JPH09248196A

JPH09248196A - フマル酸の製造法

Info

Publication number: JPH09248196A
Application number: JP8057540A
Authority: JP
Inventors: Kazuhisa Hatakeyama; 和久畠山; Makoto Goto; 誠後藤; Koichi Uchida; 康一内田; Masato Terasawa; 真人寺沢; Hideaki Yugawa; 英明湯川
Original assignee: Mitsubishi Chemical Corp
Current assignee: Mitsubishi Chemical Corp
Priority date: 1996-03-14
Filing date: 1996-03-14
Publication date: 1997-09-22

Abstract

(57)【要約】【課題】マレイン酸イソメラーゼを活性化及び安定化
させ、効率的にフマル酸を製造する。【解決手段】酵素反応によりフマル酸を製造するに当
たり、カタラ−ゼおよび／またはＳＯＤあるいは該酵素
生成微生物等を添加し、反応を行う。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、マレイン酸の異性
化によりフマル酸を製造する方法に関する。フマル酸
は、主に無水マレイン酸からマレイン酸の異性化によっ
て製造され、医薬、食品、工業原料として、広く利用さ
れている。フマル酸からは、酵素法等により例えば食
品、医薬、工業原料として有用なＬ−アスパラギン酸、
Ｌ−リンゴ酸、Ｌ−アラニンが製造される。

【０００２】

【従来の技術】マレイン酸の異性化によるフマル酸の製
造法としては、主に化学的方法が提案されている（米国
特許第２，８１６，９２３号明細書、２，９５５，１３
６号明細書、３，３３２，９９２号明細書）が、反応平
衡によりフマル酸への変換率が制約を受けること、反応
条件が高温反応由にマレイン酸あるいはフマル酸劣化が
起こり、副生成物を生成し、収量が低くなるなどの問題
点を有している。

【０００３】一方、酵素法では、マレイン酸イソメラー
ゼがマレイン酸を異性化してフマル酸を生成すること
が、知られている（Ｋ．ＯｔｓｕｋａＡｇｒｉｃ．Ｂ
ｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５，（９），ｐ７２６（１９６
１））が、酵素学的性質について検討しているに過ぎ
ず、産業上の応用の観点から、効率良くフマル酸を製造
するための検討はほとんどなされていない。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、効率よく
フマル酸を製造する方法を確立すべく、鋭意検討を行っ
た結果、マレイン酸イソメラーゼ活性を有する微生物ま
たはその処理物をマレイン酸を含有する水溶液中で酵素
反応させるに際し、反応系にカタラーゼおよび／または
スーパーオキシドディスムターゼ（以下、ＳＯＤと略す
ことがある）を添加することにより、マレイン酸イソメ
ラーゼを活性化あるいは安定化させることができ、大き
な活性減衰なく、連続的に、フマル酸を製造することが
可能な事を見いだし、本発明を完成するに到った。

【０００５】すなわち、本発明の要旨は、マレイン酸イ
ソメラーゼ活性を有する微生物またはその処理物を用い
てマレイン酸を異性化してフマル酸を製造するに際し、
（ｉ）カタラーゼあるいはカタラーゼ活性を有する微生
物もしくはその処理物および／または（ｉｉ）スーパー
オキシドディスムターゼあるいはスーパーオキシドディ
スムターゼ活性を有する微生物もしくはその処理物を添
加することを特徴とするフマル酸の製造法に存する。

【０００６】以下、本発明を詳細に説明する。

【０００７】

【発明の実施の形態】本発明に用いられるマレイン酸イ
ソメラーゼ活性を有する微生物としては、本活性を有す
る微生物であれば特に限定されるものではないが、アル
カリゲネス属、シュードモナス属、キサントモナス属、
バチルス属に属する微生物が好適に用いられる。特にア
ルカリゲネスフェカリス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ
ｆａｅｃａｌｉｓ）ＩＦＯ１２６６９、同ＩＦＯ
１３１１１、同ＩＡＭ１４７３、アルカリゲネス
ユウトロファス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓｅｕｔｒｏ
ｐｈｕｓ）、シュウドモナスフルオレッセンス（Ｐｓ
ｅｕｄｏｍｏｎａｓｆｌｕｏｌｅｓｃｅｎｓ）ＡＴＣ
Ｃ２３７２８、シュードモナスマルトフィラ（Ｐｓ
ｅｕｄｏｍｏｎａｓｍａｌｔｏｐｈｉｌａ）ＡＴＣＣ
１３２７０、バチルスステアロサーモフィラス（Ｂ
ａｃｉｌｌｕｓｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕ
ｓ）ＭＩ−１０１（ＦＥＲＭＢＰ−５１６０）、同
ＭＩ−１０２（ＦＥＲＭＢＰ−５１６１）、同Ｍ
Ｉ−１０５（ＦＥＲＭＢＰ−５１６４）、同ＭＩ
−１１０（ＦＥＲＭＢＰ−５３３９）、バチルス
ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｂｒｅｖｉｓ）ＭＩ−１
０３（ＦＥＲＭＢＰ−５１６２）等が好適に用いられ
る。さらに、上記微生物の遺伝子を組換えた遺伝子改変
微生物を用いても何等差し支えない。

【０００８】マレイン酸イソメラーゼ活性を有する微生
物の培養には、肉エキス、酵母エキス、ペプトン等の天
然栄養源を添加した用いた一般的な培地を用いる事がで
きる。該培地には、必要に応じ、窒素源として、塩化ア
ンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等
のアンモニウム塩、硝酸ナトリウム、硝酸カリウム、硝
酸アンモニウム等の硝酸塩、アンモニア等を、無機物と
しては、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、鉄、マン
ガン、亜鉛、銅等を添加して培養することもできる。

【０００９】また、マレイン酸イソメラーゼ活性を高め
るためには、培地中にマレイン酸またはマロン酸のアナ
ログを添加することが望ましい。マレイン酸、マロン酸
等の添加濃度は１０〜２００ｍＭ、好ましくは５０〜１
００ｍＭである。培養した各菌体は、予めリン酸緩衝液
等の緩衝液（ｐＨ７）等で洗浄した後、用いることも出
来る。洗浄用のリン酸緩衝液の濃度は０．０５Ｍ〜０．
２Ｍ程度が好適に用いられる。菌体はそのまま使用して
も良いが、必要により、処理物を用いても良い。

【００１０】処理物とは、該菌体を超音波破砕等で処理
をした菌体破砕物や該破砕物を遠心分離した無細胞抽出
液、該無細胞抽出液を硫安分画法、イオン交換カラムク
ロマトグラフィー、ゲルろ過カラムクロマトグラフィー
等で精製した精製酵素、または該菌体や菌体破砕物をア
クリルアミドモノマー、アルギン酸等の担体を用いた固
定化酵素等を言う。

【００１１】菌体をもちいる場合、予め菌体を凍結した
り、上記緩衝液中にＴｒｉｔｏｎＸ−１００、Ｔｗｅｅ
ｎ２０等の界面活性剤を０．０１〜０．２％添加した
液中で、１５〜４０℃、１０〜１２０分間、菌体を処理
することにより菌体の透過性を高めてから使用する事も
できる。本発明では、マレイン酸イソメラーゼ活性を有
する微生物またはその処理物をマレイン酸を含有する水
溶液中で酵素反応させるに際し、反応系にカタラーゼ
（ＥＣ１．１１．１．６）および／またはスーパーオ
キシドディスムターゼ（ＥＣ１．１５．１．１）を添
加することにより、マレイン酸イソメラーゼを活性化あ
るいは安定化させ、連続反応における大きな活性減衰な
くフマル酸を製造することに特徴を有する。

【００１２】本発明に用るカタラーゼは、例えばウシ肝
臓（Ｂｏｖｉｎｅｌｉｖｅｒ）の他、アスペルギルス
・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ）、バ
イソン肝臓（ＢｉｓｏｎＬｉｖｅｒ）、イヌ肝臓（Ｄ
ｏｇＬｉｖｅｒ）、ヒト赤血球（Ｈｕｍａｎｅｒｙ
ｔｈｒｏｃｙｔｅ）、マウス肝臓（Ｍｏｕｓｅｌｉｖ
ｅｒ）等、市販品（シグマ社等）を用いることができ
る。また、カタラーゼ活性を有する微生物としては、、
エシェリヒア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ，
１９７９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．９８：１０５５
−１０６１）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎ
ａｓｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ，１９５６，Ｊ．Ｂｉ
ｏｌ．Ｃｈｅｍ．２２０：９６７−９８２）、ロドシ
ュードモナス属（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
ｃａｐｓｕｌａｔａ，１９８７，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃ
ｈｅｍ，２６４：６８７１−６８７６）、ストレプト
コッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｆａｅｃａ
ｌｉｓ，１９５７，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２
２５：５５７−５７３）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕ
ｓｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ，１９８
９，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７１：４８７１−４
８７５）、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃ
ｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ，１９８４，Ｊ．Ｂｉ
ｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５９：１３０２７−１３０３６）
等がよく知られており、これらの微生物またはその処理
物の他、その遺伝子をクローニングした後、生体内で高
発現させた遺伝子改変微生物等を用いることもできる。

【００１３】また、ＳＯＤは、例えば、バチルス属（Ｂ
ａｃｉｌｌｕｓｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕ
ｓ）由来のものの他、エシェリヒアコリ（Ｅｓｃｈｅ
ｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）、西洋わさび（Ｈｏｒｓｅｒ
ａｄｉｓｈ）、ウシ肝臓（ＢｏｖｉｎｅＬｉｖｅ
ｒ）、ウシ腎臓（ＢｏｖｉｎｅＫｉｄｎｅｙ）、イヌ
赤血球（ＤｏｇＥｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅｓ）、ヒト赤
血球（ＨｕｍａｎＥｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅｓ）等、市
販品（シグマ社等）を用いることができる。また、ＳＯ
Ｄ活性を有する微生物としては、エシェリヒア属（Ｅｓ
ｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ，１９８６，ＥＭＢＯ
Ｊ．５：６２３−６３０）、バチルス属（Ｂａｃｉｌ
ｌｕｓｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ，１
９９０，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７２：１５３９
−１５４６）、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍ
ｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ，１９８８，Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃｓｄ．Ｓｃｉ，ＵＳＡ
８５：４７８９−４７９３）等がよく知られており、こ
れらの微生物またはその処理物の他、その遺伝子をクロ
ーニングした後、生体内で高発現させた遺伝子改変微生
物等を用いることもできる。

【００１４】カタラーゼおよび／またはスーパーオキシ
ドディスムターゼの添加方法は、マレイン酸イソメラー
ゼ活性を有する微生物またはその処理物に、酵素あるい
は微生物またはその処理物を直接添加してもよいし、あ
らかじめプラスミド等を利用した遺伝子組換え技術の手
法を用いてイソメラーゼ活性含有微生物菌体内で高発現
させておいてもよい。

【００１５】上記、マレイン酸イソメラーゼ酵素を用い
るマレイン酸の異性化反応を行うには、ｐＨ５〜１０好
ましくは６〜９で、反応温度は２０〜５０℃、好ましく
は２５〜３７℃で、通常５〜１２０時間反応させる。カ
タラーゼの添加量は、５〜５，０００，０００ユニッ
ト、好ましくは１０〜１，０００，０００ユニットであ
り、ＳＯＤの添加量は、２〜５，０００，０００ユニッ
ト、好ましくは、５〜５００，０００ユニットである。

【００１６】ここで、カタラーゼ１ユニットとは、２
５℃で１分間に１μｍｏｌのＨ₂Ｏ₂が分解される酵素量
をいい、ＳＯＤ１ユニットとは、３０℃でチトクロー
ムＣの還元反応を５０％阻害する酵素量をいう。本反応
液には、必要に応じカルシウム塩、マグネシウム塩、マ
ンガン塩等の２価金属塩を添加することができる。

【００１７】反応に用いる菌体またはその処理物の添加
量は、特に制限されるものではないが、菌体重量（湿菌
体）として１〜３０％が好適に用いられる。上記の方法
で生成したフマル酸は、限外ろ過膜分離、遠心分離等に
より菌体及びその処理物から分離した後、硫酸等電点沈
澱法等の公知の方法で沈澱させ、水洗、乾燥する事によ
り、結晶として採取できる。

【００１８】以下の実施例により本発明をさらに詳しく
説明するが、本発明は実施例により制限されるものでは
ない。

【００１９】

【実施例】

＜参考例１＞アルカリゲネス・フェカリスＩＦＯ１３
１１１株由来のマレイン酸異性化酵素の精製マレイン酸-ブイヨン培地［組成：マレイン酸ナトリウ
ム１０ｇ、牛肉エキス１０ｇ、ＮａＣｌ５ｇ、蒸留水
１０００ｍｌ（ｐＨ７に調整）］１００ｍｌを５００
ｍｌ容の三角フラスコに分注し、１２０℃、２０分間滅
菌処理したものに、アルカリゲネス・フェカリスＩＦＯ
１３１１１株を植菌し、３０℃にて２４時間振とう培養
した。

【００２０】次いで、上記と同様の培地１０００ｍｌを
３Ｌ容のジャーファーメンターに入れ、１２０℃、２０
分間滅菌処理したものに、上記培養物３０ｍｌを接種
し、３０℃にて２４時間通気撹拌培養した。培養後の培
養液を遠心分離（３，５００×ｇ、４℃、２０分間）し
菌体を回収した。得られた菌体からのマレイン酸異性化
酵素の抽出は、菌体を０．５ｍＭジチオスレイトール
を含むリン酸緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ７．２）に懸濁
し、超音波破砕器（ブランソン社製）により菌体を破砕
することにより行った。菌体破砕物を遠心分離（１０，
０００×ｇ、４℃、３０分間）し、上清の可溶性画分を
粗酵素液として得た。

【００２１】次に、この粗酵素液を硫安分画（４０〜７
０％）し、上記リン酸緩衝液中に対して４℃で一夜透析
した。次いで、この透析液をＤＥＡＥセファロースカラ
ム（ファルマシア社製）クロマトグラフィー、ゲル濾過
カラム（セファクリルＳ−２００、ファルマシア社製）
クロマトグラフィー、モノＱカラム（ファルマシア社
製）クロマトグラフィーにかけ、マレイン酸異性化酵素
の活性画分を得た。マレイン酸異性化酵素の活性の検出
は、大塚らの方法［Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．，Ｖｏｌ．２５，ｐ．７２６（１９６１）］
に従い、ブタ心臓由来フマラーゼ（ベーリンガーマンハ
イム社製）存在下、マレイン酸の減少を２４０ｎｍの吸
光度変化として測定した。

【００２２】上記マレイン酸異性化酵素の精製画分をポ
リアクリルアミドゲル（４〜２０％グラジエントゲル）
電気泳動［２５ｍＭトリス−１９２ｍＭグリシンか
らなる緩衝液（ｐＨ８．４）中にて、４０ｍＡ定電流で
１時間泳動］により分離し、クマシーブルー色素［組
成：０．２％（ｗ／ｖ）クマシーブリリアントブルーＲ
２５０、４０％（ｖ／ｖ）メタノール、１０％（ｖ／
ｖ）酢酸］によって染色したところ、分子量約６０ｋＤ
ａの単一バンドが検出された。更に同精製画分をドデシ
ル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）処理液［組成：６２．５ｍ
Ｍトリス−塩酸（ｐＨ６．８）、２％ＳＤＳ、１０
％グリセロール、５％２−メルカプトエタノール、
０．００１％ブロモフェノールブルー（ＢＰＢ）］に
溶解し、９５℃にて３分間熱変性処理後、ポリアクリル
アミドゲル（１０〜２０％グラジエントゲル）電気泳動
［２５ｍＭトリス−１９２ｍＭグリシン−０．１％
ＳＤＳからなる緩衝液（ｐＨ８．４）中にて、４０ｍ
Ａ定電流で１時間泳動］により分離し、上記と同様に染
色したところ、分子量約３０ｋＤａのバンドのみを検出
した。これらの結果より、該マレイン酸異性化酵素の構
成は、分子量約３０ｋＤａのサブユニットから成る分子
量約６０ｋＤａの２量体であることが推定された。

【００２３】さらに精製酵素０．２ｍｇを反応液［０．
４ｍＭマレイン酸ナトリウム］１ｍｌに添加後、３
０℃で１５分間反応させた。反応終了後、煮沸処理によ
り反応を停止させた後、反応液を遠心分離（８，０００
×ｇ、４℃、２０分間）し、得られた上清液について有
機酸カラム（島津製作所製ＳＣＲ−１０１Ｈカラム）、
ＵＶ検出器（２１０ｎｍ）を用いた高速液体クロマトグ
ラフィー分析（島津社製、ＬＣ-５Ａ）に供した。その
結果、原料マレイン酸のピークの他にフマル酸のピーク
を検出し、また、原料マレイン酸が減少していることが
確認された。

【００２４】＜参考例２＞バチルス・ステアロサーモ
フィラスＭＩ−１０５株（ＦＲＥＭＢＰ−５１６４）
が産生するマレイン酸異性化酵素の精製５Ｌ容ジャーファーメンターに、培地Ａ［組成：マレイ
ン酸二ナトリウム５ｇ、ＫＨ₂ＰＯ₄ ０．７ｇ、Ｋ₂
ＨＰＯ₄ １．４ｇ、ＮＨ₄ＮＯ₃ １ｇ、ＭｇＳＯ₄・７
Ｈ₂Ｏ０．２ｇ、ビオチン０．２ｍｇ、チアミン・
塩酸塩０．２ｍｇ、ＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ２０ｍｇ、
ＭｎＳＯ₄ ２０ｍｇ、蒸留水１Ｌ（ｐＨ７．２）］
３Ｌを入れ、１２１℃にて２０分間減菌処理したものに
ＭＩ−１０５株を植菌し、５０℃にて２４時間振とう培
養した。培養後、遠心分離（３，０００×ｇ、４℃、２
０分間）により培養液より菌体を回収し、緩衝液Ａ［組
成：２００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．
２）、０．５ｍＭジチオスレイトール］で洗浄した。

【００２５】得られた菌体を再度緩衝液Ａに懸濁し、約
３０％（ｗ／ｖ）の菌体懸濁液を超音波破砕器（ブラン
ソン社）にかけ菌体を破壊した。次いで、この菌体破壊
物を遠心分離（１２，０００×ｇ、４℃、３０分間）に
かけ、マレイン酸異性化酵素を含有する粗酵素液として
上清を回収した。得られた粗酵素液につき、２．２％
（ｗ／ｖ）となるようにストレプトマイシン硫酸塩を添
加し、除核酸した後、常法により３０〜７０％硫安沈澱
画分を回収し、上記緩衝液Ａ（４℃）中にて一夜透析し
た。得られた硫安画分を、緩衝液Ａにて平衡化したＤＥ
ＡＥ−Ｓｅｐｈａｃｅｌカラム（直径２．６ｃｍ×３０
ｃｍ、ファルマシア社製）に吸着させ、同緩衝液Ａにて
十分洗浄後、塩化カリウムの直線濃度勾配（０〜０．２
Ｍ）によって溶出した。尚、流速は２ｍｌ／分とし、各
フラクションは１０ｍｌずつ分取した。マレイン酸異性
化酵素画分の検出は、マレイン酸異性化酵素活性を大塚
らの方法［Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，ｖｏ
ｌ．２５，ｐ．７２６（１９６１）］に従い、ブタ心臓
由来フマラーゼ（ベーリンガーマンハイム社製）存在下
で、４５℃における基質マレイン酸の減少を、２４０ｎ
ｍの吸光度減少として分光光度計（ベックマン社ＤＵ７
５００）を用いて測定することにより行った。

【００２６】得られた活性画分を、限外濾過装置（東洋
濾紙製ＵＨＰ−４３Ｋ、分画分子量２０，０００）によ
り濃縮後、緩衝液Ａで平衡化されたゲル濾過カラム（フ
ァルマシア社製ＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ−２００、φ
ｌ．６×６０ｃｍ）にのせ、流速０．５ｍｌで溶出し
た。活性画分は上記と同様な方法で検出した。次に、得
られた活性画分を、緩衝液Ａで平衡化された陰イオン交
換カラム（ファルマシア社製「Ｍｏｎｏ−Ｑ」、φ１×
１０ｃｍ）にのせ、塩化カリウムの直線濃度勾配（０〜
１Ｍ）によって溶出し、得られた活性画分をマレイン酸
異性化酵素の精製画分とした。

【００２７】マレイン酸異性化酵素の活性の検出は、大
塚らの方法［Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖ
ｏｌ．２５，ｐ．７２６（１９６１）］に従い、ブ
タ心臓由来フマラーゼ（ベーリンガーマンハイム社製）
存在下、マレイン酸の減少を２４０ｎｍの吸光度変化と
して測定した。上記マレイン酸異性化酵素の精製画分を
ポリアクリルアミドゲル（４〜２０％グラジエントゲ
ル）電気泳動［２５ｍＭトリス−１９２ｍＭグリシ
ンからなる緩衝液（ｐＨ８．４）中にて、４０ｍＡ定電
流で１時間泳動］により分離し、クマシーブルー色素
［組成：０．２％（ｗ／ｖ）クマシーブリリアントブル
ーＲ２５０、４０％（ｖ／ｖ）メタノール、１０％（ｖ
／ｖ）酢酸］によって染色したところ、分子量約６０ｋ
Ｄａの単一バンドが検出された。更に同精製画分をドデ
シル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）処理液［組成：６２．５
ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ６．８）、２％ＳＤＳ、１
０％グリセロール、５％２−メルカプトエタノー
ル、０．００１％ブロモフェノールブルー（ＢＰ
Ｂ）］に溶解し、９５℃にて３分間熱変性処理後、ポリ
アクリルアミドゲル（１０〜２０％グラジエントゲル）
電気泳動［２５ｍＭトリス−１９２ｍＭグリシン−
０．１％ＳＤＳからなる緩衝液（ｐＨ８．４）中に
て、４０ｍＡ定電流で１時間泳動］により分離し、上記
と同様に染色したところ、分子量約３０ｋＤａのバンド
のみを検出した。これらの結果より、該マレイン酸異性
化酵素の構成は、分子量約３０ｋＤａのサブユニットか
ら成る分子量約６０ｋＤａの２量体であることが推定さ
れた。

【００２８】さらに精製酵素０．２ｍｇを反応液［０．
４ｍＭマレイン酸ナトリウム］１ｍｌに添加後、３
０℃で１５分間反応させた。反応終了後、煮沸処理によ
り反応を停止させた後、反応液を遠心分離（８，０００
×ｇ、４℃、２０分間）し、得られた上清液について有
機酸カラム（島津製作所製ＳＣＲ−１０１Ｈカラム）、
ＵＶ検出器（２１０ｎｍ）を用いた高速液体クロマトグ
ラフィー分析（島津社製、ＬＣ-５Ａ）に供した。その
結果、原料マレイン酸のピークの他にフマル酸のピーク
を検出し、また、原料マレイン酸が減少していることが
確認された。

【００２９】〔実施例１〕カタラーゼおよびスーパーオ
キシドディスムターゼによるアルカリゲネス・フェカリ
ス由来マレイン酸イソメラーゼの活性化および安定化保存液（１．５Ｍアスパラギン酸溶液）に、実施例１で
得られたアルカリゲネス・フェカリスＩＦＯ１３１１１
株由来のマレイン酸異性化酵素の精製酵素液（０．１ｍ
ｇ／４ｍｌ保存液）を添加し、そこにカタラーゼ２０，
０００ユニットおよび／またはスーパーオキシドディス
ムターゼ（ＳＯＤ）５，０００ユニットを添加した後、
３０℃で保温し、それぞれのマレイン酸異性化酵素に対
する効果を検討した。一定時間後に精製酵素保存液１ｍ
ｌを抜き取り、反応液［０．４ｍＭマレイン酸ナトリ
ウム］１ｍｌを添加後、３０℃で１５分間反応させ
た。反応終了後、煮沸処理により反応を停止させた後、
反応液を遠心分離（８，０００×ｇ、４℃、２０分間）
し、得られた上清液について有機酸カラム（島津製作所
製ＳＣＲ−１０１Ｈカラム）、ＵＶ検出器（２１０ｎ
ｍ）を用いた高速液体クロマトグラフィー分析（島津社
製、ＬＣ-５Ａ）に供し、原料のマレイン酸の減少を定
量することによりマレイン酸イソメラーゼの残存活性を
定量した。カタラーゼはウシ肝臓由来カタラーゼ（シグ
マ社製）を、スーパーオキシドディスムターゼは大腸菌
由来マンガン・スーパーオキシドディスムターゼ（シグ
マ社製）を用いた。

【００３０】その結果を表１に示す。保存後の残存活性
はそれぞれ、カタラーゼおよびＳＯＤ無添加の場合の保
温開始前の活性を１００とする相対値であらわした。こ
の結果から、カタラーゼおよび／またはＳＯＤを添加す
ることで、マレイン酸イソメラーゼを活性化および安定
化させることが確認され、効率的にフマル酸が製造でき
ることが示唆された。

【００３１】

【表１】 ──────────────────────────────────── 保存時間０時間１時間１７時間 ──────────────────────────────────── 対照（無添加）１００３００カタラーゼ(20,000 ユニット)添加１８０１４０５０ＳＯＤ(5,000 ユニット)添加１８０１００２０カタラーゼおよびＳＯＤ添加１８０１８０１２０ (20,000 ユニットおよび5,000 ユニット) ────────────────────────────────────

【００３２】〔実施例２〕カタラーゼおよびスーパーオ
キシドディスムターゼによるバチルス・ステアロサーモ
フィラス由来マレイン酸イソメラーゼの活性化および安
定化保存液（１．５Ｍアスパラギン酸溶液）に、参考例２で
得られたＭＩ−１０５株の精製酵素液（０．６ｍｇタン
パク質／４ｍｌ保存液）、カタラーゼ２０，０００ユ
ニットおよび／またはＳＯＤ５，０００ユニットを順
次添加し、Ｎ2ガスを１分間吹き込んだ後、すみやかに
容器を密閉した。４５℃で保温し、カタラーゼおよびス
ーパーオキシドディスムターゼのマレイン酸異性化酵素
に対する効果を検討した。一定時間後に精製酵素保存液
１ｍｌを抜き取り、反応液［０．４ｍＭマレイン酸ナ
トリウム］１ｍｌを添加後、４５℃で１５分間反応さ
せた。反応終了後、煮沸処理により反応を停止させた
後、反応液を遠心分離（８，０００×ｇ、４℃、２０分
間）し、得られた上清液について有機酸カラム（島津製
作所製ＳＣＲ−１０１Ｈカラム）、ＵＶ検出器（２１０
ｎｍ）を用いた高速液体クロマトグラフィー分析（島津
社製、ＬＣ-５Ａ）に供し、原料のマレイン酸の減少を
定量することによりマレイン酸イソメラーゼの残存活性
を定量した。カタラーゼはウシ肝臓由来カタラーゼ（シ
グマ社製）を、スーパーオキシドディスムターゼは大腸
菌由来マンガン・スーパーオキシドディスムターゼ（シ
グマ社製）を用いた。

【００３３】その結果を表２に示す。保存後の残存活性
はそれぞれ、カタラーゼおよびＳＯＤ無添加の場合の保
温開始前の活性を１００とする相対値であらわした。こ
の結果から、カタラーゼおよび／またはＳＯＤを添加す
ることで、マレイン酸イソメラーゼを活性化および安定
化させることが確認され、効率的にフマル酸が製造でき
ることが示唆された。

【００３４】

【表２】 ──────────────────────────────────── 保存時間０時間１日間２日間 ──────────────────────────────────── 対照（無添加）１００００カタラーゼ(20,000 ユニット)添加１２０５０４０ＳＯＤ(5,000 ユニット)添加１２０５０５カタラーゼおよびＳＯＤ添加１５０５０４０ (20,000 ユニットおよび5,000 ユニット) ────────────────────────────────────

【００３５】

【発明の効果】微生物を用いてマレイン酸を異性化さ
せフマル酸を製造させるに当たり、本発明の方法によれ
ば、酵素を安定化させ、大きな活性減衰なく、連続的に
フマル酸を製造することができる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者寺沢真人茨城県稲敷郡阿見町中央八丁目３番１号三菱化学株式会社筑波研究所内 (72)発明者湯川英明茨城県稲敷郡阿見町中央八丁目３番１号三菱化学株式会社筑波研究所内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】マレイン酸イソメラーゼ活性を有する微
生物またはその処理物を用いてマレイン酸を異性化して
フマル酸を製造するに際し、（ｉ）カタラーゼあるいは
カタラーゼ活性を有する微生物もしくはその処理物およ
び／または（ｉｉ）スーパーオキシドディスムターゼあ
るいはスーパーオキシドディスムターゼ活性を有する微
生物もしくはその処理物を添加することを特徴とするフ
マル酸の製造法。
【請求項２】カタラーゼがウシ肝臓由来のカタラーゼ
であることを特徴とする請求項１記載のフマル酸の製造
法。
【請求項３】スーパーオキシドディスムターゼが大腸
菌由来マンガン・スーパーオキシドディスムターゼであ
ることを特徴とする請求項１記載のフマル酸の製造法。