JPS62836A - 沈降による分散液中の微粒子の分類方法および装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は異なった密度の、たとえば白血球、赤血球、抗
原抗体複合体などの微粒子 （ｐａｒｔｌｃｕｌａｔｅ　ｍａｔｅｒｉａｌ＞の少な
くとも２つの分画をうるために沈降し、そうしてえられ
た分画の少なくとも１つを回収することによる分散液中
の微粒子の分類に関する。

沈降は遠心力による重力によってひきおこされて、本発
明により分類される分散液は懸濁液または乳濁液であっ
てよい。

本発明は診断、分析および予備処理のような種々の目的
に応用することができ、典型的な応用例としては天然に
採取した血液からの白血球の分離、回収した白血球分画
のＢ細胞およびＴ細胞中への分離、混合反応混合物中に
イン　ビトロで生じた抗原抗体複合体の他の微粒子から
の分離、リポ蛋白質の分類、骨髄細胞の分類などがある
。

［従来の技術および発明が解決しようとする問題点］ ある種の遠心分離技術においては、遠心中に生じる高い
圧力に耐えられるように設計された試験管状の容器が一
般に用いられる。そのような容器においては、遠心分離
の結果によって生じる層間の境界は不安定な構造である
ので、分画のパックミキシング（ｂａｃｋ　ｍｉｘｉｎ
ｇ）をさけるために特別の注意がはられれねばならない
。前記不安定さはさらに分画を分離するばあいに問題と
なり、従って必然的にこのような分離は慎重でゆっくり
とした動作とならざるをえない。本発明の目的は、従来
技術の前記欠点が解消された、分散液中の微粒子の分類
の改善された方法および手段を提供することである。

第６図に示されている遠心分離による従来方法は、赤血
球と白血球を互いに分離し白血球を回収する血液の分類
に関するものである。

第６図に示されているように遠心分離管（１）には多糖
類の溶液（２）が密度調整のために充填され、血液部（
３）がその後多糖類の溶液（２）の上に充填される。充
填中は、血液（３）と多糖類の溶液（２）が分離動率に
影響する不適当な混合をしないで層をなしたままの状態
となるように注意を払わなければならない。遠心分離に
より、容器（１）内の物質は赤血球のクロッ）　（ｃｌ
ｏｔ）の下層（４）、多糖類の溶液からなる中間層（５
）および中間層の界面近くに浮遊する白血球（刀の集塊
を有する血漿（６）から主としてなる上層に分離される
。白血球（７）を回収するには、前記上層を非常に注意
深くピペット（８）によって吸引し他の容器（９）に移
さなければならない。そのばあい吸引操作は赤血球の下
層（４）とのパックミキシングをさけるために非常に注
意深く行なわなければならない。このため上層の血漿（
６）と白血球（７′）の分離は時間のかかる操作であり
、また完全には実行することができない。

［発明が解決しようとする問題点］ 本発明は分散液中の微粒子の沈降による分類方法に関す
るものであって、以下のような特徴がある。すなわち、 （１）少なくとも一つの開口部を経て連通している少な
くとも２つの一列に隣接して並んだ区画室（ｃｏｍｐａ
ｒｔｍｅｎｔ）からなり、シールせられた底部を有する
第１の端の区画室と上端が開放せられた第２の端の区画
、室を備えた器を使用する。

（２）前記容器の中に前記分散液を充填する。

（３）そうして充填した容器を沈降操作に供する。

（４）分・散した微粒子をその中に含む液体分画を前　
　　−記第２の端の区画室からデカントする。

前記開口部は１つまたは多数の孔からなり、その直径は
クリティカル（ｃｒｉｔｉｃａｌ）でなく、孔の長さお
よび分類されるべき微粒子の性質に依存する。開口部の
直径は１０Ｉ１１を超えないのが好ましく、とくに５鰭
以下であるのが好ましい。

また開口部はたとえば毛細管のように、かなり狭いもの
であってもよい。第２の区画室から液体分画を移動させ
るに際し、パックミキシングをひき起こすことなく容器
全体をさかさにすることができる。

本発明による方法は、重力沈降により行なってもよいし
また遠心力沈降により行なってもよい。

本発明の方法においては、所望により遠心分離に先だっ
て、たとえば予め選定された密度の作動液もしくは溶質
の付加によってそれ自体公知の密度調整を行なってもよ
い。作動液を使用するばあい、作動液は分類されるべき
微粒子゛の分画の中間の密度を有する単一密度のもので
あってもよく、またそれ自体知られているような密度勾
配を有するものであってもよい。

２つの微粒子の部分のみに互いに分離され、軽い方の部
分のみが回収されるばあい、たとえばより軽い部分であ
る白血球のみが回収されるような血液診断の多くのばあ
いには、容器は２つの区画室のみからなる使い捨てユニ
ットとして作製し、上方の分画の回収ののちに捨てるよ
うにしてもよい。

他方、分散微粒子を異なった密度の２種または３種以上
の分画に分別し、それぞれを別々に回収する必要がある
ばあいには、容器は遠心分離に際し各々の区画室の成分
が別々に回収されるよう設計される。容器が２つの区画
室のみからなるときには、第１の区画室の底の部分は取
りはずし可能にしてもよく、遠心分離の完了後筒２の区
画室の成分はデカントすることによって回収され、第一
の区画室の成分は底の部分を取り外して流し出すことに
よって回収される。

分散された微粒子が３つ以上の部分に分類され、したが
って容器がそれに応じて３つ以上の区画室からなるばあ
い、容器はそれぞれが１つの区画室に対応する２つもし
くは３つ以上の構成部分からなる分解可能なユニットで
あってもよい。そして遠心分離操作の完了後、容器器は
分解され、それぞれの区画室の成分が別々に回収される
。

本発明はさらに前述の方法を行う円筒状の沈降器からな
り、該沈降器は少なくとも１つの開口部を経て連通ずる
一列に隣接した少なくとも２つの区画室からなり、シー
ルせられた底部を有する第１の端の区画室と開口端を有
する第２の端の区画室とを有する。

前記開口部の直径は１０ｍｍを超えないのが好ましく、
とくに前述したごと＜５ｍｍを超えないのが好ましい。

本発明の容器の一実施例では、該容器は２つの区画室を
有する使い捨てのユニットである。

本発明の容器の他の実施例によれば、第１の端の区画室
の底は取りはずし可能な底部材によってシールされてい
る。

本発明の容器のさらに他の実施例によれば、容器は分解
可能であり、それぞれから組立てられた容器の１つの区
画室に相当する円筒状の構成部分（ユニット）からなる
。そして２つの隣接する構成部分が一の構成部分の下方
に突きでた突起部が他の構成部分の開口端に嵌合するこ
とによりぴったりと内部でかみあっている。

本発明の容器における隣接する２つのユニットを互いに
連通ずる開口部は、それによって２つの隣接する区画室
が互いに分離せられる有孔隔壁により提供することもで
きる。そのばあい隔壁として多孔性物質を使用すること
も可能である。

以下の記載において、本発明は遠心分離によって沈降が
ひきおこされるばあいについて説明しているが、本発明
はそれに限定されるものではなく重力沈降を用いること
もできる。

［実施例コ つぎに図面に基づき本発明の方法および装置を説明する
。

第１図は本発明の遠心分離法の概略説明図、第２〜５図
は本発明の容器の各種実施例を示す図である。

第１図に概略示されている本発明の遠心分離法は、多糖
類の溶液による密度調整を行なって血液を白血球と赤血
球に分類することに関するものである。図から明らかな
ように管状の容器Ｍは第１図下方にある第１の区画室（
ＩＩ）と第１図上方にある第２の区画室（１２１とから
なり、これらの区画室は、中央に毛細管状の小孔ａ中を
有し両面が凹状のブロック日の形をした隔壁ｎによって
互いに分離されている。そして該管状の容器□□□には
多糖類の溶液にかその液面が毛細管状の小孔０４）の上
端に達するまで充填されている。その後容器□□□はそ
の第２の区画室０２）内に血液Ｏｅが充填される。この
血液の充填操作中においては、小孔０４）を有する隔壁
■が多糖類の溶液四と血液Ｏｅの混合を防止するので、
とくに注意を払う必要はない。遠心分離によって管状の
容器（１０）の内部の物質は赤血球の坑口からなる最下
層と、その上に多糖類の溶液の小部分の層ａＦ３と、そ
の上に多糖類の溶液の大部分の層（至）と、さらにその
上の血漿の層■とに分離され、この血漿の層■の前記大
部分の層（至）に近い部分には白血球（２１）の集塊が
浮遊している。白血球（２１）を回収するために、第２
の区画室０２）中の全成分が第１図右側に示されている
ようにデカントすることによって他の器の中に注がれる
。このデカントするあいだ、小孔ａ４）のおかげで赤血
球の塊０７）が第１の区画室０１）から漏れることはな
く、それにより赤血球と白血球のパックミキシングを防
ぐことができる。

この特別の操作においては赤血球は必要ではなくその結
果、容器（至）は第２の区画室０′２Ｊ中の成分が前述
のように他の容器ｎ中に注がれたのちに廃棄されるよう
使い捨てとなっている。

第１図の遠心分離方法に使用される本発明の沈降用の容
器００）がさらに第２°図にも示されている。第２図に
おいて第１図と同一符号は同一のものを示す。容器（Ｋ
））は第２図下方にある第１の区画室０１）と第２図上
方にある第２の区画室０りとからなり、これらの区画室
は中央に毛細管状の小孔ａ中を有する両面が凹状のブロ
ック■によって互いに分離されている。小孔０Φの長さ
はクリティカルではないが、その直径は５關を超えない
のが好ましい。両面が凹状のブロック０３のおかげで、
第１の区画室０１）中にエアーポケットが形成されるこ
とはなく、また第２の区画室０′２Ｊの小孔ｆ′１４）
付近の部分が逆鉤鐘状となっているので遠心分離中に小
孔（１４）を経てより濃密な物質が完全に排出される。

第３図に示されている本発明の容器の実施例は繰り返し
使用できるよう設計されており、上部の分画と下部の分
画とを別々に回収することが可能となる。図に示される
ごとく容器のは本質的には第２図のものと同じ設計であ
る。容器のは下方の第１の区画室Ｑ４と上方の第２の区
画室（至）からなり、これらは中心に小孔のを有する両
面が凹状の隔壁（至）によってたがいに分離されている
。

第１の区画室Ｑ４はその一部が管状の容器力の本体に対
し取り外し可能な底部材のによって形成されており、前
記本体はその下端に下方に突き出て形成された突起部国
が前記底部材■の上端に円状に形成された凹所（至）に
嵌合することにより底部材■とぴったりと一体に組みた
てられるようになっている。。第３図の実施例は２つの
沈降分画を回収する必要があるばあいに使用される。そ
して遠心分離後、第２の区画室Ｇの成分は第１図に示さ
れるごとくデカントすることによって回収され、その後
底部材■を取り外し、第一の区画室Ｑ４の成分を徐々に
流出せしめる。

第４図の実施例もまた繰り返し使用ができるように設計
されており、そのものは、各々が容器の１つの区画に相
当する２つの構成部分からなっている。図に示されてい
るように容器（３１）は第４図下方にある下部ユニット
（３２）と第４図上方にある上部ユニット（３３）から
なる。下部ユニット（３２）には上方に開いた開口端部
（３４）が形成され、一方、上部ユニット（３３）には
下方につきでた突起部（３５）が形成されている。この
突起部（３５）は中心部に小孔（３６）が設けられてお
り、下部ユニットの開口端部（３４）に密着して嵌合す
る。突起部（３５）はまた下部ユニット（３２）と上部
ユニット（３３）とを互いに分ける隔壁を構成しており
、第３図の実施例と同様にそれは両面が凹状である。

第４図の実施例もまた２種類の分画を回収する必要があ
るばあいに使用される。従って遠心分離の後、上部ユニ
ット（３３）中の成分が第１図に示されるごとくデカン
トすることによって除かれる。この除去が完−全に行な
われた後、上部ユニット（３３）が取り除かれ、それに
よって下部ユニット（３２）中に集められた分画は容易
に回収される。

第５図に示されている遠心分離用の容器（３７）は３つ
の構成ユニット（３８）、（３９）、（４０）からなっ
ている。最下部のユニット（３８）は第４図に示されて
いる下部ユニット（３２）と同様の設計であり、それに
は上方に開口した開口端部（４１）が設けられている。

中間にある中間ユニット（３９）には第４図の突起部（
３５）と同様に中心部に小孔（４３）を有する、両面が
凹状の下方に突起した突起部（４２）が設けられている
。中間ユニット（３９）にはさらに上方に開口した開口
端部（４４）が設けられている。上方にある上部ユニッ
ト（４０）には中心部に小孔（４Ｂ）を有する、両面が
凹状の下方に突起した突起部（４５）が設けられている
。組み立てられた状態では、中間ユニット（８９）の突
起部（４２）は下部ユニット（３８）の開口端部（４１
）内に嵌合されている。そして同様に上部ユニット（４
０）の下方に突起した突起部（４５）は中間ユニット（
３９）の開口端部（４４）内に密着して嵌合されている
。

第５図の実施例は３種類の分画を別々に回収するために
使用される。すなわち、上部ユニット（４０）中の分画
をデカントす゛ることによって回収した後に上部ユニッ
ト（４０）が取り外され、中間ユニット（３９）中に集
められた中間の分画が再びデカントすることによって分
離され、その後中間ユニット（３９）が再び下部ユニッ
ト（３８）がら取り外される。それにより下部ユニット
（３Ｂ）中の分画が回収されやすくなる。

つぎに実施例にもとづき本発明の詳細な説明するが、本
発明はもとよりかかる実施例に限定されるものでない。

実施例１ 血液からの単核性細胞の分離 アメリカ合衆国、ミズーリ州、セントルイス市のシグマ
・ケミカル拳カンパニー（ｓｉｇｕｍａＣｈｅｍｉｃａ
ｌ　Ｃｏ、）より登録商標Ｈ１ｓｔｏｐａｑｕｅとして
販売されている多糖類水溶液（ｄ　−１，０７７）の１
．３ｍ＋ｓを第２図の容器００）の第１の区画室０１）
中に注ぎ、その液のメニスカス表面が小孔０４）の上端
に位置するようにした。そして２．０ｍｌの血液を、多
糖類の溶液との混合を防ぐために必要な特別の注意を払
うことなく容器（至）の第２の区画室（１２）中に注い
だ。この特別の注意を不必要とす、るのは器（財）の特
殊な設計により前記混合を本質的に防ぐことができるか
らである。その後前記成分を含んだ管状の器（財）を７
５０　ｇ　（Ｉｇ　＝　９．８ｍ／５ｅｃ２）で２０分
間遠心分離機にかけた。遠心分離された後、第２区画室
０′２Ｊには３つの層が形成された。すなわち最上層が
血漿からなり、最下層が多糖類の溶液からなり、これら
のあいだの白色の境界層には単核性細胞が含まれていた
。

第一の区画室口）には多糖類溶液の層と底部に血液細胞
からなる層が形成された。パックミキシングは隔壁ｎお
よび小孔０４）により自動的に防止されるので、第２の
区画室Ｏｚ内の全成分を特別の注意を払うことなく他の
器に注いだ。リン酸バッファーを第２の区画室（１２１
から回収された単核性細胞懸濁液に加えたのち、該懸濁
液に必要な処理を施した。

実施例２ 改善された分離効率の実験 本発明による改善された分離効率の実験が次のように行
なわれた。すなわち５９個の血液のサンプルを、それぞ
れ第６図で示されるような従来の方法および第１図で示
されるとともに例１で述べたような本発明による方法を
使用して並列的に処理した。その結果束じた単核性細胞
の懸濁液のたんばく質成分をローリ−（Ｌｏｗｒｙ）の
方法によって分析した。この比較研究の結果を第１表に
まとめる。

［以下余白コ 第　　１　　表 （注１）収量とは１．０ｍｌの血液からえられる単核性
細胞懸濁液中のたんばく質の量（ｍｇ　）をいう（平均
値）。（注２）従来方法の効率を１．００としている。

［発明の効果］ 従来技術と比較した本発明の利点を以下のように簡潔に
要約することができる。

１）溶液により密度調整をするばあいの充填：従来方法
では密度調整溶液とサンプルとの最初の混合をさけるた
めに非常に注意深く充填を行なわなければならないのに
対し、本発明では前記最初の混合は本質的に防止される
ので、サンプリングのあいだ前記注意を払う必要がない
。

２）上部の分画の除去： 従来の遠心分離の方法におい゛ては上部の分画は吸引に
よる以外にはとり除くことができず、またパックミキシ
ングをさけるために特別の注意を払わなければならない
。−力木発明においては上部の分画がデカントすること
によって上方の区画室から回収され、必然的にパックミ
キシングが防止される。

３）沈降後の容器の取り扱い： 従来方法においては沈降後の容器の取扱いは制限されて
おり、行なうとしても非常に注意深く取扱う必要がある
のに対して本発明の容器の取り扱いにはとくに制限がな
い。

４）操作の同時性： 従来の方法では一人のオペレータが一度に一つの容器を
取り扱えるのみであり、その結果多数の容器の上部の分
画の回収は一つずつ順に行なわなければならない。一方
本発明によるばあいには、多数の容器を同時に取り扱う
ことができる。たとえばすべての上部の区画室中の成分
を同時に注ぎ出すためにそれらを棚に置き、その棚を反
転させることによって行うことができる。

５）効　率： 従来の方法によるばあいには、上部の区画室の分画の回
収量は吸引中のパックミキシングという危険のために本
来的に不充分である。一方本発明によるばあいには上部
の区画室中の分画はすべてパックミキシングの危険もな
く回収されるので分離効率は従来方法と比較して２０〜
２５％増加する。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明による遠心分離法の概略を示す図、第２
〜５図は本発明による管状の器の各種実施例を示す図、
第６図は従来の遠心分離法の概略説明図である。 （図面の主要符号） （１０）：容　器 旧）：第１の区画室 ０２）：第２の区画室 （１３：隔　壁 ａ４）：小　孔 旧：多糖類の溶液 特許出願人　　アッサフ・ファーマシューティカル・イ
ンダストリーズφリミ 才２図 才３図　　才４図 才５図

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １（ｉ）少なくとも１つの開口部を経て連通している少
   なくとも２つの一列に隣接して並んだ区画室からなり、
   シールせられた底部を有する第１の端の区画室と上端が
   開放せられた第２の端の区画室を備えた容器を使用し、 （ｉｉ）該容器の中に分散液を充填し、 （ｉｉｉ）そうして充填した容器を沈降操作に供し、（
   ｉｖ）分散した微粒子をその中に含む液体分画を前記第
   ２の端の区画室からデカントする ことを特徴とする沈降による分散液中の微粒子の分類方
   法。 ２　前記沈降が重力によってひきおこされる特許請求の
   範囲第１項記載の方法。 ３　前記沈降が遠心分離によってひきおこされる特許請
   求の範囲第１項記載の方法。 ４　前記分散液の充填に先だって、分類されるべき微粒
   子の分画の中間の密度を有する作動液が前記容器中に充
   填される特許請求の範囲第３項記載の方法。 ５　前記分散液の充填に先だって、密度勾配を有する作
   動液が前記容器中に充填される特許請求の範囲第３項記
   載の方法。 ６　２つの区画室のみを有する容器を使用し、沈降のの
   ち第２の端の区画室中の成分のみを回収し、その後該容
   器を廃棄する特許請求の範囲第１項、第２項、第３項、
   第４項または第５項記載の方法。 ７　前記第１の端の区画室中の成分を回収できるように
   なっている２つの区画室のみを有する前記容器を使用し
   、沈降ののちに各区画室の成分を回収する特許請求の範
   囲第１項、第２項、第３項、第４項または第５項記載の
   方法。 ８　２つもしくは３つ以上の区画室からなる分解可能な
   容器を使用し、沈降ののちに該容器を分解し、各区画室
   中の成分を回収する特許請求の範囲第１項、第２項、第
   ３項、第４項または第５項記載の方法。 ９　沈降による分散液中の微粒子の分類方法に使用し、
   その中に分散液を充填する容器であって、少なくとも一
   つの開口部を経て連通している少なくとも２つの一列に
   隣接して並んだ区画室からなり、シールせられた底部を
   有する第１の端の区画室と上端が開放せられた第２の端
   の区画室を備えた容器。 １０　２つの区画室を有する特許請求の範囲第９項記載
   の容器。 １１　取り外し可能な底部を有する特許請求の範囲第１
   ０項記載の容器。 １２　分解可能な円筒状の構成部分からなり、これらの
   構成部分のそれぞれが組立てられた容器の一つの区画室
   を形成し、一の構成部分の下方に突き出た突起部が他の
   構成部分の開口端内に密着して受け入れられることで２
   つの隣接する構成部分が内部でかみあう特許請求の範囲
   第９項記載の容器。 １３　隣接する区画室のあいだに１つの隔壁が形成され
   該隔壁に少なくとも１つの小孔が形成されてなる特許請
   求の範囲第９項、第１０項、第１１項または第１２項記
   載の容器。 １４　前記小孔の直径が１０ｍｍを超えない特許請求の
   範囲第９項、第１０項、第１１項、第１２項または第１
   ３項記載の容器。 １５　前記小孔の直径が５ｍｍを超えない特許請求の範
   囲第１４項記載の容器。 １６　前記小孔が毛細管状である特許請求の範囲第９項
   、第１０項、第１１項、第１２項または第１３項記載の
   容器。 １７　２つの区画室が多孔性物質によって分離される特
   許請求の範囲第９項、第１０項、第１１項、第１２項ま
   たは第１３項記載の容器。