CN103896846A - 一种以壳聚糖修饰的金纳米通道膜分离组氨酸对映体的方法及其检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种以壳聚糖修饰的金纳米通道膜分离组氨酸对映体的方法,分别以聚碳酸酯膜和氧化铝膜为基膜,采用化学沉积法制备金纳米通道膜,再将壳聚糖自组装至金纳米通道孔壁上,形成表面具有手性位点选择性的功能化纳米通道膜,利用纳米通道优异的分离能力手性分离DL-组氨酸。检测时采用银溶胶作为表面增强拉曼的基底,增强对D-,L-组氨酸的SERS效应,提高检测该物质的选择性和灵敏度,对D-组氨酸和L-组氨酸同时进行检测。本发明为构建纳米通道分离池与SERS检测系统的偶联装置对手性物质的分离检测提供了更加快速便捷的方法,体现了其独特的优越性和广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及材料领域和传感技术领域,是一种基于纳米通道膜材料上的分子水平膜分离检测技术,具体为基于纳米通道结合表面增强拉曼散射光谱分离检测组氨酸对映体的方法。
背景技术
从1959年著名物理学家、诺贝尔奖获得者Richard Feynman提出了纳米技术概念,到现在纳米技术经历了50余年的发展,已经成为现代科学(量子力学、介观物理、分子生物学等)和现代技术(微电子、计算机技术和扫描隧道显微镜技术、核分析技术等)交叉结合的产物,是现代科学研究的前沿。
近年来,纳米通道技术作为纳米生物技术研究的领域重要分支,因其独特的结构和理化性质,近年来在国际上得到广泛关注,在基因测序、单分子分析、仿生离子通道设计和药物装载等研究中体现了独特的优越性。纳米通道对手性物质的分离检测尚鲜见报导。在用纳米通道技术模拟生物膜发展高灵敏、高选择性分离手段,研制各种基底材料的纳米通道等方面的研究,研究者们正面临着重大的机遇和挑战。
手性是自然界的一种普遍现象,构成生物体的基本物质单位如氨基酸、糖类、蛋白质、核酸等都是手性分子。手性分子是具有对映异构体的外消旋混合物,它们在结构上、物理化学性质上极其相似,但是在药力、毒性方面却存在很大的差异。氨基酸是组成蛋白质的基本单元,是人类和动物生命活动重要物质。氨基酸是具有L型和D型的外消旋体,两者在人体内的活性差异很大,因此研究新的对映体氨基酸的拆分方法对人类健康,社会发展具有很深远的意义。
目前常见的对映体氨基酸拆分方法主要有化学拆分法、膜拆分法、色谱拆分法等。纳米通道对其分离研究还较少。因此,发展基于纳米通道的多通道手性传感检测技术是非常有意义的。常用分离氨基酸对映体的方法主要有高效毛细管电泳(HPCE)法、高效液相色谱(HPIC)法、薄层色谱(TLC)法和气相色谱(GC)法等。氨基酸对映体在色谱分离前通常需要进行衍生化。然而,这些方法检测复杂、费时,仪器不易携带,需要试样量较多,在连续监测及现场测定中受到限制。
快速准确而有效的分离、分析氨基酸对映体组分在当代药物化学、农业化学、食品化学和生物化学等领域的研究中具有非常重要的意义,对于进一步了解生命活动的本质也具有重要的意义。
表面增强拉曼散射技术(SERS)是一种表面测试技术,指当一些分子吸附到经特殊处理或制备的粗糙金属或胶体表面(如金、银等)时,它们的拉曼光谱信号强度一般比正常拉曼强度增加近106倍。由于SERS具有很高的灵敏度,不仅能够检测到吸附在粗糙金属表面的单分子层和亚单分子层的分子,而且能够给出表面分子的结构及构象的信息,同时可有效地避免溶液相中相同物种的信号干扰,获取高质量的表面分子信号,SERS被认为是一种很好的表面分析的手段,广泛应用于表面科学、分析科学和生物科学等领域。
本发明尝试基于金纳米通道膜技术,将纳米通道技术与对映体拆分结合,对对映体的拆分进行新的探索。并且发展基于纳米通道的多通道手性传感检测技术,构建纳米通道分离池与SERS检测系统偶合装置,将分离系统和检测系统有机的结合在一起,实现手性氨基酸的分离与测定。
发明内容
本发明的目的在于发明基于功能性纳米通道阵列实现手性对映体组氨酸的分离方法。构建纳米通道分离池与SERS检测系统偶合装置,将分离系统和检测系统有机的结合在一起,实现手性组氨酸更加快速地分离与检测。
为实现以上发明目的,本发明采用的技术方案如下:
一种以壳聚糖修饰的金纳米通道膜分离组氨酸对映体的方法,包括以下步骤:
(1)壳聚糖修饰的金纳米通道膜的制备:分别以聚碳酸酯膜和氧化铝膜为基膜,采用化学沉积法,分别在上述膜的纳米通道内沉积金纳米粒子,制得金纳米通道膜,将壳聚糖自组装至金纳米通道孔壁上,形成表面具有手性位点选择性的功能化纳米通道;
(2)D-,L-组氨酸的分离:以U形连通池作为组氨酸对映体分离的装置,U形连通池分进样池、透过池两部分,将壳聚糖修饰的金纳米通道膜置于进样池和透过池中间,利用D-,L-组氨酸在壳聚糖修饰的金纳米通道膜内迁移速度的不同实现手性D-,L-组氨酸的分离。
步骤(1)所述壳聚糖修饰的金纳米通道膜的具体制备过程如下:
采用化学沉积法,分别以50nm孔径的多孔聚碳酸酯膜和100nm孔径的多孔阳极氧化铝膜为模板,在纳米通道内沉积金纳米粒子,制得的金纳米通道膜以25%质量浓度硝酸溶液浸泡12h以去除表面上残留的杂质,取出用水冲洗三次,浸入在15mol/L的三巯基丙酸溶液中,6h后用去离子水冲洗5次,然后浸入摩尔比5:1的EDC-NHS溶液中,2h后用水冲洗干净,将上述处理过的膜浸没在0.4wt%的壳聚糖溶液中(pH=7.4)24h,通过EDC-NHS交联的壳聚糖自组装在金纳米通道膜上,用水冲洗干净后备用;制备过程均在4℃条件下进行。
一种基于纳米通道表面增强拉曼散射光谱检测组氨酸对映体的方法,包括以下步骤:
以制备好的银溶胶作为基底,取透过池溶液、银溶胶和NaCl溶液混合均匀,用表面增强拉曼光谱测定透过池中D-组氨酸和L-组氨酸含量,考察壳聚糖修饰的金纳米通道对D-组氨酸和L-组氨酸的分离效果。
通过EDC-NHS交联的壳聚糖自组装形成表面具有手性位点选择性的功能化纳米通道膜,利用纳米通道优异的分离能力手性分离DL-组氨酸,可以使组氨酸对映体很好的得到分离;与SERS检测系统的进行偶联之后,为更低浓度手性物质的分离检测提供了更加快速便捷的方法,体现了其独特的优越性和广阔的应用前景。
本发明可以对组氨酸对映体进行分离,分离过程简单,具有较好的应用前景。本发明将表面增强拉曼(SERS)应用于手性对映体的分析检测中,为构建纳米通道分离池与SERS检测系统的偶合装置对手性物质的快速即时灵敏的分离检测开辟了广阔的应用前景。结果表明拉曼可以与纳米通道进行偶联在线即时分离检测手性组氨酸对映体,并且能大大缩短检测时间。
附图说明
图1内径为100nm的Al2O3膜为基底的纳米通道膜沉积不同时间得到的金纳米通道膜场效应扫描电镜(FESEM)图,沉积时间:a,0h;b,7h;c,9h。
图2为D-组氨酸和L-组氨酸在50nm PC镀金3h纳米通道膜上修饰壳聚糖后迁移量随时间的变化,(a)D-组氨酸,(b)L-组氨酸。
图3为D-组氨酸、L-组氨酸在100nm-9h Al2O3-金纳米通道上修饰壳聚糖后迁移量随时间的变化,(a)D-组氨酸,(b)L-组氨酸。
图4为用表面增强拉曼光谱分别对10-11mol/L D-组氨酸、L-组氨酸以及D-,L-组氨酸混合物进行检测,(a)10-11mol/L D,L-组氨酸,(b)10-11mol/LL-组氨酸,(c)10-11mol/L D-组氨酸,(d)未加入银溶胶基底时。
具体实施方式
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应该指出的是,这些实施例仅用于说明本发明而不限制本发明的范围。此外应理解,在阅读了本发明描述的内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,如操作手册,或按照制造厂商所建议的条件。
实施例:
1金纳米通道膜的制备
采用化学沉积法在50nm的多孔聚碳酸酯(PC)膜上和100nm的多孔阳极氧化铝膜(AAO)上分别沉积金。将PC膜浸入无水甲醇中30min,以洗去基膜上吸附的杂质,将AAO膜用30%过氧化氢浸泡24h。然后将清洗过的PC膜、AAO膜分别放入0.026mol/L SnCl2和0.007mol/L CF3COOH50%甲醇/水溶液中,置摇床中震摇45min,转速90转/分,使Sn2+均匀地吸附在基膜及膜孔表面,将敏化后的膜取出用甲醇漂洗3次,然后将膜放入新制的0.029mol/L Ag(NH3)2 +溶液中15min,并持续通入氮气,使膜表面充分活化。取出后用甲醇洗3次,水洗3次,每次3min。然后浸入浓度为7.9×10-4mol/L亚硫酸金钠沉积溶液(pH=10.00)中。在4℃下按要求沉积一定时间。最后,将沉积金后的纳米通道膜用25%HNO3浸12h除去未反应的Ag,而后用超纯水充分洗涤并浸泡一段时间,除去膜上吸附的硝酸根离子,最后吹干或者晾干备用即得到Au纳米通道阵列膜。
2壳聚糖的修饰
将所制得的Au纳米通道膜浸入在1%的三巯基丙酸溶液中,6h后用去离子水冲洗5次,然后浸入5:1的EDC-NHS溶液中2h,用水冲洗干净,将活化的膜浸没在0.4wt%的壳聚糖溶液中(pH=7.4)24h,通过EDC-NHS交联的壳聚糖自组装在Au纳米通道膜上,用水冲洗干净后备用。实验均在4℃条件下进行。
3组氨酸对映体分离效果的测定
采用U形池作为组氨酸对映体分离的装置,U形池分进样池、透过池两部分,将纳米通道膜置于进样池和透过池中间,膜的有效透过面积为0.196cm2。
在U形连通池的进样池中分别加入10-4mol/L D-组氨酸和10-4mol/LL-组氨酸各4mL,透过池中加入8mL水,间隔一定时间后用旋光仪对组氨酸对映体进行检测,借此作为纳米通道对组氨酸分离计算其分离度的数据。作渗透池中D-组氨酸和L-组氨酸的浓度随时间变化的关系,所得直线斜率之比定义为两种待测物的分离度。
图2D-组氨酸(图2曲线a)、L-组氨酸(图2曲线b)在50nm PC镀金3h纳米通道膜上修饰壳聚糖后迁移量随时间的变化。分离选择在pH为7.59的条件下对10-4mol/L的D-,L-组氨酸对映体进行拆分。很显然,D-组氨酸的迁移速率明显大于L-组氨酸,壳聚糖功能化的金纳米通道对D-,L-组氨酸对映体分离度为4.91。这是由于表面具有手性位点选择性的壳聚糖功能化的金纳米通道膜对手性组氨酸具有优异的分离能力。
图3为D-组氨酸(图3曲线a)、L-组氨酸(图3曲线b)在100nm-9hAl2O3-金纳米通道上修饰壳聚糖后迁移量随时间的变化。实验得出分离度为4.14。实验结果表明,基底膜的改变对手性组氨酸的分离并没有很大的影响。
4银溶胶的制备
用柠檬酸钠还原法制备银溶胶。取0.0255g的硝酸银溶于150mL的超纯水中,不断搅拌硝酸银溶液,将其加热至沸腾后,取3mL1%的柠檬酸钠溶液逐滴缓慢加入其中。柠檬酸钠溶液滴加完成后,继续加热维持溶液在沸腾状态下,同时继续不断搅拌,10min之后停止加热,自然冷却至室温,得到呈灰色的银溶胶。避光保存。
5表面增强拉曼光谱(SERS)测定对映体组氨酸
以制备好的银溶胶作为基底,取透过池溶液200μL、100μL银溶胶和60μL80mmol/L的NaCl,混合均匀,取10μL混合液滴在干净的石英片上,用表面增强拉曼光谱测定透过池中D-组氨酸和L-组氨酸含量。考察壳聚糖修饰的金纳米通道对D-组氨酸和L-组氨酸的分离效果。结果表明拉曼可以与纳米通道进行偶联在线即时分离检测手性组氨酸对映体,并且能大大缩短检测时间。
组氨酸对映体分离检测
采用U形池作为进样池中组氨酸对映体浓度与渗透池中浓度关系的装置,U形池分进样池、透过池两部分,将功能化壳聚糖的纳米通道膜置于进样池和透过池中间,膜的有效透过面积为0.196cm2。
分别将10-4mol/L D-,L-组氨酸8mL置于进样池中,透过池放置8m L水,每隔一小时用旋光仪检测渗透池中D-组氨酸和L-组氨酸的含量,得到渗透池中D-,L-组氨酸渗透时间与渗透量的关系,所得直线斜率之比定义为两种待测物的分离度。
图4为用表面增强拉曼光谱分别对10-11mol/L D-组氨酸、L-组氨酸以及D-,L-组氨酸混合物进行检测。从图4d中可以看出银溶胶起到了SERS活性基底的作用,未加入活性基底无法检测出组氨酸。由于D-组氨酸和L-组氨酸的空间位阻不同,与银微粒作用不同,振动频率不同,所以各自会出现自己的特征峰。L-组氨酸在1000cm-1左右有其特征峰(图4b),D-组氨酸在1590cm-1左右有其特征峰(图4c),而在D-,L-组氨酸的混合溶液中通过SERS检测可以同时看到D-组氨酸和L-组氨酸的特征峰存在(图4a),由此可以看出,通过表面增强拉曼光谱(SERS)可以同时检测区分D-组氨酸和L-组氨酸。
Claims (3)
1.一种以壳聚糖修饰的金纳米通道膜分离组氨酸对映体的方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)壳聚糖修饰的金纳米通道膜的制备:分别以聚碳酸酯膜和氧化铝膜为基膜,采用化学沉积法,分别在上述膜的纳米通道内沉积金纳米粒子,制得金纳米通道膜,将壳聚糖自组装至金纳米通道孔壁上,形成表面具有手性位点选择性的功能化纳米通道;
(2)D-,L-组氨酸的分离:以U形连通池作为组氨酸对映体分离的装置,U形连通池分进样池、透过池两部分,将壳聚糖修饰的金纳米通道膜置于进样池和透过池中间,利用D-,L-组氨酸在壳聚糖修饰的金纳米通道膜内迁移速度的不同实现手性D-,L-组氨酸的分离。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(1)所述壳聚糖修饰的金纳米通道膜的具体制备过程如下:
采用化学沉积法,分别以50nm孔径的多孔聚碳酸酯膜和100nm孔径的多孔阳极氧化铝膜为模板,在纳米通道内沉积金纳米粒子,制得的金纳米通道膜以25%质量浓度硝酸溶液浸泡12h以去除表面上残留的杂质,取出用水冲洗三次,浸入在15mol/L的三巯基丙酸溶液中,6h后用去离子水冲洗5次,然后浸入摩尔比5:1的EDC-NHS溶液中,2h后用水冲洗干净,将上述处理过的膜浸没在0.4wt%的壳聚糖溶液中(pH=7.4)24h,通过EDC-NHS交联的壳聚糖自组装在金纳米通道膜上,用水冲洗干净后备用;制备过程均在4℃条件下进行。
3.一种基于纳米通道表面增强拉曼散射光谱检测组氨酸对映体的方法,包括以下步骤:
以制备好的银溶胶作为基底,取透过池溶液、银溶胶和NaCl溶液混合均匀,用表面增强拉曼光谱测定透过池中D-组氨酸和L-组氨酸含量,考察壳聚糖修饰的金纳米通道对D-组氨酸和L-组氨酸的分离效果。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
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C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C14 | Grant of patent or utility model | ||
GR01 | Patent grant | ||
CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
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Granted publication date: 20160525 Termination date: 20190305 |