JPS63279786A - 無血清増殖培地 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、増殖培地中に鉄を必要とする細胞を培養する
のに用いることのできる無血清増殖培地に関する。本発
明の培地を用いることにより、血清を使用しないで細胞
を培養することができるだけでなく、本発明の培地は他
の増殖培地の品質を試験するために用いることもできる
。

（従来の技術及び発明が解決しようとする問題点）血清
を培地に添加することは、増殖に必要な成分を培養液に
与えるがその反面、得られる結果の正確さが極めて重要
である大抵の実験の場合に否定的な影響を与える成分を
も培養液に与えるため、産業上の利用においてまた研究
においても無血清培地及び無血清増殖培地が強く望まれ
ていた。これは、細胞免疫、バイオテクノロジー、体外
受精、臓器移植、癌研究や血液保存や輸血などの分野に
おいて有用である。

現在、産業上′及び研究上そして臨床で用いられている
培地や生理的溶液は１００年も前の古い組成に基づいた
ものであり、従って生物学的研究の分野における行詰り
の典型となっている。これまでに細胞培養に用いられて
きた培地は、非常に多くの場合いわゆる市販の基礎培地
に概ね１０％の加熱不活性化血清を添加したものである
。この非常に古い方法は以下のような欠点がある。

１）細胞を溶解する血清の作用を妨げるために必要な熱
処理は、重要な血清成分を変性させる作用を有する。

２）異なるバッチ（ｂａＬｃｈ）の血清は、それらの由
来や、インビトロ（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）の細胞培養の挙
動に望ましくない変動を与える何かあるものの違いのた
めに異なった性質を有する。

３）血清は、細胞に対して未知でかつ制御できない作用
を有する幾つかの未知の因子や化合物を含有する。

４）細胞は血清と比較して異なった量の異なった化合物
を含有する体内のいわゆる組織液に適合しているので、
血清は大抵の細胞にとっては非生理的液体である。

５）血清中の抗体が細胞と結合して実験の妨げとなる。

６）インビトロ（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）における細胞によ
る血清因子の合成の研究においてそれらの因子の血清中
でのバックグランドレベルが比較的高くなるので血清の
使用はその研究を妨げる。

（問題点を解決するための手段及び作用）本発明の目的
は上記の欠点を克服し、細胞や組織をインビトロ（ｉｎ
　ｖｉｔｒｏ）で培養したり保存するのに適した培地を
提供することにある。即ち、本発明によれば、 ａ）鉄キレート剤および ｂ）オーリン−トリカルボン酸 を含有し、そして Ｃ）アルカリ金属−ＥＤＴＡおよび／またはｄ）微量元
素 を随意に含有していてもよく、好ましくはｐｉ１７．０
〜７．８の範囲の緩衝作用を有することを特徴とする無
血清増殖培地が提供される。

本発明の無血清増殖培地を使用することによって、前述
の欠点を克服することができるので本発明の培地はイン
ビトロ（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）での細胞や組織の培養や保
存に極めて適している。また、本発明の完全培地は無血
清、無蛋白（ただし、ある種の細胞が要求する、そして
必要に応じて用いられるが用いたとしてもごく少量のイ
ンシュリンを除く）−７＝ であり、トランスフェリンや脂質の存在なしに安定化し
たキレート化元素または化合物として鉄および微量元素
を含有することによって特定されるものである。本発明
の培地は非常に安価に製造することができる。

従来の無血清培地の主な問題点は、以下の２つの事情の
ためにそれらの培地が、任意に選んだ細胞に使用するの
に適していないということである（エヌ、エヌ、イスコ
ープ（Ｎ、Ｎ、ｌ５ｃｃｏｖｅ）及びエフ。

メルチャーズ（Ｆ、　Ｍｅｌｃｈｅｒｓ）、「コンプリ
ート　リプレースメントオブセーラムバイ　アルブミン
、トランスフェリン、アンドソイビーンリピドインカル
チャーズオプリポボリサッカライドーリアクティブＢ−
リンホサイツ（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ　Ｒｅ−ｐｌａｃｅｍ
ｅｎｔ　ｏｆ　Ｓｅｒｕｍ　ｂｙ　Ａｌｂｕｍｉｎ、　
Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ。

ａｎｄ　５ｏｙｂｅａｎ　Ｌｉｐｉｄ　ｉｎ　Ｃｕ１ｔ
ｕｒｅｓ　ｏｆ　Ｌｉｐｏｐｏｌｙ−ｓａｃｃｈａｒｉ
ｄｅ−ｒｅａｃｔｉｖｅ　Ｂ−１ｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ
）　Ｊ　、ジエイ、エクスプ、メト、（Ｊ、　Ｅｘｐ、
　Ｍｅｄ）、第１４７巻、第９２３〜９３３頁（１９７
８年）；アール、ジー、ハム（ＲｏＧ。

Ｈａｍ）、「インポータンスオブザベーサルニュ一トリ
エントメディームインザデザインオブホーモナリーディ
ファインドメディア（）ｍｐｏｒｔ、ａｎｃｅ　ｏｆ　
ｔｈｅ　ｂａｓａｌ　Ｎｕｔｒｉｅｎｔ　Ｍｅｄｉｕｍ
　１ｎｔｈｅ　Ｄｅｓｉｇｎ　ｏｆ　Ｈｏｒｍｏｎａｌ
ｌｙ　Ｄｅｆｉｎｅｄ　Ｍｅｄｉａ）Ｊ、グロースオブ
セルズインホーモナリーディファインドメディア（Ｇｒ
ｏｗｔｈ　ｏｆ’　Ｃｏ１ｔｓ　ｉｎｌｌｏｒｍｏｎａ
ｌｌｙ　Ｄｅｆｉｎｄ　Ｍｅｄｉａ）、コールドスプリ
ングハーバーコンファレンスオンセルプロリファレーシ
ョン（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｃｏｎ
ｆｅｒｅｎｃｅｏｎ　Ｃｅ１ｌ　Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔ
ｉｏｎ）、第９巻、第３９−６０頁（１９８２年）；お
よびディー、バーネス（Ｄ、　Ｂａｒｎｅｓ）およびジ
ー、サトー（Ｇ、５ａｔｏ）、「メソッズフォーグロー
スオブカルチャードセルスインセーラムーフリーメディ
ーム（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｏｒ　Ｇｒｏｗｔｈ　ｏｆＣ
ｕｌｔｕｒｅｄ　Ｃｅ１ｌｓ　ｉｎ　Ｓｅｒｕｍ−ｆｒ
ｅｅ　Ｍｅｄｉｕｍ）、１、アナル、バイオケム、（Ａ
ｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、）、第１０２巻、第２５５〜
２７０頁（１９８０年）〕。

ｌ）生理的な量の重炭酸塩及びＣａ”　／Ｍｇ”オンの
存在が、３７℃、ｐ１４７〜８の条件下における既知の
キレート剤系（トランスフェリンを除く）がら鉄および
３価の微量元素を沈殿させてしまう。

２）毒性化合物を含む微量元素の培地中の濃度が制御で
きず、またその濃度は培地中の水及び不純物の各々の性
質や配合によって著しく変化する。

個の問題の唯一の解決策は必要な全ての微量元素および
金属の平衡溶液を含む完全に安定な金属イオン緩衝液を
製造して、毒性元素を緩衝液に吸収させることである（
毒性作用は平衡化されてなくなってしまう）。

トランスフェリンは高価で種特異的であるので、本発明
の培地は合成非蛋白性キレート剤のＦｅ／微量元素緩衝
液に基づいて製造されており、それによって、３７℃に
おける沈殿（上記参照）という主な問題点は、溶液と混
合したときに、各キレート剤単独の場合と比較して非常
に異なったそして特殊な性質を有するある種のキレート
剤を複数添加することによって解決されている。選ばれ
たキレート剤はＥＤＴＡとクエン酸塩であり、そのクエ
ン酸塩緩衝剤とＥＤＴＡのモル濃度比が１：３以上であ
る。これに関し、クエン酸塩緩衝剤とはクエン酸塩とり
エン酸との合計をいう。

第２の問題点、即ち細胞膜及び細胞への鉄の供給につい
ては、培地にオーリン−トリ・カルボン酸を添加するこ
とにより解決した。たとえＥＤＴＡ／クエン酸塩が金属
溶液を完全に安定化したとしても、動物細胞やヒト細胞
の種類によっては鉄欠乏によって増殖しないであろう。

ＥＴＤＡ／クエン酸塩／オーリン−トリカルボン酸の組
合せがこれまで開示されていなかった未解決のキレート
特性及び鉄供給特性をもたらすことを発見した。これに
関し、ＥＤＴＡ単独を、金属の沈殿が問題とならない条
件下でｐｔｔｓ、　０で植物細胞の増殖用の鉄キレート
剤として以前に用いたが全く取るにたらない結果であっ
た〔ビー、クルーセ（Ｐ、　Ｋｒｕｓｅ）およびエム、
ケー。

ペターソン（Ｍ、　Ｋ、Ｐｅｔｔｅｒｓｏｎ）、「テイ
シュカルチャーメソッズアンドアプリケーションズ（Ｔ
ｉｓｓｕｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ａｎｄ
　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）Ｊ、アカデミツクプレス
（Ａｃａｄｅｍｊｃ　Ｐｒｅｓｓ）、（１９７３年）；
およびジェイ、アール、スティン（Ｊ、Ｒ１５ｔｅｉｎ
）、［ハンドブックオブフイジオロジカルメソッズ（Ｈ
ａｎｄｂｏｏｋ　ｏｆ　Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ　
ＭｅＬｈｏｄｓ）Ｊ、ケンブリッヂ□ユニバーシティ　
プレス（ＣａｍｂｒｉｄｇｅＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐ
ｒｅｓｓ）、（１９７３年）参照〕。

細胞増殖に関し、ＥＩ）ＴＡとクエン酸（クエン酸塩）
の比が例えば１：１０であると非常に有利であることが
わかった。又、培地中での細胞増殖は通常ｐＨ７゜４で
行なわれるが、本発明によれば最終的な培地のｐＨは種
々の細胞の増殖における要求に応じて、それとは異なる
ものでもよい。

本発明の増殖培地の例としては、２．４〜３．６μ閃Ｆ
ｅ−ＥＤＴＡ、２．４〜３．６μ門オーリン−トリカル
ボン酸、０．８〜’１．２／ＩＺＭ　Ｎａ、−ＥＤＴＡ
、　１２−１８μＭクエン酸及び２０〜３０μＭクエン
酸ナトリウムを含有する培地をあげることができ、微量
元素としては例えば０．０８〜０．１２μＭＺｎ″”　
０．０１６−０．０２４μＭ　Ｃｕ”　、０．’０Ｏ０
８〜０、ＯＯ１２７ｚＭ　Ｍｎ”　、０．００１２μＭ
Ｃｒ３＋、０．０００２４μＭ　Ｎｉ２＋、０．００１
６〜０．００１２４μＭ　ｈｘ”　、０．００（１８〜
０．００１２μＭＣｒ”　、’　０．００１２μＭＣｒ
３＋、０．０００２４μＭ　Ｃｏ”　及び０．０８〜０
．１２μＭ　Ｓｅ’＋のイオンを随意に含有していても
よい。

本発明の増殖培地は、例えば培地の各成分の濃縮液を純
水に添加混合して作製することができる。

例えば２．４〜３．６＋ｎＭ　Ｆｅ−ＥＤＴ’Ａ、２．
４〜３．６ｍＭオーリン−トリカルボン酸、０．８〜’
１．２ｍＭ　Ｎａ、−ＥＤＴＡ、　１２−１８ｍＭクエ
ン酸及び２０〜３０ｍＭクエン酸ナトリウムを含有する
濃縮液とすることができる。本発明による増殖培地を調
製する際に、可゛能なかぎり高度に精製された水、例え
ば英国トラベノール（Ｔｒａｖｅｎｃ＋１）社製の［ト
ラベノール（Ｔｒａｖｅｎｏｌ）　（商標）滅菌水等を
使用することが極めて重要である。そのような濃縮混合
液の１例として１０００倍濃度のものとして用いること
のできる濃縮混合液を以下に示す。

第１表 ３　ｍＭ　Ｆｅ−ＥＤＴＡ”　　　　　　　　　１２０
．１　ｍｇ３　ｍＭオーリントン−カルボン酸”　　　
１２６．７　ｍｇｌ　ｍＭ　Ｎａ、−ＥＤＴＡ　　　　
　　　　　　　　　３７．２　ｍｇｌ５　ｍＭクエン酸
　　　　　　　　　　　３１５．０　ｍｇ２５　ｍＭク
エン酸ナトリウム　　　　　　７３５．０　ｍｇ（任意
に１％の微量元素を加えてもよい°））ｌ）エチレンジ
アミン四酢酸Ｆｅ（ｍ）Ｎａキレートの２水和物〔コツ
ホ−ライト（Ｋｏｃｈ−Ｌｉｇｈｔ）社製、カタログＮ
ｏ、　２５２９−００　） ２）米国ジグＶ（Ｓｉｇａｍａ）社製、カタログＮｏ、
Ａ−１３）微量元素としては、下記にしめすものが使用
可能である： ０．０８〜０．１２ｍＭ　Ｚｎ”　、０．０＋６−０．
（１２４ｍＭ　Ｃｕ２＋、０．０００８〜０．００１２
ｍＭ　Ｍｎ″＋、０．００１２μＭＣｒ３＋、０．００
６２４ｍＭＮｉ”　、０．００１６−０．００２４ｍＭ
　ＡＩ”　、０．０００８〜０．００１２ｍＭ　Ｃｒ２
＋、０．００１２μＭＣｒ３＋、０．’０００２４ｍＭ
　Ｇｏ”及び０．０８〜０゜１２ｍＭ　Ｓｅ’＋のイオ
ン。

組成物のｐＨは４．５〜５．０に調整することが好まし
い。これに関し、上記の組成で組成物を調製した場合は
ｐｔｌは自動的に４．５〜５．０の範囲内に入るが、も
しこの範囲に入らないような場合にはＮａＣ１や［ＩＣ
１あるいは当業者にとって通常の公知の他の酸やアルカ
リを用いてｐｔｌを上記範囲内に入るように調整するこ
とができる。

尚、用いることのできるアルカリ−ＥＤＴＡとしては上
記のＮａ、　−ＥＤＴＡの他にに−ＥＤＴＡなどが挙げ
られる。

微量元素を任意に添加する場合は、例えば以下に示すよ
うに調製することのできるステム（ｓｔｅｍ）溶液を用
いて添加することができる。以下に示すシステム溶液は
上記増殖培地において使用される濃度の１０００００倍
の濃度の各微量元素成分を含有している。下記に示す溶
液の調製に際して、Ｚｎ、　Ｃｕおよびキレート剤（Ｅ
ＤＴＡ及びクエン酸塩）は５〜ｌ０ＮＮａＯＨで溶液の
ｐＨを５．０に調整する前に加えるべきである。残りの
成分はその後に加える。溶液の最終ｐＨは４．０〜４．
５の範囲内にくるようにすべきである。

（以下余白） 第２表 微量金属　　　　　塩　　　水１００ｍ１当りの重量（
ｃｏｎｃ、　） １０　ｍＭ　Ｚｎ　　　　　Ｚｎ５Ｏ，・７Ｈ，Ｏ２８
７，５ｍｇ２　ｍＭ　Ｃｕ　　　　　Ｃｕ５Ｏ，・５Ｈ
，０４９，９ｍｇＯ，１ｍＭ　Ｍｎ　　　　　ＭｎＳＯ
４・Ｈ，Ｏ１，７ｍｇｏ、０２ｍＭＮｉ　　　Ｎ１（Ｎ
Ｏ，）、・６Ｈ，ＯＯ，５８＋ｎｇＯ，２ｍＭ　ＡＩ　
　Ｎ１（４Ａｌ（ＳＱ、）、・１２＋ｌ、０　　　９．
２　ｍｇｏ、１　ｍＭ　Ｃｒ　　　ＫＣｒ（ＳＱ４）ｔ
４２Ｈ，０５，Ｏｍｇｏ、０２　ｍＭ　Ｃｏ　　　　Ｃ
ｏＣ１，・６１１，０　　　０．４８　＋ｎｇ１　ｍＭ
　Ｓｅ’　　　　　　Ｓｅａ、　’　　　　　　１１．
１　ｍｇ１４　ｒｎＭ　Ｎａ、−ＥＤＴＡ　　　　　’
　　　　　　５２１ｊ　ｒｒｇｌ　ｍＭクエン酸ナトリ
ウム　　　　　　２９．４　ｍｇ当然のことながら、こ
のような微量元素の組成物は、用いる組織あるいは細胞
の種類の要求に応じて上記の表に示されたものに加えて
他の微量元素を更に含有していてもよい。

本発明の培地は、前記の成分に加えて細胞の増殖を刺激
する化合物及び細胞の増殖に必要な化合物を更に含んで
いてもよい。このような化合物の例として、プルロニッ
ク（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ）　Ｆ　６８　（１（１〜２００
ｍｇ／ｌ、好ましくは２０ｍｇ／ｌ）などの界面活性剤
やＤ−グルコース（２，５ｇ／Ｉ）、Ｌ−グルタミン（
２ｍＭ）、ピルビン酸ナトリウム（１ｍ閃）、インシュ
リン（０，５ｍｇ／ｌ）あるいはエタノールアミン（２
０μＭ）等の無血清増殖因子が挙げられる。上記の括弧
中に表示された濃度はすべて最終濃度である。上記化合
物（室温で液体であるエタノールアミンを除く）からな
る添加組成物を乾燥品として調製することもできるが、
それはそのままで長期間の保存が可能であり数年間も保
存することができる。エタノールアミンが必要な場合は
、上記組成物の使用時に所望の濃度で培地に加えること
ができる。エタノールアミンはハイブリドーマを用いて
モノクローナル抗体を産生させる実験において最もよく
使用される。

本発明による培地添加物を添加することのできる基礎培
地としては、２．５ｇ／Ｉ　ＮａＣ０，及び２０　ｍＭ
ＨＥＰＥＳ（Ｎ−２−ハイドロオキシ−エチルピペラジ
ン−Ｎ−Ｎ’−エタンスルホン酸を含有するｌ１ｌＰ１
１１ｒ培地が好ましい。

本発明による無血清培地が殊に有効に使用できることが
判明した好ましい細胞培養株としては、Ｌ９２９マウス
繊維芽細胞株、ＩＩＥＬＡヒト腫瘍細胞株、血清含有培
地で増殖した場合と同程度の量のモノクローナル抗体を
産生ずる種々のマウス及びヒトＢハイブリドーマ細胞お
よび補体受容体を保持しながら７日間でマクロファージ
へ分化するヒト単球が挙げられる。

本発明の培地は増殖の速いタイプ（早生型）の細胞を用
いて、他の種類の培地の品質の試験用に使用することが
特に好ましい。その使用に当っては、本発明による無血
清培地組成物をＲＰＭＩ　１６４０と混合゛し、試験に
供する培地を無血清培地添加組成物干ＲＰＭ１１６４０
：未知の供試培地の比がＩ：１になるように加える。そ
の後混合培地１ｍｌ当り約３０．０００個の細胞を加え
て３６〜３９℃、好ましくは３７℃で培養する。

もし供試培地中に細胞に対して毒性を示す化合物が存在
しないならば、４日後に当初に加えた細胞数の約１０倍
の細胞数に増加しているのが観察される。しかしながら
、もし供試培地中に細胞に対して毒性を示す化合物が存
在するならば、細胞の増殖は観察されない。このように
これは試験系に血清を含まないため極めて鋭敏で非常に
単純な品質試験である。また血清が毒性不純物に結合し
遮蔽することがないので、間違った結果が出ることが避
けられる。

従って、本発明の増殖培地は上記の増殖の速いハイブリ
ドーマ細胞種と共にテストキットに入れて、例えば本発
明の血清代替物、凍結したあるいは増殖している上記細
胞を含有し、そして任意に培地（ＲＰＭＩ１６４０）及
びプラスチックあるいは他の適当な材料で作製した培養
装置を含有してもよいテストキットを提供することがで
きる。

上述したように他の増殖培地を試験する際に用いること
のできる好ましい新規な細胞株として、ポートンダウン
、サリスベリー、ウィルシャイア−（Ｐｏｒｔｏｎ　Ｄ
ｏｗｎ、　５ａ１ｉｓｂｅｒｙ１Ｗｉｌｔｓｉｒｅ）Ｓ
Ｐ４０ＪＧ。

英国のヨーロピアンコレクションオブアニマルセルカル
チャーズ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　
ｏｆＡｎｉｍａｌ　（：ｅｌｌ　Ｃｕ１ｔｕｒｅｓ）　
（ＥＣＡＣＣ）に１９８６年１１月２０日付で寄託番号
第８６１１２００１号の下に寄託された細胞株ＩＥ６が
挙げられる。この細胞株はＰ３Ｕ１’ｌ！を癌細胞とマ
ウスＢリンパ球とから作製した速く増殖する早生型ハイ
ブリドーマである。この細胞株は前述したような他の増
殖培地の品質試験に用いるのに特に有用であることが証
明されており、この細胞株も本発明に包含されるもので
ある。

上記寄託細胞株は、ケーラー、ジー、　（Ｋ８ｈｌｅｒ
。

Ｇ、）及びミルスタイン、シー、（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ、
　Ｃ，）によってネーチャー（Ｎａｔｕｒｅ）　（ロン
ドン）、第２５６巻、第４９５頁（１９７５年）に紹介
されたミエローマハイブリッド技術を用いて作製した。

親細胞はマウスのＰ、　Ｕ、ミエローマとＢＡＬＢ／　
ｃマウスＢリンパ球である。

ハイブリドーマ細胞は培地の質に対して要求性を示すこ
とが知られている。イ１１胞株］Ｅ６が、試験した２０
株のうちで最も速く増殖する本発明のハイブリドーマと
して選択された。この株は、よく知られている製造業者
から購入した種々の培地を実験的に調べるのに用いた。

その結果、試験した９種類の培地のうち２種類のみが満
足できる品質を有することがわかった。残りのうち６種
類の培地が６１〜１００％の細胞毒性を示した。無血清
ハイブリドーマ試験は、培地中に血清を添加する（無毒
化作用がある）ことを含む他のバイオアッセイよりもよ
り感受性が高い。

本発明の細胞株ＩＥ６の増殖の効果を本発明の無血清培
地を併用して調べることにより潜在的な毒性物質の毒性
を同定することも可能である。

比較実験として、マウス胎゛芽試験（ｍｏｕｓｅｅｍｂ
ｒｙｏ　ｔｅｓｔ）により増殖培地の品質を調べた。

マウス腋芽試験は生体内で（ｉｎ　ｖｉｖｏ）増殖した
マウス腋芽を試料である培地中で４〜５日培養すること
を含む。もし、８０％以上の腋芽が発達して芽細胞に成
れば、その培地は認容できるものである。

本発明による細胞培養試験はハイブリドーマ細胞株ＩＥ
６及びＲＰＭＩ−１６４’Ｏ／ＳＳＲ培地（ＲＰＭ■１
ＳＳＲと略する）を用いて行った。試験は下記の工程に
従って行った。

工程１　：　ＲＰＭＩ／ＳＳＰと試料培地をｌ：１で混
合する（血清無添加）。

工程２：パイブリドーマ細胞を１．５　Ｘ　１０°個１
ｍＱの濃度になるよう加えて４日間培養する。

工程３：細胞数を計測する。もし毒性物質が存在しなけ
れば、計測値は概ね３　Ｘ　１０’個／ｍＱになるであ
ろう。

リドカインの毒性を調べる試験では、細胞株ＩＥ６の細
胞増殖の阻害でその毒性を評価した。結果は下記の表に
示すとおりである。

試験の結果、０．Ｏ１■／ｍα以上の濃度のリドカイン
は毒性を示すことがわかった。マウス腋芽試験では毒性
は検出さ′れなかった。このことは、本発明のハイブリ
ドーマと無血清増殖培地を用いる試験がこれまでに通常
行われてきたいかなる試験よりも優れていることを示す
ものである。

また、マウス腋芽試験はハイブリドーマ細胞試験に比較
して感受性が非常に低いと結論することができる。

第３表　水質試験 水の種類　　　　　　　　　細胞増殖阻害トロムス（Ｔ
ｒｏｍｓ）φ、２回蒸留　　　　　　３５％トロムス（
Ｔｒｏｍｓ）φ、２回蒸留、非無菌的保存　　　９２％ ミリポア（Ｍｉ　ｌ　ｌ　１ｐｏｒｅ）ＲＯ、ゴーテン
プルグ（Ｇｏｔ、ｈｅｎｂｕｒｇ）　　　　　　Ｉ　Ｉ
％ファーマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）Ｓ、Ｗ。

（スウェーデン）８８％ ステリドス（ＳＬｅｒｉｄｏｓ）Ｓ、Ｗ。

（スウェーデン）　　　　　　　　　　　　　ＯχＮＡ
ＦＳ、Ｆ、（ノルウェー）　　　　　　　　　　　０％
トラベノール（Ｔｒａｖｅｎｏｌ）Ｓ、Ｗ、（英国）　
　　　Ｏ％トラベノール（Ｔｒａｖｅｎｏｌ）Ｓ、Ｗ、
（米国）　　　　０％メデイボラー（Ｍｅｄｉｐｏｌａ
ｒ）Ｓ、Ｗ。

（フィンランド）　　　　　　　　　　　　　Ｏ％アナ
ラー（Ａｎａｌａｒ）Ｓ、Ｗ、（英国）　　　　　　　
０％第４表　培地の品質試験 液体培地（１倍） 培地Ｎｏ、培地の種類　製造者　　細胞増殖阻害Ｉ　　
　ＥＢＳＳ　　　　シグマ（Ｓｉｇｍａ）　　　　　０
％２　　　ＥＢＳＳ　　　　ギブ：Ｉ　（Ｇｉｂｃｏ）
　　　　３２％３−５　　　ＥＢＳＳ　　　　フロー（
Ｆｌｏｗ）、ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）、 シグマ（Ｓｉｇｍａ）　　　　８５−９２％６−８　　
　ハム（Ｈａｍ）フロー（Ｆｌｏｗ）、ＦＩＯギブｍｌ
　（Ｇｉｂｃｏ）、 シグマ（Ｓｉｇｍａ）　　　　６１−１００％９　　　
ＲＰＭＩ　１６４０シグマ（Ｓｉｇｍａ）　　　　　Ｏ
％粉状培地＋水 培地Ｎｏ、培地の種類　製造者　　細胞増殖阻害ｔｏ−
１１ＭＥＭ　　　　ゴーテンプルグ（Ｇｏｔｈｅｎｂｕ
ｒｇ）　　　　３０−３３％１２−１７　　ＥＢＳＳ　
　　　ゴーテンプルグ（Ｇｏｔｈｅｎｂｕｒｇ）　　　
　１２−４５％１８〜２３　　ＥＢＳＳ　　　　トロム
ス（Ｔｒｏｍｓ）φ 〔フロー（Ｆｌｏｗ）、 ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）、 シグマ（Ｓｉｇｍａ））　　　　　０％２４〜２７　　
ハム（Ｈａｍ）　　トロムスＦ　ＩＱ　　　　（Ｔｒｏ
ｍｓ）φ 〔フロー（Ｆｌｏｗ）、 ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）、 シグマ（Ｓｉｇｍａ））　　　　Ｏ％ 第５表　リドカイン毒性試験 リドカイン濃度　　　　　　細胞増殖阻害〔スウェーデ
ン、アストラ ０．０００１　ｍｇ／ｍＱ　　　　　　　　　　　０％
０．００１　ｍｇ／＋ｎＱ　　　　　　　　　　　０％
０．０１　ｍｇ／ｍＱ２０％ 特許出願人　メディーカルトエー／ニスニー／エスジー
イーエー

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. （１）ａ）鉄キレート剤および ｂ）オーリン−トリカルボン酸 を含有し、そして ｃ）アルカリ金属−ＥＤＴＡおよび／または ｄ）微量元素 を随意に含有していてもよく、好ましくはｐＨ７．０〜
   ７．８の範囲の緩衝作用を有することを特徴とする無血
   清増殖培地。
2. （２）鉄キレート剤がＥＤＴＡ及びクエン酸塩／クエン
   酸を含有し、そのクエン酸塩／クエン酸塩のモル濃度が
   全ＥＴＤＡのモル濃度の３倍以上であることを特徴とす
   る特許請求の範囲第（１）項に記載の無血清増殖培地。
3. （３）各成分を細胞増殖において生理的に許容できる量
   含有することをことを特徴とする特許請求の範囲第（１
   ）項に記載の無血清増殖培地。
4. （４）Ｚｎ、Ｃｕ、Ｍｎ、Ｎｉ、Ａｌ、Ｃｒ、Ｃｏおよ
   びＳｅの金属元素を微量元素として含有することを特徴
   とする特許請求の範囲第（１）〜（３）項に記載の無血
   清増殖培地。
5. （５）プルロニック（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ）Ｆ６８などの
   界面活性剤を更に含有することを特徴とする特許請求の
   範囲第（１）〜（４）項に記載の無血清増殖培地。
6. （６）Ｄ−グルコース、Ｌ−グルタミン、ピルビン酸ナ
   トリウム、インシュリンおよびエタノールアミンなどの
   無血清増殖因子を更に含有することを特徴とする特許請
   求の範囲第（１）〜（５）項に記載の無血清増殖培地。
7. （７）２．５ｇ／ｌのＮａＨＣＯ＿３及び２０ｍＭ　Ｈ
   ＥＰＥＳを含有するＲＰＭＩ培地などの基礎培地からな
   ることを特徴とする特許請求の範囲第（１）〜（６）項
   に記載の無血清増殖培地。
8. （８）２．４〜３．６μＭ　Ｆｅ−ＥＤＴＡ、２．４〜
   ３．６μＭ　オーリン−トリカルボン酸、０．８〜１．
   ２μＭ　Ｎａ＿２−ＥＤＴＡ、１２〜１８μＭ　クエン
   酸及び２０〜３０μＭ　クエン酸ナトリウムを含有し、
   ０．０８〜０．１２μＭ　Ｚｎ＾２＾＋０．０１６〜０
   ．０２４μＭＣｕ＾２＾＋、０．０００８〜０．００１
   ２μＭ　Ｍｎ＾２＾＋、０．０００１６〜０．０００２
   ４μＭ　Ｎｉ＾２＾＋、０．００１６〜０．００２４μ
   Ｍ　Ａｌ＾３＾＋、０．０００８〜０．００１２μＭ　
   Ｃｒ＾３＾＋、０．０００１６〜０．０００２４μＭＣ
   ｏ＾２＾＋及び０．０８〜０．１２μＭ　Ｓｅ＾４＾＋
   のイオンを随意に含有していてもよいことを特徴とする
   特許請求の範囲第（１）〜（７）項に記載の無血清増殖
   培地。
9. （９）好ましくはｐＨ４．５〜５．０の範囲の緩衝作用
   を有する濃縮物であることを特徴とする特許請求の範囲
   第（１）〜（７）項に記載の無血清増殖培地。
10. （１０）２．４〜３．６ｍＭ　Ｆｅ−ＥＤＴＡ、２．４
    〜３．６ｍＭ　オーリン−トリカルボン酸、０．８〜１
    ．２ｍＭ　Ｎａ＿２−ＥＤＴＡ、１２〜１８ｍＭ　クエ
    ン酸及び２０〜３０ｍＭ　クエン酸ナトリウムを含有し
    、０．０８〜０．１２ｍＭ　Ｚｎ＾２＾＋、０．０１６
    〜０．０２４ｍＭＣｕ＾２＾＋、０．０００８〜０．０
    ０１２ｍＭ　Ｍｎ＾２＾＋、０．０００１６〜０．００
    ０２４ｍＭ　Ｎｉ＾２＾＋、０．００１６〜０．００２
    ４ｍＭ　Ａｌ＾３＾＋、０．０００８〜０．００１２ｍ
    Ｍ　Ｃｒ＾３＾＋、０．０００１６〜０．０００２４ｍ
    Ｍ　Ｃｏ＾２＾＋及び０．０８〜０．１２ｍＭ　Ｓｅ＾
    ４＾＋のイオンを随意に含有していてもよいことを特徴
    とする特許請求の範囲第（９）項に記載の無血清増殖培
    地。
11. （１１）乾燥状態の組成物であることを特徴とする特許
    請求の範囲第（１）〜（１０）項に記載の無血清増殖培
    地。
12. （１２）Ｐ＿３Ｕ＿１腫瘍細胞とＢ−リンパ球とのマウ
    スハイブリドーマであり、ヨーロピアン　コレクション
    オブ　アニマル　セル　カルチャーズ（ＥＣＡＣＣ）に
    寄託番号第８６１１２００１号の下に寄託されているこ
    とを特徴とする細胞株。
13. （１３）Ｐ＿３Ｕ＿１腫瘍細胞とＢ−リンパ球とのマウ
    スハイブリドーマであり、ヨーロピアン　コレクション
    オブ　アニマル　セル　カルチャーズ（ＥＣＡＣＣ）に
    寄託番号第８６１１２００１号の下に寄託されている細
    胞株を随意に用いて又は用いないで行なう他の増殖培地
    の品質の試験用の特許請求の範囲第（１）〜（１１）項
    に記載の無血清増殖培地。