JPS6236671B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は虫歯の予防ないしは治療に有用な新規
アルカリプロテアーゼM₃に関する。 虫歯の成因は次のように考えられている。すな
わち、食物等から由来するシユクロース（シヨ
糖）を栄養源としてStreptococcus mutansや
Streptococcussanguisの如き虫歯菌が口腔内で生
育増殖しながらグルコシルトランスフエラーゼ
（glucosyltransferase）（以下、GTFと略す）を
生産し、このＧＴＦはシユクロース（シヨ糖）を
水溶性あるいは非水溶性のデキストランの如き多
糖類に変換する。かくして生産された多糖類、特
に非水溶性の多糖類は虫歯金その他の細菌の表面
を被覆しながら、やがては歯牙表面に付着して歯
苔（デンタル プラク）を形成し、その中の細菌
は更に歯苔中の糖を利用して乳酸の如き酸を産生
し、この酸の歯のエナメル質を溶解し、初期の虫
歯が発生するとされている。 そこで本発明者らはこのＧＴＦの活性を阻害す
れば歯苔の発生、ひいては虫歯の予防ないしは治
療ができるとの観点から、種々検討した結果、本
発明の新規アルカリプロテアーゼM₃が極めて強
いＧＴＦ阻害活性および虫歯抑制作用を有するこ
とを見い出し、本発明を完成した。 次に本発明のアルカリプロテアーゼM₃の理化
学的性質を述べ、ついで本発明のアルカリプロテ
アーゼM₃が新規な酵素である根拠を明らかにす
る。 (1) 作用 本酵素はカゼインを加水分解し、かつＧＴＦ
の活性を阻害する強アルカリ性プロテアーゼで
ある。しかし本酵素は虫歯菌細胞溶解活性を実
質的に有ささない。 (2) 至適pHおよびpH安定性 第１図に示すようにカゼインを基質とした場
合の至適pHは９〜12.5であり、また第２図に示
すように本酵素はpH４〜９において37℃、６日
間放置した場合約50％以上のプロテアーゼ活性
が残存する。 (3) 至適温度および熱安定性 第３図に示すようにカゼインを基質とした場
合の本酵素の至適温度は約65℃であり、また第
４図に示すように本酵素水溶液を55℃、10分間
加熱してもそのプロテアーゼ活性は失なわれな
い。 (4) 失活条件 第４図に示すように、本酵素水溶液を60℃、
10分間加熱した場合その約50％のプロテアーゼ
活性が失なわれ、65℃、10分間の加熱ではその
90％以上のプロテアーゼ活性が失活する。 (5) 各種添加剤の影響 本酵素のプロテアーゼ活性に対する種々物質
の影響を次表に示す。

【表】 前表から明らかなように、本酵素のプロテア
ーゼ活性は10^-3Mのヨード酢酸、ＤＥＲ、FeSO₄
およびＥＤＴＡによつて実質的に阻害されず、
10^-4MのＮＢＳによつて完全に阻害される。 なお、第１表に挙げた物質以外に、８−ヒド
ロキシキノリン、シユウ酸カリウム、ジエチル
ジチオカルバミン酸ナトリウム、ピロリン酸ナ
トリウム、Na₂HAsO₄、FCH₂COONa、
NH₂OH・ＨＣｌ・チオセミカルバジド、
(NH₂)₂・ＨＣｌ・1 /2H₂SO₄、NaHSO₃、
HSCH₂CH₂OH、グルタチオン、Ｌ−システイ
ン塩酸塩、２・３−ジメルカプト−１−プロパ
ノール、ＮａＦ、大豆から抽出したトリプシン阻
害剤、MgCl₂、Li₂SO₄およびAg₂SO₄をそれぞ
れ10^-3M添加した場合、本酵素のプロテアーゼ
相対活性は85〜110であり、本酵素のプロテア
ゼ活性はこれらの物質によつてほとんど影響さ
れない。 (6) 等電点 pH9.5付近 〔pH２〜11.5のキヤリアー・アンホライト法
（LKBプロダクター社製）、（300V、40時間）〕 (7) 分子量 約1.7×10⁴ 〔セフアデツクスＧ−75（フアルマシア社
製）によるゲル過法〕 (8) UV吸収スペクトラム 第５図に示すとおり。 (9) IR吸収スペクトル 第６図にに示すとおり。 (10) 精製法 後記実施例記載のとおり。 (11) 力価の測定法 (イ) プロテアーゼ活性 0.6％カゼイン−0.05Mトリス・塩酸緩衝
溶液（pH8.0）２mlに適当に希釈したアルカ
リプロテアーゼM₃溶液１mlを加えて37℃、
10分間温置し、反応停止溶液〔0.01Mトリク
ロル酢酸−0.02Ｍ酢酸ソーダ−0.03Ｍ酢酸〕
３mlを加え、生ずる沈殿を去し液の
275nｍにおける吸光度を測定する。この
UV₂₇₅値を、チロシン標準溶液のUV₂₇₅値と
の比較から、チロシン量に換算する。 プロテアーゼ活性の１単位とは、１μｇの
チロシンを１分間に増加させるに必要な酵素
量である。 (ロ) ＧＴＦ阻害活性 試薬 (ａ) ＧＴＦ溶液 Streptococcus mutansのK₁−Ｒ株また
はＡＨＴ株をＴＴＹ※培地中で37℃、24時間
静置培養し、培養物を遠心分離し、その上
清に50％硫安を加えて生ずる沈殿を0.05Ｍ
リン酸緩衝溶液（pH6.8）に溶解し、水に
対して透析して調製する。 ※ Trypticase−Tryptose−Yeast
extract培地（pH7.0） (ｂ) ５％シユクロース−1/15Ｍリン酸緩衝溶
液（pH6.8） (ｃ) アルカリプロテアーゼM₃−1/15Ｍリン
酸緩衝溶液（pH6.8） (ｄ) 1/15Ｍリン酸緩衝溶液（pH6.8） (ｅ) アンスロン溶液 再結晶アンスロン200mgを95％硫酸100ml
に冷却下溶解し、更に水20mlを加えて調製
する。 方法 0.1mlの(a)、2.0mlの(b)および0.05mlの(c)か
らなる混液を37℃、18時間温置し、次に最終
濃度が70％となるようにエタノールを加えて
４℃、２時間放置する。生ずる沈殿（多糖
類）を遠心分離し、沈殿を5.0mlの（ｄ）に溶解
し、再たび同様なエタノール処理して沈殿を
得る。沈殿を5.0mlの（ｄ）に溶解し、冷却下そ
の0.1mlに6.0mlの（ｅ）を加えてよく振盪し100
℃で10分間加熱する。冷後620nmの吸光度
を測定し多糖類の量を求める。 なお、ＧＴＦの活性は多糖類の生成量（μ
ｇ／ml）で表示し、ＧＴＦの阻害率は次式に
従つて算出するものとする。 阻害率（％）＝Ａ−Ｂ／Ａ×100 Ａ；M₃非添加時のＧＴＦ活性値 Ｂ；M₃添加時のＧＴＦ活性値 このような理化学的性質を有する本発明のアル
カリプロテアーゼM₃と至適pH値が10以上で分子
量が27000以下と認められる既知のアルカリプロ
テアーゼとの比較を次に挙げる。

【表】 本発明のアルカリプロテアーゼM₃は、前記第
２表に挙げた理化学的性質のいずれかにおいて既
知のアルカリプロテアーゼとは異なり、新規な酵
素と認められる。特に本発明のアルカリプロテア
ーゼM₃は次の諸性質を有する点において既知ア
ルカリプロテアーゼとは区別される。 (1) 至適pH値が９〜12.5の強アルカリプロテアー
ゼであり (2) FeSO₄、ＤＦＰ、ＥＤＴＡまたはヨード酢酸のい
ずれによつても実質的に阻害されず (3) ＧＴＦ阻害作用を有し、かつ (4) アルカリプロテアーゼのうちでも最も低分子
であること なお、前記第２表に挙げた既知アルカリプロテ
アーゼのうちでも文献番号13（特開昭48−
92582）に記載されている酵素は本発明の酵素M₃
と最も類似すると考えられるが、ＤＦＰの作用な
らびに等電点において明確に区別される。 本発明の新規アルカリプロテアーゼM₃はスト
レプトマイセス属に属するアルカリプロテアーゼ
M₃生産菌を培養し、培養物からアルカリプロテ
アーゼM₃を採取することにより製造できる。 ストレプトマイセス属に属するアルカリプロテ
アーゼM₃生産菌としては、例えばStreptomyces
globisporus Ｂ−1829株が好適である。このＢ−
1829株は微工研およびATCCに、微工研菌寄第
596号およびATCC−21553号として寄託されてお
り、その菌学的性質ならびに培養方法は特公昭49
−16956号や米国特許3929579号明細書に詳細に説
明されている。 Ｂ−1829菌株の培養物からアルカリプロテアー
ゼM₃の採取は、アンバーライトＣＧ50（ダウケミ
カル社製）処理、硫安分画、ＣＭ−セフアデツク
スＣ−25（フアルマシア社製）処理等を適当に組
み合せることにより実施できる。 かくして得られる本発明の新規アルカリプロテ
アーゼM₃は歯みがき粉、練歯みがき、口腔洗浄
剤等の形態で虫歯の予防ないしは治療に供され
る。 次に製造実施例ならびに試験例を挙げて本発明
を更に詳細に説明する。 実施例 アルカリプロテアーゼM₃の製造 ２％デキストリン、0.5％大豆粉、0.25％ペプ
トン、0.5％Na₂HPO₄、0.1％KH₂PO₄、0.1％
MgSO₄および0.5％NaClからなる培地（pH7.5）
７０中で培養したStreptomyces globisporus Ｂ
−1829の培養物をフイルタープレスで過し液
７０を得、これにアンバーライトＣＧ50（ダウケ
ミカル社製のH⁺タイプのイオン交換樹脂）2.8kg
を加え、１時間攪伴して酵素を吸着させたのち遠
心分離機により樹脂部分を分離する。酵素が吸着
された樹脂に0.2Ｍ Na₂HPO₄ 10を加え、アンモ
ニア水でpH7.5に調節して１時間攪拌溶出する。
その溶出液12に60％飽和となるように固形硫酸
アンモニウムを加えて４℃で１夜放置する。生じ
た沈殿を取し、水道水1.8に溶解して酵素含
有液を得る。これを1N HClでpH2.0に調節し、室
温にて30分間攪拌後、1N NaOHでpH6.0となし流
水中で透析する。別に準備したＣＭ−セフアデツ
クスＣ−25（Na⁺タイプ）のカラム（４×40cm）
に上記透析液を通し、脱イオン水で280nｍの吸
収がなくなるまで洗浄する。ついで水３と
0.2Ｍリン酸緩衝液（pH7.0）からなる溶媒を用
いる直線勾配法で溶出を行なう。緩衝溶液濃度
0.03〜0.05Ｍ附近に溶出される活性区分約400ml
を集め、ダイヤフイルターＡＳ201（バイオエンジ
ニアリング社製）によつて脱塩・濃縮を行ない、
約50mlになつた濃縮液を凍結乾燥し0.7ｇのアル
カリプロテアーゼM₃を得る。本酵素のプロテア
ーゼ活性は730Ｕ／mgであつた。 次に本酵素のアミノ酸分析の結果を、特開昭48
−92582に記載された酵素との比較において示
す。

【表】

【表】 試験例 １ ＧＴＦ阻害作用 Streptococcus mutansのK₁−Ｒ株ならびに
AHT株由来のGTFに対するアルカリプロテアー
ゼM₃および既知のプロテアーゼの阻害活性を測
定し次表の結果を得た。なお、各プロテアーゼの
添加量は160Ｕ／mlである。 第４表の結果から明らかなように本発明のアル
カリプロテアーゼM₃は強いＧＴＦ阻害活性を有す
ることが判る。すでに述べた様にＧＴＦ阻害活性
の測定は、中性プロテアーゼの活性が最も強いpH
6.8において行なわれるにもかかわらず、中性プ
ロテアーゼにはＧＴＦ阻害活性がほとんど認めら
れない。

【表】

【表】 実験例 ２ 虫歯の抑制 一群10匹のゴールデンハムスター（３週令）を
虫歯誘発飼料No.200（Archives of Oral Biology
９ 377〜400、1964）で１週間予備飼育した
後、あらかじめ培養したStreptococcus mutant
ＡＨＴの培養物をハムスターの両頬嚢内へ0.1mlず
つ接種し、ついで各種プロテアーゼを含有する前
記No.200飼料で更に４週間飼育する。その後ハ
ムスターを屠殺して上下の顎骨を採取し、肉片お
よび歯苔を除去してからP.H.Keyesらの方法（J.
Dental Research 23 439−444、1944）に従つ
て臼歯の虫歯のスコアリングを行ない次表の結果
を得た。なお、臼歯試料の動物番号は観察者に対
しブラインドにして観察を行なわせしめた。

【表】

【表】

【表】 前表から明らかなように本発明のアルカリプロ
テアーゼM₃は極めて強い虫歯抑制作用を有す
る。

【図面の簡単な説明】

第１図はM₃の活性pH範囲を、第２図はM₃のpH
安定性を、第３図はM₃の活性温度範囲を、第４
図はM₃の熱安定性を、第５図はM₃のＵＶ吸収スペ
クトラムを、第６図はM₃のＩＲ吸収スペクトラム
をそれぞれ表わす。 なお、第１図および／または第２図における１
はリン酸緩衝溶液を、２はトリス・塩酸緩衝溶液
を、３はSorensen氏緩衝溶液を、４はクエン酸
緩衝溶液をそれぞれ意味し、緩衝溶液濃度は第１
図では0.05Ｍであり、第２図では0.02Ｍである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 下記の理化学的性質を有するアルカリプロテ
   アーゼM₃； (1) 作用 本酵素はカゼインを加水分解し、かつグルコ
   シルトランスフエラーゼの活性を阻害する (2) 至適pHおよびpH安定性 カゼインを基質とした場合の本酵素の至適pH
   値は９〜12.5であり、本酵素はpH４〜９におい
   て37℃、６日間放置した場合約50％以上のプロ
   テアーゼ活性が残存する (3) 至適温度および熱安定性 カゼインを基質とした場合の本酵素の至適温
   度は約65℃であり、本酵素水溶液を55℃、10分
   間加熱しても安定である (4) 失活条件 本酵素水溶液を60℃、10分間加熱した場合に
   はその約50％のプロテアーゼ活性が失なわれ、
   65℃、10分間の加熱でそのプロテアーゼ活性の
   90％以上が失活する (5) 各種添加剤の影響 本酵素のプロテアーゼ活性は10^-4MのＮ−ブ
   ロモスクシンイミドによつて完全に阻害される
   が、10^-3Mのヨード酢酸、ジイソプロピルフル
   オロホスフエート、エチレンジアミンテトラア
   セテート（ＥＤＴＡ）およびFeSO₄によつてほと
   んど阻害されない (6) 等電点 pH9.5付近 (7) 分子量 約1.7×10⁴