JPS6322180A - 新菌種サ−マス・ラクテウス - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は新規好熱性フマラーゼ、その製造法および該酵
素を生産する能力を有する微生物ならびに該酵素を利用
するＬＩＪンゴ酸の製造法に関する。

Ｌ−リンゴ酸は輸液の成分として利用され、また清涼飲
料水の酸味料としての用途も広がｐつつある重要な物質
である。現在Ｌ−リンゴ酸の製造法としてはマレイン酸
よシ化学的に得られるＤ　Ｌ−１，１ンゴ酸の光学分割
法、微生物由来の７マラーゼを利用する方法、微生物の
直接発酵による方法などがあるが、微生物由来の７マラ
ーゼを利用する方法が実用的である。微生物由来の７マ
ラーゼを利用した例としては、北原等による乳酸菌ラク
トバチルス・プレビスをフマール酸カルシウムに作用さ
せＬ−リンゴ酸カルシウムとして析出させる方法（特公
昭３７−弘！ｌ／）、酵母を用いフマール酸から酵素的
Ｋ　Ｌ−ＩＪンゴ酸を製造する方法（特開昭！コー／１
ｏｊｒｙ）およびブレビバクテリウム・アンモニアゲネ
スを用いフマール酸から酵素的にＬ−リンゴ酸を製造す
る方法（ヨーロピアン・ジャーナル・オン・アプライド
・ミクロバイオロジー、第３巻、ｉｔり頁、ｌり７を年
）などが知られている。特公昭３７−４１！／ｌ記載の
方法は、石膏の副生および増殖不良などの欠点があυ、
後二者は酵素反応を常温で行うので実用上難点がある。

発酵操作、酵素反応などを高温条件で行なえることは、
雑菌汚染防止、酵素反応の迅速性、冷却エネルギーの節
約などの点から極めて有利である。

本発明者らは、熱安定な７マラーゼを得る目的で狸々の
好熱性細菌についてフマラーゼ活性を調べた結果、サー
マス属およびバチルス属に属する高度好熱性細菌が好熱
性の７マラーゼ活性を有することを見出し本発明を完成
するに到った。

従って本発明は、新規好熱性フマラーゼ、その製造法お
よび該ｅ素を生産する能力を有する微生物ならびに該酵
素を利用するＩｇンゴ酸の製造法に関し、以下にその詳
細を説明する。

本発明に係る高度好熱性フマラーゼは、該酵素を生産す
る能力を有する微生物を栄養培地に培養し、培養物中に
該酊素を蓄積せしめ、該培養物から該び素を採取するこ
とによって製造することができる。

本発明で使用する微生物は高度好熱性７マラーゼを生産
する能力を有するものならいかなる菌株を用いてもよい
が、具体的にはサーマス戊またはバチルス属に属する菌
株、例えばサーマｈＴｃｃＪｉｒｚｒ）、サーマ２・ラ
フテラス・ｈＴｃｃ３１ｚｊ７’）、サーマス・ルーベ
ンス・ムＴＣＣＪ／Ｊ−１ｔ）、サーマス・アクアティ
クスＡＴＣＣ２ｊ１０１７．サーマス・アクアティクス
ムＴＣＣ２Ｊ’１０ｊ、サーマス・サーモフィルス（Ｔ
ｈｅｒｍｕａ　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ムＴＣＣコ
ア４３１１．１１１１号、ＮＲＲＬ　　Ｂ−／２ｏａｔ
ｘ）、ハｆ　ルＢ−ハＺＪｕｊ）、バチルス・ズブチリ
ス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｕｂｔｉｌｉすＡＴＣＣＪＯ
ｊ／、バチルス・リケニホルミスＡＴＣＣ／／ｊｔＯ、
バチルス・ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）　Ａ　Ｔ　Ｃ
Ｃ／　、２０　／　Ａ　。

パｆＡ／ス−：ｒ７ギユラ７　ス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　
ｃｏａｇｕ−１ａｎｓ）ＡＴＣＣ７０ｊ１７などがあげ
られる。

上記微生物の苗字的性質については下記文献にそれぞれ
記載がある。

サーマス・アクアティクスＢｅｒｇｅｙ’ｓ　Ｍａｎｕ
ａｌ　ｏｆＤｅｔａｒｍｌｎａｔｉｖｅ　　Ｅａｃｔｅ
−ｒｉｏｌｏｇｙ第を版、２１１頁 サーマス・サーモフィルス　特開昭ｘｉ−ｉｉｒりｔｒ
号公報 バチ／ｌ／、Ｘ参りケニホルミス　　Ｂｅｒｇｅ７’ｓ
　Ｍａｎｕａｌ　ＯｆＤｅｔｅｒｍｉ−ｎａｌｖｅ　　
Ｂａｃｔａ−ｒｉＯ１０ｇ７第！版、！３４Ｌ頁 バチルス・プミルス　　同上、ｊＪＪ〜Ｊ−Ｊ≠頁バチ
ルス・ズブチリス　同上、ｊ３／〜ｊ３３頁ノザにス・
ステアロサーモフィラス　同上、！３２〜！≠０頁バチ
ルス・コアギュラレス　同上、！ｌ１０−ｊ≠１頁尚、
本発明者らが分離したサーマス・アクアの根拠について
以下に示す。

上述の菌学的性質をもとにして、バージ−のマニュアル
・オン・デターミナテイプ・バクテリオロジー第ｒ版お
よびジャーナル・オン・バクテリオロラー２２巻、２ｒ
ターコタ７頁（１２６り）、インターナショナル・ジャ
ーナル・オン・システマテイツク・バクテリオロジ−！
　４７％／　ｏ　ｓ−／’Ｉ　２頁（ｌり７弘）、同コ
！巻ｊｊ７−ＪＡ≠頁（／り７ｊ）、アグリカルチエラ
ル・バイオロジカルケミストリー３を巻２３３７−２３
６１頁を参考にして、公知の菌株とその異同を検討した
。

上記の３菌株は、グラム隘性、無胞子、非運動性、好気
性の桿菌ないし糸状桿菌で、生育至適温度ｔｏ℃以上の
偏性好熱菌であるところから、サーマス属に属するもの
と考えられる。

ｓｉｏ≠菌は、同定実験に際し対照菌として使用したサ
ーマス・アクアティクスの標準法についての実験結果あ
るいは、前記報文中の記載とほぼ完全に一致するので、
サーマス・アクアティクスと同定した。５ｉｏｒ菌株は
、（１）コロニーがクリーム色であること　（２）ガラ
クトース、ラクトーズ、グリセロールからの酸生成が異
なること　（３）グルタミン酸の要求性がない点からサ
ーマス・アクアティクスと区別でき、新種と見なし、サ
ーマス・ラフテラス・ノブ・エスピーと命名した。１６
１０２菌は、（１）コロニーが赤橙色であること　（２
）生育至適温度が低いこと（３）至適ｐＨが低いこと　
（４）グリセロール、マニトールからの酸生成が異なる
点からサーマス・アクアティクスと区別でき、新種と見
なし、サーマス・ルーベンス・ノブ・ニス？”−ト命名
した。

これらの菌株の培養について述べる。これらの菌株の培
養においては通常の好熱性ｎＵ菌の培養法が一般に用い
られる。

炭素源トシてはシュークロース、マンノース、澱粉、糖
蜜、グリセリン、マニトール等の糖質および粘アルコー
ルが単独または組合せて用いられる。また菌の資化性に
よっては炭化水素、アルコール類、有機駿等も用いうる
。窒素源としてはａＨアンモニウム、塩化アンモニウム
、硝酸アンモニウム、硝酸ソーダ、尿素等の無機窒素源
、あるいはポリペブト／、ペプトン、イーストエキス、
コーン・スｆ　−フ・リカー、アミノ酸等の有機窒素源
を単独または組合せて用いることができる。

また７マ一ル酸等有機酸やＭｎ′１、Ｃ〇九Ｍｇ代ＭＯ
皆を含む各種塩の添加によシ菌の生育−？酵素の生産が
促進される。培養法としては液体培養法が適している。

培養温度はｊＯ−ｒＯ℃でｐＨは中性付近で培養を行な
うことが望ましい。

培養終了後、培養液よシ好熱性７マラーゼを採取するＫ
は一般の酵素採取法を用いることができ、本酵素は菌体
内酵素であるため、例えば次のような方法で単離するこ
とができる。

まず得られた菌体をｒｏｉ７を程度の濃度でダイノーミ
ル（シンマルエンタープライス）Ｋかけ無細胞抽出液を
得る。これを４ｔＯ〜７０％の硫酸アンモニウムで２弘
時間塩析する。緩衝液は０．　／　Ｍ　）　ＩＪス・塩
酸液を使用する。

次に、ＤＥＡＥ・七７アデツクスＧ−，ｚｔ（生化学工
業社製）カラムに吸着させ０−０．ｔＭ食塩水で濃度勾
配に溶出させ活性区分を集める。

次にこの画分を硫酸アンモニウム７０チ飽和にし、生じ
た沈澱を集めてｐＨ約Ａ、ｊのリン酸緩衝液で透析する
。さらにＤＥＡＥ・セルロース（生化学工業社製）、Ｄ
ＥＡＥ・セファデックスＧ−７０（生化学工業社！！り
、最後にハイドロキシ・アパタト（゛生化学工業社！ｌ
！りに吸着・溶出させて本酵素を得る。

本ひ素の活性の測定は次のように行う。

０．７Ｍフマール酸ナトリウムと本酵素、菌体または菌
体処理物とを（ＤＣＷ換算１０１／ｌ）接触させ、ｐＨ
７０％温度ＩＬｔＯ〜７０℃で３０分間反応を行う。反
応液をＬ−リンゴ酸として！〜ｒｏｒ程度になるように
稀釈する。

稀釈液／　ｘｉを採取し、これに渦硫酸４ａｊを加えて
十分に攪拌後、２７−ナフタレンジオール（／ｌ／１０
０ｄ−濃硫酸）Ｏ２／翼ｌを加えて沸とう水中ＶＣ，ｔ
ｏ分間浸漬する。

これを冷却後３り（７ｎｍでの吸収値よりＬ−リンゴ酸
量を算出し、この値から溝索活性を算出する。その他高
速液体クロマトグラフィー法、マリツクエンザイム法、
過マンガン酸カリウムによるフマール酸の定量法等が使
用可能である。

いずれの場合も酵素活性は国際単位（ｕｎｉｔ／９−ｍ
１ｎ）で表示する。

次に得られた酵素の性質について述べる。サーマス属、
バチルス属によシ生産される酵素は若干性質に差がある
ので、別々に記載する。

サーマス属菌（サーマス・アクアティク−１／Ｖｓ１０
≠よシ得た酵素を代表として示す） （１）作用および基質特異性 ７マール酸およびＬ−リンゴ酸にのみ作用し、Ｌ−リン
ゴ酸からフマール酸および水を生成する反応およびその
逆反応を触媒する。

（２）至適ｐＨ ０，２Ｍリン酸緩衝液（ｐｎａ　〜ｒ）、０．．２Ｍト
リス・塩酸緩衝液（ｐＨｒ〜り）中での活性をｔｏ℃／
Ｑ分間処理にて測定した。結果は第１図に示す通りであ
って、ｐＨ７＃付近に至適ｐＨがある。一般に動物起源
、および常温菌産生のフマラーゼはアルカリ側に至適ｐ
Ｈがあるが、好熱性フマラーゼは一般的に中性かあるい
は若干酸性側に至適ｐＨを有している。

（３）安定ｐＨａ囲 ０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨＪ：ｔ〜ｒ、ｏ）、ｏ、２
Ｍトリス・塩酸緩衝液（ｐＨよｏ−ｇＯ）中、ｔｏ”ｃ
、／を時間処理し、７Ｍフマール酸ナトリウム（Ｐ　Ｈ
７，２）を添加し６０℃、３０分反応して活性を測定し
た。結果は第１図よ示す通りである。ｐ　Ｈｒ、　０で
バッファーによシ活性に約２倍の差が生じたが図のよう
ＫｐＨよ！〜２よ壕では相対的に安定と思われる。

（４）作用過温の範囲 、ｒＯ−、ｒｔ”Ｃの範囲でｐ　Ｈ７，２でｌＯ分間反
応した。結果は第３図の通りであり、７０℃付近に至適
温度がある。

（５）温度安定性 本酵素を０．７Ｍリン酸緩衝液（ＰＨ７コ）中ｔｏ−，
ｒｏ℃にＪＯ−／２０分間処理した後／Ｍ７マール酸ナ
トリウムヲ加え−ｃｔｏ℃、ｉｏ分間反応して活性を測
定した。結果は第１図に示す通シである。ぶｏ′Ｃまで
はｉｏ。

多安定である。

（６）阻害、活性化および安定化 本酵素はある演の２価の金属イオンにて若干の活性化を
示す。その順序はＣｏ　）Ｚｎ　）Ｍｇであり、Ｃｕ　
　は若干の阻害作用を示す。０−７エナンスロリン、α
、α１−ジピリジルなどの金属キレート試薬によシ阻害
を受ける。

（力分子量 内部標準蛋白としてチトクローム−０１オパルブミン、
γ−グロブリンを使用してセファデックスＧ−２００１
１Ｃよるゲル濾過を行った結果、分子量は約／ｊ万であ
った。

ハチ／Ｌ’スＭ菌（、ｐ＜テルス・ｖヶニホルミスＴ−
Ｊｌｌよシ得た酵素を代表として示す）（１）作用およ
び基質特典性 フマール酸お上びＬ−リンゴ酸にのみ作用し、Ｌ−リン
ゴ酸からフマール酸および水を生成する反応およびその
逆反応を融媒する。

（２）至適ｐＨ 不酵素をＯ，コｊＱ’ｐ酸緩衝液（ｐａｊ〜＆Ｊ）、０
．２Ｍリン酸緩衝液（Ｐｌ（４７〜ｒ、ｔ）、０．２Ｍ
トリス・塩酸緩衝液（ｐＨｒ、ｒ−／　ｏ、ｏ　）中で
の活性を！Ｏ″ＣＪＯ分間処理にて測定した。結果は第
！図に示す通シであって、ｐＨ７Ｏ付近に至適ｐＨを有
する。

（３）安定ｐＨ範囲 上記の緩衝液中！Ｏ℃でｐＨ範囲よθ〜１０．０にて／
Ａ時間処理後、ｔｏ℃、ｐｋ１７０で活性を測定した。

結果は第を図に示す通シで１、安定ｐＨ範囲はｐＨ７，
０−’ＺＦで安定である。

（４）　　作用適温の範囲 ≠０−１０℃の範囲でＰ　Ｈ７，０で１０分間反応した
。結果は第７図に示す通シであシ、ｊＯ〜Ａｏ℃に至適
温度がある。

（５）温度安定性 酵素液を４ｔｏ−ｔｏ℃にＰ　Ｈ７，０でＪｌｌ）〜／
ＪＯ分間処理した後／Ｍフマール酸ナトリウムを添加し
て１０℃、ｉｏ分間反応して活性を測定した。１ｇｒ図
に示すよりＶＣｔＯ”Ｃまではｉｏ。

多安定である。

（６）阻害、活性化および安定化 本酵素はｃｏ＋）、Ｚｎ４＋、Ｍｇ什、ＭＯＪ＋等のコ
価の金属イオンにて若干の活性化を示す。基質であるフ
マール酸塩の存在で安定化作用が認められている。Ｃｕ
＋および０−７エナンスロリン、α、α゛−ジピリジル
などの金属キレート試薬は若干の阻害作用を示す。

（７）分子量 内部標準蛋白としてチトクロームＣ１オパルプミン、ｒ
−グロブリンを使用してセファデックスＧ−，２００１
１Ｃよるゲル濾過を行った結果、分子量は約／ｒ万であ
った。

本酵素、本酵素を含有する菌体または該菌体の処理物を
フマール酸く作用させるととＫよってＬ−リンゴ酸を晟
造することができる。反応は通常≠Ｏ〜ｊＯ℃、ｐＨぶ
、０〜ｒ、　ｏで行う。

反応に際しての７マ一ル酸濃度は０．２〜／、７モル程
度が適当である。また酵素濃度は！〜ｊＯｕｎｉｔｓ　
／ゴ程度が適当である。

反応に際してフマール酸は通常塩として用いる。用いら
れる塩としてはナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウ
ム塩、マグネシウム塩、亜鉛塩などがあげられる。従来
のフマラーゼを用いる場合は、溶解度の関係から１価の
金属塩の使用に限られていたが、本発明の耐熱性フマラ
ーゼの使用により２価の金属塩の使用も可能になシ、Ｌ
−リンゴ酸への転換率が著しく向上した。

反応に際しては酵素、菌体、菌体処理物を固定化して用
いるとよシ実用的にＬ−リンゴ酸を製造することができ
る。これらの固定化は酵素、菌体等の固定化に用いられ
る一般的方法によシ行うことができる。たとえば、酵六
液はフマラーゼを吸着しうる一般的な陰イオン交換樹脂
と接触させればよく、菌体の固定化には、エチルセルロ
ース、酢酸・酪酸セルロース等によるマイクロカプセル
化、アクリルアミド系単量体によるゲル包括、ポリビニ
ールアルコールによる包括、コラーゲンによる膜状包括
等が用いられる。また単に菌体を充ｊＪｔ混合剤と混合
し、架橋剤等で処理する方法、たとえばゼラチン・ゲル
タールアルデヒド法、キトサン・ゲルタールアルデヒド
法、カラゲー二ン・ゲルタールアルデヒド法、アルブミ
ン・ジアルデヒドデンプン法などが利用できる。

反応液からのＬ−ＩＪンゴ酸の採取は反応液を常法によ
シイオン交換樹脂、活性炭処理を行った後、濃縮、晶析
することによシ得ることができる。

実施例１゜ ポリペプトンｏ、ｒｊ７ｃｕ、イーストエキス０．４ｔ
ｇ／ｄ！、塩化ナトリウム０．２１７ｄｌの組成を有し
ｐＨ７０に調整した培地ＪＯｘｌを含む３００ｄ容量フ
ラスコにサーマス・アクアティクス屑１０４を菌、サー
マス・ラフテラス・ノブ・エスピー４１０１菌、サーマ
ス・ルーベンス・ノブ・エスピーＡ１０ａＨ、サーマス
・アクアティクスＡ　Ｔ　ＣＣ，２よ１０４ｔ、ＡＴＣ
Ｃ２！１０よ、サーマス・サーそフィルス人ＴＣＣ２７
ｔＪ’１を接種し、ｔｏ−ｔｏ″ＣＫて／２時時間上り
培養する。次にこの培養物全量を同組成の培地ＪＯＯｎ
ｌを含むλ！容量バッフル付フラスコに植菌し同温度で
コー時間振とう培養する。この培養液をさらに同組成の
培地３１を含む！ｌ容量ジャーファーメンターに植菌し
てｔ　ｏ−ｒ　。

℃、通気量０．　ｒ　ｖ＋ｖ＋Ｉｎ＋、　ｆｆｌ拌Ｊ　
００　ｒ、ｐ、ｍ、にてコ弘時間培養した結果第２表に
示す景の菌体が得られた。得られた菌体を／　０．００
０　Ｇにて遠心分離を行ない、２度洗浄を繰夛返した後
、凍結乾燥した。この乾燥菌体を１モルのフマール酸ナ
トリウムと接融させ！０〜ｔＯ℃、３０分反応し生成す
るＬ−リンゴ酸よシフマラーゼ活性を測定したところ第
２式に示す如き結果であった。

第　コ　宍 一邦 実施例ユ 実施例／と同様の培地はフマール酸を０．２ｉ／ｄｌ　
ｔａ　加Ｌ　テサーマス・ルーベンス−ノブ・ニス　　
　゛ピー４１０．２菌をｔｏ”ｃで２≠時間培養した。

フマラーゼ活性を測定したところりｏｏｕｎｉｔ／、ｐ
、ｃｅｌｌの菌体が得られた。この菌体を凍結乾燥口、
この凍結乾燥菌体を用いて固定化微生物を作成した。分
散媒としての水ｔｏｏｘｉｔに分散剤としてエマルゲン
ーｙｒｔ　（化工アトラス社ｎ）を７．２９、セロゲン
ーＰＲ（第一工業製薬社製）を３ｇ溶解し、強攪拌下よ
〜１０℃に冷却しておく。一方凍結乾燥菌体／よＩをα
タチ生理食塩水ｊＯｔｄ、と菌体凝集剤である／％キト
サン水／よゴに均一に懸濁しておく。酢酸・酪酸セルロ
ース３ｒｉ−ｒｏ＜イーストマン・ケミカルインターナ
ショナルＬｔａ製）／！ｙと分散剤としてアルラセルー
Ｊ′３（化工アトラス社製）Ｊｇを／３！ｇの酢酸イソ
ブチルに溶かしたものを十分に攪拌し、均一なＷ１０エ
マルジョンとする。この菌体懸濁液と酢酸・酪酸セルロ
ースＫｊ：るＷ１０エマルジョンを先の冷却授拌中の分
散媒にロートを用いて滴下し、滴下後ｎ−ヘキサン１２
００ｎｌを徐々に定量ポンプで添加する。その結果、酢
酸・酪酸セルロース内に菌体が包括された、強固で均一
な粒径の固定化微生物が液中に析出する。これ全戸布等
で戸取し、十分に洗浄して反応に使用する。

得られた固定化微生物を用いて７Ｍ−フマール酸ナトリ
ウムからＬ−リンゴ酸への転換を１０℃、流速ＢＶ＝０
．６にて連続カラム運転によって行ったところ、７よチ
以上の転換率でＬ−リンゴ酸の生産が７７月以上可能で
あった。

さらに常温では使用しがたいフマール酸マグネシウムも
一モルの濃度でｔｏ℃では可溶であシ、これを用いたと
ころ？！チ以上の転換率で安定したＬ−リンゴ酸マグネ
シウムが得られた。これＫよシ常温で使用し難いマグネ
シウム塩を用いたことによシ反応率がＩＱ係係上上上昇
未反応７マール酸の回収工程も縮少され精製工程も簡略
された。

実施例３゜ サーマス・アクアティクスム１０ＩＡ菌を実施例／の培
地ニフマール酸アンモニウム０．λ１１７ｄｌ添加した
培地中、７（１）’Ｃで３を時間培養したところ２００
　ｕｎｉｔ／ｌ１−ｃｅｌｌのフマラーゼ活性を有する
菌体３１１／ｌが得られた。

菌体を十分洗浄してから速結乾燥し、この凍結乾燥菌体
を！０９／ｌの濃度で超音波処理し粗酵素液を調製した
。

この粗酵素液を隘イオン交換樹脂である吸着担体に接触
させ固定化ヒ素を作成した。

まずデュオライ）−Ａ７（米国ダイヤモンドジャムロッ
クケミカル社製）をレジン水にて十分に洗浄してから０
．　／　Ｍ　リン酸緩衝液（ｐ　Ｈ４，ので緩衝化する
。これに上記で調製した粗酵素液を活性値として１００
〜コ００　ｕｎｉｔ廓樹脂の割で、ｊ　ｊ、〜７　ｊ　
”Ｃ’で負荷し、／Δ時間吸着固定化させる。蛋白吸着
量はり０チ以上であった。

その後面素の安定化剤として０．　／％フマール酸ナト
リウム、架橋剤として０．コチグルタールアルデヒドを
０．　／％リン酸緩衝液に溶がしたものを３０分間反応
させ、十分洗浄して固定化酵素とした。この固定化＃素
をｊＯＭｌ’４量のコーンタイプ流動層にＪＯｄ充填し
て１Ｍ７マール酸ナトリウムからＬ−リンゴ酸への転換
を連続カラム運転によって行ったところ、５ｖ＝ｏ、ｐ
。

７０℃で約、２（７日間の間、転換率１０チでＬ　−リ
ンゴ酸の連続生産が可能であった。反応液は完全清澄液
であシ、酵素の洩れもなく、また高温操作の為、雑菌汚
染もなく非常に効率よいＬ−リンゴ酸の生産が可能であ
った。

す〜マス・ラフテラス・ノブ・ニスピーラ実Δ 施例３と同様の培地で７０Ｃでコ弘時間培養したところ
Ｊ　００　ｕｎｉｔ／ｇ・ｃｅｌｌのフマラーゼ活性の
菌体が得られた。

得られた菌体をコラーゲン・フィブリル液と十分に混合
してテフロンシート上にキャスティングして固定化微生
物とした。この固定化微生物をチップ状に細断してカラ
ムに充填して７Ｍ７マー／ｌ／酸マグネシクムをＢ　Ｖ
　＝　ｏ、ｚで通液したところり０４以上の転換率で１
０日間以上安定したＬＩＪンゴ酸の生成が確認された。

高速液体クロマトグラフィー８ｈｏｄｅ；ｃ工。ｎｐａ
ｋｃ−ｒｉｉ（昭和電工社製）で反応液を分析したとこ
る・、Ｌ−リンゴ酸とフマール酸のみが検出され、他の
不純物は皆無であった。

実施例よ ｌ／−濃度のブイヨン培地にて活性化スラントトシタバ
チルス・リケニホルミスＴ−！／／菌、バチルス・フミ
ルスＴ−ｊ３０Ｍ、バチルス、ズブチリスＡＴＣＧ７ｏ
ｊ／およびバチルス・リケニホルミスＡＴＣＣ／／７７
θをポリペプトンμｒｇ７ｔｕ、イース）　・Ｌ＋、Ｘ
、０．４ｔｌ／／ｄ１１食塩ｏ、ａｇ７ｔｔの組成を有
し、ｐＨ７ＯＶｃＦＡＩＪ１した培地ＪＯ１ｔｌを含む
ＪＯＯ＊ｌ容量フラスコに接征し第３表に示す温度で１
１時間培養する。

次にこの培養物全量をグルコース３１１７ｄｌ、ペプト
ン１ｉ７ｃｕ、イーストエキス。、２　！　１１／ｄｉ
１リン酸−カリウム０．／／ｊ／ｄ１１　　リン酸二カ
リウム０．／Ｅ／ｄｌ、硫酸マグネシウム。、ｉｉ／ｄ
ｔ１硫酸鉄ｏ、　ｏ　ｏ　２１　／　”　ｓ硫酸’Ｔ７
ガンｏ、ｏｏｏｏｚｇ　７ｃｕ、硫酸亜鉛ｏ、ｏｏｉｉ
７ｃｕ、β−アラニア０．０００！ｉ／ｄｌ（Ｄ組成を
有シｐ１ｉｚ、、ｚＫ１４整した培地ＪＯＯ−を含む−
ｌ容量バッフル付フラスコに植替えて第３表は示す温度
でλ弘時間培養した結果第３弐に示す量の菌体が得られ
た。得られた菌体を／　０．０００　Ｇにて遠心分離を
行ない２度洗浄した後、凍結乾燥した。

この乾燥菌体をｉｏｇ７ｚの旦度で１モルの７マール酸
ナトリウムと接融させｊＯ〜７０″Ｃ１３０分反応し生
成するし一リンゴ酸よυフマラーゼ活性を測定した。結
果を第３米に示す。

第３表 実施例ｔ。

バチルス・フミルスＴ−１３０菌をグルコースｊ　ｉ　
／ｄｌ、　７ｊｊｌ酸す）　！Ｊ　ラム０．２１１／ｄ
ｌ、　　１，１７酸−カリウム０．／１１／ｄｌ、リン
酸二カリウムｏ、ｊＶａ１塩化アンモニウム０．より／
ｄｉ、硫酸マグネシウム０．０　／　ｉ　／　ｄｌ　、
硝酸アンモニウム０．　／　ｉ／ａ１塩化カルシタカル
シウム０００　／　Ｊｉ’　／　ｄ１％Ｎ１ｔｓｃｈｅ
’５ｔｒａｃｅ　ｅｌｅｍｅｎｔ　／　ｄ　／　／の組
成を有しｐ　Ｈ７，＋２に調整したＪＯＯＭＩの培地を
含む、２１８ｍバッフル付フラスコに３０−の容量の前
培養液（培地は上記と同じ）を植菌し≠ｊ”ｃで３λ時
間培養した。

フマラーゼ活性を測定したところ２３！ｕｎｉｔ／１・
ｃｅｌｌの菌体が得られた。

この凍結乾燥菌体をｊ　０１／ｌの製置で超音波処理し
た。かくして得られた粗酵素液を陰イオン交換樹脂であ
る吸着担体に接触させ固定化酵素を作成した。

まずデュオライ）−Ａ７をレジン水にて十分に洗浄して
からｏ、７Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ五〇）で緩衝化する。

次に、上記で調整した粗酵素を活性値として／　００−
２００　ｕｎｉｔ／ｄ−樹脂の割で、６３〜７３℃で負
荷し／７時間吸着固定化させる。蛋白吸着量はり０％以
上であった。

その後、酵素の安定化剤として０．　／％フマール酸ナ
トリウム、架橋剤として０．２チグルタールアルデヒド
を０．　／チリン酸緩衝液に溶かしたものを３０分間反
応させ、十分洗浄して固定化扉素とした。

この固定化酵素を１０ａｌ容量のジャケット付カラムに
充填しｔｏ℃流速５Ｖ＝＝θ、／で／Ｍフマールｒヌナ
トリウムを流したところ約７０チの転換率でり、−リン
ゴ酸がｌＯ日日間わたって連続生産可能であった。

高温操作の為、雑菌汚染もなく、非常に安定したし一リ
ンゴ酸の生産がなされた。

実施例Ｚ 実施例λと同様の合成培地でバチルス・リクニホルミス
Ｔ−ｊ／／菌をＪ′Ｏ℃で、！ＬＬｒ時間培養したとこ
ろ、約ユ０１／ｌの菌体が得られた。この菌体のフマラ
ーゼ活性は、２ｒＯｕｎｉｔ／／ｊ−ｃｅｌｌであった
。

次に得られた菌体を十分洗浄して凍結乾燥菌体としてか
ら、コラーゲン・フィブリル液と混合して、テフロン・
シート状にキャスティングすることＫよシ、コラーゲン
包括菌体を作成した。

このコラーゲン包括菌体をチップ状に細断してカラムに
充填し流速ＳＶ二ｏ、　ｏ　ｒ、ｔＯ℃で７Ｍ７マ、−
ル酸マグネシウムを通液したところｒｚｐ程度の転換率
で７日間安定したＬ−リンゴ酸の生成が確認された。

副生成物を高速液体クロマトグラフィーにて確認したと
ころフマール酸とＬ−リンゴ酸以外の他の有機酸類は検
出されなかった。

実施例Ｌ サーマス・ルーベンス・ノブ・エスピー屑１０コ菌を実
施例１と同様に培養する。得られた菌体（ｒｏｇ／ｌ）
を超音波破砕する。

との破砕液をＤＥＡＥ・セファデックス（）−，１を充
填したカラムに通塔し、０−０．１．Ｍ食塩水で濃度勾
配溶出させ、フマラーゼ活性区分を集めた。これを硫安
７０チ飽和とし、生じた沈殿をリン酸緩衝液（ｐ）ＩＡ
ｊ）で透析する。

この這析液をＤＥＡＥ・セルロースを用いｐＨ７ｊにて
カラムクロマトグラフィーを行い、ついで溶出液をハイ
ドロキシ・アパタイトでカラムクロマトを行い、凍結乾
燥を行って、フマラーゼ粉末を得る。得られたフマラー
ゼの蛋白当シの比活性はセルフリー抽出液の約よ０倍で
あった。

ここで得られたフマラーゼを蛋白換算約！ＩＩｇ／ｌの
濃度で７Ｍフマール酸ナトリウムとぶ０℃、ｐＨ７，２
で２０時間接触させたところ約ｒＯ％の転換率でＬ−リ
ンゴ酸が得られる。

実施列２ バチルス・プミルスＴ−４ＪＯ菌を実施例１と同徐にし
て１ｌＬｓ”ｃ、−≠時間培養する。得られる菌体を実
施例ｒと同様に処理してフマラーゼ粉末を得る。得られ
たフマラーゼの蛋白当シの比活性はセルフリー抽出液の
約ｔｏ倍でめった。

ここで得られたフマラーゼを蛋白換算／　０１９／ｌの
濃度で／Ｍフマール酸ナトリウムと４Ｌ３℃、ｐ’Ｈ７
よで２０時間接触させたところ約７ｔ％の転換率でＬ−
リンゴ酸が得られる。

実施例／　０゜ サーマス・アクアティクスＡｉｏｐ菌を％施例１の培地
にフマール酸アンモニウム２２／ｌ添加した培地中、７
０℃で３ｚ時間培養したところ２００　ｕｎｉｔ／ｒ　
ｄｒｙ　ｃｅ’ｌｌのフマラーゼ活性を有する菌体が得
られた。

菌体分離後、菌体を十分洗浄して凍結乾燥品とした。本
゛品を！Ｏｆ／ｌの濃度で超音波処理し粗＃紫液を調製
した。これを陰イオン交換樹脂である吸着担体く接触さ
せ固定化酵素を作成した。まずデュオライ）Ａ−７（米
国、ダイヤモンドジャムロックケミカル社製）をレジン
水で十分に洗浄してから０．　／　Ｍリン酸緩衝液（ｐ
ａ＋、Ｏ）で緩衝化する。これに上記で調製した粗扉累
液を７マラーゼ活性値としてｉｏｏ〜２００ｕｎｉｔ／
ｒｄ樹脂の割合でぶ！〜７ｊ’Ｃで負荷し、／Ａ時間吸
着固定化させる。蛋白吸着量はりＯａ）以上であった。

その後７マラーゼの安定化剤としてｌり／ノのフマール
酸ナトリウム、架橋剤としてλり／ｌのゲルタールアル
デヒドを０．　／　％リン酸緩衝液に溶かしたものを３
０分間反応させ十分洗浄して標品を得た。

この固定化＃累を５０１容量の：−ン型流動層に３０ゴ
充填し、１モルフマール酸マグネシウムを連続的に通液
したところｓ　ｖ　＝　ｏ、　ａ、７．０ＣでｒＪｒ％
以上の転換率で安定してＬ−リンゴ酸マグネシウムが得
られた。反応液は完全清澄液であり酵素の洩れもなく、
また高温操作の為、雑菌汚染もなく効率よいし一リンゴ
酸の生産が可能であった。

実施例／を 笑施例コで得られたサーマス・ルベ〃、　７７’コピー
の凍結乾燥物に１モルフマール酸アンモニウムをｔｏ℃
、３時間作用でせたところ本凍結乾燥物にはアスパルタ
ーゼ活性がほとんどな（、Ｌ−リンゴ酸アンモニウムが
ｒ４ｔ％の転換率で得られた。

【図面の簡単な説明】

Ｍ１図〜第φ図は、サーマス属菌によシ生産される本酵
素の至適ｐＨ，安定ｐＨ範囲、作用適温の範囲および温
度安定性をそれぞれ示す。 第ｊ図〜第を図は、バチルス月菌により生産される本酵
素の至適ｐＨ１安定ｐＨ範囲、作用適温の範囲および温
度安定性をそれぞれ示す。 尤　１１ Ｐｌ＋ 第２図 Ｓ　　　　６’７　　　１３　　　　’Ｉｌ−１ 第　３１コ ５ｇＪＪｖＦ、（で） ′ｆＪ　＋　図 ケＯＧＯ’７０１３０ ｆＡｊＬノｎ（’Ｃ） 扇　１ Ｈ ｊｌ”ｉ　　Ｇ　口 ピ１−１ 貼　７　図 りも　　ざ　図 ５７’７ａ７亘　（゛Ｃ〕

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 新菌種　サーマス・ラクテウス。