JPH06292570A - 新規な細胞株及びこれを用いる供試培地の品質試験方法 - Google Patents

新規な細胞株及びこれを用いる供試培地の品質試験方法

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JPH06292570A
JPH06292570A JP6052560A JP5256094A JPH06292570A JP H06292570 A JPH06292570 A JP H06292570A JP 6052560 A JP6052560 A JP 6052560A JP 5256094 A JP5256094 A JP 5256094A JP H06292570 A JPH06292570 A JP H06292570A
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Abstract

(57)【要約】 【目的】 本発明は、新規な細胞株、並びにこの細胞株
を用いる高感度でかつ簡単な供試培地の品質試験方法を
提供することを目的とする。 【構成】 本発明は、P3U1腫瘍細胞とB-リンパ球とのマ
ウスハイブリドーマであり、ヨーロピアン コレクショ
ンオブ アニマル セル カルチャーズ（ECACC）に寄託番
号第86112001号の下に寄託されている新規細胞でる。こ
の細胞株、特定の無血清増殖培地および供試培地よりな
る混合系を調製し、混合系を培養に付し、細胞株の増殖
度によって供試培地の品質を高感度に評価することがで
きる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、新規な細胞株及びこれ
を用いる供試培地の品質試験方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】血清を培地に添加することは、増殖に必
要な成分を培養液に与えるがその反面、得られる結果の
正確さが極めて重要である大抵の実験の場合に悪影響を
与える成分をも培養液に与えるため、産業上の利用にお
いてまた研究においても無血清培地及び無血清増殖培地
が強く望まれていた。これは、細胞免疫、バイオテクノ
ロジー、対外受精、臓器移植、癌研究、各種試験、更に
血液保存や輸血などの分野において有用である。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】現在、産業上及び研究
上そして臨床で用いられている培地や生理的溶液は１０
０年も前の古い組成に基づいたものであり、従って生物
学的研究の分野における行詰りの典型となっている。こ
れまでに細胞培養に用いられてきた培地は、非常に多く
の場合いわゆる市販の基礎培地に概ね１０％の加熱不活
性化血清を添加したものである。この非常に古い方法は
以下のような欠点がある。
【０００４】１）血清の細胞溶解作用を妨げるために必
要な熱処理は、重要な血清成分を変性させる作用を有す
る。
【０００５】２）異なるバッチ（batch）の血清は、そ
れらの由来や、インビトロ（in vitro)の細胞培養の挙
動に望ましくない変動を与える何かあるものの違いのた
めに異なった性質を有する。
【０００６】３）血清は、細胞に対して未知でかつ制御
できない作用を有する幾つかの未知の因子や化合物を含
有する。
【０００７】４）細胞は血清と比較して異なった量の異
なった化合物を含有する体内のいわゆる組織液に適合し
ているので、血清は大抵の細胞にとっては非生理的液体
である。
【０００８】５）血清中の抗体が細胞と結合して実験の
妨げとなる。
【０００９】６）インビトロ（in vitro)における細胞
による血清因子の合成の研究においてそれらの因子の血
清中でのバックグランドレベルが比較的高くなるので血
清の使用はその研究を妨げる。
【００１０】したがって、上記の欠点を克服し、細胞や
組織をインビトロ（in vitro)で培養したり保存するの
に適した培地が望まれている。さらに、このような培地
及び細胞株を用いることにより、高感度でかつ簡単な供
試増殖培地の品質の試験方法が望まれている。
【００１１】
【問題点を解決するための手段】本発明の１つの態様に
よれば、P3U1腫瘍細胞とB-リンパ球とのマウスハイブリ
ドーマであり、ヨーロピアン コレクションオブ アニマ
ル セル カルチャーズ（ECACC）に寄託番号第86112001
号の下に寄託されている細胞株が提供される。
【００１２】本発明の他の１つの態様によれば、ａ）鉄
キレート剤および ｂ）オーリン−トリカルボン酸を含
有し、そしてpH7.0〜7.8の範囲の緩衝作用を有する無血
清増殖培地、上記細胞株および供試培地よりなる混合系
を調製し、混合系を培養に付し、細胞株の増殖度によっ
て供試培地の品質を評価することを特徴とする供試培地
の品質試験方法が提供される。
【００１３】本発明は、供試培地を用いて或る細胞株を
培養し、該細胞株の増殖度によって該供試培地の品質を
評価する方法に関するものであるが、該供試培地に目的
とする試験に有効な別の培地を混合することによって、
極めて鋭敏な品質試験方法を提供すべく鋭意研究の結
果、本発明に到達したものである。
【００１４】次に、まず、供試培地と混合培地を形成す
るための、本発明の方法に用いる新規な無血清培地につ
いて説明する。
【００１５】本発明の細胞株とともに供試培地と混合系
を形成する無血清増殖培地は、インビトロ（in vitro)
での細胞や組織の培養や保存に極めて適している。ま
た、この完全培地は無血清、無蛋白（ただし、ある種の
細胞が要求し、必要に応じて用いられるところのごく少
量のインシュリンは除く）であり、トランスフェリンや
脂質の存在なしに、鉄および微量元素を安定化したキレ
ート化元素または化合物として含有することによって特
定されるものである。本発明の培地は非常に安価に製造
することができる。
【００１６】従来の無血清培地の主な問題点は、以下の
２つの事情のためにそれらの培地が、任意に選んだ細胞
に使用するのに適していないということである〔エヌ．
エヌ．イスコーブ(N.N.Isccove)及びエフ．メルチャ−
ズ(F.Melchers)、「コンプリート リプレースメント オ
ブ セーラム バイ アルブミン、トランスフェリン、ア
ンド ソイビーン リピドイン カルチャーズ オブ リポ
ポリサッカライド-リアクティブ B-リンホサイツ（Comp
lete Replacement of Serum by Albumin,Transferrin,
and Soybean Lipid in Cultures of Lipopolysaccharid
e-reactive B-lymphocytes)」、ジエイ．エクスプ．メ
ド、(J. Exp. Med)、第147巻、第923〜933頁（1978
年）；アール．ジー．ハム（R.G. Ham)、「インポータ
ンス オブ ザ ベーサル ニュートリエント メディーム
イン ザ デザイン オブ ホーモナリー ディファインド
メディア（Importance of the basal Nutrient Medium
in the Design of Hormonally Defined Media)」、グロ
ース オブ セルズ イン ホ−モナリー ディファインド
メディア（Growth of Colls in Hormonally Defined Me
dia)、コールド スプリング ハーバー コンファレンス
オン セル プロリファレーション(Cold Spring Harbor
Conference on Cell Proliferation)、第9巻、第39〜60
頁（1982年）；およびディー．バーネス（D.Barnes)お
よびジー．サトー（G.Sato)、「メソッズ フォーグロー
ス オブ カルチャード セルス イン セーラム-フリー
メディーム（Methods for Growth of Cultured Cells i
n Serum-free Medium)」、アナル．バイオケム．(Anal.B
iochem.)、第102巻、第255〜270頁（1980年）〕。
【００１７】１）生理的な量の重炭酸塩及びCa2+ /Mg2+
イオンの存在が、37℃、pH7〜8の条件下における既知の
キレート剤系(トランスフェリンを除く)から鉄および3
価の微量元素を沈澱させてしまう。
【００１８】２）毒性化合物を含む微量元素の培地中の
濃度が制御できず、またその濃度は培地中の水及び不純
物の各々の性質や配合によって著しく変化する。この問
題の唯一の解決策は必要な全ての微量元素および金属の
平衡溶液を含む完全に安定な金属イオン緩衝液を製造し
て、毒性元素を緩衝液に吸収させることである(毒性作
用は平衡化されてなくなってしまう)。
【００１９】トランスフェリンは高価で種特異的である
ので、本発明の培地は合成非蛋白性キレート剤のFe/微
量元素緩衝液に基づいて製造されており、それによっ
て、37℃における沈澱(上記参照)という主な問題点は、
溶液と混合したときに、各キレート剤単独の場合と比較
して非常に異なったそして特殊な性質を有するある種の
キレート剤を複数添加することによって解決されてい
る。選ばれたキレート剤はEDTAとクエン酸塩であり、そ
のクエン酸塩緩衝剤とEDTAのモル濃度比が３：１以上で
ある。これに関し、クエン酸塩緩衝剤とはクエン酸塩と
クエン酸の合計をいう。
【００２０】第2の問題点、即ち細胞膜及び細胞への鉄
の供給については、培地にオーリン-トリカルボン酸を
添加することにより解決した。たとえEDTA／クエン酸塩
が金属溶液を完全に安定化したとしても、動物細胞やヒ
ト細胞の種類によっては鉄欠乏によって増殖しないであ
ろう。EDTA／クエン酸塩／オーリン-トリカルボン酸の
組合せがこれまで開示されていなかった未解決のキレー
ト特性及び鉄供給特性をもたらすことを発見した。これ
に関し、EDTA単独を、金属の沈澱が問題とならない条件
下でpH 5.0で植物細胞の増殖用の鉄キレート剤として以
前に用いたが全く取るにたらない結果であった〔ピー．
クルーセ(P.Kruse)およびエム．ケー．ペターソン(M.K.
Petterson)、「ティシュ カルチャー メソッズ アンド
アプリケ−ションズ(Tissue Culture Methods and Appl
ications)」、アカデミック プレス(Academic Press)、
(1973年);およびジェイ．アール．ステイン(J.R.Stei
n)、「ハンドブック オブ フィジオロジカル メソッズ
(Handbook of PhysiologicalMethods)」、ケンブリッヂ
ユニバーシティ プレス(Cambridge University Pres
s)、(1973年）参照〕。
【００２１】細胞増殖に関し、EDTAとクエン酸（クエン
酸塩）の比が例えば1:10であると非常に有利であること
がわかった。又、培地中での細胞増殖は通常pH 7.4で行
なわれるが、本発明によれば最終的な培地のpHは種々の
細胞の増殖における要求に応じて、それとは異なるもの
でもよい。
【００２２】本発明に使用する増殖培地の例としては、
2.4〜3.6μM Fe-EDTA、2.4〜3.6μMオーリン-トリカル
ボン酸、0.8〜1.2μM Na2-EDTA、12〜18μM クエン酸及
び20〜30μM クエン酸ナトリウムを含有する培地をあげ
ることができ、さらに随意に微量元素として例えば0.08
〜0.12μM Zn2+、0.016〜0.024μM Cu2+、0.0008〜0.00
12μM Mn2+、0.00016〜0.00024μM Ni2+、0.0016〜0.00
24μM Al3+、0.0008〜0.0012μM Cr3+、0.00016〜0.000
24μM Co2+ 及び0.008〜0.012μM Se4+ のイオンを含有
していてもよい。
【００２３】この増殖培地は、例えば培地の各成分の濃
縮液を純水に添加混合して作製することができる。例え
ば2.4〜3.6mM Fe-EDTA、2.4〜3.6mM オーリン-トリカル
ボン酸、0.8〜1.2mM Na2-EDTA、12〜18mM クエン酸及び
20〜30mM クエン酸ナトリウムを含有する濃縮液とする
ことができる。本発明による増殖培地を調製する際に、
可能なかぎり高度に精製された水、例えば英国トラベノ
ール(Travenol)社製の「トラベノール(Travenol)(商標)
滅菌水等を使用することが極めて重要である。そのよう
な濃縮混合液の1例として1000倍濃度のものとして用い
ることのできる濃縮混合液を以下に示す。
【００２４】
【表１】 3 mM Fe-EDTA1) 120.1 mg 3 mM オーリン-トリカルボン酸2) 126.7 mg 1 mM Na2-EDTA 37.2 mg 15 mM クエン酸 315.0 mg 25 mM クエン酸ナトリウム 735.0 mg (任意に1%の微量元素を加えてもよい3)） 1)エチレンジアミン四酢酸Fe(III)Naキレートの2水和物
〔コッホ-ライト(Koch-Light)社製、カタログNo.2529-0
0〕 2)米国シグマ(Sigma）社製、カタログNo.A-1895 3)微量元素としては、下記にしめすものが使用可能であ
る：0.08〜0.12mM Zn2+、0.016〜0.024mM Cu2+、0.0008
〜0.0012mM Mn2+、0.00016〜0.00024mM Ni2+、0.0016〜
0.0024mM Al3+、0.0008〜0.0012mM Cr3+、0.00016〜0.0
0024mM Co2+ 及び0.008〜0.012mM Se4+ のイオン。
【００２５】組成物のpHは4.5〜5.0に調整することが好
ましい。これに関し、上記の組成で組成物を調製した場
合はpHは自動的に4.5〜5.0の範囲内に入るが、もしこの
範囲に入らないような場合にはNaClやHClあるいは当業
者にとって通常の公知の他の酸やアルカリを用いてpHを
上記範囲内に入るように調整することができる。
【００２６】尚、用いることのできるアルカリ-EDTAと
しては上記のNa2-EDTAの他にK2-EDTAなどが挙げられ
る。
【００２７】微量元素を任意に添加する場合は、例えば
以下に示すように調製することのできるステム(Stem)溶
液を用いて添加することができる。以下に示すステム溶
液は上記増殖培地において使用される濃度の100000倍の
濃度の各微量元素成分を含有している。下記に示す溶液
の調製に際して、Zn、Cuおよびキレート剤（EDTA及びク
エン酸塩）は5〜10N NaOHで溶液のpHを5.0に調整する前
に加えるべきである。残りの成分はその後に加える。溶
液の最終pHは4.0〜4.5の範囲内にくるようにすべきであ
る。
【００２８】
【表２】 微量金属 塩 水100ml当り (conc.) の重量 10 mM Zn ZnSO4・7H2O 287.5 mg 2 mM Cu CuSO4・5H2O 49.9 mg 0.1 mM Mn MnSO4・H2O 1.7 mg 0.02 mM Ni Ni(NO3)2・6H2O 0.58 mg 0.2 mM Al NH4Al(SO4)2・12H2O 9.2 mg 0.1 mM Cr KCr(SO4)2・12H2O 5.0 mg 0.02 mM Co CoCl2・6H2O 0.48 mg 1 mM Se SeO2 11.1 mg 14 mM Na2-EDTA 521.1 mg 1 mM クエン酸ナトリウム 29.4 mg
【００２９】当然のことながら、このような微量元素の
組成物は、用いる組織あるいは細胞の種類の要求に応じ
て上記の表に示されたものに加えて他の微量元素を更に
含有していてもよい。
【００３０】上記培地は、前記の成分に加えて細胞の増
殖を刺激する化合物及び細胞の増殖に必要な化合物を更
に含んでいてもよい。このような化合物の例として、独
国、セルバ ファインビオケミカ社(Serva Feinbiochemi
ca)より入手できるプルロニック（Pluronic)Ｆ６８(10
〜200mg/l、好ましくは20mg/l)などの界面活性剤やD-グ
ルコース(2.5g/l)、L-グルタミン(2mM)、ピルビン酸ナ
トリウム(1mM)、インシュリン(0.5mg/l)あるいはエタノ
ールアミン(20μM）等の無血清増殖因子が挙げられる。
上記の括弧中に表示された濃度はすべて最終濃度であ
る。上記化合物(室温で液体であるエタノールアミンを
除く)からなる添加組成物を乾燥品として調製すること
もできるが、それはそのままで長期間の保存が可能であ
り数年間も保存することができる。エタノールアミンが
必要な場合は、上記組成物の使用時に所望の濃度で培地
に加えることができる。エタノールアミンはハイブリド
ーマを用いてモノクローナル抗体を産生させる実験にお
いて最もよく使用される。
【００３１】上記培地添加組成物を添加することのでき
る基礎培地としては、2.5g/l NaHCO3及び20 mM HEPES(N
-2-ハイドロオキシ-エチルピペラジン−N,N'-エタンス
ルホン酸)を添加したRPMI培地、特にRPMI1640培地が好
ましい。RPMIは、Reagents Park Memorial Institute
(リエージェント パーク メモリアル インスチチュー
ト)で調製された基礎培地の名前であって、その調製研
究所の頭文字をとった略語であり、その1種であるRPMI1
640はデンマークのジーイーエー社(GEA, LTD.)から入手
できる。
【００３２】上記無血清培地が殊に有効に使用できるこ
とが判明した好ましい細胞培養株としては、L929マウス
繊維芽細胞株、HELAヒト腫瘍細胞株、血清含有培地で増
殖した場合と同程度の量のモノクローナル抗体を産生す
る種々のマウス及びヒトBハイブリドーマ細胞および補
体受容体を保持しながら7日間でマクロファージへ分化
するヒト単球が挙げられる。
【００３３】上記培地は、増殖の速いタイプ(早生型)の
細胞を用いて、供試培地（本発明に用いる無血清増殖培
地以外の培地）の品質を試験するのに好ましく用いるこ
とができる。その使用に当っては、上記無血清培地用添
加組成物（即ち、血清代替物）（SSR: synthetic serum
replacement の略）をRPMI1640と混合し、試験に供す
る培地を無血清培地用添加組成物＋RPMI1640:未知の供
試培地の比が1:1になるように加える。その後混合培地1
ml当り約30,000個の細胞を加えて36〜39℃、好ましく
は37℃で培養する。もし供試培地中に細胞に対して毒性
を示す化合物が存在しないならば、4日後に当初に加え
た細胞数の約10倍の細胞数に増加しているのが観察され
る。しかしながら、もし供試培地中に細胞に対して毒性
を示す化合物が存在するならば、細胞の増殖は観察され
ない。このようにこれは試験系に血清を含まないため極
めて鋭敏で非常に単純な品質試験である。また血清が毒
性不純物に結合し遮蔽することがないので、間違った結
果が出ることが避けられる。
【００３４】従って、上記増殖培地は上記の増殖の速い
ハイブリドーマ細胞種と共にテストキットに入れて、例
えば本発明の血清代替物(SSR)、凍結したあるいは増殖
している上記細胞を含有し、そして任意に培地(RPMI164
0)及びプラスチックあるいは他の適当な材料で作製した
培養装置を含有してもよいテストキットを提供すること
ができる。
【００３５】上述したように供試増殖培地を試験する際
に用いることのできる好ましい新規な細胞株として、本
発明のポートン ダウン、サリスベリー、ウィルシャイ
アー(Porton Down, Salisbery, Wiltsire)SP40JG、英国
のヨーロピアン コレクションオブ アニマル セル カル
チャーズ(European Collection of Animal Cell Cultur
es)(ECACC)に1986年11月20日付で寄託番号第86112001号
の下に寄託された細胞株1E6が挙げられる。本発明の細
胞株はP3U1腫瘍細胞とマウスBリンパ球とから作製した
速く増殖する早生型ハイブリドーマである。この細胞株
は前述したような供試増殖培地の品質試験に用いるのに
特に有用であることが証明されている。
【００３６】上記寄託細胞株は、ケーラー、ジー．（Ko
ehler，G.)及びミルスタイン、シー.(Milstein，C.)に
よってネーチャー(Nature)(ロンドン）、第256巻、第49
5頁(1975年)に紹介されたミエローマハイブリッド技術
を用いて作製した。親細胞はマウスのP3U1ミエローマと
BALB/cマウスBリンパ球である。
【００３７】ハイブリドーマ細胞は培地の質に対して要
求性を示すことが知られている。細胞株1E6が、試験し
た20株のうちで最も早く増殖する本発明のハイブリドー
マとして選択された。この株は、よく知られている製造
業者から購入した種々の培地を実験的に調べるのに用い
た。その方法は、前述した通り、上記無血清培地用添加
組成物（即ち、血清代替物）（SSR: synthetic serum r
eplacement の略）をRPMI1640と混合し、試験に供する
培地を無血清培地用添加組成物＋RPMI1640:未知の供試
培地の比が1:1になるように加える。その後混合培地1 m
l当り約30,000個の細胞を加えて36〜39℃、好ましくは3
7℃で培養する。4日後に当初に加えた細胞株を算えて細
胞増殖阻害の有無を調べる。その結果、表３に示すよう
に、試験した9種類の培地のうち2種類のみが満足できる
品質を有することがわかった。残りのうち6種類の培地
が61〜100%の細胞毒性を示した。無血清ハイブリドーマ
試験は、培地中に血清を添加する(無毒化作用がある)こ
とを含む他のバイオアッセイよりもより感受性が高い。
【表３】
【００３８】又、各種水質のテストも上記と同様に行な
った。その結果を第４表に示す。
【表４】
【００３９】本発明の細胞株1E6の増殖の効果を上記無
血清培地を併用して調べることにより潜在的な毒性物質
の毒性を同定することも可能である。
【００４０】比較実験として、マウス胎芽試験（mouse
embryo test)により増殖培地の品質を調べた。マウス胎
芽試験は生体内で(in vivo)増殖したマウス胎芽を試料
である培地中で4〜5日培養することを含む。もし、80%
以上の胎芽が発達して芽細胞に成れば、その培地は認容
できるものである。
【００４１】本発明による品質試験方法として、例え
ば、細胞培養試験はハイブリドーマ細胞株1E6及びRPMI1
640/SSR培地(RPMI/SSRと略する）を用いて行った。試験
は下記の工程に従って行った。
【００４２】工程1：RPMI/SSRと試料培地を１：１で混
合する（血清無添加）。 工程2：ハイブリドーマ細胞を1.5×104個/mlの濃度にな
るよう加えて４日間培養する。 工程3：細胞数を計測する。もし毒性物質が存在しなけ
れば、計測値は概ね3×105個/mlになるであろう。
【００４３】リドカインの毒性を調べる試験では、細胞
株1E6の細胞増殖の阻害でその毒性を評価した。結果は
下記の表５に示すとおりである。
【００４４】
【表５】 リドカイン毒性試験 リドカイン濃度 細胞増殖阻害 〔スウェーデン、アストラ (Astra)社製キシロカイン〕 ──────────────────────── 0.0001 mg/ml 0 % 0.001 mg/ml 0 % 0.01 mg/ml 20 % 0.1 mg/ml 85 % ────────────────────────
【００４５】試験の結果、0.01mg/ml以上の濃度のリド
カインは毒性を示すことがわかった。マウス胎芽試験で
は毒性は検出されなかった。このことは、本発明のハイ
ブリドーマと無血清増殖培地を用いる試験がこれまでに
通常行なわれてきたいかなる試験よりも優れていること
を示すものである。
【００４６】また、マウス胎芽試験はハイブリドーマ細
胞試験に比較して感受性が非常に低いと結論することが
できる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims (2)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 P3U1腫瘍細胞とB-リンパ球とのマウスハ
    イブリドーマであり、ヨーロピアン コレクションオブ
    アニマル セル カルチャーズ（ECACC）に寄託番号第861
    12001号の下に寄託されている細胞株。
  2. 【請求項２】 ａ）鉄キレート剤および ｂ）オーリン
    −トリカルボン酸を含有し、そしてpH7.0〜7.8の範囲の
    緩衝作用を有する無血清増殖培地、請求項１に記載の細
    胞株および供試培地よりなる混合系を調製し、該混合系
    を培養に付し、該細胞株の増殖度によって該供試培地の
    品質を評価することを特徴とする供試培地の品質試験方
    法。
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