KR0148468B1 - 내열성 d-히단토이나아제를 숙주세포 내에서 가용성인 상태로 대량 생산하는 방법 및 회수방법 - Google Patents

내열성 d-히단토이나아제를 숙주세포 내에서 가용성인 상태로 대량 생산하는 방법 및 회수방법

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Abstract

본 발명은 고온균 바실러스 스티아로더모필러스 SD-1(대한민국특허 제122284호)에서 유래된 내열성 D-히단토이나아제(D-hydantoinase)-코딩 유전자를 포함하는 고발현성 플라스미드, 이에 의해 형질전환된 숙주세포, 이를 배양하여 D-히단토이나아제를 대량 생산하는 방법 및 배양배지로부터 D-히단토이나아제를 간단하고 효과적으로 분리회수하는 방법을 제공한다.

Description

내열성 D-히단토이나아제를 숙주세포 내에서 가용성인 상태로 대량 생산하는 방법 및 회수방법
제1도는 본 발명에 따라 D-히단토이나아제-코딩 유전자를 클로닝하는 방법의 도식도이다.
제2도는 D-히단토이나아제 유전자를 포함한느 10.5kb Sau3A 1 DNA 단편의 제한효소지도이다.
제3도는 D-히단토이나아제 유전자 단편을 포함하는 각종 재조합 벡터를 제작하는 과정의 도식도이다.
제4도는 D-히단토이나아제의 대량생산을 위한 발현용 플라스미드인 pHU183의 제조전략 및 각종 크기의 플라스미드의 D-히단토이나아제의 활성비교이다.
본 발명은 고온균에서 유래된 가용성의 내열성 D-히단토이나아제(D-hydantoinase)-코딩 유전자를 포함하는 고발현성 플라스미드, 이에 의해 형질전환된 숙주세포, 이를 배양하여 가용성의 내열서 D-히단토이나아제(D-hydantoinase)를 대량 생산하는 방법 및 배양배지로부터 D-히단토이나아제를 간단하고 효과적으로 분리회수하는 방법에 관한 것이다.
D-히단토이나아제는 동물의 간조직에서 발견되는 디히드로피리미디나아제(dihydropyrimidinase, E.C.3.1.2.2)와 동일한 효소로 알려져 있으며, 바실러스(Bacillus) 속, 슈도모나스(Pseudominas)속, 아그로박테리움(Agrobacterium)속, 아쓰로박터(Athrobacter)속 등의 미생물에서도 흔하게 발견된다[Yamada er al.(1978) J. Ferment. Technol. 56,484-491].
이 효소는 히단토인 유도체의 3번 질소와 4번 탄소 사이의 아마이드결합을 가수분해하여 N-카바모일-D-아미노산을 생성한다. 이 N-카바모일-D-아미노산을 화학적 혹은 효소적으로 처리하여 N-카바모일기를 제거하면, 기질로 사용된 히단토인 유도체에 따라 D-파라-히드록시페닐글리신(D-p-hydroxyphenylglycine) 혹은 D-발린(D-valine) 등의 D-아미노산이 생성된다.
이러한 D-아미노산들은 의약품, 농약 등의 합성에 산업적으로 널리 이용되고 있다.
상기의 D-아미노산 제조법에 있어서 중요한 점은 D-히단토이나아제의 역가와 안정성으로, 이는 공정의 경제성을 결정하는 요소이다. 따라서, 경제성있는 효소공정의 개발을 위해서는 열에 안정한 내열성 효소가 요구된다. 이미 본 발명자들은 지금까지 보고된 D-히단토이나아제들 중 가장 높은 열안전성을 보인 내열성 D-히단토이나아제를 생산하는 바실러스 스티아로더모필러스 SD-1을 토양으로부터 분리하여(Lee et al. (1994) Biotechnol. Lett. 16. 461), 한국과학기술연구원 유전공학연구소에 기탁하였으며(기탁번호 KCTC 8551P), 특허출원을 완료하였다(출원번호 94-5832 : 특허 제 122284호).
한편, 기질인 히단토인 유도체들은 대부분이 수용액에서의 용해도가 낮아서 D-히단토이나아제를 이용한 아미노산의 제조방법에 있어서 효과적인 효소반응 및 연속공정에 장애가 될 수 있다. 고온에서 효소 반응을 수행할 경우, 기질인 히단토인 유도체의 용해도가 증가되어서 반응속도가 빨라질 뿐만 아니라, 연속조업이 용이하게 되고, 미생물에 의한 오염이 방지되는 장점이 있다. 이와같은 가능성들에 기초하여, 본 발명자들은 기존의 상온균 유래의 D-히단토이나아제 반응이 30℃에서 수행되어 온 데 반하여 55℃에서도 활성을 유지하는 내열성 D-히단토이나아제를 이용하여 N-카바모일-N-아미노산을 생산하는 방법을 개발한 바 있다(출원번호 94-5833 : 특허 제119168호).
그러나, 상기한 한국특허출원 제94-5832호에 따른 미생물을 이용하여 히단토인류로부터 아미노산을 제조하는 방법은, 공업적으로 이용하기에는 상기 미생물로부터 유도된 D-히단토이나아제의 활성이 충분치 않고, 미생물이 포자를 형성하기 때문에 높은 균체 농도까지 배양하기 어렵다고 하는 결점이 있다.
한편, 일본에서도 바실러스 스티아로더모필러스 SD-1과 유사한 균주인 바실러스 스티아로더모필러스 NS1122A 유래의 내열성 D-히단토이나아제가 발견되어 대장균에 클로닝되었으나(일본특허 공개 4-325093), 그들의 경우에는 생산된 D-히단토이나아제가 세포내에 응집되어 불활성인 상태로 존재하기 때문에 실제로는 산업에 이용할 수 없는 문제점이 있고, 가용성 상태로 발현되는 경우에도 대장균 균체의 성장을 강력하게 저해하여 배양이 어려운 문제점이 있다(Mukohara et. at. (1994) Biosci. Biotech. Biochem. 58, 1621-1626).
이에 본 발명자들은, D-히단토이나아제의 활성을 높이고 대량으로 가용성의 내열성 D-히단토이나아제를 생산할 수 있는 방법을 제공하고자 광범위하게 연구한 결과, 바실러스 스티아로더모필러스 SD-1으로부터 D-히단토이나아제를 코딩하는 유전자를 분리하고, 유전자 재조합 기술을 이용하여, D-히단토이나아제의 발현활성이 높은 벡터를 제작하고 이를 대장균내에 클로닝하고 발현시키므로써, 바실러스 스티아로더모필러스 SD-1을 배양하여 효소를 생산하는 방법에 비하여 저렴하고 효율적으로, 그리고 가용성의 효소를 생산할 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
그러므로, 본 발명의 목적은 가용성의 내열성 D-히단토이나아제를 보다 효율적인 방법으로 대량으로 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 바실러스 스티아로더모필러스 SD-1으로부터 유래된 내열성 D-히단토이나아제-코딩 DNA를 함유하는 고활성 플라스미드를 제공한다.
본 발명은 또한 상기 벡터를 포함하는 숙주세포를 제공한다.
본 발명은 또한 상기 숙주세포, 특히 비(非) 내열성 숙주세포를 배양하므로써 가용성의 내열성 D-히단토이나아제를 효율적으로 생산하는 방법을 제공한다.
본 발명은 나아가 상기와 같은 배양에 의해 축적된 내열성 D-히단토이나아제를 신속하고 효율적으로 분리 및 회수하는 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 목적, 특징 및 적용은 하기 발명의 상세한 설명란에 의해 당업자에게 명백하게 드러날 것이다.
이하 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
어떤 단백질을 유전자 재조합 기술로 생산하기 위해서는 먼저 목적하는 단백질을 코드하는 유전자를 제조하여야 한다. 본 발명에서는 내열성 D-히단토이나아제를 코드하는 유전자를 제조하기 위하여, 바실러스 스티아로더모필러스 SD-1(KCTC 8551P)로부터 분리한 염색체 DNA를 제한효소로 잘라서 유전자 운반체인 벡터에 재조합한 다음, 대장균에 도입하여 염색체 DNA라이브러리(library)를 만들었다. 이렇게 얻어진 형질전환체 중에서, D-히단토이나아제 활성을 보유하는 클론을 선별하고, 선별된 D-히단토이나아제 DNA 단편의 제한효소지도를 작성하고, 여러 제한효소의 조합에 의하여 D-히단토이나아제 DNA 단편의 크기를 줄이면서, D-히단토이나아제 활성이 가장 높은 클론을 재선별하였다. 이렇게하여 선별된 D-히단토이나아제의 활성이 가장 높은 재조합 벡터는 3.1kb의 크기를 갖는 pHU183이다.
상기 방법에 있어서, 유전자 운반체인 벡터로는 당업계에 공지된 것을 제한없이 사용할 수 있다. 본 발명에서는 바람직하게는 pBR322를 사용하였다. 상술한 바 대로, 본 발명에 따라 D-히단토이나아제-코딩 유전자를 클로닝하는 방법을 제1도에 도시하였다.
내열성의 가용성 D-히단토이나아제의 활성이 가장 높은 벡터를 숙주 세포에 클로닝하여 얻은 재조합 숙주세포를 배지에서 배양하므로써 내열성의 가용성 D-히단토이나아제를 대량으로 생산할 수 있다.
숙주세포로는 당업계에서 통상적으로 사용되는 것으로서, D-히단토이나아제를 발현시킬 수 있고, 바람직하게는 열에 대해 비교적 약한 특성을 보이는 군주가 사용된다. 본 발명의 구체적인 구현예에서는 대장균, 특히 대장균(E. coli) DH5 α F'를 사용하였지만, 여기에만 한정되는 것은 아니고, 위에서 열거한 특성을 나타내는 것이면 어느 것이나 사용가능하다.
특히 대장균을 숙주세포로 사용하는 경우, 세포내 총 단백질에 대한 D-히단토이나아제의 비율을 증가시킬수 있으며, 후술하는 바와 같이 배양완료 후에 대장균체로부터 D-히단토이나아제를 분리함에 있어 대장균 유래 단백질이 비교적 열에 약하고 D-히단토이나아제는 열에 대한 강한 점을 이용하여 D-히단토이나아제를 효율적이고도 신속하게 분리할 수 있기 때문에 바람직하다.
이렇게 본 발명에 따른 D-히단토이나아제 유전자를 포함하는 벡터에 의해 재조합된 대장균 DH5 αF'는 한국과학기술원 유전공학연구소(Korean Collection for Type Cultures, KCTC)에 부다페스트 조약하의 규정에 따라 1995년 1월 25일 자로국제기탁되어 KCTC 0147BP의 수탁번호를 부여받았다.
본 발명에 따른 벡터 pHU183를 포함하는 숙주세포를 배양하는 방법, 배양에 사용되는 배지의 종류와 함량은 특별이 한정되지 않는다. 다만, 본 발명에서는 대장균(E. coli/ DH5 α F' -pHU183 : KCTC 0147BP)을 D-히단토이나아제의 생산을 최적으로 하기 위한 조건에서 배양하기 위해 가장 최적인 배지 조성을 확립하였다. 이러한 배지 조성은 하기 표1에 나타내었다.
배양후 대장균 DG5α F'를 수확하여 세포를 파쇄하고 고형물을 원심분리하여 제거한, 무세포 조효소액의 효소활성을 분석한 결과에 따르면, D-히단토이나아제 활성이 바실러스 스티아로더모필러스 SD-1에서보다 크게 증가한 것이 입증된다. 또한, 이 무세포 조효소액을 SDS-전기영동법으로 분석했을 때, D-히단토이나아제 단백질은 대장균의 총단백질의 약 20% 수준이었다.
또한, 효소 대량생산의 효율성을 표시하는 단위용적 당 효소의 활성에 있어서도, 바실러스 스티아로더모필러스 SD-1을 사용하는 경우에 비하여 약 20배 높아지는 것으로 밝혀졌다.
효소반응을 이용하여 목적물을 생산함에 있어서, 고정화 효소가 여러 가지 장점으로 인하여 광범위하게 사용되고 있으나, 본 발명자들은 히단토인 유도체로부터 N-카바모일-D-아미노산을 생산하기 위하여 실리케이트를 담체로하여 고정화한 D-히단토이나아제를 사용하는 방법도 개발하였다)한국특허출원 제94-5833호 : 특허 제119168호). 연속적인 효소반응을 위한 고정화 효소의 역가는 효소 반응기의 성능에 영향을 미치는 가장 중요한 요소이기 때문에, 고정화에 사용되는 효소액의 비활성도(units/mg protein)가 고정화 효소반응기의 생산성을 결정짓는다고 할 수 있다. 그러나, 일반적인 경우 효소액의 비활성을 증진시키기 위해서는 크로마토그라피 등 복잡하고 값비싼 장치가 필요하므로 경제성 때문에 사용하기 어렵다. 이에 본 발명자들은 내열성 D-히단토이나아제가 매우 높은 내열성을 가지는 특성을 이용하여, 비교적 열에 약한 대장균 유래의 단백질로부터 쉽게 분리함으로써 상기의 D-히단토이나아제의 고정화를 위한 내열성 D-히단토이나아제 효소액의 제조를 위한 신속하고도 경제적인 부분 분리정제방법을 개발하였다.
본 발명에 따르면, 재조합 숙주세포를 전술한 통상의 방법으로 배양하여 D-히단토이나아제를 축적시키고, 배양배지로부터 균체를 회수하고 D-히단토이나아제를 분리하는 효율적인 방법이 제공된다. 이 방법은 배양 배지를 MN++이온의 존재하에 50-65의 온도로 30분 내지 2시간동안 열처리하므로써 불필요한 단백질을 제거하므로써 목적하는 효소의 활성 회수율을 증가시키는 것을 포함한다.
즉, 본 발명은 내열성의 D-히단토이나아제-코딩 유전자를 포함하는 벡터에 의해 형질전환된 내열성의 D-히단토이나아제 생산능을 갖는 비(非) 내열성 균주를 배양하여 D-히단토이나아제를 생산하고, 배양된 균체로부터 D-히단토이나아제를 분리회수하는 방법에 있어서, 상기 분리 회수 방법이 다음 단계(a)-(c)를 포함함을 특징으로 하는 효율적인 내열성의 D-히단토이나아제의 분리 방법을 제공한다.
(a) 내열성 D-히단토이나아제가 가용성 상태로 생산된 균주를 수확후 분쇄용 완충액에 녹이고 효모게나이저로 균체를 파괴시키는 단계;
(b) 균체 파쇄액을 원심분리하여 얻은 무세포 조추출액을 10-20mM의 MN++화합물 존재하에 50-65℃에서 30분 내지 2시간동안 열처리하여 비(非) 내열성 숙주세포의 단백질을 침전시키는 단계; 및 (c) 원심분리하여 침전물을 제거하고 D-히단토이나아제를 포함하는 상등액을 회수하는 단계/ 상기 열처리에 있어서, 망간이온은 1내지 40mM의 농도로 첨가될 수 있고, 이 범위내에서 효소의 활성 회수율을 향상시킨다. 그러나, 비교적 낮은 동도에서는 효소의 장기간 보관시에 히단토이나아제의 안전성이 떨어지고, 20mM을 피크로하여 그 이상에서는 20mM을 사용한 경우에 비하여 농도의 증가에 따라 효소활성 회수율이 증가되지 않고 오히려 낮아지는 경향이 있다. 따라서, 망간이은은 10 내지 20mM의 농도로 사용하는 것이 바람직하다.
사용가능한 망간 이온으로는 망간 이가 이온을 포함하는 대부분의 염이 포함되며, 바람직하게는 염화망간(MnCl2) 또는 황산망간(MnSO4)이다.
열처리 온도는 50 내지 65℃가 바람직하다. 상기 범위의 하한선보다 낮은 온도에서 처리하면 대장균의 여타 불필요한 단백질이 잘 침전되지 않으며, 상한선보다 높은 온도에서는 히단토이나아제의 활성 회수율이 떨어진다.
열처리 시간은 30분 내지 2시간이며, 30분보다 짧은 경우에는 여타 다른 단백질이 잘 침전되지 않으며, 처리 시간이 길어지면 히단토이나아제 활성 회수율이 떨어진다.
위와 같은 본 발명의 방법에 의해 분리된 D-히단토이나아제는 히단토인 유도체로부터 아미노산류를 공정에 유용하에 사용할 수 있으며, 예를 들면 한국특허출원 94-5833호에 기재된 방법에 따라 이용될 수 있다.
이하 본 발명을 각종 실시예에 의해 상세히 설명하지만, 본 발명이 이들 예에만 한정되는 것은 아니다.
[실시예1]
D-히단토이나아제를 코드하는 유전자를 클론하기 위한 전략을 제1도를 참조로하여 설명한다. 바실러스 스티아로더모필러스 SD-1의 염색체 DNA를 일반적으로 사용돼는 Maniatis 등[Maniatis et. al. (1982) Molecular Cloning, Cold Spring Harvor]의 방법에 따라 분리하였다. 분리한 염색체 DNA를 Sau3Al으로 부분가수분해하고, 0.8% 아기로스 젤에서 전기영동한 후, 10킬로베이스 크기의 DNA단편들을 GENE CLEAN KIT를 써서 정제하였다. 이와같이 얻어진 약 0.7㎍의 DNA단편들을 BamH1으로 자른 플라스미스 pBR322 0.1㎍에서 16℃에서 16시간동안 T4 DNA 리가제(ligase) 반응에 의하여 접합시켰다. 이것을 대장균 DH5α F'에 형질전환시킨 염색체 DNA의 라이브러리로부터 D-히단토이나아제 유전자를 보유하는 클론을 선별하였다. 클론의 선별은 1% 히단토인과 0.01% 페놀레드 지시약을 함유한 LB-암피실린 한천배지의 pH를 8.0으로 조절하고, 37℃에서 24시간동안 배양한 후, 노랑색을 띄는 콜로니를 분리하는 방법을 확립하여 이용하였다.
일차적으로 선별된 양성반응을 나타내는 클론들을 LB-암피실린 배지에서 24시간 동안 혼탁배양한 후, 균체를 분리하여 1% Triton X-100으로 투과화(permeabilization)하고 하기의 방법으로 D-히단토이나아제 활성을 분석하였다.
D-히단토이나아제 활성은 히단토인 67mM, 망간이온 1mM, 트리스-염산 완충액 0.1M(pH 8.0)과 적당량의 D-히단토이나아제를 포함한 반응액 1.5mL을 55℃에서 30분간 반응시킨후, 다까하시[Takahashi et. al. (1978) J. Ferment. Technol. 57, 492-498] 등의 방법으로 생성된 카바모일글리신의 량을 측정하여 결정하였다.
D-히단토이나아제 활성 분석결과로부터 한 개의 클론을 선택하여 배양한 후, 플라스미스드 DNA를 분리하였다. 이 플라스미드는 pHBR5로 이름지었으며, 크기가 10.5kb인 염색체 DNA 단편을 포함하고 있었다. 제2도에 DNA 단편의 제한효소지도를 도시하였다.
이와같이 분리한 D-히단토이나아제 유전자를 보유하는 플라스미드를 여러 가지 제한효소로 잘라서 크기를 줄이면서 D-히단토이나아제의 대량생산을 위한 발현용 벡터 pHU183을 재조합하는 과정을 제3도 및 제4도에 도시하였다.
먼저, pHBR5의 10.5킬로베이스 DNA 단편으로부터 제한효소 EcoR1을 사용하여 6.4킬로베이스 단편을 잘라내고, D-히단토이나아제 유전자를 포함하는 나머지 DNA 단편을 슬라스미드 pBR322에 결합시켜서 플라스미드 pHBR54로 명명하였다. 또한, 플라스미드 pHBR54의 EcoRI-SacI 3.1킬로베이스 단편을 회수하여 플라스미드 pCU18에 결합시켜서 플라스미드 pHU183을 얻었다. 그리고, 플라스미드 pHU183으로부터 제한효소 SacI과 Sal1을 사용하여 2.5킬로베이스DNA 단편을 잘라내어 화수한 후, 플라스미드 pUC18과 회수한 유전자의 절편을 혼합하여 T4 DNA 리가제 반응에 의하여 접합시켰다. 이와같이하여 획득한 플라스미드를 플라스미드 pHU182로 명명하였다. D-히단토이나아제 유전자를 함유하고 있는 플라스미드 pHBR5, pHBR54, pHU183, pHU182들을 대장균 DH5 α F' 에 각각 도입하였다.
플라스미드 pHU183을 포함하는 DH5αF'는 한국과학기술원 유전공학연국소(Korean Collection for Type Cultures, KCTC)에 부다페스트 조약하의 규정에 따라 1995년 1월 25일 자로 국제기탁되어 KCTC 0147BP의 수탁번호를 부여받았다.
상기에서 얻은 각 재조합 균주들을 37℃에서 12시간 배양한 후, 각각의 재조합 대장균 균체를 회수하였다. 회수한 대장균 균체를 소니케이션(sonication)에 의하여 균체를 파쇄한 후, 원심분리(Eppendorfcentrifuge, 14,000rpm)하여 침전이 완전히 제거된 상등액을 회수하였다. 상등액 중의 D-히단토이나아제 활성을 측정하고 그 결과를 제4도에 나타내었다.
제4도에서 알 수 있는 바와 같이, 각 벡터, pHBR5, pHBR54, pHU183 및 pHU182를 함유하는 대장균 DH5αF'의 D-히단토이나아제 비활성(非活性)(μmol/min/mg 단백질)은 각각 1.38, 1.13, 34.6 및 0.5로서, 특히 pHU183-포함 대장균 DH5αF'의 경우 현저히 높은 것을 알 수 있다. 이러한 수치는, 동일한 조건하에서 바실러스 스티아로더모필러스 SD-1의 상기효소 비활성이 약 2.13[μmol/min/mg 단백질]인 것에 비하여 약 16배 높은 D-히단토이나아제 생산능을 가진 것을 알 수 있었다.
(실시예2)
플라스미드 pHU1183을 포함하는 대장균 DH5αF'(KCTC 0147BP)를 1.5L 발효조[(주) 한국발효기]에 하기 표1의 조성을 가진 배지 1.0L를 채우고, 온도 30℃에서 통기속도 1v/v/m 그리고 교반속도 1,000rpm으로하여 배양하였다. 24시간동안 배양한 후, 원심분리(5,000rpm)하여 약 17g의 균체를 회수하였다. 회수한 대장균 균체를 호모게나이저(pressure homegenizer)로 균체를 파쇄한 후, 원심분리(Sorvall centrifuge, 9,000rpm)하여 고형물질을 제거하고 상등액을 회수하였다. 상등액 중의 D-히단토이나아제 총활성은 약 340,000units이었고, D-히단토이나아제 비활성은 약 30units/mg(protein)이었다.
(실시예2)
실시예1에서 기술한 방법으로 배양한 대장균 균체로부터 무세포 조추출액을 얻은후, 이 용액에 20mM 농도가 되도록 망간이온을 가하고 60℃에서 30분동안 열처리하여 대장균 유래의 열에 약한 단백질들을 불용성 침전물로 만들었다. 이 침전물들은 원심분리(Sorvall centrifuge, 9,000rpm)하여 제거하였다. 얻어진 상등액의 단백질 농도 및 효소활성을 측정한 결과, 내열성 D-히단토이나아제는 전혀 실활되지 않고 대장균 유래의 단백질들만 제거되어 상기효소의 비활성이 약3배 증가하는 것을 알 수 있었다.
상기 실시예1에서 얻은 상등액과 본 실시예2에서 열처리 후 얻은 상등액에 대해 총 가용성 단백질의 양, 및 총 D-히단토이나아제의 활성(units)과 비활성(units/mg 단백질)을 측정하고 그 결과를 하기 표2에 나타내었다.

Claims (5)

  1. 바실러스 스티아로더모필러스 SD-1(KCTC 8551P)에서 유래된 가용성의 내열성 D-히단토이나아제를 코딩하는 총 10.5kb의 유전자중에서 3.1kb의 SacⅠ-EcoRⅠ 단편을 함유하는 플라스미드 pHU183.
  2. 제1항의 플라스미드에 의해 형질전환된 대장균 HF5αF'(KCTC 0147BP).
  3. 제2항의 대장균을 배양배지에서 배양하여 세포내에 가용성의 내열성 D-히단토이나아제를 축적시키고, 균체로부터 D-히단토이나아제를 회수함을 특징으로 하는 배양법에 의한 가용성의 내열성 D-히단토이나아제의 생산방법.
  4. 제3항에 있어서, 배양배지는 표1에 기재된 것임을 특징으로 하는 생산방법.
  5. 내열성의 D-히단토이나아제-코딩 유전자를 포함하는 벡터에 의해 형질전환된 내열성의 D-히단토이나아제 생산능을 갖는 비(非) 내열성 균주를 배양하여 D-히단토이나아제를 생산하고, 배양된 균체로부터 D-히단토이나아제를 분리회수하는 방법에 있어서, 상기 분리회수 방법이 다음 단계 (a)-(c)를 포함함을 특징으로 하는 내열성의 D-히단토이나아제의 분리방법; (a) 내열성 D-히단토이나아제가 가용성 상태로 생산된 균주를 수확후 분쇄용 완충액에 녹이고 호모게나아저로 균체를 파쇄시키는 단계; (b) 균체 파쇄액을 원심분리하여 얻은 무세포 조추출액을 10-20mM의 MN++화합물 존재하에 50-65℃에서 30분 내지 2시간 동안 열처리하여 비(非) 내열성 숙주세포의 단백질을 침전시키는 단계; 및 (c) 원심분리하여 침전물을 제거하고 D-히단토이나아제를 포함하는 상등액을 회수하는 단계.
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