよソ等モルにおいて（ ＤＮＡ濃度約１０μ、！ｉｌ　／ｒｎ（！　Ｋ　オイて）混合し、そしてＤＮＡ 溶液を収容１−だ試験管を沸騰水浴に２分間入れることによって加熱し、そして 加熱によって形成された単鎖のアニーリングによってホモデュルノクス及びヘテ ロデュプレックスの形成が可能となるように徐々に冷却（数時間にわたって室温 まで）した。ホモデュプレックスは両方の鎖が同一の親プラスミドに由来する二 重鎖ＤＮＡ　。

すなわちＡＡ、又はＡ′八へを有する。平滑末端であるためホモデュプレックス は環化できない。ヘテロデュプレックスは各鎖が別々の親シラスミドに由来する 二重鎖デュプレックスＤＮＡ　、すなわち晶′、又はＡ’Ａを有する。ｐｓＹｃ ７４２及びｐＳＹＣ７４４間のヘテロデュプレックスは環化する。生成するヘテ ロデュプレックスの１つの形を第３図に示す。図に示すように、突出尾部、単鎖 ギャップ、及びアミノ酸２７のコドンの中央ヌクレオチドにおける不適正が存在 する。

ホモデュプレックスＤＮＡ　、及びヘテロデュプレックス環化ＤＮＡの混合物を Ｅ、コリに一１２／Ｃ８４１２細胞に形質転換する。線状ホモデージレックスは 、ヘテロデュプレックス環の約０．０１という低い頻度で形質転換する。アンビ アリン耐性形質転換体をプレート上で選択し、そして・形質転換体の１つをさら に特徴付けた。ｐＳＹＣ７４８と称するこの形質転換体からのシラスミドは第３ 図に示す構造を有し、プラスミドｐＳＹＣ７４４のそれに類似しておシ、突出尾 部の生体内除去、単鎖ギャップの修復、及び不対合の修正によシ生ずる。２７位 における不適正の修正により、ｐＳＹＣ７４８は−Ｂａｍ　ＨＩ部位を接待し、 この遺伝子にＳ　ｅ　ｒ　２７変異が存在することが示される。Ｓ　ｅ　ｒ　２ ７変異の導入は、この位置における野性型塩基対に対応するコード鎖において不 適正塩基対を有するヘテロデュプレックスＤＮＡによる形質転換の結果である。

ノラ、スミドｐＳＹＣ７４２はこの位置にセリンのコドンＴＣＣを有し、他方シ ラスミドｐＳＹＣ７４４はシスティンをニー　ドするＴＧＣを有する。生体内Ｄ ＮＡ修復過程は、ヘテロデュプレックス中に存在する２つの鎖のいずれ６２ か一方のＤＮＡ配列に従って不適正を修正する。

Ｓ　ｅ　ｒ　２７変異を含有するプラスミド（ｐＳＹＣ７４８）　は新たなりａ ｍ　ＨＩ部位の存在によって同定した。

同様の方法を用いて、プラスミドｐＳＹＣ７４２とシラスミドｐＳＹＣ７２８と の間でヘテロデュプレックス組換を行った。ｐＳＹＣ７２８をＥｃｏ　ＲＩによ り線状にし、　そしてＳ１ヌクレアーゼ処理によシ平滑末端化した。

ｐＳＹＣ７４２を）（ｉｎｄ　ｌｌにより平滑末端化し、そしてＳ１ヌクレアー ゼ処珪によシ平滑末端化した。次に、ｐｓＹｃ７４２とｐＳＹＣ７４４について 前記したのと同様にして、得られた断片を用いてヘテロブーツ０レツクフ組換を 行った。形質転換にＥ、コリに一１２／Ｃ３４１２を使用１〜そして選択にアン ピシリン耐性を用いた。再び、生体内で突出尾部を除去し、単鎖ギャップを満た し、キ１〜で不適正（２７位における）を修正した。アンピシリン耐性形質転換 体からｐＳＹＣ７７８と称するプラスミドを分離した。ｐＳＹＣ７７８はｐＳＹ Ｃ７２８に類似する配列を有するが、ｐＳＹＣ７７８はＳ　ｅ　ｒ　２　ｙ変異 を獲得している。従って、この生体内組換を用いて２種類の誘導体組換シラスミ ドが造成され、これらのそれぞれがｐｅｎ　ＰＳ２７のシグナルと成熟ｈＧＨの コード配列とから成る融合遺伝子を担持する。シラスミドｐＳＹＣ７７８におい て、融合遺伝子ｐｅｎＰＳ２７シグナルペプチドの３４アミノ酸のだめのＤＮＡ 配列及びそれに続くアラニンそして次にフェニルアラニン及びｈＧＨ配列の残り のだめの配列を有する。プラスミドｐＳＹＣ７４８において、融合遺伝子はｐｅ ｎ　ＰＳ２７シグナル被プチドの３４アミノ酸のだめのＤＮＡ配列及びそれに続 く完全な成熟ｈＧＨ蛋白質のだめの配列を有する。ｐＳＹＣ７４８及びｐＳＹＣ ７７８上の融合遺伝子の一部分を第６図に示す。

プライマー指令変異誘発のだめの追加のオリゴヌクレオチド。

次のオリコゝヌクレオチドを、Ｍ、　Ｍａｔｌｅｕｃｃ及びＭ、Ｃａｒｒｕｔｈ ｅｒｓ　、Ｊ、Ａｍ、Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｓｏｃ、　、１０３　＋３１８５−３ ９９１　（１９８１）の方法に従って、自動合成機（ビオサーチ社、サンラフア ニル、カリポルニア製モデル・サムワン）を用いて調製し、た。

３’−ＧＴＣＣＴＡＧＡＧＧＡＴＴＧＴＴ−５’　（オリゴヌクレオチド５２７ Ｐ２８と称する）；及び ３’−ＧＣＡＧＣＧＣＧＧＴＣＴＡＧＡＡＣＧＴＣＣＴ−５’　（オリコゝヌク レオチドＰＤ２４と称する）。

さらに、次のオリコゝヌクレオチドを、オリゴヌクレオチド５２７Ｐ２８、及び ＰＤ２４と同じ方法にょＩ）調製した。

３’−ＡＡＣＧＴＣＣＣＣＧＣＧＧＡＴＴＧＴ−５’　（オリゴ８ヌクレオチド Ａ２７Ｐ２８と称する）。

４ シグナルペフ０チドをコードするＤＮＡ配列中に変異を有する追加のＢ。リケニ ホルミス７４９／Ｃ−２ニンリナーゼ遺伝子及びこの変異した遺伝子を含有する ベクター Ａ、　２７位にセリンを有しそして２８位にプローリンを有する変異体（ｐＳＹ Ｃ９４７） 前記の例■の方法〔本質上Ｚｏｌｌｅｒ及びＳｍ１ｔｈ（＋９８）。

にプライマーとしての、例■において調製した５′−燐酸化オリゴヌクレオチド ５２７Ｐ２８を用いて、プライマー指令変異誘発を行った。投ニンリナーゼ遺伝 子中のコドン２７及び２８における配列５’−ＴＣＣＧＣＴ−：＋／［す乃：わ ち、Ｓ　ｅ　ｒ　２７−ベリジリナーゼのシグナル配列中のアミノ酸２７　（Ｓ ｅｒ　）及び２８　（Ａｌａ　）に対応するコドン〕がＳｅｒ及びＰｒｏのため の５ｌ−ＴＣＴＣＣＴ　−３’に変化しているＭ１３　ＲＦ’−ＤＮＡを分離し た。

この変異体のスクリーニングは、Ｚｏｌｌｅｒ及びＳｍ　ｉ　ｔｈ（１９８Ｆ、 ）、前掲、　Ｃｉ　４．９２頁、６４９３頁及び６７１９６頁、に記載されてい る方法に従って、７０ローブとして放射性ラベルオリゴヌクレオチド５２７Ｐ２ ８を用いて、ＤＮＡ−オリゴヌクレオチドバイブリド形成ブロービング法によシ 行った。変異した共有結合物に閉環した環状二重鎖ＲＦ−ＤＮＡにょシ形質転換 されたＥ、コリＪＭ１０３の培養物の上清中のファージから単鎖ＤＮＡを分離し た。このスクリーニング法によって分離されたファージが二Ｐ８２７Ｐ２８を有 する所望のファージであることの確認は、分離ファージのＲＦ−ＤＮＡの制限分 析によシ得られた。この分析にょｐ１予想通１）　Ｂａｍ　ＨＴ部位が喪失して いることが示された。ｐｅｎ　ＰＳ２７中のアミノ酸２６．２７のコドンば５　 ’　−ＧＧＡＴＣＣ−：３　’である。この配列６匣１（Ｉの認識配列である。

ｐｅｎ　Ｐ８２７Ｐ２８においてはセリン２７のコドンがＴＣＴに変化している から、±＋ｍＨＩ部位が喪失する。イ１ｆられたツアー）をＭ１３　ｐｅｎ　Ｐ Ｓ２７Ｐ２Ｆ、ト称する。

フ０シスミドｐＳＹＣ６６（１’ｊ：、）世ｉｌｌにおいで前記（−１／仁よう に（７てＢａｍ　ＨＩにより部分消化１〜だ。完全消化の／こめの［票準的条件 下で制限酵素を用いたが、冗全消、化のために必要な時間のおよそ半分より短い 時間にわたって反応を行った。部分消化されたン°シスミ１゛の１＆着末端をＥ 、コリ　ＤＮＡポリノラーゼＩ　Ｋｌｅｎｏｗ　断片及び必要なｄＮＴＰを用い て修復した。得られ／こ平滑末端線状′プラスミドをＴ　４．　ＤＮＡ　リガー ゼを用いて連結した。得られたプラスミドを用いてＥ、コリに一１２／Ｃ３４１ ２細胞を形質転換した。形質転換体をアン１？シリン耐性についてスクリーニン グし、そして次に１個６６ のＢａｍ　ＨＩ部位を有するプラスミドについてスクリーはｐｅｎ　ＰＳ２７遺 伝子中のセリンのためのコドンに存在しく前記例■を参照のこと）、他方はｐｅ ｎ　ＰＳ２７遺伝子を含有する約１．３２　ｋｂｐ　（キロ塩基対）のＨｉｎｄ ｌＩ［−Ｂａｍ　ＨＩ断片の一端に存在する。Ｂａｎ　ＨＩ部分消化によりμ＝ 　ｎ　ＰＳ　２　ｙのセリン、７コドンにおけるＢａｍＨＩ部位において切断さ れたシラスミドはアンピシリン耐性を有していないはずである。この耐性はベニ シ゛リナーゼ遺伝子によシもたらされ、この遺伝子は、遺伝子が上記のように切 断されそして次に連結された（修復された平滑末端を用いて）後には発現できな いからである。従って、アンピシリン耐性につい質転換体のみが残る。選択され た形質転換体の幾つかは、ｐＳＹＣ６６０中の他のＢａｍ　ＨＩ部位、すなわち 約１３２０　ｂｐの±ｎｄ　１ｌ−Ｂａ二ＨＩ断片の一端の竺ＨＩを喪失してい るシラスミドを担持する。単一のＢａｍ　ＨＩ　８位に有するシラスミドに関し て形質転換体をスクリーニングすることによシブラスミドｐＳＹＣ６６７が分離 される。

プラスミドｐＳＹＣ６６７はｐｓＹｃ６６０と次の点を除き同じである。ｐｓＹ ｃ６６０中の約１３２０ｂｐ坦憇■−貼二ＨＩ断片の末端における加ＨＩ認識配 列（５’−ＧＧＡＴＣＣ−３′）の代りに、ｐｓＹｃ６６７は配列５′−脈ＧＡ Ｔｃｃ−３′■及びＢｇｌ　ｌ認識部位を保持している（例ｎ、前記。

を参照のこと）。同様に、μ巳Ｐ８２７Ｐ２８遺伝子を含。

有するＭ１３里ＰＳ２７Ｐ２８の現憇■−貼ユＨＩ　断片は、ｐｓＹｃ６６７中 の一且υす■−とＨｊｐｔ五””’２７含有含有中のＰｓｔ　Ｉ部位及びＢｇｌ 　１部位と同じ位置にそれぞれ一一一一一−−■■塾−−轡１■■■鴫−■Ｐｓ ｔＩ部位及び、シ已■部位を有する。

ｐＳＹＣ６６７をＰｓｔ　Ｉ及びＢｇｌ　ｌで切＋ＵＴＬ、そして大断片をケゝ ル溶出によシ分離した。

Ｍ１２μ”Ｐｓ２７Ｐ２８を一片りＩ及びシ±■にょ多切断し、そして小ｐｅｎ Ｐ８２７Ｐ２Ｂ断片を含有する断片をグル溶出により分離した。

ｐＳＹＣ６６７からの大Ｐｓｔ　Ｉ−Ｂｇｌ　ｌ［断片、及び　ｊＭ１３県ＰＳ ２７Ｐ２８からの小ｐ、ｔ　Ｉ　−Ｂｇｌ　ＩＩ断片を、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを 用いて連結し、そして得られたプラスミドＥ、コリに一１２／Ｃ８４１２に形質 転換した。形質転換体をケンピシリン耐性に関して選択した。さらに検討するた めに選ばれた１つの形質転換体はシラスミドｐＳＹＣ９４７を含有し、−このプ ラスミドは予想通８ 部位を有しない。ｐＳＹＣ９４７はｐＳＹＣ６６７と同じであるが、ｐＳＹＣ６ ６７中のμ己ＰＳ２７遺伝子がｐＳＹＣ９４７においてはｐ　ｅ　ｎ　ＰＳ　２ ７　Ｐ　２８によシ置き換えられている。

ｐＳＹＣ９４７上の一程狸ＰＳ２７Ｐ２８遺伝子の部分を第５図に示す。ｐＳＹ Ｃ９４７の表示中日で囲んだ「１」を付したＴＣＧコドンは、Ｂ、リケニホルミ ス大エキソベニシリナーゼのＮ末端セリンをコードする。ｐＳＹＣ９４７の表示 中の、ＴＣＴＣＣＴから左、ＯＣＴとＴＣＧの間、及びＴＣＧから右の水平の線 は、第５図中ｐｓＹｃ３１０−２について示された配列によって例示される野性 型遺伝子における同じ位置のヌクレオチド配列と同一のヌクレオチド配列を示す 。

Ｂ、２７位にアラニンを有しそして２８位にノロ−リンを不する変異体（ｐｓＹ ｃ９＝１７Ａ　）例Ｘ（Ａ）、前記、の方法を用いて、ゾライマー指令変異誘発 を行ってＭ１３とＰＡ２７■）２８と称するＭ１８ファージを調製する。このフ ァージは、コドン２６においてグリ７ンのＧＧＡからグリ７ンＧＧＧに変異して おシ、コドン２７においてシスティンの１’ＣＧからアラニンのＧＣＧに変異し ており、そしてコドン２８においてアラニンのＧＣＴからグローリンのＣＣＴに 変異しているＢ、リケニホルミス７４９／Ｃ由来のベニンリナーゼ遺伝子を担持 する。この方法は、例■から０５’−燐酸化オリゴヌクレをチドＡ２７Ｐ２８、 及びファ７ジＭ１３μ五ＰＡ２７（例■）からのＤＮＡを用いて実施する。得ら れたファージＭ１３ｐ＋己ＰＡ２７Ｐ２８のＲＦ−ＤＮＡは、ファージＭ１３二 ＰＡ２７のＲＦ　−ＤＮＡ中約３１０ｂｐ及び３４０　ｂｐの長さの２個のＡｌ ｕ　Ｉ制限断片の代シに、約６５０　ｂｐの長さのＡｌｕ　Ｉ制限断片を有する 。さらに、ファージＭ１３ごＰＡ２７Ｐ２８ＲＦ　−ＤＮＡは、ファージＭ１３ μ二ＰＡ２．　ＲＦ　−ＤＮＡが含有しない匣■制限部位を含有する。これらの 制限部位の相違は１、ピＬＰＡ２７中のアミノ酸２６．２７及び２８のコドンの 配列（ｓ’−ａａｈａｃｒａｃｒ−３’　）と県ＰＡ２７Ｐ２８のそれ（５ｌ− ＧＧＧＧＣＧＣＣＴ−３’　）との比較から明らかである。

これらの制限部位の相異はＡ２７Ｐ２８変異を獲得（−だファージを同定するた めに使用される。　゛プラスミドｐｓｙｃ３ｉｏ−２をＨｉｎｄ　ｉｌｌ及び） ３ａｍ　ＨＩで消化１．そして大断片をケ゛ル溶出によ如分離する。

Ｍ１３ｐｅｎ　ＰＡ２７Ｐ２８　ＲＦ　ＤＮＡを１（ｉｎｄ　ｉｌｌ及びＢａｍ 　Ｈ，ＩｐｓＹｃ３１０−２からの太Ｈｉｎｄ　ｉｌｌ　−Ｂａｍ　ＨＩ断片、 及びＭ１３ヱ畠ＰＡ２７Ｐ２８からの約１３２０　ｂｐの肋す■−Ｂａｍ　ＨＩ 断片をＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結し、そして得られたプラスミドをＥ、コ リに一１２／ＣＳ　４１２に形質転換する。形質転換体をアンピシリン耐性に関 して選択する。さらに検討するため１つのアンピ７リン耐性形質転換体を選択し 、そしてこれがプラスミドｐＳＹＣ９４，７Ａを含有することを見出す。このプ ラスミドは、シラスミドｐｓＹｃ６６０ＡのＮａｒ　Ｉ消化においでは見出され ない約１０５０　ｂｐの長さのＭａｒ　Ｉ制限断片を有する。これはｐｓｙｃ　 ９４７　Ａ中の二ＰＡ２７Ｐ２８中のＮａｒ　Ｉ部位の存在の故に期待された通 りである。

ｐｓｙｃ　９４．７　Ａ上のｐｅ　ｎ　ＰＡ２　ｙ　Ｐ　２　Ｂ遺伝子の部分を 第５図シグナル配列中の３４位のアラニンの後に融合したポリペノチドは、Ｂ、 リケニホルミス７・１９／Ｃの野４７４−型−ｐニシリナーゼのシグナル配列中 の３１１位のアラニンの後に融合した同じ醪すペプチＩ′上りも高い効率で分泌 されるであろう。ｐＳＹ０９４７Ａ上のｐｅｎＩ）Ａ２７Ｐ２８により発現され る被ニンリナーゼの、該シラスミドに、１：　ｐ形質転換されだＥ、＝Ｉり及び Ｂ、ズブグーリスの両者によｐ分泌される部分は、野性形ｐｅｎＰ遺伝子により 発現される梨ニゾリナーゼの、フ０ラスミド（例えば野性型−遺伝子を含有する ｐｓＹｃ３１０−２　）によシ形質転換された場合にそれぞれの菌株において分 泌される部分より犬であろう。

Ｃ２２３位のアラニンと２４位のロイシンとの間に挿入されたジ被ゾチドＮＨ２ ・−Ｐｒｏ　Ａｓｐ　−Ｃ０ＯＨを有し、そして２７位においてソステインでは なくセリンを有する変異体（ｐＳＹＣ９５７） 例Ｘ（５）、前記、の方法を用（ハて、ゾライマー指令変異誘発を行いＭ１３二 ＰＳ２７　：　’　ＰＤ２４と称するＭ１３ファージを調製した。このファージ は、アラニンのコドン２３　（ａｃａ　）とロイ７ンのコドン２４．　（ｃｒｒ ）との間へのプローリン及びアスノｅラギン酸の２つのコドン（５’−ＣＣＡＧ ＡＴ−３’　）の挿入によシ変異し、そしてコドン２７（変異した遺伝子のコド ン２９）においてＴＣＧ　（ンステイン）からＴＣＣ（セリン）に変異したＢ、 リケニホルミス７４９／ｃ由来の被ニゾリツーーゼ遺伝子を相持する。

この方法は、例■からの５７−燐酸化オリコ゛ヌクレオチ１゛ＰＤ２７、及０’ 　７−ｒ−ジＭ、１．３　ｐｅｎ　ＰＳ２７　（例■）からのＤＮＡを用いて実 施した。

目的とするｐｅｎ　ＰＳ２７：　：　ＰＤ２７を含有するＭ↓３ファージのＲＦ 　−ＤＮＡは瞥ＰＳ２７中のコドン２６及び２７目的の変異遺伝子を有する７ア ージのスクリーニングは、例Ｘ（Ａ）、前記、におけるようにＺｏｌｌｅｒ及び Ｓｍ１ｔｈ　（１９８１）のバイブリド形成グローブ技法を用いて、放射性ラベ ルオリゴヌクレオチ・トＰＤ２４ニ２ よシ実施した。このスクリーニング法により単離されたファージが目的のＭ１３ 二ＰＳ２７：：ＰＤ２４ファージであることの確認は、ファージのＲＦ　−ＤＮ Ａの制限分析によシ得られた。これによＩ）　、Ｍ１３　ｐｅｎＰＳ２７又はＭ １３−　ＣＭＩ　ＲＦ　−ＮＡＮに比べて追加の期待されたＢｇｌ　１１部位が 示された。

例Ｘ（Ａ）、前記、からのシラスミド゛ｐＳＹＣ６（５７を、Ｂａｍ　ＨＩで消 化し、そしでＨｉｎｄ　１１１で部分消ｆヒし、そして大断片をケ゛ル溶出によ シ分離した。（部分消化（は、完全消化のための標準的な条件下での反によシ、 し７かし完全消化のために必要な時間の子分より短く限定さ、ｔＬだ１１、冒； １」にわ］（二って行った。）ファージＭ　１３μ望ＰＳ２７：：円〕２４のＲ Ｆ　−ＤＮＡをと初の２８アミノ酸のコード配列を含ｂ゛する約３２０ｂｐの小 断片をケ゛ル溶出に、Ｌり分ｔ４１１シ、た。

Ｃ８４１，２を形質転換し、そして形質転換体をアンピッリン耐性及びクロラム フェニコール耐性から選択した。をらに検討ｊ−るために、］つの］アンピリリ ン耐性−クロラムフェニコール耐性形質転換を選択し、プラスミドｐＳＹＣ９５ ７を含有することを見出した。このシラスミドはプラスミドｐＳＹＣ６６７と同 一であるが、但しｐｓＹｃ６６７中のｐｅｎＰＳ２７遺伝子がｐＳＹＣ９５７に おいノ０ラスミ１ゝｐＳＹＣ９５７上の二ＰＳ２７：：ＰＤ２４遺伝子の一部分 を第５図に示す。

プチドコード配列及びヒト成長ホルモンコード配列を含有する追加の融合遺伝子 、及びこの融含遺（ｒζ子を含んで成る）゛う７ミド。

Ａ、　ヒト成長ホルモンの：Ｉ−１゛配列に融合Ｌノζ、ｐｅｌｌ　ＰＳ２７　 ：：　ＰＤ２４によりコ−１″されるシグナル配列の１３０個のＮ−末端アミノ 酸をコードする配列を自するシラスミド（ｐｓＹｃ９７０　）。

ポリメラーゼＩ　Ｋｌｅｎｏｗ［ｌｊ片及び４種のｄＮＴＰを用いて修復した。

次に、生成した平滑末端化された線状７４ また該シラスミド上にユニーク部位を有し、これはプラスミドｐｓｙｃ　３１０ −２上のユニークＥｃｏ　ＲＩ部位に対応する。［ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ等（１ ９８２）、前掲；これはｐＳＹＣ６６７及びｐｓＹｃ６６０　（例■及び例Ｘ　 （Ｃ）を参照のこと）を介してｐＳＹＣ９５７に関連する。〕次に、シラスミド ｐｓＹｃ７０９　（例■）を、該フ０ラスミド上ポリメラーゼＩ　Ｋｌｅｎｏｗ 断片及び４種のｄＮＴＰによシ修復した。次に、平滑末端化された線状化プラス ミドをそのユニーク部位（第４図参照のこと）におい断片と混合し、そして平滑 末端連結に適する条件下でＴ　４　ＤＮＡ　＋）ガーゼを用いて連結を行った。

得られた混合物を用いてＥ、コＩＪ　Ｋ−１，２７Ｃ８４１２を形質転換し、そ して形質転換体をアンピシリン耐性に関して選択した。さらに分析するために１ つのアンピシリン耐性形質転換体を選択し、そしてこれがｐｓＹｃ９７０を担持 することを見出した。

プラスミドｐｓＹｃ９７０を第６図に示す。これは次の点を除きｐｓＹｃ７２０ と同一である。ｐｓｙｃ　９７０　によシニードされる変異ベニンリナーゼシグ ナル配列は、ｐｓＹｃ７２０によシニードされる変異被ニシリナーゼシグナル配 列に比べてさらに２個のアミノ酸、すなわち２４位のプローリン及び２５位のア ス・ぐラギン酸を有する。

シグナルペプチドをコードしそしてヒト成長ホルモンのだめの配列に融合してい るｐｓｙｃ　９７０上の配列はｐｅｎ　ＰＳ２７：　：　ＰＤ２４によシニード されるシグナルペプチドの最初の３０個のＮ−末端アミノ酸をコード末端Ｐｈｅ を有する成熟ヒト成長ホルモンである。

Ｂ、　ヒ【成長ホルモンをコードする配列に＃＋ｌｊ！合し、ており　、ｐｅｎ 　ＰＳ　２　ｙＰ　２８によシニードされる／グナルペプチドヲ該シグナルペプ チドのカルボキシ末端にある追加のアラニンと共にコードする配列を有するプラ スミドｐＳＹＣ９６２゜ ｐｓＹｃ３１０−２中のユニーク基ｃｏ　ＲＩに対応するユニークＥｃｏ　ＲＩ 部位を有する。このプラスミドはさラニペニシリナーゼのアミノ酸７１及び７２ に対応するコロ トンにＭｓｐＩ部位（さらに、Ｈｐａ　１部位）を有する［　Ｊ、　Ｋｒｏｙｅ ｒ及びＳ、　Ｃｈａｎｇ（１９８１）　、前掲〕を有する。約４５０　ｂｐ　Ｅ ｃｏ　ＲＩ−Ｍｓｐ　Ｉ断片をグル溶出によシ分離した。

プラスミドＩ）ＳＹＣ７０９（例■）を、ユニークＥｃ。

ＲＩ部位（第４図参照のこと）において消化し、そし腔ＲＩ−聾■消化ｐｓＹｃ ７０９に加え、そしてＴ４ＤＮＡ　リガーゼを用いて連結を行った。得られたシ ラスミドによりＥ、コリに一１２／Ｃ８／Ｊ］２を形質転換し、そして形質転換 体をアンビアリン耐１」招・ζついて遠択シ１．た。Ｌつのアンピシリン耐性形 質転換体をさらに試験し、ｐＳＹＣ９５６と称するプラスミドを含有するこｐＳ ＹＣ９５６ｌ″ｊ：、そのユニーク旦上ＲＩ部位とそのの３５位のアラニンに対 応するコドンＧＣＴとの間に有するのと同一の配列を有する。但し次の点におい て相違する。（ｉ）　ｐｓＹｃ９５６は二””２７Ｐ２８　（第５図中ｐＳＹＣ ９４７を参照のこと）によりコートされるシグナルペプチドをコードする配列を 有するが、ｐＳＹＣ７７８はｐ　ｅ　ｎ　Ｓ　２７　（第２図中ｐＳＹ０６６０ を参照のこと）によシニードされるシグナルペプチドをコードする配列を有し、 この相違はｐＳＹＣ９５６におけるシグナル配列コード中のコドン２７及び２８ におけるＴＣＴ　ＣＣＴからｐＳＹＣ７７８における同じ位置のコドン中のＴＣ ＣＧＣＴへの変化に関する。（ｉｉ）　Ｉ）ＳＹＣ９５６は、形変されたシグナ ル配列中３４位のアラニンのコドン（！：　ｐＳＹＣ９５６及びｐＳＹＣ７７８ の両者における成熟ヒト成長ホルモンのＮ−末端フェニルアラニンのコドンＴＴ Ｃとの間に１、　］、　７　ｂｐを有するが、ｐｓｙｃ　７７８は、この１１７ 　ｂｐソペ−’／リナーゼ（Ｋｒｏｙｅ及びＣｈａｎｇ、　１，９８１　、前掲 参照のこと）の最初の３３３個のＮ−末端アミ７ノ市をコードする〕、及び３′ −末端における翻訳終止シグナル（ＵＡＡ　）を欠いている。そして（ｉｉｉ） 　ｐＳＹＣ９５６はそのＥｃｏ　ＲＩ部位とｐＳＹＣ９４７山来Ｈ４ｎｄ　ＩＩ ］部位のＣとの間に約３０　ｂｐを有するが、これはｐＳＹＣ７７８土のｐｅｎ 　Ｐプロモーターに隣接するＥｃｏ　ＲＩのＴのすぐ後に存在しない。

プラスミドｐＳＹＣ９５６をＥｃｏ　ＲＩで線状化し、そして生成した突出端を 、このＤＮＡを５０μｊｑ　７ｆｎｌの濃度において２２℃にて３０分間、３０ ０　ｎＭ　ＮａＣ１、６０ｍＰＡＺｎＳＯ４及び５ＣｌｍＭ酢酸ナトリウムを含 有するｐＨ４，６７８ の緩衝液中Ｓ］ヌクレアーゼ（２２０Ｕ／ｍｌ）　によ逆処理することによって 除去した。Ｍａｎｉａｔｉｓ等（１９８２）」４０頁を参照のこと。３０分間の 後、ＤＮＡをフェノール抽出し、そしてエタノール沈澱せしめた。

プラスミドｐＳＹＣ７７８をＢａｍ　［により線状化しくｈＧＩＩコード配列中 の部位において）、そして生成した突出末端を、Ｅｃｏ　ＲＩで切断したｐＳＹ Ｃ９５６の突出末端と同様にして、Ｓ１ヌクレアーゼにより除去した。Ｓ１ヌク レアーゼ処理の後、ＤＮＡをフェノール抽出し、そしてエタノール沈澱せしめた 。

ｐＳＹＣ９５６及びｐＳＹＣ７７８からのＤＮＡペレットを、それぞ７１．２５ 　ｔｔ、！７７ｍｅとなるように、２０　ｍＭ　ｔ□リス。

１００　ｍＭ　ＮａＣｔ％及び０．５　ｍＭ　ＥＤＴＡを含有するｐＨ７５のア ニーリノグ緩衝液中に一緒に■懸濁（〜だ。

１．５ψｅのエッペンドルフ管中の溶液を沸腋水浴中で１分間加熱し、そしてさ らに９０℃の浴中で１〜３分間保持し、そして次に４時間にわたって徐々に；３ ０℃に冷却した。この処理によりヘテロデージレックス環状ＤＮＡが（ホモデー プレックスと共に）生成した。このホモデープレックスは線状化プラスミドの平 滑末端のために再現化できなかった。

ヘテロデープレックス環を含有するＤＮＡの混合物を使用してＥ、コリに一１２ ／Ｃ３４２１を形質転換した。

こノ場合、ヘテロデープレックスの生体内修復の間に組換プラスミドが形成され た。形質転換体をアンピシリン耐性について選択した。ζらに検討するために幾 つかのアンピシリン耐性形質転換体を選択した。１つがプラスミドｐＳＹＣ９６ ２を担持していた。このシラスミドは次の点を除きプラスミドｐｓｙｃ　７７８ と同一である。ｐＳＹＣ７７８上の変形されたｐｅｎ　Ｐ遺伝子中の２７位及び ２８位のアミノ酸のコドンＴＣＣＧＣＴ伝子中ではコドンＴＣＴ　ＣＣＴ　（Ｓ ｅｒ　−Ｐｒｏ　）により置き換えられている。第６図を参照のこと。

プラスミドｐｓｙｃ　９６２　ｉ　ｔだ、ＭＵ己のヘテロテ゛ユフ０レックス法 を用いて、ｐＳＹＣ９５６をＥｃｏ　Ｒ１で切断しそして次に８」ヌクレアーゼ ではなく４１．車のｄＮＴＰと共にＥ、コリＤＮＡポリンラーゼＩ　Ｋｌｃｎｏ ｗ断片を用いて平滑末端化したものと、ｐＳＹＣ７７８を一■で切１ｆＪｉ　Ｌ そして次に８１ヌクレアーゼ消化の代りにＡＴＰ及びＴＴＰと共にＫｌｅｎｏｗ 断片を用いて平滑末端化Ｉ−だものとによシ形成することもできる。

Ｃ０ヒト成長ホルモンをコードする配列に融合した、ｐｅｎＰＳ２７によりコー ドされるシグナル配列の２８個のＮ−末端アミノ酸をコードする配列を有するパ ーティジョンープロフィシエント（ｐａｒｔｉｔｉｏｎ　−ｐｒｏｆｉｃｊｅｎ ｔ　）プラスミド（ｐＳＹＣ８５２）増殖する細胞の培養において安定に維持さ れるた０ めに、プラスミドは、すべての分裂細胞の各娘細胞が少なくとも１コピーのグラ スミドを受領するようニ「パーティションプロフィシェント」でなければならず 、あるいは培養条件下で生存を続けるために培養中の細胞が有しなければならな い表現形質を提供しなければならない。

典型的には、遺伝子工学的手法により造成されたプラスミドは抗生物質（１種類 又は複数種類）に対する耐性のだめの１個又は複数の遺伝子を含有し、この遺伝 子は、該抗生物質耐性遺伝子を有するフ０ラスミドを担持しない細胞（この細胞 に前記）０ラスミドが形夕゛１転換されることが意図さノ′している）に対して 致命的である。このプラスミドは、培地中に抗生物質（この抗生物質に対しでプ ラスミド土の遺伝子が耐性をもたらす）を有することによつで、増殖する細胞の 培養中に維持される。プラスミドを有する細胞のみが生存を続ける。培地から抗 生物質が除去されれば、プラスミドかさらに［・９−ティジョンプロフィンエン トヨでない限り培養中プラスミドを担持する細胞の・ぐ−センテーノは、急速に 、典型的には約２５回の倍化の間に、しかし種々の速度においてＯに減少するで あろう。

抗生物質は高価であシ、そして遺伝的に操作されたプラスミドによシ形質転換さ れた細胞によシ生産された生成物（例えば、食品として又は医療的に使用するた めの蛋白質）の精製方法を複雑化するので、「パーティションプロフィシエント 」でｈｈ、そｔ。

て従って培地中に抗生物質を必要としないで、増殖細胞の培養中に安定に維持さ れるようなプラスミドを用いるのが有利である。

５４２　（１９８０）により同定された短ＤＮＡ断片によυプラスミドに付与さ れる。

Ｂ。ズブチリスを包介するグラト陽性細菌中のパーティションプロフィンエンン ーは、ン０ラスミドｐＯＧ２３８１土の約３５０　ｂｐのＨ４ｎｄ　ｌｌｌ　− ｆｔａｅ　Ｉ１１断片中に存在する短ＤＮＡ断片（この明紹ｌ　４：　ｉ４−　 、；ｌｂ・いて１−ｐａｒ−１断片と称する）によりゾ゛ラスミドに４１４さノ Ｌる。ノ０ラスミドｐＯＧ２３８１は、本出願の譲り受け人に譲渡された１９８ ３年２月２８日出願の米国！侍Ｊ汀出願！４７０，５７６号を基礎とする公表さ れたヨーロッ・Ｑ特許出願第００９５９４７号に記載されておシ、引用によりこ の明細書に組み入れる。

次の方法が、Ｈｉｎｄｌ［部位に便利に結合するｐａｒ断片含有配列を生成せし めた。

ン０ラスミドｐｏｃ　２３２６をＢａｍＨＩで消化し、そして８２ ゼ■Ｋｌｅｎｏｗ断片及び４種類のｄＮＴＰを用いて平滑末端化した。次に、平 滑末端化線状断片を、そのユニークＨｉｎｄ　ｍ部位においてＨｉｎｄ　ＤＩに よ多切断した。

線状断片の得られた混合物を、Ｈｉｎｄ　Ｉ［［及びＨａｅ　］１によ９消化さ れたｐＯＧ　２３８１の断片からダル溶出によ）（ｉｎｄ　ＩＩＩ　ｐａｒ断片 含有配列と、ｐＯＧ２３２６からの２個のＨｉｎｄ　ｌ１ｌ−平滑末端化Ｂａｍ 　ＨＩ断片とを、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて平滑末端連結に適する条件下で連 断片を有するシラスミドについてスクリーニングした。（Ｈａｅ　ＩＩＩ切断端 と平滑末端化Ｂａｍ　ＨＩ切断端との連結がＢａｍ　ＨＩ部位を再構成する。） このような形質転換体を見出し、そしてこれから、ｐＳＹＣ６７６と称する目的 プラスミドを分離した。

ｐＳＹＣ６７６は、ｐａｒを含有する叫ｎｄ　ｌｌ−Ｂａｍ　ＨＩ断片の外側で あってＨｉｎｄ　ｍ部位から数ｂｐの位置にポリメラーゼＩ　Ｋｌｅｎｏｗ断片 及び４種類のｄＮＴ’Ｐによシ満たし、そして末端をＴ　４　ＤＮＡ　ＩＪガー ゼを用いて平滑末端連結のための条件下で連結した。この方法の結果、Ｂａｎ　 ＨＩ部位（ＧＧＡＴＣＣ）が鮨■部位（下線を付した）　（ＧＧＡＴＣＧＡＴＣ Ｃ）に転換する。

ｐｓｙｃ　６７６　ＣＬＡと称する得られたプラスミドをＣ１ａ　Ｉで消化し、 そして約３６０　ｂｐのｐａｒ断片含有配列をグル溶出によシ分離し、そしてユ ニークＣ１ａ　Ｉ部位においてＣ１ａ　Ｉで切断したｐＢＲ３２２と一緒にする 。断片をＴ４ＤＮＡ！Ｊガーゼで連結し、そして得られたシラスミドをＥ、コ’ ）　Ｋ−１２／Ｃ８４１２に形質転換する。アンピシリン耐性形質転換体からｐ ｓＹｃ　７５６　Ｂｘｊと称するプラスミドが分離され、そして制限部位分る ９堕Ｉ一旦υ」■・・・・・・・・・ｐａｒ・・・・・・・・・免肪■一旦見ｉ ｄ　■断片を有するｐｓｙｃ　７５６　ＢＨのごときシラスミドの造成りＨｉｎ ｄ　Ｉ１１部位を有する任意のシラスミドをｐＢＲ３２２の代シに使用すること ができる。このような代替物の１つは、Ｊｏｕｒ、　ＢａｃＬｅｒｉｏｌ、１５ ４　＋　１５１３−１５１５（１９８３）中に記載されているｐＪＨ１０１でお る。

ｐＪＨｌｏｌを、肛工消化ｐｓｙｃ　６７６　ＣＬＡと共に、ｐｓｙｃ　７５６ 　ＢＲの造成においてｐＢＲ３２２に関して上記したようにして用いてｐＳＹＣ ７５６と称するプラスミドを造成した。ｐＳＹＣ７５６はｐｓｙｃ　７５６　Ｂ Ｈ上のそれと同じ約３６０　ｂｐのＣ１ａ　Ｉ−曳す■・・・・・・ｐａｒ・・ ・・・・Ｃ１ａ　Ｉ合した。混合物をＴ４ＤＮＡリガーゼによシ連結し、そして 得られたプラスミドをＥ、コリに一１２／Ｃ８４１２に形質転換した。形質転換 体をアンピシリン耐性について選択し、そして２個のＦｔｉｎｄ　Ｉ１１部位中 に挿入されたｐａｒ含有断片を有するシラスミドについてスクリーニングした。

このような形質転換体を見出し、そしてこれを含有するプラスミドをｐｓｙｃ８ ５２と命名した。

ｐＳＹＣ８５２を第６図に示す。これは配列において置と同じである。

ｐＳＹＣ８５２ハハーティションノロフィシエントである。

ｐＳＹＣ８５２によシ形質転換されたＢ、ズブチリスＢＤ２２４を抗生物質を含 有しないブロス中で培養する中で培養された場合と同様に多くのヒト成長ホルモ ンを生産する。（ｐｓＹｃ７２０はｐｓＹｃ’３１０−２由来のクロラムフェニ コール耐性遺伝子を有する。）　ｐｓＹｃ’７２０は抗生物質を含有しないＢ、 ズブチリス培養から急速に失われ、従って、このような培養における細胞当シの ヒト成長ホルモンの生産は増殖の継続に従って低下する。

例　Ｘ■ セリン、７変形Ｂ。リケニホルミスシグナルペプチドをコードする配列及びセリ ン、２５インターロイキン−２ｆ！す４プチドをコードする配列を含有する融合 遺伝子。

インターロイキン−２（ＩＬ−２）はＴ−細胞増殖因子とも称され、レクチン又 は抗原で活性化されたＴ−細胞によシ生産されるリンホカインである。インター フェロンと同様に、ＩＬ−２はナチュラルキラ８６ いて有用である。ＩＬ　−２はまた、他の多数の医療的及び診断的用途を有する 。Ｄ、Ｍａｒｋ等、ヨーロッパ特許出願第８３３０６２２１．９゜ ヒトＩＬ−２をコードする遺伝子のヌクレオチド配列、及びＩＬ−２生物活性を 有するヒ）ＩＬ−２ポリペノチドを細菌において生産するための発現ベクター３ ］、（１（１，９８３）及びＭａｒｋ笠、ヨーＣｌ　ツノ’Ｅ’特許出願８３３ ０６２２１．９　（前掲）に記載されている。

この明細書において例示する技法に類似する技法を用いて、ヒトＩＩ、−２汁？ り深プチドをコードする配列がこの発明の変形されたシグナルベノチドをコード する配列、例えばｐｓＹｃ７２０又はｐＳＹＣ７７８上の配列と機能的に連結さ れ、そしてＥ、コリ（ρりえば、Ｌｖ　’Ｊ　Ｋ−，１，２／　ＭＩＶ１２９４ 又はＥ、コリに一１２／Ｃ３４］、２　）、あるいは１３．ズブチリス（例えば 、Ｂ、ズブチリスＢＣ２２４）中で複製可能なプラスミド上の融合遺伝子が、中 でシラスミドが徨製可能な宿主中に形質転換され、そしてヒ）ＩＬ−２ポリペプ チドが発現され、そして成熟形で分泌される。

Ｅ、コリ及びＢ、ズブチリスからの分泌のための変形されたシグナル配列の分析 この例に含まれるプラスミド、及びこの出願中のの形質転換のすべては、Ｃｏｈ ｅｎ　、　Ｃｈａｎｇ及びＨｓｕ　。

Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ＋Ｓｃｊ、　（米国）６９．２１１０（１９ ７３）の技法によシ実施した。さらに、Ｍａｎｉａｔｉｓ等、（１９８２）、前 掲２４９−２５５頁を参照のこと。

Ｂ、Ｂ、ズブチリスの形質転換 この例に含まれるシラスミド、及びこの出願中のチリスの形質転換のすべては、 次のようにして、Ａｎａｇｎｏｓｔｏｐｏｕｌｔ＋ｓ及び５ｐｉｚｉｚｅｎ　、 　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　ｒ７１１１−７４．６　（：１．９６１　）に より記載されている技法に関連する技法を用いて実施した。

１０’Ｘ　５ｐｉｚｉｚｅｎ　ｒ最少溶液に１．２０．！／の（ＮＨ４）２Ｓ０ ４．１４０．９のに２ＨＰ０４．６０ｇのＫＨ２Ｐｏ４及び１０ｇのクエン酸ナ トリウムを蒸留水で満たされた１１の全容積溶液中で混合することにより調製し た。

５ｐｉｚｉｚｅｎ　ｌ培地は、２．０５　ｒｎｌのＩ　Ｍ　Ｍｇ５ｏ４；　６ｍ ｌ＋の５０　（ｗ／ｗ）％グル”　２　；　５　ｍｌ（Ｄ　１０　（ｗ／ｗ）　 ％　酵母エキス；５ｍｌの２　（ｗ／ｗ）％カゼイン加水分解物；形質転換され るべき菌株により要求される各アミノ酸＋２．５ｍ／！の１　（ｗ／ｗ）％アミ ノ酸溶液；５０ｍ１の１０　Ｘ　５ｐｉｚｉｚｅｎ　Ｉ最少溶液；及び全溶液容 積を５００８ ｍｌにするのに十分な蒸留水を混合することによって調製した。Ｂ、ズブチリス ＢＤ２２４及びＢズブチリス細胞］、７０については要求されるアミノ酸はスレ オニン及びトリノ’　ｌ−ファンである。Ｂ、ズブチリス５ＣＲ６６７は栄養要 求株であシ、そして５ｐｉｚｉｚｅｎ　Ｉ溶液中にアミノ酸を要求しない。

５ｐｉｚｉｚｅｎ　ｌ培地は、５００ｍ１の５ｐｉｚｉｚｅｎ　ｌ培地に０．２ ５　ｍ／！のＪＭ　ＣａＣ２２及び］、　ｍｅのＩＭＭｇＣｔ２を加えることに よって調製した。

３Ｑｍｉの５ｐｉｚｉｚｅｎ　ｌ培地に、形質転換さｆ＋るべき１３、ズブチリ スのコロニー又は胞子を接種し、そして；（７℃にて一夜（１６〜２０時間）増 殖せしめた。

次に、工５ψｌの一夜培養物を２８　Ｉ）　Ｏｍｅのクラス、−Ｉ中５ｐｉｚｉ ｚｅｎ　Ｉ培地］　３５　Ｔｎｌ　Ｋ接Ｊｌｉ　Ｌ、だＯＪ７４　ｊ’ｆｔ物の ６００　ｏｍにおける光学濃度（０，１））をＪ、　５〜２．０時間後、及びそ の酸１５分毎に測定１〜．１５分間のＯ，Ｉ）の読みの増加が５％未満であるこ とを基礎にして培養が対数後期にあることが見出される丑で続けた。

次に、対数後期の培養物５０ｍ１を２８００ｍｅのフラスコ中４５０　ｍｌの５ ｐｉｚｉｚｅｎ　ｌ培地に接種し、そして３７℃にて１．５時間増殖せしめた。

１５時間増殖せしめた後、４℃、５０００ｒｐｍ　にて１０分間遠心分離するこ とにより細胞を沈降せしめた。

次に、遠心分離からのベレ、１・を４５ｒｎｌの上清に再懸濁し、次にこれに、 ドライアイス−エタノール浴（−７０℃）中で培養物が凍結する直前に、５ｒｎ ｌの８０　（ｖ／ｖ）　％無菌グリセリンを加えた。凍結培養物中の細胞はコン ピテント細胞であって、次のようにして所望のプラスミドにより形質転換するの に適する。

０、５　ｍｌ　−０，６ｒｎｌの凍結したコン１？テント細胞含有培養物を氷上 で解凍した。

この細胞に形質転換されるべきシラスミドを３−有する溶〆夜１０〜５０　ｔｔ ｌを解凍した培養′吻と一緒にした。得られた混合物を３７℃にて２時間振とう し、この間に７０ラスミドの形質転換及びこの土にある遺伝子の発現が生じた。

最後に、選択のため、形質転換された細胞の柚養物の小アリコート、例えに約５ 〜約２００μｌを、ス゛ｊｙ択のために望ましい抗生物′Ｐ；　（ｉ種類又は複 数種類）を含有するプレートに移し／こ。

この例中にデーターが存在するノ°ラスミドによシ形質転換されだＢ、ズブチリ ス細胞については、フ０レート上で、５μｊ７／ｍｅで存在するクロラムフェニ コールによシ選択を行った。

Ｃ，Ｂ、ズブチリスからの分泌についての測定注目のプラスミドで形質転換され たＢ、ズブチリスの細胞を５μｇ／ｌのクロラムフェニコールを含有するり、Ｂ ブ９０ ｏ　ス［：　Ｍａｎｉａｔｉｓ等（１９８２）、前掲、４４０頁］中で３７℃に て激しぐ振とうしながら培養物のＯＤ（６６ｏｎｍにおける光学濃度）が１０に 達するまで増殖せしめた。次に、培養物のアリコートを、試験されるシグナル配 列をコードする配列を含有する遺伝子によシ発現される全蛋白質（すなわち、分 泌されたもの及び未分泌のもの）の測定のために取シ出した。次に残シの培養物 中の細胞を遠心分離（エッベンドル７ミクロフユージを用いて室温にて２０秒間 ）によシペレット化した。使用した条件下で、細胞溶解の証拠は存在しなかった 。このことは、上清及びベレットからの蛋白質によシ調製されたグル上での蛋白 質パターンの比較により、並びに細胞内性であることが知られている若干の蛋白 質が培地中に検出し得る量看在しないことＶＣより示された。

この例のＥ項の方法によ夕ｈＧＨ又はベニ７リナーゼについてサンプルを分析し た。上清中の目的蛋白質の量が分泌された蛋白質の量である。

全目的蛋白質を、４レツト化の前に取シ出された培養物のアリコート中めｈＧＨ 又はベニシリナーゼについての測定（この例のＥ項の方法による）により決定し た。全蛋白質を測定するこの方法が正確であることを保証するため、アリコート をまず超音波処理し、膜及び他の細胞片を回転沈降せしめ、そして得られた上清 液を蛋白質について分析した。

被二シリナーゼについて、このような超音波処理を伴わないで全蛋白質の測定を 行った。ｔｅｐｅｎＰデルタ２４２８シグナル配列の場合を除き、超音波処理を 伴う、及び伴わないにニシリナーゼ測定が実質上同一の結果を与゛え、被ニシリ ナーゼが細胞外媒体中に分泌され、又はこの測定方法によシ検出［７得る方法で 細胞の（外部）表面に結合したことが示さペニシリナーゼのかなシの部分が細胞 内に残シ、又は細胞の超音波処理を行わなければ測定にかからない方法で細胞膜 に結合していた。

細胞を、５０μｆｌ／ｍｌの濃度でアンピシリンを含有するり、Ｂグロス中で、 激しく振とうしながβ３７℃にて、培養物の６００　ｎｍにおけるＯ、Ｄ、が１ ．０に達するまで増殖せしめた。

この例のＥ項の方法を用いて、目的蛋白質（ベニシリナーゼ又はｈＧＨ）につい てサンプルを測定した。

細胞のベリグラズム空間（すなわち、操作的には細胞の浸透圧ショック処理物） に見出される目的蛋白質の量が分泌さ、れた蛋白質である。浸透圧ショック処理 物は、本質上Ｎｏａｅｌ及びＨｅｐｐｅｌ　、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、ｐ 。

２ ２４１．３θ５５−３０６２　（１９６６）　の方法にょシ調製した。Ｏ，Ｄ、 　＝　１．０の培養物のアリコートからの細胞を遠心分離によシペレント化し、 そしてアリコートの１／１０容量の緩衝液［ｐＨ７，４ｓ　５０　ｒｎＭ　Ｆリ ス。

２、５　ｍＭ　ＥＤＴＡ　、及び２　（ｗ／ｖ）％シーークロースからなる〕に 再Ｓ濁した。２３℃にて１０分分間−た後、細胞を遠心分離によりペレット化し 、そｌ−て次に同容量の冷（約２℃）脱イオン水に渦流にょシ再懸濁し、そして 次にこの溶液を４℃にて１０分間放置した。最後に、細胞をペレット化し、そし て浸透圧処理物を含有する上清を目的蛋白質について分析した。

他の方法として、Ｌｕｒ＋ｎ及びＰｉ、ｇｊｅｔの変法を用い注目のシグナル技 ノチドをコードする配列を含有する遺伝子からのＥ、コリにおいて発現される目 的蛋白質（被゛ニシリナーゼ又はＩＩＧＨ）の全量を測定するために、浸透圧処 理物の調製における最終段階とし測定した。この波レット化材料を、−浸透圧処 理物の調製のためにはじめに用いた培養物のアリコートの容量の１／１０の容量 の緩衝液〔ｐｉ−１７，４、上記と同様に５０７７１Ｍ　）リス、２　（ｗ／ｖ ）％シーークロース及び２５ｍＭ　ＥＤＴＡ　Ｅ中に再懸濁した。得られた溶液 をまず超音波処理し、そして次に目的蛋白質について測定した。

目的蛋白質の総量が、浸透圧処理物中に見出される量及び浸透圧処理物の調製の 最終段階として４レツト化された再懸濁細胞材料中に見出される量の合計である 。

Ｅ、　ヒト成長ホルモン及びベニシリナーゼの分析方法 泌されたヒト成長ホルモンの量を、カンプリッゾメディカルジアグノスティック 社（ＣａｍｂｒｉｇｄｇｅＭｅｄｉｃａｌ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ　Ｉｎｃ、 　）　＋ビレリカ、マサチューセッツから入手できるｈＧＨＲＴＡキットを用い ゛Ｃ１放射免疫σ１１１定（１ｔＩＡ）　Ｋよシ測定した。

Ｅ、コリ及びＢ、ズブチリスにより発現され、そして分泌されるペニシリナーゼ の量は、５ｃｈｊｎｄｅｒ及Ｖｅｒｌａｓ　Ｃｈｅｍｉｅ　、　Ｗｅｉｎｈｅｊ ｍ　、西独、１．６９−１７６（１９８０）の方法によシ、カルビオケム社（Ｃ ａｌｂｉｏｃｈｅｍ　Ｉｎｃ、　）ラジョラ、カリホルニアから販売されたＰＡ ＤＡＣ［：　７−　（チェニル−２−アセタミド）　−３（２（４−Ｎ、Ｎ−ジ メチルアミノ−フェニルアゾ）ピリジニウムメチル）−３−セフェム−４−９４ カルボン酸〕を用いて、あるいはＯ’　Ｃａｌｌａｇｈａｎ等。

Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ　、　Ａｇ、　Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ、、１　＋　２８３− ２８８（１９７２）により１３７℃ではなく２１℃において、そしてグラクソリ ザーチ社（Ｇｌａｘｏ　Ｒｅ５ｅａｒ＋Ｊ　Ｌｔｄ、。

クリーンフォード、英国によシ提供されるニトロセフイン（クロモゲンセファロ スポリン８７／３１２　）　ヲ用いて測定した。

Ｆ、結果−ヒト成長ホルモン ス中で発現されそしてそこから分泌されるヒト成長ホルモン ｐｓＹｃ７２０　ａ）　１０７　５３　０．４９ｐｓＹｃ９７０．ｂ）　４９６ 　８６　０．１７ｐＳＹＣ７４４ａ）　７１６　２６　０．０４ｐＳＹＣ７４８ ａ）　１２６６　６６　０．０５ｐＳＹＣ７２８ａ）　３８０　２０　０．０５ ｐＳＹＣ７７８ａ）　６０８　、　１１８　０．１９ｐＳＹＣ９６２ｂ）　２８ ２　４９　０．１７ｐＳＹＣ８５２ｃ）　１１．２　４６　０．４２９５　持１ ＝Ｂａ　ＧＯ−５００７０１（２６）ａ：少なくとも３個の測定の平均。形質転 換された菌株はＢ、ズブチリス５ＣＲ６６７。

ｂ：少なくとも２個の測定の平均。形質転換された菌株はＢ、ズブチリス５ＣＲ ６６７。

Ｃ：形質転換された菌株は、増殖培地中に抗生物質発現され、そしてそこから分 泌されるヒト成長ポルプラスミド　全ｈＧＨ分泌されたｈＧｒ（分泌された割合 （プングラム■スＶｂ、Ｄ：ｘ−＝、ト（０００ｎｍＪ泡）ｐｓＹｃ７０９　ａ ）　（５（５− ｐＳＹＣ７２０ａ）　］、　１２８　８８３　０．７８ｐＳＹＣ９７０ｂ）　６ ９０　４００　０．５８ｐＳＹＣ７４４ａ）　６７４　６４　０．０９ｐＳＹＣ ７４８ａ）　７９２　６８０　０．８６ｐＳＹＣ７２８ａ）　６２５　５１　０ ．０８ｐＳＹＣ７７８ａ）　５０４　４００　０．７９１］５ＹＣ９６２ｂ）　 ｔ３ｓｏ　１２０　０．０９ａ：少なくとも３個の測定の平均。

ｂ＝１個の測定。

６ ｐｓｙｃ　７２０により形質転換されたＥ、コリ　Ｋ−１２／Ｃ８４１２を増殖 培地中にトリチウム化フェニルアラニンを伴って増殖せしめ、そして浸透圧処理 物から分離し、そしてＮ−末端アミノ酸配列を決定した。天然の成熟ヒト成長ホ ルモンについて期待されるように、放射性フェニルアラニンが１位及び１０位に 見第■表 種々のプラスミドにより形質転換されだＢ、ズブチリスＢＤ　２２４中で発現さ れ、そしてそこから分泌袋れる０、Ｄ、ユニットｃ（６００ｎｍ）細胞）ｐｓＹ ｃ３１０−２　８．７（８，０）　６．８　０．７８ｐｓＹｃ６１７　１．５（ ０，７）　０．６　ｃ）　０．４　ｃ）ｐｓｙｃ　６６０　８．３　（７，９） 　７．５　０．９０ｐｓｙｃ　９４７　約−０，Ｑ　ｄ） ｐｓｙｃ　９５７　約０１ｄ） ａ：カソコ内の量は超音波処理を伴わないもの。

ｂ：全量で除した分泌された量。

Ｃ：細胞膜はｐｓＹｃ６１７上のｐｅｎ　Ｐデルタ２４２８遺伝子によシ弱体化 されているようであり、そして分泌されたベニシリナーゼの量はおそらく、少な くとも部分的には溶解細胞からの蛋白質を示す。

ｄ：全蛋白質及び分泌された蛋白質の定量的データは得られていない。数値は、 上清（分泌された蛋白質について）及び培養物（全蛋白質、について）のケゝル 上でのベニシリナーゼに対応するバンドの強度の定量的比較に基く。

プラスミド　全ベニシリ　分ｙ、された　分泌された割合プー−ゼ　−゛ヒノリ ヅーＨ ビｓＹｃ３１０−２　ａ）　］、、７　０　０．００ｐｓＹｃ６１７　ａ）　５ ，５　０　０．００ｐＳＹＣ６６０ａ）　５．４　４．３　０．８０ａ）Ｅ、コ リ　Ｋ−１２７ＭＭ２９４、又はＥ−コリに一１２／Ｃ３４１２に形質転換され た。これらの変種の間で結果は実質上具らない。

９８ シラスミド及び微生物の入手 次のものは、アメリカン・タイプカルチュア・コレクンヨン、ロックビレ、メリ ーランド（ＡＴＣＣ）　ヲ含む多くの供給者から入手することができる。これら は次に示す番号のもとにＡＴＣＣに寄託されている。

ｐＢＲ３２２、ＡＴＣＣＡ３７０１７　；　及び製するこの発明のシラスミドと 共に、■３．ズブ乞茫Ｚミルウォーギー、ウイスコン／ンから入手するととイッ ク・ストック・センター、デパートメントオブマイクロバイオロノー（Ｂａｃｉ ｌｌｕｓ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　５ｔｏｃｋＣｅｎｔｅｒ　、Ｄｅｐａｒｔｍｏｎｔ 　ｏｆ　Ｍｊｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　）　、オヒオ州立大学、コロンビア、オヒ オ（ＢＧＳＣ）からＢＧＳＣＡ　ＩＡ　４２として入手することができる。

次のものは、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブタベスト条約の もとに、ＡＴＣＣに寄託されている。

ｐＯＧ２３８１　（Ｅ、　ｖ　ＩＪ　Ｋ−１２／　Ｃ８４１２）　、　ＡＴＣＣ Ａ３９０３８　；ｐＯＧ２３２６　（Ｅ、コリに一１２／Ｃ８４１２）、ＡＴＣ ＣＡ３９（５００；ＰＳＹＣ３１０−２（Ｂ。カチリス　ＢＤ　２２４　）　、 ＡＴＣＣＡ３９６０：３　；れかを抗生物質の非存在下で培養することによシ得 ることができる。同様に、プラスミドを喪失した右下で培養することによシ得る ことができる。

Ｂ、スズチリスＢＤ２２４、及びＢ、ズブチリ、（５ＣＲ６６７はまた、それぞ れＡｌＡ４６、及びＡｌ５５３としてＢＧＳＣから入手することができる。

００ 従って、この発明は、膜結合リポ蛋白質を形成することができるタイプの野性型 シグナルペプチドから誘導される変形されたシグナル＜ｆチドを提供することが 明らかであろう。変形されたシグナル被プチドをコードするＤＮＡ配列は、カル ボキン末端の保存領域又はシグナルペプチドの連結領域に見出されそして膜結合 リポ蛋白質の形成において修飾される少なくともアミノ酸システィンのためのコ ドンを、膜結合り、）Ｑ蛋白質の形成のために機能しないであろう／スティン以 外のアミノ酸のためのコドンて置き換えることに」：って造成される。従って、 この発明の変形さ才したシグナル啄プヂドは、膜結合リポ蛋白質の形成に１・・ いて修飾さｈるシスティンの代りにシスティン以外のアミノｒｌヲを不する。こ の発明の変形されたソゲナルｏ７ａチｌ”Ｕｌ、それらか生産される細胞からの 目的蛋白質の分泌を？４Ｊるのに有用である。

変形されたシグナルにプチドをコードするＤＮＡ配列ハ、クローニングベクター 中で有用である。この発明はさらに、生体内で組換プラスミドを造成する方法を 提供する。

この明細書において示されそして記載されたものに加えて、この発明の種々の変 法か、前記の記載及び添付図面に基いて、湧業者にとって明らかとなろう。この ような変形は添付されだ諸求の範囲に属す１０す るものと意図される。

国際調査報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、　エキソーシグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列であって、該エキソ− シグナルペプチドは対応する野性型シグナルペプチドのシスティン残基の代シに アミノ酸Ｘを含有するアミノ酸配列を有し、該野性型シグナルペプチドは（ａ） 膜結合リポ蛋白質を形成することができ、そして（ｂ）１個のシスティンを含む 促進領域を含有し、Ｘは膜結合リポ蛋白質の形成のために機能せず、そしてＸに ょシ置き換えられるシスティンｔｒｉ　（ｂ）の促進領域中のシスティンである ことを特徴とするＤＮＡ配列。 ２、対応する野性型シグナルペプチドが細菌シグナルペプチドである請求の範囲 第１項記載のＤＮＡ配列。 ３、Ｘが、３個よシ少ない炭素原子を含有する中性側鎖を有するアミノ酸から成 る群から選ばれる請求の範囲第２項記載のＤＮＡ配列。 ４、Ｘがセリンである請求の範囲第３項記載のＤＮＡ配列。 ５、所望の蛋白質に機能的に連結された請求の範囲第１項のエキソ−シグナルに プチドを含んで成るペプチドをコードするＤＮＡ配列。 ６、所望の蛋白質が細菌エキソ被ニシリナーゼ、ＩＬ−２、又はｈＧＨである請 求の範囲第５項記載の０３ ＤＮＡ配列。 ７、請求の範囲第５項のＤＮＡ配列を発現するために原核生物宿主細胞中で効果 的な複製可能な発現ぺ９、請求の範囲８のベクターによって形質転換されだ組換 宿主細胞。 １０、エキソ−シグナル波プチドであって、該ペプチドは対応する野性型シグナ ルペプチドのシスティン残基の代シにアミノ酸Ｘをぽ有するアミノ酸配列から本 質上酸シ、該野性型シグナルペプチドは（、）膜結合リポ蛋白質を形成すること ができ、そして（ｂ）　を個の７ステインを含む促進領域を含有し、そ■７てＸ は膜結合リポ蛋白質の形成のだめに機能せず、そしてＸによシ置き換えられるシ スティンは（ｂ）の促進領域中のシスティンであることを％徴とするシグナルペ プチド。 １１、所望の蛋白質に機能的に連結されたエキソ−シグナルペプチドを含んで成 るペプチドであって、陣エキソーシグナルベゾチドは対応する野性型シグナルペ プチドのシスティン残基の代シにアミノ酸Ｘを含有するアミノ酸配列から本質上 酸シ、該野性型シグナルペプチドは（ａ）膜結合リポ蛋白質を形成する１０４ ことができ、そして（ｂ）１個のシスティンを含む促進領域を含有し、Ｘは膜結 合ＩＪ　、ｌ蛋白質の形成のために機能せず、そしてＸにより置き換えられるシ スティンは（ｂ）の促進領域中のシスティンであることを特徴とするペプチド。 １２　原核性宿主細胞中で請求の範囲第１１項のペプチドの生産を行うことがで きる複製可能な発現ベクター。 １３、請求の範囲第１２項のベクターによって形質転換された組換宿主細胞。 １４、請求の範囲第１３項の形質転換された細胞を適当な栄養培地中で培養する ことを含んで成る所望の蛋白質配列の分泌を行うだめの方法。 ］５　所望の蛋白質の発現を得る方法であって、所望のペプチドに機能的に連結 されたエキソーングナルペプチドをコードするＤＮＡ配列の発現において効果的 な複製可能な発現ベクターによυ原核性宿主細胞を形質転換することを含んで成 シ、ここで前記エキソ−ノブナルにブチ１″は、対応する野性型シグナルペプチ ドのシスティン残基の代９にアミノ酸Ｘを含むアミノ酸配列を含んで成シ、該野 性型シグナルペプチドは（ａ）　膜結合リポ蛋白質を形成することができ、そし て（ｂ）　１個のシスティンを含む促進領域を含有し、Ｘは膜結合リホ蛋白質の 形成のために機能せず、そしてＸによシ置き換えられる／スティンは（ｂ）の促 進領域中のシスティンであることを特徴とする方法。 １６、Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ｐｈｅ−８ｅｒ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｌ ｙｓ−Ｌｅｕ　−Ｌｙｓ−Ｌｙ＋５−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ −Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−８ｅｒ　−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌ ｙ−Ｘ−Ｙ−（Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ｇｉｎ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ａｌａ） （式中、Ｘはセリン又はアラニンであり、Ｙはアラニン又はプローリンであり、 そしてｎは０又は１である）によシ実質土表わされるアミノ酸配列を含んで成る エキンーシグナルベグチド。 １７　所望の蛋白質配列に機能的に連結された請求の範囲第１６項のエギソー／ グナル・ゼゾチドｔ　ｔんで成る融合ペプチド。 １８、請求の範囲第１７項のペン０チドをコードするＤＮＡ配列を発現するため に原核生物組換宿主網ＩＪμ中で効果的な複製可能な発現ベクター。 １９、請求の範囲第１８項のベクターにょｐ形質転換された組換宿主細胞。 ２０　組換プラスミドベクターの製造方法であって、（ａ）、第一の親プラスミ ドを制限酵素にょシ切断して第一の線状ＤＮＡ断片を得； （ｂ）　第一の親プラスミドと実質的に相同な配列を有する第二の親ノラスミド を、第一の親ノラスミ０６ ド中で切断される部位と類似する部位から少なくとも２０　ｂｐ離れてた部位に おいて切断する制限酵素によシ切断して第二の線状ＤＮＡ断片を得：（ｃ）（ａ ）及び（ｂ）の線状ＤＮＡ断片中の単鎖末端を平滑化し； （ｄ）　（ａ）及び（ｂ）の線状ＤＮＡ断片を単鎖ＤＮＡに分離し； （ｃ）　（ｄ）の単鎖ＤＮＡを二重鎖ＤＮＡの形成をもたらす条件下に置き； （ｒ）　（ｅ）の二重鎖ＤＮＡを用いてコンピテント宿主細胞を形質転換し：そ して、 （ｇ）　＜ｆ）の形り７１転換された細胞を培養する；ことを含んで成る方法。