JPS63258589A - コルチカムの組織培養によるコルヒチン又はデメコルシンの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明はコルチカム属（Ｃｏｌａｈｌｃｕｍ）の植物組
織より誘導し九カルスを好気的に固体を九は液内培養す
ることによるコルヒチン及び、又はデメコルシンの製造
方法に関するものである。

コルチカム属植物から抽出される天然アルカロイドが関
節痛に効果があることは古くから見いだされておシ、す
でに西暦５５０年にギリシャの医者アレキサングーが関
節痛の治療に用いてい九という記録がある。その後、痛
風に使われだしたのは１８世紀になりてからであるが、
今日コルチカム属植物から採取されるアルカロイドはコ
ルヒチンとデメコルシンに分離精製され、コルヒチンは
急性痛風薬としてデメコルシンは慢性骨髄性白血病薬と
して広く世界中で使用されている。また、近年コルヒチ
ンは植物育種における倍数体作出のための化学試薬とし
て市販されている。

（従来の技術） これらコルヒチン及び、又はデメコルシンは、従来、コ
ルチカムオータムナーレ（Ｃｏｌａｈｌｃｕｍａｕｔｏ
ｍｎａｌｅ）　　の種子または球茎よυ抽出する方法が
とられてい念。しかしながら、この方法では原料となる
植物の量や品質が、品種や土壌条件、気象条件または季
節によって左右されるという欠点がある。

（本発明が解決しようとする問題点） 本発明が解決しようとする問題点は、そのような天然条
件に左右されず、コルチカム属植物を人工的に管理され
た条件下で培養し、短期間に多量のコルヒチン及び、又
はデメコルシンを生成せしめ、これらを採取することに
ある。

（問題点を解決するための手段） 本発明者らはこのよう表目的に合う方法として植物組織
培養法を用い、好結果を得て本発明を完成せしめた。

本発明の方法によって、カルスが生産する物質は、コル
チカム属の植物が自然状態で生合成していル天然コルヒ
チンおよびデメコルシント同一である。コルヒチンおよ
びデメコルシンは下記の化学構造式をもりている。また
、カルス中に生成されるコルヒチンとデメコルシンは、
自然状態のものと同じく多成分系アルカロイドとして蓄
積せず、二成分が主要アルカロイドとして、細胞内に著
積するため、その抽出精製操作も容易である。このよう
にして生産されたコルヒチンおよびデメコルシンは、そ
れぞれ急性痛風薬や慢性骨髄性白血病薬などの医薬品と
して、また植物育種における倍数体作出の次めの化学試
薬として利用することができる。

コルヒチン（Ｃｏ１ｅｈｌｅｌｎａ） 本発明において使用する植物細胞はコルチカム物の芽、
根、茎、葉、種子そして花弁部を洗浄、殺菌し、組織培
養用固体培地に置床、培養することによりてカルスが得
られる。このカルスを固体もしくは液体培地に接種し、
好気的に培養することにより、多量のコルヒチン及び、
又はデメコルシンを生産する細胞が得られる。

本発明に使用される培地としては無機イオン、炭素源及
び他の栄養成分を含有する培地が用いられる。寒天など
を上述の成分に加え、固体培地として使用することもで
きる。寒天は通常７ｇ〜１０１１／ｌの濃度で使いられ
る。無機イオンとしては、通常の植物組織培養に使用さ
れる基本培地、例えばムラシゲ及スクーグ（Ｍｕｒａｓ
ｈｌｇｅ　Ａ　Ｓｋｏｏｇ　）の培地、リンズマイヤー
＆スクーグ（Ｌｌｎｓｍａｉｓｒ＆　Ｓｋｏｏｇ　）の
培地、ホワイト（Ｗｈ　Ｉ　ｔ　ｓ　）の培地、ガン〆
−グ（Ｑａｍｂｏｒｇ）の培地、ヘラ−（Ｈｅｌｌｅｒ
）の培地及び上記培地の無機イオン濃度を適当量に改変
した培地等が用いられる。炭素源としては、シュークロ
ーズ、グルコース、フラクトース等が５〜１００１／ｌ
で使用される。

上記の培地にさらにイノシトール１〜１０００＃／Ａ’
、ニコチン酸０．０１〜５ｒｎ９／ｌ、チアミン塩酸塩
０．０１〜１〜／ｌ、ピリドキサール塩酸０．０１〜Ｉ
Ｖｌおよびグリシン０．０１〜１０ｍ９＃！ｅ添加すれ
ば、より良好な増殖が得られる。上述のように調製した
培地はｐＨ４，０〜８．０に調整し、常法通シ殺菌して
培地として用いられる。

カルスを誘導させるために、上記の培地に更に、オーキ
シン類及び望ましくはサイトカイニン類を添加した培地
を用いると良好な結果が得られる。

オーキシン類としては、２．４−ジクロロフェノキシ酢
酸、α−ナフタレン酢酸、β−ナフトキシ酢酸、４＝ク
ロロフエノキシ酢酸、２メチＡ／４クロロフエノキシ酢
酸、インドール酢酸、インドール酪等のオーキシン類が
使用される。これらのオーキシン類は通常０．０１〜〜
１０１Ｒ９／ｌの濃度で使用される。

サイトカイニン類としてはゼアチン、リボシルゼアチン
等の天然サイトカイニンの他、カイネチン、ペンシルア
ミノグリ／、ペンチルアミノブリン、ナフチルアミノプ
リン等の合成カイネチンが使用される。これらのサイト
カイニン類は通常０．０１ダ〜１０〜／ｌの濃度で使用
される。

コルチカム属植物から誘導されたカルスは培地で、２０
〜３０℃で好気的に培養することによりカルスの増殖と
コルヒチンおよびデメコルシンの蓄積が細肥内に認めら
れる。この際に、培地中に天然凰オーキシン類ｉ０．０
１！ｎ９〜１０■／ｌ及びサイトカイニン類′ｆｔｏ、
０１■〜１０■／ｌ添加すると、カルスの増殖とコルヒ
チン及び、又はデメコルシンの生産が促進されるので、
コルヒチン及び、又はデメコルシンを得るには有利であ
る。天然型オーキシン類としては、インドール酢酸、イ
ンドール酪酸、インドールグロビオン酸、インドール酢
酸メチルエステル等が使用される。天然型オーキシンに
よるカルスの培養は、人ニオーキシン類による培養と比
べて、コルヒチンおよび、またはデメコルシンの生産効
率が良く、人体に対する安全性も高いため、有利である
。

コルチカム植物細胞において、コルヒチンおよびデメコ
ルシンの骨格は、１分子のフェニルアラニンと１分子の
チロシンから合成されることが明らかになりている。ま
た、その側鎖であるメチル基はメチオニンのメチル基の
転移によυ生成する。

従って、上記の培地にフェニルアラニン、チロシン及び
、又はメチオニン全添加することによって、コルヒチン
およびデメコルシンの生ａｔ高めることができる。さら
にフェニルアラニンの代謝産物であるケイ皮酸、フマル
酸等や、チロシンの代謝産物であるチラミン等を添加す
ることも有効である。またコルヒチン前駆体でもあるデ
メコルシンを培地に添加することはコルヒチンの生産に
有効である。

培養し九カルスからコルヒチンおよびデメコルシンを分
離採取するには、培養物を細胞と培養液に戸別し、得ら
れた細胞から熱エタノールにより抽出する。抽出液は、
Ｌｉｅｈｒｏｍｏｒｂ　ＲＰ−１８（Ｍ＠ｒｃｋ）のカ
ラム（２５０Ｘ　４．６　ｍ　）に供して、移動相のリ
ン酸緩衝液（ｐＨ６，０）／アセトニトリル／メタノー
ルー６５：３０：５の溶媒全１ａ／／分の流速で流すと
、コルヒチンまたはデメコルシンの画分が分離溶出でき
る。このようにして得られたコルヒチンおよびデメコル
シン画分は、それぞれ高速液体クロマトグラフィによる
分析で標品のコルヒチン（保持時間７．０２分）および
デメコルシン（保持時間８．９０分）と保持時間が一致
し、さらにそれらの紫外吸収スベク）、１１／ともそれ
ぞれ標品アセトニトリル／メタノール−６５：３０：５
）と同一である。またカルスより得られたコルヒチン画
分のマススイクトルパターンは標品のスＱトルパターン
に一致するこれらの結果から、コルチカム属植物のカル
スから得た物質がそれぞれコルヒチンおよびｒメコルシ
ンであることが同定できるＯ 以下、本発明について実施例をあげてさらに具体的に説
明する。

実施例１ コルチカムオータムナーレ（Ｃｏｌｃｈｌａｕｍ　ａｕ
ｔｕｒｎｎａｌ＊）の芽′ｆ、７０％エチルアルコール
に５分間、次いで０．６１次亜塩素酸溶液に１０分間浸
漬して表面を殺菌した後、滅菌水で残存殺菌剤を洗浄除
去した。

次に殺菌した芽を滅菌メスで切開して、子房部、花弁部
、花軸部を切断して小片とし、これを次の組成の固体培
地上に置床して３０℃暗所で培養した。

培地としては、ムラシゲ＆スクーグの無機イオン培地に
、ショ糖３０　Ｆ／／ｌ、２．４−ジクロロフェノキシ
酢酸２ｍ９／ｌ、カイネチン０．３ｍ９／１１イノシト
ール１００ｒＲ９／ｌ、ニコチン酸０．５ｍ９／ｌ。

チアミン塩酸塩０．１〜／ｌ、ピリドキサール塩酸０．
５■／ｌ、グリシン２〜／！および寒天１ｏｐ／１を加
えて−５，８に調整し、１２０℃、１５分間処理によっ
て滅菌した。

上記の方法で培養して派生したカルスを切シ取りて同組
成の新培地で継代培養を行なった。得られたカルスＩ１
１に上述の組成の培地から寒天金除き、２，４−ジクロ
ロフェノキシ酢酸２■／ｌをインドール酪酸２ｍ９／ｌ
に置き換えた液体培地（濾過滅菌）Ｉ　Ｑｄ’ｉ５　Ｑ
＃ｔＪ容振盪フラスコに入れたものに接種し、２５℃で
６週間振盪培養した。

この培養液を戸別し、細胞を分離し、熱エタノールニヨ
つてコルヒチンおよびデメコルクンヲ抽出した。この抽
出液を高速液体クロマトグラフィにより分析して、コル
ヒチン１４．７■／ｇカルス、乾重量およびデメコルシ
ン０．３　ｍｔｙ　／　Ｉカルス乾重量を得た。

実施例２ コルチカムカルス５ｙの熱エタノール抽出液を高速液体
クロマトグラフィにかけ、コルヒチン溶品のマススペク
トルパターンと一致した。

比較例 ２．４−ジクロロフェノキシ酢酸２■／ｌ、およびカイ
ネチン０．３ｍ９／ｌ’に含むムラシｒ＆スクーグの培
地で誘導したカルスをインドール酪酸２〜／ｌおよびカ
イネチン０．３■／７を含むムラシゲ＆スクーグの寒天
培地に移し、２ケ月ごとに４回継代培養したものをさら
に上述の培地から寒天、インドール酪酸およびカイネチ
ンを除い次液体培地に接種し、２５℃で１週間振盪培養
し九。この結果、カルスの生育速度は高められ念。

このカルス１２５１１＃９ｅムラシゲ＆スクーグの液体
培地１０＃Ｉ７を５０４容振盪フラスコに入れたものに
接種し、２５℃で暗黒下、４週間ロータＩＪ−シェーカ
ー上で、旋回培養（１００ｒｐｍ　）　した。

培養後のコルチカムカルスｅ濾過により採取し、その重
量（新鮮重）を測定するとともに、カルスから熱エタノ
ールによってコルヒチンおよびデメコルシン金抽出した
。この抽出液を高速液体クロマトグラフィにより分析し
て、新鮮重ｉ１Ｆあたりのコルヒチンおよび、又はデメ
コルシン生産量を求めた。

実施例３〜１７ 比較例において、液体培地にインドール酪酸とカイネチ
ンを第１表に示す濃度で添加する以外は比較例と同様に
行りた。

第１表 実施例１８〜２１ 比較例において、液体培地にインドール酪酸０．１１１
９／ｌ及びカイネチｙＯ０ｌｒｎ９／ＪＩＪ−添加し、
培地成分のうち硫酸イオン濃度を第１表に示す値とする
以外は比較例と同様に行りた。

第　　２　　表 実施例２２〜２４ 比較例において、液体培地の硫酸イオン濃度を２０ｍＭ
としてインドール酪酸０．１１ｎ９／ｌ及びカイネチン
０．１１１９／ｌｔ”添加し、またコルヒチン及びデメ
コルシンの前駆体であるフマル酸、チラミンを第３表に
示す濃度で添加する以外は比較例と同様に行りた。

第　　３　　表 実施例２５〜２６ 比較例において、液体培地の硫酸イオン濃度を２０ｒｎ
Ｍとしてインドール酪酸０．１ｍ９／ｌ及びカイネチン
０．１■／ｌｋ添加し、またコルヒチンの前駆体である
Ｔメコルシンを第４表に示す濃度で添加する以外は比較
例と同様に行った。

第　　４　　表 出　願人　　味の素株式会社 手続補正書 昭和６２年４月１０日

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）コルチカム属（Ｃｏｌｃｈｉｃｕｍ）の植物組織よ
   り誘導したカルスを培養し、培養物からコルヒチン及び
   、又はデメコルシンを採取することを特徴とするコルヒ
   チン及び、又はデメコルシンの製造法。 ２）カルスがオーキシン類と望ましくはサイトカイニン
   類を含む培地でカルス化されたカルスである特許請求の
   範囲第１項記載のコルヒチン及び、又はデメコルシンの
   製造法。 ３）培地が天然型オーキシン類及び、又はサイトカイニ
   ン類を含む培地である特許請求の範囲第１項又は特許請
   求の範囲第２項記載のコルヒチン及び又はデメコルシン
   の製造法。 ４）培地の硫酸イオン濃度が１０ｍＭ以上である液体培
   地を用いることを特徴とする特許請求の範囲第１項又は
   特許請求の範囲第２項記載のコルヒチン及び、又はデメ
   コルシンの製造法。 ５）培地にフェニルアラニン、チロシン及び又はメチオ
   ニンまたはそれらの代謝産物を添加することを特徴とす
   る特許請求の範囲第１項又は特許請求の範囲第２項記載
   のコルヒチン及び、又はデメコルシンの製造法。 ６）培地にデメコルシンを添加することを特徴とする特
   許請求の範囲第１項又は特許請求の範囲第２項記載のコ
   ルヒチンの製造法。