JPS63222686A - 菌体中のヒスチダ−ゼの分離取得法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、ヒスチダーゼを含有するシュードモナス属に
属する菌体から、ヒステダーゼを分離取得する方法に関
する。

（従来の技術） ヒスチダーゼは歯体内に酵素として存在している。従来
菌体からヒスチダーゼを製造するには、ヒスチダーゼを
産生ずる菌体を培養し、培養物から遠心分離等によシ菌
体を分離した後、菌体から粗とスチダーゼを採取し、引
き続いて精製する方法が一般的である。そして、菌体か
ら粗ヒスチダーゼを分離取得するには、菌体をアルミナ
等によシ摩砕したり、ホモナイザー等で破砕した後、固
液分離により粗酵素液を得、引き続いて塩析等により粗
ヒスチダーゼを得る方法が知られている。しかし、この
方法では工程が繁雑であり、酵素が操作途上で、昇天変
性したり、酸化失活するのく加え、菌体から粗酵素液中
に目的とする酵素以外の水溶性成分が多量に溶出するた
め、場合によっては粗酵素の活性が低くなったシ、又、
液の粘度の上昇によって菌体分離が困離となる等の欠点
があった０ ヒスチダーゼはＬ−ヒスチジンを脱アミノ化し、ウロカ
ニン酸とする酵素である。そしてクロカニン酸は汗中に
存在する天然の紫外線吸収剤として知られ、化粧品等の
用途に供されている。ところで、ヒスチダーゼを含有す
る菌体はウロカナーゼ体から分離し念ヒスチダーゼ中に
はウロカナーゼが共存していることになシ、この様な粗
ヒスチダーゼを用いてＬ−ヒスチジンからウロカニン酸
を製造した場合、折角生成したウロカニン酸がウロカナ
ーゼによりて分解、消費されてしまうことになる。

（発明が解決しようとする問題点） 本発明者らは、上記問題点Ｋｍみ鋭意研究を続けた結果
、ヒスチダーゼを含有するシュードモナスＩ！Ａ４Ｃ属
する菌体を分散した水性媒体を加熱すると、ヒスチダー
ゼが菌体外に溶出すると共に、ヒスチダーゼと共存し、
ウロカニン酸を分解消費するウロカナーゼが失活する現
象を見い出し、本発明を完成し九ものである。

本発明の目的は、簡単な操作でヒスチダーゼを含有する
シュードモナス属に属する菌体から高活性のヒスチダー
ゼを効率よく分離取得する方法を提供するにある。他の
目的は、菌体からヒスチダーゼを分離取得すると同時に
、ウロカニン酸を分解消費するクロカナーゼを失活する
方法を提供するにある。本発明の更に他の目的並びに効
果は以下の説明から明らかにされよう。

（問題点を解決するための手段） 上述の目的は、ヒスチダーゼを含有するシュードモナス
属に属する菌体からヒスチダーゼを分離取得するに際し
、該菌体を分散した水性媒体を加熱し、ヒスチダーゼを
菌体外に溶出せしめることを特徴とする菌体中のヒスチ
ダーゼの分離取得法によシ達成される。

本発明に適用される菌体参与＜は、加熱水性媒体により
酵素を溶出し且つヒスチダーゼを産生蓄積する必要があ
る。か＼る特質を備えた菌体として本発明では、シェ−
ドモナス属に属し、ヒスチダーゼ産生蓄積能を有する菌
体、換言すればヒスチダーゼを含有するシュードモナス
属に属する菌体が適用される。これら厘体中好適なもの
を具体的に例示すると、シュードモナス・フルオレッセ
ンス、シュードモナス・アシドボッンス、シュードモナ
ス・ルテッセンス、シュードモナス・プチダ、シュード
モナス・アエルギノザ等が挙げられる。これら本発明方
法に使用される菌体は公知の適宜方法により容易に培養
でき、分離取得し得る。

その−例を具体的に示すと例えば、通常使用される培地
ＫＬ−ヒスチジンを０．１〜５％程度添加した培地に菌
体を接種し２４〜４Ｇ’Ｃの温度で１２〜８６時間培養
した後、培養物から遠心分離等の適宜の方法により菌体
を分離する。そして本発明に適用される菌体は生菌体で
も凍結乾燥物でもよいＯ 次に、菌体を分散する水性媒体としては、菌体からヒス
チダーゼを溶出し且つ溶出したヒスチダーゼを失活しな
いものであって、例えば、水、緩衝液等の塩類溶液が挙
げられる。

得られた菌体は水性溶媒に分散せしめ、ｇｏ’ｃ〜８５
℃にて１〜１２０分間、好ましくは６５℃〜８０℃にて
２〜８０分間熱処理を行うと水性媒体中に酵素が溶出さ
れる。次いで遠心分離によシ固液分離すると、粗酵素液
と菌体とが分離される。

そしてか＼る熱処理過程でヒスチダーゼと共存するクロ
カナーゼの活性は完全に失活する。

温度が６０℃よシ低いと、抽出時間に拘らず、水溶液中
へ抽出される酵素量は少なく実用性がない。又、９０℃
以上では酵素が急速に失活する為、抽出されても活性は
低いものとなシ、用いることができない。

このようにして得られ九粗酵素液は、機械的に菌体を磨
砕して抽出される酵素活性と同等、ないしはそれ以上の
活性を含有しておシ、本発明の方法によりて容易、且つ
高効率に活性酵素を抽出できる。

又、粗酵素液からの酵素の分離、精製は、従来用いられ
ている遠心分離等の方法による分離が可能であシ、必要
に応じて精製を加えることができるＯ （本発明の効果） 本発明の方法によるヒスチダーゼの分離・採取法によっ
て磨砕や、ホモジナイザー等による菌体の破砕工程を省
くことができ、又、遠心分離により菌体が分離され易い
特徴を有する為、工程的に簡便容易、且つ効率よく高活
性の酵素を得ることが可能となったものである。

以下、実施例によシ本発明を具体的に説明する。

実施例１ シュードモナス・フルオレセンス乾燥菌体（シ示す温度
及び時間の条件で熱処理を行った。次い衝液を加え、同
条件で遠心分離する洗浄操作を２回行い、洗浄液を上澄
液に合わせた。つαカナーゼ活性の失活を完全にする為
、これに更に、７０°Ｃで１５分間の加熱処理を加えた
後、ヒスデダーゼ活性測定を行ない抽出活性を求めた。

ヒスチダーゼ活性は、Ｑ、ＩＭ−トリス緩衝液系（ｐＨ
９，０）基質Ｌ−ヒスチジン濃度２７ｍＭ１８０゛Ｃの
条件に於いてウロカニン酸に基づく２７７１ｍの吸光度
増加により測定した。但し、ｌ　ｕｎｉｔ　＝　ｌ　ｎ
ｍｏｌｅ　／ｍｉｎ、　テロる。

結果を第１表に示す。

（以′下余白） 第　　１　　表 ・を抽出率は、製造元羨示の活性より計算された使用１
体中の総活性に対する抽出活性の比率を示す。

第１表よシ解るように処理温度が６０℃より低いと、酵
素活性の抽出率は低い。又、処理時間が過変に長くなる
と、他成分の抽出量が増大するこトポ、ケルパーミエー
シ璽ンクロマトグラフイーにより確かめられた。

又、８６℃より高温で処理すると、酵素の、よ速な熱失
活により抽出活性が低下すると共に、抽出操作が不安定
なものとなることがわかる。

菌体を海砂と共に磨砕後常法処理することによシ求めた
活性抽出率は８６〜１０５％であり、本発明の方法によ
れば、高活性を容易に採取できることがわかる。

実線例２ シュードモナス・アシトポランス（ＡＴＣＣ１１２９９
ｂ）を、リン酸水索二カリウム０．１５ヒ、み身ジン・
ＨＣＪ−［２００，２％を含む培地ａｏｏｍｇに接種し
、８０℃、２４時間培養し、菌体１．２５ｇ（湿重量）
を得た。これを水１２．５ｍ／に分散後０．８ｇずつ４
本に分注し、それぞれ７０″Ｃ９０，５分、２分、１０
分°、ａＯ分間熱処理し、遠心分離によシ粗、酵素液を
得た。抽出活性は、各々２１７０　＋　８０２０　＋　
８２１０．８２５０　ｕｎｉｔであった。

菌体を海砂と共に磨砕後、常法処理によシ得られた活性
は２９０　Ｑ　ｕｎｉｔ　　で８　、ｂ　ｄ−６，２分
以上では活性の殆んどが抽出されていることがわかる。

又、ｌＯ分以降クりカナーゼ活性は全く認められなかっ
た。

実施例８ シュードモナス・アシトポランス（ＡＴＣ０１１２９９
ｂ）ｔ−実施例２と同様な培地を用いて培養し、菌体１
０．９ｇｔ−得た。これｔ−０，０５Ｍリン酸緩衝液（
ｐＨ７，０）　１０　ｍｌｔに分散し、７２℃２０分間
熱処理したのち、遠心分離を行い、上澄液を採象した。

更に菌体に５ｍＪの緩衝液を加え、遠心分離した。洗浄
操作を２回行い、洗浄液管上澄液に合わせた。

こうして得られた粗酵素液を公知の方法に従い硫酸アン
モニウムで壇析したのち脱塩し、総活性８６０００　ｕ
ｎｉｔ　、　　比活性２８００　ｕｎｉｔ／ｍｇの酵素
を得た。

同様に、ウロカナーゼ活性は認められなかった。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）ヒスチダーゼを含有するシュードモナス属に属す
   る菌体からヒスチダーゼを分離取得するに際し、該菌体
   を分散した水性媒体を加熱し、ヒスチダーゼを菌体外に
   溶出せしめることを特徴とする菌体中のヒスチダーゼの
   分離取得法。
2. （２）加熱が６０℃〜８６℃で行われるものである特許
   請求の範囲第（１）項に記載の菌体中のヒスチダーゼの
   分離取得法。
3. （３）水性媒体が水である特許請求の範囲第（１）項に
   記載の菌体中のヒスチダーゼの分離取得法。