JPS6244174A - 植物の組織培養方法 - Google Patents
植物の組織培養方法Info
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- JPS6244174A JPS6244174A JP60185438A JP18543885A JPS6244174A JP S6244174 A JPS6244174 A JP S6244174A JP 60185438 A JP60185438 A JP 60185438A JP 18543885 A JP18543885 A JP 18543885A JP S6244174 A JPS6244174 A JP S6244174A
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- Japan
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- plant
- callus
- medium
- hydroquinone
- arbutin
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
[産業上の利用分野]
本発明は植物のカルスまたは腫瘍組織を用いて効率良く
アルブチンを製造するための組織培養方法に関する。
アルブチンを製造するための組織培養方法に関する。
[従来の技術]
従来アルブチンの製造方法には合成法(ArtherD
、Jarett−corp of Delaware
U、S、P、 3201385)とウワウルシ(Arc
tostaphylos uva−ursi)、コケモ
モ(Vaccinium vitis−idaea)な
どの天然植物から抽出する方法がある。
、Jarett−corp of Delaware
U、S、P、 3201385)とウワウルシ(Arc
tostaphylos uva−ursi)、コケモ
モ(Vaccinium vitis−idaea)な
どの天然植物から抽出する方法がある。
[発明が解決しようとする問題点コ
合成法は、1)グルコースのアセチル化、2)ベンジル
エーテルの付加、3)脱アセチル化、4)脱ベンジル化
、の4工程からなり非常に繁雑であること、また抽出法
については、天然のウワウルシやコケモモのアルブチン
含有量が、それぞれ乾燥重量の5.0〜7.5%、4.
0〜7.0%と少ないうえに抽出の際に大量の鉛を使用
する。鉛を使用する方法は直接人体に摂取されたり、接
触するような医薬、農薬、化粧料添加物、食品添加物な
どに使用するための物質あるいはその原料を製造する方
法としては、重金属である鉛混入の危険があり、かつ使
用済の重金属を含む廃液の処理、廃棄などにも難点があ
り不適当である。
エーテルの付加、3)脱アセチル化、4)脱ベンジル化
、の4工程からなり非常に繁雑であること、また抽出法
については、天然のウワウルシやコケモモのアルブチン
含有量が、それぞれ乾燥重量の5.0〜7.5%、4.
0〜7.0%と少ないうえに抽出の際に大量の鉛を使用
する。鉛を使用する方法は直接人体に摂取されたり、接
触するような医薬、農薬、化粧料添加物、食品添加物な
どに使用するための物質あるいはその原料を製造する方
法としては、重金属である鉛混入の危険があり、かつ使
用済の重金属を含む廃液の処理、廃棄などにも難点があ
り不適当である。
本発明者等はこれら従来技術の問題点を解決する手段と
して、植物のカルス又は腫瘍組織を組織培養しアルブチ
ンを採取する方法について研究した結果、培地中にハイ
ドロキノンを添加することにより大量のアルブチンが培
養物中に蓄積することを見出し、先に特許出願をした。
して、植物のカルス又は腫瘍組織を組織培養しアルブチ
ンを採取する方法について研究した結果、培地中にハイ
ドロキノンを添加することにより大量のアルブチンが培
養物中に蓄積することを見出し、先に特許出願をした。
しかしながら本法においても、収率を上げる目的で基質
としてのハイドロキノンの添加量を増やすとかえって変
換効率が下り、結果として収率が低下するという欠点を
有していた。
としてのハイドロキノンの添加量を増やすとかえって変
換効率が下り、結果として収率が低下するという欠点を
有していた。
[問題点を解決するための手段]
本発明者等は上記の事情に鑑み、アルブチンを高収率で
得る組織培養方法について鋭意研究を重ねた結果、アル
ブチンの生産に用いる植物のカルスまたは腫瘍組織を継
代培養する際に一定量以下のハイドロキノンを培地に添
加して継代培養すると上記目的が達成できることを見出
し、この知見にもとずいて本発明を完成するに至った。
得る組織培養方法について鋭意研究を重ねた結果、アル
ブチンの生産に用いる植物のカルスまたは腫瘍組織を継
代培養する際に一定量以下のハイドロキノンを培地に添
加して継代培養すると上記目的が達成できることを見出
し、この知見にもとずいて本発明を完成するに至った。
すなわち本発明は1m)4以下のハイドロキノンを添加
した培地で植物のカルスまたは腫瘍組織を継代培養する
ことによりアルブチン生成能に優れた培養物を誘導する
植物組織培養方法を提供するものである。
した培地で植物のカルスまたは腫瘍組織を継代培養する
ことによりアルブチン生成能に優れた培養物を誘導する
植物組織培養方法を提供するものである。
以下、本発明の詳細な説明する。
まずニチニチソウの芽生え(幼植物)の根、胚軸、子葉
、成熟植物の根、茎、葉、葉柄、花、花粉などの細胞群
又は組織片を出発原料として、これを通常の方法にてオ
ーキシンやサイトカイニンを添加した培地で培養すれば
カルスが誘導される。この場合、材料としていずれの植
物の器官の細胞群、組織を使用しても難易の差はあるが
カルスは誘導きれる。使用する培地はムラシゲ・スクー
グ培地に寒天を士ぜたものが通常用いられるがこれに限
らず、White、 Gamborg、 N1tsch
。
、成熟植物の根、茎、葉、葉柄、花、花粉などの細胞群
又は組織片を出発原料として、これを通常の方法にてオ
ーキシンやサイトカイニンを添加した培地で培養すれば
カルスが誘導される。この場合、材料としていずれの植
物の器官の細胞群、組織を使用しても難易の差はあるが
カルスは誘導きれる。使用する培地はムラシゲ・スクー
グ培地に寒天を士ぜたものが通常用いられるがこれに限
らず、White、 Gamborg、 N1tsch
。
He1ler、 5chenk−Hildebrand
t、旧tsch−N i tsch 。
t、旧tsch−N i tsch 。
Kohlenbach−3chmidtなどのいずれの
培地を用いてもよい。勿論、寒天を含まない液体培地で
もカルスは誘導できる。また一般にカルス誘導に際して
はオーキシンが必要とされるが、2.4−ジクロロフェ
ノキシ酢酸(2,4−D)、α−ナフタリン酢酸(HA
A)、2.4.5−トリクロロフェノキシ酢酸(2,4
,5−T)、インドール酢酸(IAA)などいずれを添
加してもよい。またサイトカイニンもゼアチン、6−ベ
ンジルアデニン、カイネチン、リボシルゼアチン、イソ
ペンテニルアデニンなどいずれを添加してもよい。添加
するオーキシンの濃度は、10−7Mから10−5Mの
範囲であり、サイトカイニンの濃度も10−8Mから1
0’Mの範囲である。この様にして誘導したカルスは上
記培地に寒天を加えない液体培地に植え継ぎ振盪培養を
行う。もちろん寒天を含む培地でもカルスは分裂生長す
る。液体振盪培養では通気のために回転式振盪培養機か
往復式振盪培養機で常に振盪する。回転数は50rpm
から15Orpmの範囲であればいずれでもよいが、1
10rpm程度が望ましい。培養中、光は照射してもし
なくてもよい。培養温度は20°Cから30°Cである
が、そのうちでも27°C程度が望ましい。カルスは週
1回新しい培地に植え継ぎ、継代培養する。継代培養は
1mM以下のハイドロキノンを含む培地にて行なわれる
。ハイドロキノンの濃度が高過ぎるとカルスは増殖でき
ないので、0.01mM乃至1mMの数段階の濃度の培
地にて培養し、その中で最も高濃度の培地で増殖したカ
ルスを選び植えつぐようにする。このような操作を繰り
返すとカルスのハイドロキノンに対する耐性は次第に高
まってくる。
培地を用いてもよい。勿論、寒天を含まない液体培地で
もカルスは誘導できる。また一般にカルス誘導に際して
はオーキシンが必要とされるが、2.4−ジクロロフェ
ノキシ酢酸(2,4−D)、α−ナフタリン酢酸(HA
A)、2.4.5−トリクロロフェノキシ酢酸(2,4
,5−T)、インドール酢酸(IAA)などいずれを添
加してもよい。またサイトカイニンもゼアチン、6−ベ
ンジルアデニン、カイネチン、リボシルゼアチン、イソ
ペンテニルアデニンなどいずれを添加してもよい。添加
するオーキシンの濃度は、10−7Mから10−5Mの
範囲であり、サイトカイニンの濃度も10−8Mから1
0’Mの範囲である。この様にして誘導したカルスは上
記培地に寒天を加えない液体培地に植え継ぎ振盪培養を
行う。もちろん寒天を含む培地でもカルスは分裂生長す
る。液体振盪培養では通気のために回転式振盪培養機か
往復式振盪培養機で常に振盪する。回転数は50rpm
から15Orpmの範囲であればいずれでもよいが、1
10rpm程度が望ましい。培養中、光は照射してもし
なくてもよい。培養温度は20°Cから30°Cである
が、そのうちでも27°C程度が望ましい。カルスは週
1回新しい培地に植え継ぎ、継代培養する。継代培養は
1mM以下のハイドロキノンを含む培地にて行なわれる
。ハイドロキノンの濃度が高過ぎるとカルスは増殖でき
ないので、0.01mM乃至1mMの数段階の濃度の培
地にて培養し、その中で最も高濃度の培地で増殖したカ
ルスを選び植えつぐようにする。このような操作を繰り
返すとカルスのハイドロキノンに対する耐性は次第に高
まってくる。
液体培養で継代しているカルスを、ハイドロキノンを含
む培地での継代培養に切り換える時期については特に制
限はないがカルスを誘導してから時を経ない方が、カル
スはより早くハイドロキノンに対する耐性を獲得するの
で好ましい。
む培地での継代培養に切り換える時期については特に制
限はないがカルスを誘導してから時を経ない方が、カル
スはより早くハイドロキノンに対する耐性を獲得するの
で好ましい。
ハイドロキノンを含む培地での継代培養を少なくとも3
ケ月以上継続した後、植えつぎ後3日目から100日目
間に10mM以下のハイドロキノンを再び添加するとす
みやかに多量のアルブチンが培地中に生産される。
ケ月以上継続した後、植えつぎ後3日目から100日目
間に10mM以下のハイドロキノンを再び添加するとす
みやかに多量のアルブチンが培地中に生産される。
[実施例1
次に実施例をあげて本発明をざらに詳細に説明する。本
発明はこれらに限定きれるものではない。
発明はこれらに限定きれるものではない。
実施例1
オーキシン類として2.4−Dを2.2X10 ” 6
M含み寒天を含まないムラシゲ−スクーグ培地(KC社
裂、以下同じ) 180rnQ−づつを500+Jの三
角フラスコに分注したものをオートクレーブで滅菌した
。
M含み寒天を含まないムラシゲ−スクーグ培地(KC社
裂、以下同じ) 180rnQ−づつを500+Jの三
角フラスコに分注したものをオートクレーブで滅菌した
。
実験に使用したニチニチソウのカルスは以下のような処
理を施した。なお、培養条件は全て27℃、光無照射下
で行ない、振盪培養する場合は回転式振盪培養装置(い
わしや科学源)を用いて110rpmで行なった。すな
わち、常法によりニチニチソウの茎より誘導したカルス
をハイドロキノン(三井石油化学製、以下同じ) 0.
02mM−、0,2111M% 0.5rnMz1mM
をそれぞれ含むムラシゲ・スクーグ培地に移植したとこ
ろ0.5m14以上のハイドロキノンを含む培地では増
殖しなかった。0 、2mM以下の実験区でLfカルス
が増殖してきたので、0.2mM区のカルスを再び0.
2mMハイドロキノンを含む培地で数回継代培養を行な
った。、かかるカルスを0.2++)4.0.4mM、
0.6mM、 0.8mM、 1.0mMのハイドロキ
ノンを含む培地にそれぞれ移植した。0.6mM以下の
実験区で遅いながらもカルスが増殖してきたので、この
カルスを006mMハイドロキノンを含む培地で1年以
上継代培養を続けた。このような処理を経たカルス2g
(生重量)を含む20mQ、細胞懸濁液をオートクレー
ブ殺菌済の500dコルベンに植え込んだ。培養5日目
にハイドロキノン88.1mgを水溶”<rlとして培
地に添加した。
理を施した。なお、培養条件は全て27℃、光無照射下
で行ない、振盪培養する場合は回転式振盪培養装置(い
わしや科学源)を用いて110rpmで行なった。すな
わち、常法によりニチニチソウの茎より誘導したカルス
をハイドロキノン(三井石油化学製、以下同じ) 0.
02mM−、0,2111M% 0.5rnMz1mM
をそれぞれ含むムラシゲ・スクーグ培地に移植したとこ
ろ0.5m14以上のハイドロキノンを含む培地では増
殖しなかった。0 、2mM以下の実験区でLfカルス
が増殖してきたので、0.2mM区のカルスを再び0.
2mMハイドロキノンを含む培地で数回継代培養を行な
った。、かかるカルスを0.2++)4.0.4mM、
0.6mM、 0.8mM、 1.0mMのハイドロキ
ノンを含む培地にそれぞれ移植した。0.6mM以下の
実験区で遅いながらもカルスが増殖してきたので、この
カルスを006mMハイドロキノンを含む培地で1年以
上継代培養を続けた。このような処理を経たカルス2g
(生重量)を含む20mQ、細胞懸濁液をオートクレー
ブ殺菌済の500dコルベンに植え込んだ。培養5日目
にハイドロキノン88.1mgを水溶”<rlとして培
地に添加した。
また比較例としてハイドロキノン無添加−の培地で継代
培養したカルスを準備し、その他は実施例と同条件のも
のを10本培養した。6日目、培養液を東洋濾紙No、
2で吸引濾過し残渣を充分純水で洗浄した。残渣を20
0+nMなす型フラスコに移し、100m1の純水を加
えて 3分間、ヒスコトロン(日音速理科器械製作所製
)でホモジナイズし、湯浴上100℃で2時間熱水抽出
を行なった。
培養したカルスを準備し、その他は実施例と同条件のも
のを10本培養した。6日目、培養液を東洋濾紙No、
2で吸引濾過し残渣を充分純水で洗浄した。残渣を20
0+nMなす型フラスコに移し、100m1の純水を加
えて 3分間、ヒスコトロン(日音速理科器械製作所製
)でホモジナイズし、湯浴上100℃で2時間熱水抽出
を行なった。
これを遠心分離により上澄液をストックし、これをシリ
カゲルカラム(Wako gel C−300、和
光純薬裂)にかけ、混合溶出e(りOr:1ホルム:メ
タノール:水=30:10:1)で溶出し、溶媒を留去
してアルブチンを結晶として205mg得た。比較例で
は120mgであった。
カゲルカラム(Wako gel C−300、和
光純薬裂)にかけ、混合溶出e(りOr:1ホルム:メ
タノール:水=30:10:1)で溶出し、溶媒を留去
してアルブチンを結晶として205mg得た。比較例で
は120mgであった。
実施例2.3および比較例2.3
リンスマイヤー・スクーグの培地(極東製薬工業裂)を
使用した他は実施例1と同様の条件で培養を行った。培
養6日目にハイドロキノンを110mg(実施例2 )
、132mg (実施例3)を添加し、7日目に実施
例1の要領で抽出し、高速液体クロマトグラフィー(日
本分光製)で定量した。溶媒は5%メタノール(ph
2.1)を使用し、流量1 、5 mL /min、
、検出波長230nmの条件で行なった。カラムはOD
Sカラム(センシュウ科学製、5sc−。
使用した他は実施例1と同様の条件で培養を行った。培
養6日目にハイドロキノンを110mg(実施例2 )
、132mg (実施例3)を添加し、7日目に実施
例1の要領で抽出し、高速液体クロマトグラフィー(日
本分光製)で定量した。溶媒は5%メタノール(ph
2.1)を使用し、流量1 、5 mL /min、
、検出波長230nmの条件で行なった。カラムはOD
Sカラム(センシュウ科学製、5sc−。
D S −161)を使用した。その結果、アルブチン
の収量は259mg (実施例2 ) 、 306mg
(実施例3)であった。一方ハイドロキノン処理をし
ないまま継代培養したカルスを使った比較例では収量1
01mg (比較例2) 、 69mg (比較例3)
であった。
の収量は259mg (実施例2 ) 、 306mg
(実施例3)であった。一方ハイドロキノン処理をし
ないまま継代培養したカルスを使った比較例では収量1
01mg (比較例2) 、 69mg (比較例3)
であった。
表1に実施例1〜3および比較例1〜3のアルブチン生
産量と転換率を示す。ただし数値ば10フラスコで生産
きれた総量の平均値である。
産量と転換率を示す。ただし数値ば10フラスコで生産
きれた総量の平均値である。
表1
本発明によって生産されたアルブチンの機器分析による
データは、紫外吸収、赤外吸収、13C核磁気共鳴の各
スペクトル分析において、市販されているアルブチン(
シグマ社製)のものと一致した。
データは、紫外吸収、赤外吸収、13C核磁気共鳴の各
スペクトル分析において、市販されているアルブチン(
シグマ社製)のものと一致した。
Claims (2)
- (1)1mM以下のハイドロキノンを添加した培地で植
物のカルスまたは腫瘍組織を継代培養することによりア
ルブチン生成能に優れた培養物を誘導する植物組織培養
方法。 - (2)植物がニチニチソウ(Catharanthus
roseusL.)である特許請求の範囲第1項記載
の培養方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP60185438A JPH062053B2 (ja) | 1985-08-23 | 1985-08-23 | 植物の組織培養方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP60185438A JPH062053B2 (ja) | 1985-08-23 | 1985-08-23 | 植物の組織培養方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS6244174A true JPS6244174A (ja) | 1987-02-26 |
JPH062053B2 JPH062053B2 (ja) | 1994-01-12 |
Family
ID=16170789
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP60185438A Expired - Lifetime JPH062053B2 (ja) | 1985-08-23 | 1985-08-23 | 植物の組織培養方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPH062053B2 (ja) |
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS6467129A (en) * | 1987-09-07 | 1989-03-13 | Mitsui Toatsu Chemicals | Tissue culture of radish |
JPH01269498A (ja) * | 1988-04-22 | 1989-10-26 | Shiseido Co Ltd | アルブチンの製造方法 |
JP2006111581A (ja) * | 2004-10-15 | 2006-04-27 | Nitto Best Kk | アルブチンの分離精製方法 |
CN110800419A (zh) * | 2019-12-11 | 2020-02-18 | 湖北省益客迅电子商务有限公司 | 一种漆树根育苗方法 |
-
1985
- 1985-08-23 JP JP60185438A patent/JPH062053B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS6467129A (en) * | 1987-09-07 | 1989-03-13 | Mitsui Toatsu Chemicals | Tissue culture of radish |
JPH01269498A (ja) * | 1988-04-22 | 1989-10-26 | Shiseido Co Ltd | アルブチンの製造方法 |
JP2006111581A (ja) * | 2004-10-15 | 2006-04-27 | Nitto Best Kk | アルブチンの分離精製方法 |
JP4738788B2 (ja) * | 2004-10-15 | 2011-08-03 | 日東ベスト株式会社 | アルブチンの分離精製方法 |
CN110800419A (zh) * | 2019-12-11 | 2020-02-18 | 湖北省益客迅电子商务有限公司 | 一种漆树根育苗方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPH062053B2 (ja) | 1994-01-12 |
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