JPS62205782A - ピルビン酸キナ−ゼ低下または欠失変異株の分離方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明はピルビン酸キナーゼ活性の低下または欠失した
微生物変異株の分離方法に関するものである。本発明の
方法によって得られる微生物を用いてアミノ酸発酵をは
じめとする各種有用物質発酵を行うとアミノ酸をはじめ
とする各種有用物質の生産性が向上する。

（従来の技術） ピルビン酸キナーゼ低下または欠失変異株がアミノ酸生
産性を向上させることは、すでに特開昭５８−１７０４
８７、特開昭５９−４５８９５、特願昭５９−２５００
４０．特願昭５９−２５００４１、によって明確になっ
ている。すなわち−例を挙げればプレビバクテリウム属
に属し、ピルビン酸キナーゼを欠失した変異株＆７０は
、炭素源としてグルコース１００１！／ｌを含む培地よ
り、最高２２．６１１／１のアスパラギン酸を生成蓄積
したが、これは通常のピルビン酸キナーゼ活性を有する
原株である１５−８菌の蓄積量（１０ｇ／ｌ　）の２．
３倍であった。（Ｍ、　Ｍｏｒｉ　＆　１．５ｈ１１ｏ
　、　Ａｇｒｉｃ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ。

４８．１１８９〜１１９７．１９８４　）Ｌかし、ピル
ビン酸キナーゼ低下または欠失変異株の分離は容易では
なく、上記の例はいずれも最初に得られたピルビン酸キ
ナーゼ低下リジン生産株ＡＪ１１８４１（ＦＥＲＭ−Ｐ
６４６３　）、およびそれからさらに変異誘導して、他
のアミノ酸の生産性を付与したものである。

これらの今までに得られている菌株が主炭素源としてリ
ボースまたはグルコン酸を含む最少培地には生育しない
か、生育が遅く、かつ主炭素源としてグルコースを含む
最少培地には親株と同様の生育をするという性質、更に
この性質に加えて主炭素係としてリコース又はグルコン
酸を含む最少培地にピルビン酸を添加した培地に生育す
るという性質を有していることは知られていない。

（本発明が解決しようとする問題点） 本発明が解決しようとする問題点は、アミノ酸発酵菌を
はじめとする各種有用物質生産菌のアミノ酸をはじめと
する各種有用物質の生産性向上に重壁であるピルビン醒
キナーゼ活性の低下または欠失した変異株を高頻度に採
取する方法を確立することにある。

（問題点を解決するための手段） 本発明者らは、ピルビン酸キナーゼ低下または欠失変異
株の分離方法に関し、検討の結果、グルコースを主炭素
源とした培地では生育するが、リボースやグルコン酸を
主炭素源とした培地に生育できず、ピルビン酸をさらに
添加すれば生育する菌株を分離することによシ、高頻度
にピルビン酸キナーゼ低下または欠失変異株が得られる
ことを発見し、本発明を完成した。本発明によれば、容
易に上記の性質を有する変異株を誘導分離できる。

したがって、既存の優秀な有用物質生産菌に上記の性質
を付与して、さらに高い生産能を有する菌株を容易に得
ることができ、ピルビン酸キナーゼ低下または欠失によ
るアミノ酸、核酸成分、ビタミン、有機酸等の生産能力
向上を広範囲かつ容易に実施可能とした点に特長を有す
る。もちろん、全く生産能をもたない菌株に上記性質を
本方法で付与後、特定生産能を付与することもでき、そ
の順序を問わず、本発明に含まれる。以下、実験例にて
、本発明の分離法で得たピルビン酸キナーゼ低下または
欠失株が有用物質の生産能を向上させることを示す一例
をプレビバクテリウム属変異株によるリジン生産につい
て説明する。

実収例 クエン醇合成酵素活性が低く、かつＬ−アスパラギン酸
による阻害の弱いホスホエノールピルビン酸カルボキシ
ラーゼを有するＬ−アスパラギン酸生産菌であるプレビ
バクテリウム・フ之パム同じ。ただし、変異処理時のＮ
−メチル−Ｎ′−二トローＮ−二トロソグアニノン最終
濃度は４００μ９／ｍ／とじ、最少培地には、いずれも
０．１％カデ用した７、 ？ｌＳ　１辰に示す組成の培地を５００ゴ芥振盪フラス
コに２０１ｄ宛分注し、加熱・滅菌した。これに別途加
熱滅菌した炭酸カルシウム粉末を１．０ｇ夫夫補添して
培地を調製した。

グルコース　　　　　　　　　　　１００９硫酸アンモ
ニウム　　　　　　　　７０Ｋｌ（２Ｐ０４・７）Ｉ２
０　　　　　　　　　　　１ＭｇＳＯ４令７Ｈ２００，
４ｊ ＦａＳＯ４−７１（２０１０ｍ９ Ｍｎ５０４・４Ｈ２０８−１／ ビオチン　　　　　　　　　　　　３００　　　μｇプ
サイミン塩酸塩　　　　　　　２００（本総窒素量（Ｔ
−Ｎ）は３２　ｍ９／ｍｌ　）この培地にあらかじめ第
２表の平板寒天培地で培養した（３０℃、２４時間）上
記菌株を１白金耳接種し、３０℃にて７２時間振盪培養
した。培養液中に蓄積したＬ−リジンを酸性ニンヒドリ
ン法で測定した。

ポリペプトン　　　　　　　　　　１０酵母エキス　　
　　　　　　　　　ＩＯ塩化ナトナトリウム　　　　　
　　　５グルコース　　　　　　　　　　　　５以下に
のべる方法でこれらの菌株のピルビン酸キナーゼ活性を
測定した。第３表に示す組成の培地を５００１ｎｌ容振
盪フラスコに５０ｒＩＬｌ宛分注し加熱・滅菌した。

ポリペプトン　　　　　　　　　　　２０酵母エキス　
　　　　　　　　　　２０塩化ナトリウム　　　　　　
　　　　５グルコース　　　　　　　　　　　　２０こ
の培地にあらかじめ第２表の平板寒天培地で培養した（
３０℃、２４時間）上記菌株を１白金耳液種し、３０℃
にて２４時間振盪培養後、集菌し、０．２％塩化カリウ
ム水溶液で洗滌後、菌体を５　ｍＭ塩化マグネシウムお
よび３０％グリセロールを含むＰＨ７，５のＴＥＳ−Ｎ
ａＯＨ緩衝液中にて、２０分間超音波破砕した。遠心分
離により不溶性残渣を除去し、上清を同緩債液で平衡化
したセファデックスＧ−２５カラムでｒル濾過し粗酵素
液を得た。次いで、第４表に示す組成の酵素反応液を２
０〜２５℃に保持し、酵素添加による反応開始後の３４
０ｎｍにおける吸光度減少の初速度を測定して、ピルビ
ン酸キナーゼ活性を求めた。なお、アデノシン−５′−
二リン酸を除いて同様の反応全行い、これを対照とした
。

第４表　　酵素反応液の組成 トリス−塩酸（ｐＨ７，５）　　　　　　１００　　　
ｍＭＭｎＳＯ４３，３’ ＮＡＤＨＯ，１５ｊ アデノシン５′−二リン酸　　　　　　　１．０／ホス
ホエノールピルビン酸２．ＯｊＰ 乳酸脱水素酵素標品　　　　　　　　１０　　μシ爾リ
ジン生産およびピルビン酸キナーゼ活性の定量結果を第
５表に示す。

ＡＪ１２２７９　（親株）　　　　１３１２　　　　　
２８．９ＡＪ１２２８０　（変異株）　　　　３２　　
　　　３７．８第５表に示すように、本発明の分離方法
で得られたｇ　異ａ　ＡＪ１２２８０は、ピルビン酸キ
ナーゼ活性が親株ＡＪ１２２７９に比べて１／４１に低
下し、一方リジン生産は３１チ向上している。

本発明に使用される変異誘導の親株はプレビバクテリウ
ム属、コリネバクテリウム属又はバチルス属に属する菌
株である。変異処理は、実験例のように、Ｎ−メチル−
Ｎ′−二トローＮ−二トロングアニジン法の他、紫外線
、Ｘ線照射等、常法による。生育を調べる培地は、グル
コースで生育するために必要な成分を含む、できるだけ
単純な組成のものを使用し、親株の生育が遅い場合は、
さる。（例は、実験例、実施例に示す。）以下実施例に
より本発明を説明する。実施例１はプレビバクテリウム
属、実施例２はコリネバクテリウム属、実施例３はバチ
ルス属にそれぞれ属する細菌からの変異株分離法である
。

実施例１ プレビバクテリウム・フラバムＡＴＣＣ１４０６７を０
、５％グルコース含有ブイヨン平板培地で培養後、これ
より１白金耳を、第２表の組成の液体培地（ただしグル
タミーン酸ナトリウムを含まない）に接種し、３０℃１
６時間培養した。生育した菌体を集めて、０．１ＭＩＪ
ン酸緩衝液（ｐＨ７，０）で洗滌後回緩衝液に懸濁した
。この懸濁液にＮ−メチル＋　Ｎ／−ニトロ−Ｎ−ニト
ロングアニジンをｉｉａ度が１０００１ＩＪ〜となるよ
うに加え、３０℃に１５分間保持して、変異処理を行っ
た。この変異処理した菌体を同緩衝液で洗滌した後、第
２表の組成の平板寒天培地（ただしグルタミン酸ナトリ
ウムを含まない）に接種し、３０℃にて４日間培養後、
生育してきたコロニー（１８０００個）をレプリカ法に
よシ、第６表に示すグルコース最少寒天培地および＋７
　、ｙ−ス最少寒天培地に接種し、３０℃にて１日おる
いは２日間培養後前者には親株同様の生育をするが、後
者には生育しないか、生育の遅い菌株（２１株）を選択
した。

第６表　　　最少培地の組成　　（ｐＨ７，０）”グル
コースまたはり♂−ス　　　　２０　　．９硫酸アンモ
ニウム　　　　　　　　１０尿素　　　　　　３１ ＫＨ２ＰＯ４１ Ｍｇ５Ｏ４−７Ｈ２００，４＃ ＮａＣ２０，５ｊＰ ＦｅＳＯ４”７Ｈ２０１０ｍ９ Ｋｎ　ＳＯ４・４Ｈ２０８，１。

ピオチン　　　　　　　　　　　　５０　　　μ９この
ようにして得られたリボース資化能欠損株のうち、リボ
ース最少寒天培地にさらにピルビン酸ナトリウム５１１
／ｌを添加した培地に生育する―株（１０株）を選択し
、これらについてピルビン酸キナーゼ活性を測定するこ
とにょシ最終的にピルビン酸キナーゼ低下・欠失株（５
株）を分離した。

ピルビン酸キナーゼ活性の測定は以下に述べる二方法に
よったが、いずれの場合も、菌体の培養、集菌、洗滌は
実験例の条件（ただし第３表の培地組成で、グルタミン
酸ナトリウムを含まない培地を使用）で行なりた。ピル
ビン酸キナーゼ測定法■は実験例の方法であるが、菌体
の超音波破砕および粗酵素液調製には０．１Ｍ硫酸アン
モニウムを含むｐＨ７，５のＴｒｉｓ−塩酸緩衝液を用
いた。ピルビン酸キナーゼ測定法■はセチルトリメチル
アンモニウムブロマイド（ＣＴＡＢ　）処理菌体を用い
る方法である。上述の洗滌菌体を０．１　Ｍリン酸カル
シウム緩衝液（ｐＨ７，５）に懸濁し、ＣＴＡＢを最終
濃度０．６ｍＭとなるように加えて３７℃で１０分間保
持した。

水冷後遠心分離により上清を除去し、菌体を０、１　Ｍ
　Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（Ｐ［（７，５）　ＶＣＬｕＤ
Ｌ、、ＣＴＡＢ処理Ｍ処理液懸濁液。第４表の組成の酵
素反応液（ただし、ＮＡＤＨと乳酸脱水素酵素を除き、
粗酵素液として上記附懸濁液を用いた。）を３０℃で１
０分間保持後氷冷し、遠心上清中の生成ピルビン酸を定
量した。上清に０．１　Ｍ　Ｔｒｌａ−塩酸緩衝液（ｐ
ｌ−１７，５＞と０．１５　ｍＭ　　ＮＡＤＩ−１（い
ずれも最終濃度）を加え、さらに５０μＱ乳酸脱水素酵
素を添加する前後の３４０ｎｍでの吸光度変化を測定し
て、生成ピルビン酸伍の相対値を得た。これを親株を１
００として表示しピルビン酸キナーゼ活性の相対値とし
た。ピルビン酸キナーゼ低下・欠失株およびその親株Ａ
ＴＣＣ１４０６７の最小培地での生育およびピルビン酸
キナーゼ活性を第７表に示す。

実施例２ コリネバクテリウム、グルタミカム、ホモセリン要求性
変異株（ＡＪ１５０９　、　ＡＴＣＣ１３２８７）よシ
、実施例１の方法（′ｆｃだし変異処理時のＮ−メチル
−Ｎ／−二トローＮ−二トロングアニジン最終濃度を５
００μｂ蟹とし、最少培地には、親株の要求性により、
スレオニン、メチオニンを各々２００〜々添加した）に
て、４５，０００個の変異処理コロニーよシ、グルコー
スに親株同様に生育し、リバースに生育しないか生育の
遅い株で、ピルビン酸添加で生育する株１６株を分離し
た。このうち５株はピルビン酸キナーゼ低下・欠失株で
あった。

これらと、その親株ＡＴＣＣ１３２８７の最少培地での
生育およびピルビン酸キナーゼ活性（Ｉは実験例の方法
、■は実施例１の方法）を第８表に示す。

第８表 ＡＴＣＣ１３２８７廿　　　　廿　　　　廿　　　１２
７７　１００ＣＰ−４−１＋　　　±　１５７３７ ＣＰ−１３５＋　　　　士　　　　廿　　　　　　　　
３６ＣＰ−１３９廿　　　　士　　　　廿　　　　　　
　４２実施例３ バチルス・ズブチリス、５−フロロトリプトファン耐性
変異株ＡＪ−１２２８４（ＦＥＲＭＰ−８６５１）よシ
実施１の方法（但し最少培地としては第９表に示す組成
を使い、変異処理は最終濃度５００μυ値のＮ−メチル
−Ｎ′−二トローＮ−二トロングアニシンで０℃　２０
分間保持することにより行なった。）によって３０．０
０　（ｌの変異処理コロニーよシグルコースに親株同様
生育し、す？−スに生育しないか、生育の遅い株６４株
分離した。これらは全てＩＪ　＆−スにピルビン酸を添
加することによって生育した。このうち１１株はピルビ
ン酸キナーゼ低下・欠失株であった。これらとその親株
ＡＪ−１２２８４の最少培地での生育およびピルビン酸
キナーゼ活性（第１０表に示す組成の培地で３０℃２４
時間振盪 ＃培養した菌体を使用し、測定法■の方法で測定した。

）を第１１表に示す。

成　　　分　　　　　　　　　　　　　　　含量（１，
Ｏｌｌクシグルコースまたはリバース　　　　　５ＩＫ
Ｈ２ＰＯ４８，６５Ｉ ＫＯＨ２，１８ｊ 硫酸アンモニウム　　　　　　　　　１．０／クエン酸
ナトリウム　　　　　　　　　０．５　　ｊＭｇＳＯ４
・７Ｈ２００，２Ｉ ＰＦ（７，０（ＮａＯＨで調整） 傘アミノ酸混合物組成（Ｌ−アミノ酸使用）グルタミン
酸ｉ２２．８ｍｇ、メチオニｙ３１．４ｍｐ、リジン１
２ｏｍｙ、セリン８０■、アスパラギン酸７２．８■、
’／スｆ７０．４ｍ９、アラニア　４０．　Ｏｍ９、ヒ
スチジン２５．６■、アルギニン４１．４ｍ９．７’ロ
リン１３０Ｉｎ９、バリン８４．４■、インロイシン６
４．４ｒ９．０イシｙ　９５．６　ｒＮｙｚ　スレオニ
ｙ５５．８ｍ９、グリシン２５．６　ｍ９゜ グルコース　　　　　　　　　　　　８０１塩化アンモ
ニウム　　　　　　　　１０．９ＫＣｔ２．９ ＫＨ２ＰＯ４１ｇ Ｍｇ　ＳＯ４・７Ｈ２００，４ｇ ＦｅＳＯ４’７Ｈ２０１０ｍ９ Ｍｎ５０４・４Ｈ２０８１η アミノ酸混合物＊４ｙ 第１１表 ＡＪ−１２２８５ （ＦＥＢＭＰ−８６５２）　　　十　　　　　士　　　
　廿　　　　　　５０ＦＰ−３１廿　　　　　士　　　
　＋　　　　　　３９ＦＰ−４７升　　　　　　　　　
　　＋　　　　　　４６ＦＰ−４９＋　　　　±　　　
　＋　　　　　　４５ＦＰ−６２＋　　　　　士　　　
　廿　　　　　　５０ＦＰ−７８＋　　　　　士　　　
　廿　　　　　　５２ＦＰ−８３廿　　　　　士　　　
　＋　　　　　　５０ＦＰ−８５＋　　　　　士　　　
　廿　　　　　　４０ＦＰ−９２＋　　　　　士　　　
　廿　　　　　　５０ＦＰ−９７廿　　　　　士　　　
　　＋　　　　　　　３３ＦＰ−１０７廿　　　　　士
　　　　＋　　　　　　３１特許出罷人　味の素株式会
社 手続補正書 昭和６１年６月π日 １、事件の表示 昭和６１年特許願第４９２９８号 ２、発明の名称 ピルビン酸キナーゼ低下または欠失変異株の分離方法３
、補正をする者 事件との関係　　特許出願人 住所　　　東京都中央区京橋−丁目５番８号５、補正に
より増加する発明の数　　　なし１、補正の内容 （１）明ｍ＋書第５頁９行目「プレビバクテリウム・フ
ラバム」の中点をスペースに訂正する。

（２）明細書筒５頁１０〜１２行目［［Ｓ−・・・スレ
オニン耐性」をｒ　［Ｓ−（２−アミノエチル）−Ｌ−
システィン＋スレオニン］耐性」と訂正する。

（３）明ｍ棗第６頁［加熱・滅菌Ｊの中点を削除する。

（４〉明細書第６頁第１表中ｒＫＨｚＰ○４・７Ｈ２０
Ｊの［・７１−＋２０」を削除する。

（５）明１１Ｉ書第７頁１１〜１２行目「加熱・滅菌」
の中点を削除する。

（６）明細書第９頁第４表中「アデノシン」の後に「−
」を挿入する。

（７）明細書筒１３頁８行目、１５行目、最下行「ｌ”
ｒｉｓＪを「トリス」と訂正する。

（８）明細書名１３頁１１行目「・・・カルシウム」を
「・・・カリウム」と訂正する。

（９）明細書第１４−頁第７表「最小培地生育（２４時
間）　　ピルビン酸キナーゼ」の下の線を削除する。

（１０）明１１１書第１５頁２行目ｒ（ＡＪ”＋５０９
、ＡＴＣＣＩ　３２８７）Ｊのカンマをスペースに訂正
する。

（１１）明細書第１６頁第８表中「最小培地生育〈２４
時間）　　ピルビン酸キナーゼ」の下の線を削除する。

（１２）明細占第１７頁２行目「遅い株６４株」を「遅
い株Ｌ６４株」と訂正する。

（１３）明細書第１９頁第１１表中「リボースピルビン
！Ｉ！Ｊのリボースとピルビン酸の間に「＋」を挿入す
る。

以　　上

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）プレビバクテリウム、コリネバクテリウムまたはバ
   チルス属に属する細菌を変異処理し、主炭素源としてリ
   ボースまたはグルコン酸を含む最少培地には生育しない
   か、生育が遅く、かつ主炭素源としてグルコースを含む
   最少培地には親株と同程度の生育をする変異株を選択す
   ることを特徴とするピルビン酸キナーゼ低下または欠失
   変異株の分離方法。 ２）選択すべき変異株が主炭素源としてリボース又はグ
   ルコン酸を含む最少培地にピルビン酸を添加した培地に
   生育する特許請求の範囲第１項記載の変異株であるピル
   ビン酸キナーゼ低下または欠失変異株の分離方法。