JPS63165758A

JPS63165758A - 分析試薬

Info

Publication number: JPS63165758A
Application number: JP30904986A
Authority: JP
Inventors: Masako Hado; 羽藤　正子; Tetsuya Katayama; 潟山　哲哉; Yoshio Ishimori; 石森　義雄
Original assignee: Toshiba Corp
Current assignee: Toshiba Corp
Priority date: 1986-12-27
Filing date: 1986-12-27
Publication date: 1988-07-09

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔発明の目的〕（産業上の利用分野）本発明は、試料液中に存在する物質を分析するための分
析試薬に属し、特に抗原または抗体などのたんばく質を
定量分析するための分析試薬に関する。

（従来の技術）従来より抗原あるいは抗体を高感度でかつ特異的に分析
する方法として種々の免疫分析法が開発されている。そ
の代表例がラジオイムノアッセイ（ＲＩ　Ａと略す）で
あり、また酵素免疫分析法（ＥＩＡと略す）である、こ
れらの方法はともに、抗原抗体反応を利用したもので、
抗原抗体反応自体が特異性の高い反応であるためこれら
の分析法は選択性が極めて高い、このためこれらの分析
法は血中の微量なタンパク質の同定や定量、病原体の有
無の判定など広範の分野で使われている。しかしながら
、ＲＩＡにおいては、放射性の物質を用いるために取り
扱いが煩雑でかつ放射能汚染の危険性が高いなどの問題
があった。また、酵素免疫分析法においては、酵素反応
によって感度を縛輻している為に、所要分析時間が長い
、操作が煩雑であるなどの問題点があった。

そこで、これらの免疫分析試薬に対して１本発明者らは
既に、マイクロカプセルを利用した免疫分析試薬を開発
してきた８例えば、本発明者らは、特開昭６０−１１７
１５９において１表面に親水性の抗体又は、抗原を固定
化し、内部に親水性の標識物質を封入した免疫分析用の
リポソームを開示した。

この試薬を用いた免疫分析方法は以下のようなものであ
る。

すなわち、抗原又は抗体が存在する試料中に前記リポソ
ーム試薬を加え、これと別に補体を加えると、抗原−抗
体反応及びそれに伴なう補体の作用によってリポソーム
が破壊され、封入されていたＩ！１ｉｌｌｔ物質（例え
ば蛍光性化合物）が流出する。この流出した標識物質の
量と、試料中の被検物質の量との間には相関関係がある
ので、流出した標識物質を所定の分析方法（例えば蛍光
分析）によって定量することにより、被検物質を定量す
ることができるのである。しかし、このリポソーム試薬
を用いて実際に血清やタンパク貿含有試薬の分析を行な
う場合、封入されたＳ識物質が保存液中や分析試薬液中
に除々に流出してしまいＳ／Ｎ比が悪くなり、さらに測
定の精度が悪くなるという問題がでてきた。この封入さ
れた物質が流出してしまうという問題点は、特開昭６０
−１１７１５９号で開示したリポソームだけでなく、脂
質を主な構成成分とする多重層及び単層のリポソーム及
びマイクロカプセルや、薬物、酵素などを封入物質とし
たマイクロカプセルを使用する際にも生ずる。

（発明が解決しようとする問題点）本発明は上記問題点を解決するためになされたものであ
り、Ｓ／Ｎ比が良く、かつ精度よく分析が行なえる分析
試薬を提供とすることを目的とする。

〔発明の構成〕

（問題点を解決するための手段と作用）本発明の分析試
薬は、マイクロカプセルに封入されている封入部材の浸
透圧が、このマイクロカプセルを分散している溶液の浸
透圧の０．６倍以上１．４倍以下であることを特徴とし
ている。

本発明におけるマイクロカプセルとは、半透膜的な性質
を有する少なくとも一層以上の膜で構成されている多１
重層又は単層の小胞体であれば何でもよく、例えばリン
脂質及び士又は糖脂質とコレステロールから構成される
リポソームや赤血球等が挙げられる。

また封入部材は何でもよく、格別に限定されるものでは
ないが親水性の物質であることが好ましい０例えば吸光
物質、蛍光物質、酵素、基質等が挙げられる。

そして、マイクロカプセルを分散している溶液の浸透圧
に対して封入部材の浸透圧は特に０．７倍以上１．３倍
以下であることが好ましい、この浸透圧の調整としては
、　Ｎａ◆、Ｋ”、Ｍｇ”、Ｃａ”、ＣＱ’″などのイ
オンを適量添加又は除去すればよい、一般的にマイクロ
カプセルを分散している溶液の浸透圧は２８０ｍＯｓ■
ｏ１１前後なのでマイクロカプセル封入部材の浸透圧は
、１９６〜３６４＋ｍＯｓｍｏｆｆｉ　テ好ましくは、
２００〜３００ｍＯｓ＋＊ｏｆｆｉである。尚、この浸
透圧の値は以下に述べる氷点降下法により決定している
。

氷点降下法とは次のような原理に基づいている。

すなわち溶液の浸透圧はモル濃度に比例し１モル濃度は
氷点降下度に比例するので、浸透圧と氷点降下度は比例
関数にある。浸透圧は０５Ｍ０Ｌの単位で１０８Ｍ０Ｌ
の浸透圧をもつ溶液の氷点降下度は−１，８５８℃とな
る為、ある溶液の氷点を精確に測定することによって、
その溶液の浸透圧が得られるのである。

さらに本発明におけるマイクロカプセルは、主に、抗原
または抗体のような蛋白質を定性又は定量分析するよう
な分析試薬であり１分析の為に。

マイクロカプセルに、抗原または抗体もしくは、抗体の
一部を固定化することも可能である。

本発明の分析試薬の具体的な一例を以下に簡単に示す、
リン脂質とコレステロールで２００ｍＯｓ■ＯＱの浸透
圧を有する蛍光物質が封入され抗体が表面に固定化され
た免疫分析用のリポソームを調製する。このリポソーム
を用いて２８０ｍＯｓｍｏ１２の浸透圧を有する溶液中
の抗原を定量したところＳ／Ｎ比が良好で精度のよい結
果が得られた。すなわち本発明の分析試薬によれば、封
入部材の浸透圧を、分散している溶液の浸透圧の０．６
倍以上１．４倍以下にａｍすることによって％Ｓ／Ｎ比
を５倍以上良好にすることができ、精度良く、測定でき
る分析試薬を供給することができるのである。

（実施例）以下実施例により、本発明の詳細な説明するがこれらの
実施例は、本発明の範囲を何ら制限するものではない。

実施例１ ■　試薬ジパルミトイルフォスファチジルコリン（Ｄ　Ｐ　Ｐ　
Ｃ）とコレステロール（Ｃｈｏｎ）はシグマ社製のもの
を用いた。カルボキシフルオレセイン（ＣＦ）は、イー
ストマン、コダック社製のものを用いた。

他の試薬は市販品（特級）を精製せずに使用した。

なお、水は全でイオン交換水を用いた。

■　リポソームのｆＨ製使用した脂質は全てクロロホルム又はクロロホルム／メ
タノール（２／１）混合溶媒に溶解した。

５ｍＭのＤＰＰＣ２００１１，１０ｍＭのコレステロー
ル１００μａを１０ＩＩｌｉ＋容量のナシ型フラスコに
入れ、更にクロロホルム２鳳ｉを加えてよく混合した１
次に。

約４０℃の水浴中でロータリーエバポレータにより溶媒
を除去した。再びクロロホルム２ｍＱを加えて十分に撹
拌した後、再度ロータリーエバポレータにより溶媒を除
去した。この操作を数回繰り返すと、フラスコ壁面に脂
質薄膜が形成された。つづいて、フラスコをデシケータ
中に移して真空ポンプで１時間吸引し、溶媒を完全に除
去した。このようなフラスコを４個作成した０次いで■
　０．１ＭＣＦ、ＰＨ７，４，浸透圧　６００ｍＯｓｍ
ｏｕ■　０．１ＭＣＦ、ＰＨ７，４，浸透圧２００ｍＯ
ｓｍｏＱ■　０．２Ｍ　、ＣＦ、ＰＨ７，４，浸透圧Ｌ
ＯＯＯｍＯ３ｒａｏＱ■　０．０２Ｍ　、ＣＦ、ＰＨ７
，４，浸透圧１ｏｏＩＩＯ８ｌＩ０２をそれぞれ各フラ
スコに１００μ２ずつ添加し、フラスコ内部を窒素で置
換した後、密栓して約６０’Ｃの水浴中に約１分間浸漬
した。つづいて、Ｖｏｒｔｅｘミキサーを用い、フラス
コ壁面の脂質薄膜が完全に消失するまでフラスコを激し
く振とうした。この操作によりリポソーム懸濁液が調製
された。更にリポソーム懸濁液に０．ＯＩＭのＨＥＰＥ
Ｓ緩衝液（０，８５％Ｎａ（Ｊ含有、ＰＨ７，４５浸透
圧２７５ｍＯｓｍｏｊｌ　：以下、ＨＰＳと記す）を少
量添加した後、全て遠心チューブに移し、４℃において
１５０００ｒｐｍで２０分間遠心する操作を数回繰り返
した。最後に１ｒｒｌのＨＢＳに懸濁させた。

（Ｊ）　　Ｓ／Ｎ比の比較調製した■〜■のリポソームのバックグランドを測定し
た。（励起波長４９０ｎｍ、蛍光波長５２０ｎｍ＊：日
立蛍光光度計）そしてさらに、脱イオン水を添加してリ
ポソームを完全に崩壊した。この時、流出したＣＦ強度
（１００％流出量）をパックグランド測定と同様の波長
で測定した。

■〜■のリポソームの測定値は以下の第１表のようにな
った。

第１表ここでダイナミックレンジとは、リポソームの１００％
流出量からバックグランドを引いた値である。

第１表からも明らかなように封入部材であるＣＦの浸透
圧が２００ｍＯｇｍｏｆｆｉである■のリポソームが、
Ｓ／Ｎ比が最もよい、さらに■、■を比較してみてもわ
かるように分散しているＨＥＰＥＳ緩衝液の浸透圧（２
７５ｍＯｓｍｏｆｆｉ）に近いほどＳ／Ｎ比が良好であ
る。

よって１本発明に係る■のリポソームが分析用のリポソ
ームとしては、適当であることが判った。

実施例２ヒトＡＦＰ量測定におけるダイナミックレンジ、精度の
比較 ■　試薬本実施例において用いた試薬のうち、ジパルミトイルホ
スファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジパルミ
トイルホスファチジルコン（ＤＰＰＣ）、コレステロー
ル及びジチオトレイトール（Ｄ　Ｔ　Ｔ）はシグマ社製
のものを用いた。また、Ｎ−サクシンイミジル３−（２
−ピリジルジチオ）プロピオネート（Ｓ　Ｐ　Ｄ　Ｐ）
及びセファデックスＧ−２５フアインはファルマシア社
製のものを用いた。

他の試薬は市販品（特級ンを精製せずに使用した。

なお、水は全てイオン交換水を用いた。

■　官能性リン脂質：　ＤＰＰＥ−ジチオピリジルプロ
ピオン酸アミド（ＤＰＰＥ−ＤＴＰ）の１１ｍ密栓付三
角フラスコにＤＰＰＥ７０■を分取し。

クロロホルム／メタノール（５：　１）混合溶媒２５＋
＋＋１に溶解した０次に、トリエタノールアミン６０μ
２及び５ＰＤＰ５０■を添加し、窒！置換した後、室温
で１時間反応させてジチオピリジルプロピオン酸アミド
（Ｄ　Ｔ　Ｐ）を導入した。つづいて、ロータリーエバ
ポレータにより溶媒を除去した０次いで。

乾燥物をクロロホルム／メタノール（１０：ｌ）混合溶
媒に溶解した後、シリカゲルカラムを用いて精製し、Ｄ
ＰＰＥ−ＤＴＰの分画を回収した。更に。

ロータリーエバポレータにより約５ｍ１２まで濃縮した
。ＤＰＰＥ−ＤＴＰの収率は８０〜９５％であった。こ
れを窒素封入下−２０℃で保存した。

この反応によりＤＰＰＨに導入されたジチオピリジル基
が固定化用官能基となる。

■　リポソームの調製使用した脂質は全てクロロホルム又はクロロホルム／メ
タノール（２／ｌ）混合溶媒に溶解した。

５　ｍ　ＭのＤＰＰＣ２０Ｑｔｔ（１，１０ｍＭのコレ
ステロール１００Ｎ！及び１ｍＭのＤＰＰＥ−ＤＴＰ　
（■で得られた官能性リン脂質）５０μｉを１０＋ａｆ
ｆｉ容量のナシ型フラスコに入れ、更にクロロホルム２
ｍＱを加えてよく混合した１次に、約４０’Ｃの水浴中
でロータリーエバポレータにより溶媒を除去した。再び
クロロホルム２ｍｌを加えて十分に撹拌した後、再度ロ
ータリーエバポレータにより溶媒を除去した。

この操作を数回繰り返すと、フラスコ壁面に脂質薄膜が
形成された。つづいて、フラスコをデシケータ中に移し
て真空ポンプで約１時間吸引し、溶媒を完全に除去した
。このフラスコを２個調製した。

次いで、００．２Ｍのカルボキシフルオレセイン（イー
ストマン・コダック社製、ＰＨ７，４：以下、ＣＦと記
す）浸透圧１０４０ｍＯｓｍ１０４Ｏ１００μ（ｌと、
００．１ＭのＣＦ浸透圧２０８ｍＯｓｍｏｇ　１００　
μ（１とを各々、フラスコに添加し、フラスコ内部を窒
素で置換した後、密栓して約６０℃の水浴中に約１時間
浸漬した。つづいて＊　Ｖｏｒｔａスミキサ−を用い、
フラスコ壁面の脂質薄膜が完全に消失するまでフラスコ
を激しく振とうした。この操作によりリポソーム懸濁液
が調製された。更にリポソーム懸濁液に０．０１ＭのＨ
ＥＰＥＳ緩衝液（０，８５％ＮａＣｇ含有、　ＰＨ７，
４５、浸透圧２７５＠Ｏｓｍｏｆｆｉ：以下、ＨＰＳと
記す）を少量添加した後、全て遠心チューブに移し、４
℃において１５０００ｒｐ−で２０分間遠心する操作を
数回繰り返した。

最後にｌ１１ｆｆｉのＨＰＳに懸濁させた。

■　抗ヒトＡＦＰ抗体の修飾１ｚ／ｄの抗ヒトＡＦＰ抗体２ｄをＨＰＳで希釈り、１
０ｍＭ（７）ＳＰＤＰｚタノール溶液ｔｏμｇを添加し
て窒素置換した後、室温で３０分間反応させ、抗ヒトＡ
ＦＰ抗体にジチオピリジル基を導入した。

次に、予め０．１Ｍ酢酸緩衝液（０，８５％ＮａＣ（！
含有、ＰＨ４，５）で平衡化したセファデックスＧ−２
５フアインカラム（ゲル体積約１５ｄ）を用いたゲルろ
過により未反応の５ＰＤＰを除去して精製し、タンパク
貿分画のみを回収した。

次いで、この分画にＤＴＴ約２０■を加え、窒素置換後
、室温で２０分間反応させ、ジチオピリジル基をＳＨ基
と置換して修飾した。つづいて、ＨＰＳで平衡化したセ
ファデックスＧ−２５フアインカラムを用いたゲルろ過
により未反応のＤＴＴを除去して精製し、タンパク質分
画のみを回収した。

■　抗ヒトＡＦＰ抗体固体化リポソームの調製■で得ら
れた２種のリポソーム懸濁液１ｄを４℃ニオいて１５０
００ｒｐｍで２０分間遠心したリポソーム沈査と、■で
得られた０、１ｇタンパク５ｊ／ｄの修飾された抗ヒト
ＡＦＰ抗体溶液２ＩＩＱとを混合し、窒素置換した後、
密栓して２０℃でゆっくり振とうしなから１＠反応させ
た。次に、ＨＰＳで洗浄して未反応の抗体を除去した。

このようにして封入されている浸透圧の異なる２種のリ
ポソーム分析試薬を得た。

■　２種の抗ヒトＡＦＰ抗体固定化リポソーム試薬によ
るヒトＡＦＰ濃度の検量線作成遊離のウサギ抗ヒトＡＦ
Ｐ抗体を用いたサンドイッチアッセイにより以下のよう
にしてヒトＡＦＰｆｉ度を定量し、検量線を作成した。

０、Ｏ１〜１１０００ｎ／　ｄの範囲で濃度を変化させ
たヒトＡＦＰＷ４液２５ｔｔＱニ、予めＧＶＢ”（ＧＶ
Ｂ−に０．５＋＋＋ＭのＭｇＣｌ２．水溶液及び０．１
５ｍＭのＣａＣ４２水溶液を添加したもの）で３０倍に
希釈したリポソーム試薬５μｉを添加し、３７℃におい
て１０分間反応させた０次に、予めＧ　Ｖ　Ｂ　＋２０
０倍に希釈したウサギ抗ヒトＡＦＰ抗体（Ｄ　ｓｋｏ社
製）２５μｆｆｉを添加し、３７℃において５分間反応
させた。つづいて、補体（５ＣＨ，。）２５μｌを添加
し、３７℃において３０分間反応させた０次いで、　０
．０１ＭのＥＤＴＡ−ベロナール緩衝液１００μｉで反
応を停止させ、各濃度のヒトＡＦＰ溶液について、流出
したＣＦ量をＭＴＰ−３２蛍光分光器（コロナ電気製）
により、励起波長４９０ｎｉｉ、蛍光波長５２０ｎ−の
条件で測定した。

相対蛍光強度＝」と」虹×１００Ｆａ　−Ｆ。

ここで、Ｆｅ：実測した蛍光強度、Ｆｏ：抗原を除した
時（リポソームが全く破壊されていない時）の蛍光強度
、Ｆａ：脱イオン水を添加しリポソームを全て破壊した
時の蛍光強度、である。

このようにしてヒトＡＦＰ濃度と相対蛍光強度との関係
を示す２種のリポソームの応答曲線を得たところ第１図
のようになった。第１図から明らかなように、■０．２
ＭＣＦ浸透圧１０４０ｍＯｓ１０４ＯよりＣ０、ＩＭの
ＣＦ浸透圧２０８ｍＯｓ＋ｗ。ａを封入した方のリポソ
ームがダイナミックレンジが広い、また。

１０■／−のＡＦＰ量を００２種のリポソームで２０回
測定したところ標準偏差が■８．２％■２．２％と■の
方が良いことが確認された。

〔発明の効果〕本発明によれば、封入部材の浸透圧を分散した溶液の浸
透圧の０．６倍以上１．４以下とすることによりＳ／Ｎ
比良く、かつ精度よく測定できる分析試薬を得ることが
できる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、実施例２におけるヒトＡＦＰ濃度を代理人　
弁理士　則　近　憲　佑同　　　　竹　花　喜久男ヒトＡＦＰ　＞）ｌ、＆　（ｆｌ−１／、ｒｆＬＬ）第
　　１　　図

Claims

【特許請求の範囲】

（１）封入部材を有して溶液中に分散したマイクロカプ
セルよりなる分析試薬において、前記封入部材の浸透圧
が前記溶液の浸透圧の０．６倍以上１．４位以下である
ことを特徴とする分析試薬。
（２）前記マイクロカプセルがリン脂質及び／又は糖脂
質とコレステロールとから構成されるリポソームである
ことを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の分析試薬
。
（３）前記封入部材の浸透圧が８０〜４８０ｍ０ｓｍｏ
ｌであることを特徴とした特許請求の範囲第１項記載の
分析試薬。
（４）前記封入部材が吸光物質、蛍光物質、酵素、基質
であることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の分
析試薬。
（５）前記マイクロカプセルが、抗原または抗体を分析
する為の試薬であることを特徴とする特許請求の範囲第
１項記載の分析試薬。