JPS6219892B2 - - Google Patents

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JPS6219892B2
JPS6219892B2 JP53024030A JP2403078A JPS6219892B2 JP S6219892 B2 JPS6219892 B2 JP S6219892B2 JP 53024030 A JP53024030 A JP 53024030A JP 2403078 A JP2403078 A JP 2403078A JP S6219892 B2 JPS6219892 B2 JP S6219892B2
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polymeric
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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、一条及び／又は二条核酸の混合物、
特にデオキシリボ核酸（以下DNAと記す）の親
和性分離用吸着剤、該吸着剤の製法及び該吸着剤
を使用して核酸を分離する方法に関する。
真核（eukaryotisch）細胞から個々の遺伝子又
は反復配列の同じ遺伝子の組を分離することは、
純科学的興味を有するばかりでなく、遺伝子工学
の観点でも重大な実際的意義を有する。このよう
な分離は、“スペーサ”を有する遺伝子又は遺伝
子群の塩基組成が総ゲノムの平均塩基組成とは少
なくとも６〜７％異なる場合にしか、可能でな
い。分離法としては、DNA−塩基特異性添加
剤、例えば銀イオン、水銀イオン、白金イオン又
はアクチノマイシン、ネトロプシン又は染料“ヘ
キスト33258”を用いるセシウムイオン濃度勾配
遠心分離法が使用された。この方法は限られた容
量しか有しないし、高価であり、時間を要する。
生体重合体の親和性クロマトグラフイー用材料
の開発により、過去数年において多数の生体重合
体の分離が著しく簡単になり、また生成重合体の
精製も初めて可能になつた。この方法では、一般
に、分離すべき生体重合体を出来るだけ特異的に
結合する物質と化学的活性化により反応する担体
材料から出発する。この特異性に基づいて、求め
る生成重合体は類似化合物の混合物から理想的な
場合選択的にクロマトグラフイー材料に吸着さ
れ、引続き適当な条件下で純粋な状態で脱着され
る〔ピー・キユアトレカサス（P.Cuatrecasas）
及びシイ・ビイ・アンフインゼン（C.B.
Anfinsen）、Ann.Rev.Biochem.40巻（1971年）
259〜278頁参照〕。
多数の生体重合体についてこの方法を使用して
成功した例が多数あるにもかかわらず、核酸混合
物をも同様に選択的かつ計画的に分離できるクロ
マトグラフイー材料は従来開発されなかつた。し
かしグラム単位での核酸混合物の高精度分画は、
個々の遺伝子又は同じ遺伝子の組の分離に関する
前提条件である。
低分子量の核酸、例えば転移−リボ核酸を分離
する現在の方法では、イオン交換体の性質と親油
性交換作用とを併有する吸着剤で種々の種に分離
する〔アール・エム・コタリ（R.M.Kothari）及
びヴイ・シヤンカー（V.Shankar）、ジヤーナ
ル・オブ・クロマトグラフイー（Journal of
Chromatography）98巻（1974年）449〜475頁参
照〕。この場合、種々の転移−リボ核酸中に種々
の量で存在する、核酸の特異の塩基と担体との交
換力が主として利用される。
比較的高分子のリボ核酸及びデオキシリボ核酸
は一般に特異的塩基を含まないので、その分離法
は下記の差異特徴に基づいて構成される： (a) 一条構造対二条構造の比 (b) 塩基組成における差異 (c) 塩基配列における差異 (d) 分子量における差異 (e) 三次構造における差異 これらの特徴はすべて現在通常の分画法に実際
に利用されている〔アール・エム・コタリ（R.
M.Kothari）、Chromatog.Rev.12巻（1970年）
127〜155頁参照〕。
最も有効な方法、即ち超遠心分離における塩濃
度勾配での分画法では、ｂ、ｃ及びｅの差異によ
り、各DNA−種に関する浮遊濃度が異なり、こ
れは塩基特異性物質の添加により更に増大する。
分離精度は分子量の減少と共に減少し、容量は分
子量の増大と共に減少する。ヒドロキシアパタイ
トでの吸着クロマトグラフイの場合には、グアニ
ン−シトシンに富む核酸を、アデニン−チミンに
富む成分より塩濃度が若干少ない場合に既に脱着
することにより、主としてａにより、僅かにｂに
より分画を行なう〔ダブリユ・パクロツパ（W.
Pakroppa）及びダブリユ・ミユラー（W.
Mu¨ller）著、Proc.Nat.Acad.Sci.USA 71(3)巻
1974年699〜703頁参照〕。
全く同様に、二条核酸を特異性蛋白質−珪藻土
−吸着剤（例えばメチル−血清アルブミン−珪藻
土）で、塩基組成の差異により分画することもで
き、その際再びグアニン−シトシンに富むDNA
−種がまず溶離される〔ジエイ・デイ・マンデル
（J.D.Mandell）及びエイ・デイ・ハーシエイ
（A.D.Hershey）著、アナリテイカル・ビオケミ
ストリイ（Analytical Biochemistry）、１巻1960
年66〜77頁；エヌ・スエオカ（N.Sueoka）及び
ツアイ−ユイン・チエン（Ts′ai−Ying
Cheng）、J.Mol.Biol.4巻1962年161〜172頁参
照〕。このむしろ遇然発見された吸着剤の固有の
作用効果は知られていない。従つてこの材料の小
さい分離精度は、すべての尽力にかかわらず、現
在まで根本的に改善されていない。
最近になつて初めて、核酸と共に錯体を形成す
る多数の物質を系統的に研究して、親和性クロマ
トグラフイー用材料の合成に適当と思われる化合
物が見い出された〔ダブリユ・ミユラー（W.
Mu¨ller）及びデイ・エム・クロタース（D.M.
Crothers）、Eur.J.Biochem.54巻1975年267〜277
頁；ダブリユ・ミユラー、エイチ・ビユーネマン
（H.Bu¨nemann）及びエヌ・ダツタグプタ（N.
Dattagupta）、Eur.J.Biochem.54巻1975年279〜
291頁及びダブリユ・ミユラー及びエフ・ガウテ
イール（F.Gautier）、Eur.J.Biochem.54巻1975年
385〜394頁参照〕。核酸混合物を分離する際にこ
の種の良好に試験された物質を適用すれば、どの
ような利用が生ずるかは、ヒドロキシアパタイト
及び塩基特異性添加物としてエチジウムブロミド
を超螺旋及び螺旋DNAの分離に併用した例〔ダ
ブリユ・パクロパ（W.Pakroppa）、ダブリユ・
ゲーベル（W.Goebel）及びダブリユ・ミユラ
ー、アナリテイカル・ビオケミストリイ
（Analytical Biochemistry）67巻1975年372〜383
頁参照〕及びヒドロキシアパタイトを塩基特異性
錯体形成剤としてのフエニルニユウトラルレツド
誘導体と併用して、二条DNA−種の分離を行な
つた例〔ダブリユ・パクロパ及びダブリユ・ミユ
ラー、Proc.Nat.Acad.Sci.USA、71(3)巻1974年
699〜703頁参照〕で既に証明された。
今述べたこれらの方法の分離力は調製用塩化セ
シウム濃度勾配法のそれと同等である。即ち、
（Ｇ＋Ｃ）−含有量（Ｇはグアニン、Ｃはシトシン
を表わす）の異なるDNA−フラクシヨンを相互
に分離することができる。この方法は、容量は高
いが、成分の平均分子量が20×106より大きい
DNA−混合物をもはや処理できないし、吸着剤
として使用した特殊なヒドロキシアパタイト自体
を製造しなければならないという欠点を有する。
核酸混合物をポリエチレングリコール−デキス
トラン系中で特定の条件でRNA及び一条DNAと
二条DNAとに分離できることは従来公知であ
る。この場合二条DNAは常に（軽い方の）ポリ
エチレングリコール相中に多量に含まれる。即ち
一条核酸より高い分布係数を有する。分布係数の
絶対値は、カリウム塩及びリチウム塩の添加によ
り約103〜104以上変動するが、この系では塩基組
成による分画は成功しない。
本発明の課題は、一条及び／又は２条及び／又
は超螺旋及び／又は線状核酸の混合物、特に
DNA−混合物の塩基特異性及び／又は構造特異
性分離を高容量で達成できる吸着剤を提供するこ
とである。
親水性特異性とは、殊に構造特異性及び塩基特
異性を意味する。
ところで、核酸に親水性の基又は塩基特異性及
び／又は構造特異性基が直接又は比較的長い中間
基（スペーサ）を介して殊に共有結合されている
重合体担体材料を有する吸着剤を用いれば、前記
の課題を解決できることが判つた。
重合体担体材料を基礎とし、核酸に対する塩基
特異性及び／又は構造特異性錯体形成基が直接又
は重合体“スペーサ”を介して重合体担体材料に
共有結合している核酸の親和性特異性分離用吸着
剤である。
本発明の吸着剤の特に有利なものは、少なくと
も２種の共重合性モノマーから成り、そのうち１
種が核酸に対して親和性の基を有するものから成
る共重合体がグラフトされている、あまり圧縮さ
れない微孔性重合体担体材料であることを特徴と
する特殊な吸着剤である。
核酸に対して親和性の基として、前記文献に記
載されている塩基性特異性及び／又は構造特異性
錯体形成剤を使用することができる。特に、下記
の一般式（）及び（）： 〔式中ＸはCH−基又は窒素原子を表わし、Ｙは酸
素原子、硫黄原子、NH−基又は式： の基を表わし、R1はそれぞれ独立して水素原子
又はメチル基を表わし、R2は水素原子又はメチ
ル基を表わし、R3は水素原子又はメチル基を表
わし、R4は水素原子又はメチル基を表わし、Ａ
は塩素イオン、過塩素酸イオン又は蓚酸イオン
のような陰イオンを表わす〕の染料の残基が適当
である。
本発明による特に有利な、重合体担体材料に結
合された塩基特異性及び／又は構造特異性錯体形
成剤は、下記の染料の残基である： しかし本発明に有利な塩基特異性及び／又は構
造特異性錯体形成剤は、式： のフエニルニユートラルレツド及び式： のマラカイトグリーンである。
これらの染料は自体公知であり、市販されてい
るか又は当業者に周知の方法、例えばダブリユ・
ミユラー及びデイ・エム・クロタース（Eur.J.
Biochem.54巻1975年267〜277頁）、ダブリユ・ミ
ユラー、エイチ・ビユーネマン及びエヌ・ダツタ
グプタ（Eur.J.Biochem.54巻1975年279〜291
頁）及びダブリユ・ミユラー及びエフ・ガウテイ
ール（Eur.J.Biochem.54巻1975年385〜394頁）
によつて前記文献に記載された方法により製造さ
れる。
これらの塩基特異性及び／又は構造特異性錯体
形成剤又は染料残基は、当業者に周知の方法によ
り、例えば担体材料に存在する水酸基で染料分子
中に導入されたカルボキシル基をエステル化し、
アミドを形成させ、ウレタンを形成させるか又は
他の共重合性単量体の不存在及び好ましくは存在
下に、染料分子中に導入されている共重合性二重
結合、例えばアクリルアミド基を介して共重合さ
せることにより（本発明に有利な塩基特異性及
び／又は構造特異性錯体形成剤に関して下記の式
のアクリル−フエニルニユートラルレツド又はア
クリル−マラカイトグリーンがそうであるよう
に）、担体材料に共有結合される。前記の名称は
一般名であり、正確な名称はアクリロイルアミノ
−フエニルニユートラルレツド又はアクリロイル
アミノマラカイトグリーンである。
当業者は、前記染料分子中にアクリル基を導入
することにより公知方法で、これらの塩基特異性
及び／又は構造特異性錯体形成剤を製造すること
ができる。このことは別の前記染料分子について
も該当する。
本明細書においてアクリル基という用語は、ア
クリロイル基と同義である。
例３及び例４に記載した方法により製造するの
が有利である。アクリロイル−染料は新規であ
る。
本発明において、重合体担体材料として、あま
り圧縮されない微孔性重合体担体材料、例えばポ
リ−ビスアクリルアミドを使用するのが有利であ
る。これらの微孔性で、あまり圧縮されない重合
体担体材料は、高粘度核酸溶液の親和性クロマト
グラフイーに特に有利であることが判つた。更
に、これらの重合体担体材料は、核酸に対する親
和性基、特に塩基特異性及び／又は構造特異性錯
体形成基との強力な相互作用を示さず、核酸は直
接又は重合体スペーサを介して重合体担体材料に
結合される。
重合体担体材料と塩基特異性及び／又は構造特
異性錯体形成剤との間に比較的長いスペーサ、即
ち官能基を有しない、比較的長い分子鎖を導入す
るのが有利であることが判つた。それというのは
その導入により塩基特異性及び／又は構造特異性
錯体形成剤と螺旋核酸との錯体形成が立体障害に
よつて損なわれなくなるからである。
従つて、特に有利な状態では本発明による吸着
剤において、核酸に対して親和性の基又は塩基特
異性及び／又は構造特異性錯体形成剤は、好まし
くは200〜300の重合度を有する共重合体を介して
重合体担体材料に結合されている。この共重合体
を生成するため、重合のため塩基特異性及び／又
は構造特異性錯体形成剤中に導入される基及び重
合体担体材料に存在する共重合性基と共重合しう
る別の単量体を使用するのが有利である。
この別の単量体としてアクリルアミドを使用
し、なお遊離の共重合性二重結合を有するポリ−
ビスアクリルアミドに前記のアクリル基含有染料
をグラフトするのが有利である。
本発明は、更に、前記吸着剤の製法に関し、該
方法はまず、重合又は重縮合に必要な官能基の他
にもう１つの官能基を有し、この官能基を介して
核酸に対して親和性の基を直接又は重合体スペー
サを介して結合しうる単量体少なくとも１種を常
法で重合又は重縮合させることにより重合体担体
材料を形成し、この重合体担体材料を場合により
所望の粒径に砕解し、次に核酸に対して親和性の
基を直接又は少なくとも１種の別の単量体の存在
で共重合させることにより共重合体としてグラフ
トさせることを特徴とする。
グラフトは任意の方法で、例えばエステル化、
アミド形成又はウレタン形成により行なうことが
でき、そのため常用の試薬及び常用の操作条件を
使用し、またこれらの反応に適当な基を重合体担
体材料又は核酸に親和性の基中に導入することが
できる。
しかし共重合性二重結合が導入された、核酸に
親和性の基を過剰の別の共重合性単量体の存在で
共重合体としてポリビスアクリルアミドにグラフ
トさせることもできる。それというのはポリビス
アクリルアミドはなお遊離の共重合性二重結合を
有するからである。グラフト共重合は水中又は任
意の不活性有機溶剤中で、常用の重合触媒の存在
で実施することができる。
共重合しうる、生体重合体に対して親和性の基
として、アクリル−フエニルニユートラルレツド
又はアクリル−マラカイトグリーンを、別の共重
合性単量体としてアクリルアミドを使用するのが
有利であり、その際これらの成分から成る共重合
体をポリビスアクリルアミドにグラフトする。有
利な操作法により、アクリルアミド及びアクリル
−フエニルニユートラルレツド又はアクリル−マ
ラカイトグリーンから成る、重合度200〜300の共
重合体をグラフトする。
このグラフト共重合において、別の共重合性単
量体に対する共重合性二重結合を有し、核酸に対
して親和性の基の比が１：100〜約１：5000であ
るとき有利に操作され、その際この反応を１：
3000の比で実施するのが有利である。共重合性二
重結合を有し、核酸に対して親和性の基に対する
別の単量体の原料モル比が共重合体中にも含まれ
ていることが判つた。共重合体の平均重合度が
200〜300である場合に、グラフトされる共重合体
鎖がそれぞれただ１個の核酸に対して親和性の基
を有することから出発することができる。これに
より共重合体は、核酸に対して親和性の基と重合
体担体材料、特にポリ−ビスアクリルアミド粒子
との間に種々の長さのスペーサを形成する。
本発明による吸着剤は求められる要求を満足
し、簡単な方法で直ちに合成により得られること
が判つた。例えば、ビスアクリルアミドを高濃度
溶液中で重合させることによつて重合体担体材料
が得られる。重合生成物は脆弱な無色の固体であ
り、これは極めて容易に良好に沈降する砕片に摩
砕することができ、これを数回の篩過により所望
の粒径まで均一にすることができる。水溶液中で
の膨潤挙動は極端な塩濃度でも一定であり、クロ
マトグラフイーの際の透過速度に実際に左右され
ない。この粒子はなお多数の未反応の重合性二重
結合を含むので、前記のように、これを別のグラ
フト重合に使用することができる。
このポリ−ビスアクリルアミド粒子の存在でア
デニン−チミン−特異性アクリルマラカイトグリ
ーン及びグアニン−シトシン−特異性アクリル−
フエニルニユートラルレツドをアクリルアミドと
水溶液中で共重合させることにより、本発明によ
る有利な吸着剤が得られる。その際平均重合度約
200の生成共重合体の40〜50％を通常の反応条件
下でグラフト共重合体の形でポリ−ビスアクリル
アミドから成る担体材料に結合させる。充分洗浄
した後、著しく着色した吸着剤粒子はもはや染料
を放出せず、次に核酸の親和性クロマトグラフイ
ーに直接使用することができる。通常、核酸混合
物を0.01M燐酸塩緩衝液中で材料に吸着させ、線
状塩勾配で脱着させる。塩の種類は、核酸の種類
に左右される。転移−リボ核酸を含めてリボ核酸
の脱着には塩化ナトリウムで充分であり、アクリ
ル−マラカイトグリーン含有吸着剤からのDNA
の塩基特異性溶離には過塩素酸塩が必要である。
担体材料を製造するため、粒状で存在する水酸
基又はアミノ基を有する不溶性材料、例えばアミ
ノアルキルセフアロース、微晶性セルロース、網
状化ヒドロキシエチルメタクリレート又はエポキ
シプロピルアクリレートから出発できることも判
つた。この担体の場合、その後のグラフトに必要
なアクリル基を、アクリロイルクロリドとの反応
により導入する。こうしてアクリルアミド砕片か
らのグラフトの場合と同様に高い、染料での負荷
を達成することができる。
従つて、本発明により、２相−親和性分配、２
相−分配クロマトグラフイー、ゲル電気泳動及び
特に親和性クロマトグラフイーにより生体重合体
を分離するため前記吸着剤を使用することができ
る。一条及び／又は二条核酸の混合物、特に
DNA−混合物の分離にこれらの吸着剤を有利に
使用することができる。
５−フエニルフエナゾニウム塩を基質とする塩
基特異性及び／又は構造特異性錯体形成剤を有す
る、本発明による吸着剤はグアニン−シトシンに
富むDNAに対して特異的に作用し、トリフエニ
ルメタン染料を基質とする塩基特異性及び／又は
構造特異性錯体形成剤を有する、本発明による吸
着剤はアデニン−チミンに富むDNAに対して特
異的に作用するので、核酸混合物の所望の塩基特
異性及び／又は構造特異性又は配列特異性分離を
実施することができる。
主として構造特異性の錯体形成剤としては、内
位添加しうる化合物が該当する。内位添加とは、
特に染料分子とDNAとの特殊な相互作用を表わ
し、DNA−二重螺旋の２個の隣接する塩基対の
間に染料分子がすべり込む。構造上どのような物
質が内位添加しうるかは、当業者に周知である。
それは平面構造で、電子密度の高い発色団であ
る。特に、窒素、酸素及び硫黄のようなヘテロ原
子を含んでいてよい、平面構造の多環式、例えば
双環式、三環式又は四環式の縮合環系である。例
えばエチジウムブロミド及び９−（アクリロイル
アミノエチル−アミノ）−２−メトキシ−６−ク
ロル−アクリジンの場合のように、DNAの燐酸
基に結合しうるアミノ基が環系に存在する場合
に、効果は高くなる。相応して有用な化合物、例
えばアクリジン、ベンズアクリジン、フエナント
レン、フエナントリジン、ピリドインドール、ナ
フタリン、ナフトチオフエン、ベンゾチオフエ
ン、チアントレン、キサンチン、フエノキサンチ
ン、キノリン、キノキサリン、フエナントロリ
ン、フエノチアジン、フエノキサジン、フタラジ
ン等を使用することは、当業者には容易である。
アクリジン誘導体、例えば９−（アクリロイル
アミノ−エチル−アミノ）−２−メトキシ−６−
クロル−アクリジン又はフエナントリジン−誘導
体、例えばエチジウムブロミド（５−エチル−
３・８−ジアミノ−６−フエニル−フエナントリ
ジウムブロミド）は、これをビスアクリルアミド
粒子に結合させた後、超螺旋DNAから塩基非特
異性二条DNAを分離する（第７図の溶離線図）。
このことは、細胞溶解物からプラスミド及びウイ
ルスのDNAsを簡単に分離するのに、極めて重要
である。カラムは、費用のかかるエチジウムブロ
ミド−塩化セシウム−勾配を代替する。両染料は
DNAと共に類似構造の錯体（内位添加錯体）を
形成するので、アクリロイルアミノフエニルニユ
ートラルレツド・カラムでも、前記分離を行なう
こともできる。アクリロイルアミノフエニルニユ
ートラルレツドは、構造特異性分離でも、塩基特
異性分離でも行なうことができる。従つて、直面
する分離の問題に応じて、吸着剤の組成に関して
多数の変更が可能である。
塩基特異性及び／又は構造特異性錯体形成剤は
安定な炭素−炭素共有結合を介して結合されてい
るので、本発明による吸着剤は極端なPH−値でも
使用でき、洗浄剤で洗浄し、塩溶液で再生するこ
とができる。更に、若干の異なる塩基特異性及
び／又は構造特異性の錯体形成剤又は単量体を導
入することもでき、転移−リボ核酸の分離に利用
しうる吸着剤を形成することができる。グラフト
される共重合体の鎖長及び従つて重合体担体材料
と塩基特異性及び／又は構造特異性の錯体形成剤
との間の鎖長は常法でメルカプトエタノールによ
り制御することができる。
次に、添附図面に関連して実施例に基づいて本
発明を詳述する。
例 １ (A) ポリ−ビスアクリルアミド担体材料の製造 丈の高い１のポリエチレンビーカー中で
Ｎ・N′−メチレンビスアクリルアミド50ｇを
メタノール100ml中に懸濁し、２回蒸溜した沸
騰水200mlと混合する。混合物を磁気撹拌機で
撹拌しながら、ビスアクリルアミドを完全に溶
解させる。60℃に冷却し、激しく撹拌した溶液
にまずＮ・Ｎ・N′・N′−テトラメチルエチレ
ンジアミン１mlをピペツトで加え、次に水５ml
中のペルオキソ二硫酸アンモニウム0.2ｇの溶
液を１回に加える。混合した直後に撹拌機を停
止させる。溶液は数秒後に混濁し、加熱下に凝
固して無色の塊になる。約１分後に重合を中断
し、重合体塊を大きいへらで迅速に粗く砕解す
る。破片を２のポリエチレンビーカー中でメ
タノール１中に懸濁し、摩擦して粒状スラリ
ーを得る。粒子を更に均一化するためスラリー
を順次、メツシユの減少する篩（１mm×１mm、
0.5mm×0.5mm及び0.25mm×0.25mm）で篩過す
る。生じた砕片を沈降させ、乳濁した上澄液を
傾瀉する。この操作を何回も、即ちまずメタノ
ール、次にメタノール／水−混合物、続いて１
％酢酸溶液及び最後に再び蒸留水で繰り返す。
得られたポリビスアクリルアミド粒子を水溶液
中に貯蔵し、こうしていつでも下記のグラフト
共重合に使用することができる。
重合溶液300mlから、沈殿したポリビスアク
リルアミド粒子約300mlが得られる。
(B) アクリルアミドとアクリル−フエニルニユー
トラルレツドとの共重合体をＡ工程で得られた
ポリビスアクリルアミドにグラフト ねじ込み栓付びん中でＡ工程で得られた、沈
殿したポリビスアクリルアミド粒子60mlを蒸留
水20ml中に懸濁する。この懸濁液にアクリルア
ミド５ｇ及びアクリルフエニルニユートラルレ
ツド−クロリド10.3mgを溶かし、染料が完全に
溶けるまで、びん中で懸濁液を注意深く振盪す
る。重合度を調節するためメルカプトエタノー
ル0.050ml及び触媒として過酸化ナトリウム溶
液１ml（1M酢酸ナトリウム緩衝液100ml中の過
酸化ナトリウム0.8ｇ、PH5.5）を添加すること
によつて共重合を開始させる。生成した懸濁液
に直ちに更に５分間窒素ガスを吹き込み、空気
を遮断して室温に保持する。約30分後、反応混
合物は明らかに発熱し、約２時間後重合はほぼ
終了している。粘稠な懸濁液を吸引過器に移
す前に、更に数時間放置する。粘稠で、濃く着
色した溶液を吸引過し、吸引過器上で残留
する、濃く着色た粒子を、洗浄が１％酢酸溶液
を使用しても着色しなくなるまで、水で完全に
洗浄する。引続き一夜PH6.0の0.01M燐酸ナト
リウム緩衝液で連続的に洗浄した後、材料を核
酸の親和性クロマトグラフイーに使用すること
ができる。
収量の測定は、アクリルアミドの場合14C−
の標識により、また染料の場合光学濃度により
行なう。収量は下記のとおりである： 染料；共重合体（結合及び未結合）中に導入
60.5％ アクリルアミド；共重合体（結合及び未結合）
中に導入 49.2％ 染料；結合した共重合体中に導入、全体に対し
て 51.0％ アクリルアミド；結合した共重合体中に導入、
全体に対して 57.0％ アクリルアミドに対する染料の出発モル比
（１：3000）は共重合体中にも保持されている
ことが判る。共重合体の平均重合度は200〜300
と測定されたので、共重合体鎖は連鎖１ケ当り
その都度１個の染料分子を有すると考えられ
る。
前記方法は第１図により説明される。
例 ２ 本発明による吸着剤での親和性クロマトグラフ
イーによる核酸の分離 第２図〜第６図の溶離線図から判るように、核
酸分画の分野での本発明による吸着剤の適用可能
性は極めて多面的である。結合した染料の塩基特
異性に応じて、二条核酸の混合物を塩基組成に対
応して分離する。
第２図は塩基組成の異なる、平均分子量約
700000Dの３種の剪断した細菌デオキシリボ核酸
の混合物の溶離線図を示す。この場合、吸着剤と
してポリビスアクリルアミド粒子にグラフトした
アクリルマラカイトグリーンアクリルアミド−共
重合体を含む、寸法16cm×1.5cmのカラムを使用
した。使用したデオキシリボ核酸は約１mgであ
る。
第３図は、種々の塩基組成を有する、平均分子
量約700000Dの３種の剪断された細菌デオキシリ
ボ核酸の混合物の溶離線図を示す。核酸１mgを溶
離するため、吸着剤としてアクリルフエニルニユ
ートラルレツド−アクリルアミド共重合体がグラ
フトされたビスアクリルアミド粒子を含む、寸法
15.2cm×1.5cmのカラムを使用した。
本発明による吸着剤を使用して、抑制エンドヌ
クレアーゼの作用により得られたDNA−フラグ
メントを分画することもできる。このことは第４
図に示されており、第４図はλ−フアージ−デオ
キシリボ核酸のEco−RI−加水分解物の溶離線図
を示し、アクリルマラカイトグリーン−アクリル
アミド共重合体がグラフトされているポリビスア
クリルアミド粒子を含む、寸法15.8cm×1.5cmの
カラムを使用して0.5mgの量で分離したものであ
る。出発物質に対比しての各フラクシヨンに関す
るゲル電気泳動分離の移動図におけるDNA−フ
ラクシヨンの表図は、J.Mol.Biol.91巻315〜328頁
（1975年）に報告されているトーマス
（Thomas）及びデービス（Davis）の論文に示さ
れている。
第５図から判るように、本発明による吸着剤を
用いて同じ生体のデオキシリボ核酸とリボ核酸と
を分離することもできる。第５図には黄色小球菌
（73％Ｇ＋Ｃ）の溶解液からDNA−RNA−混合物
の溶離線図が示されており、その際１mgの混合物
を、アクリルマラカイトグリーン共重合体がグラ
フトされているポリビスアクリルアミド粒子が充
填されている、寸法16.2cm×1.5cmのカラムを用
いて分離した。
第６図は、酵母から得た４種の転移−リボ核酸
の混合物の溶離線図である。1.5mgの量で分離さ
れた混合物は、ｔ−RNAPhe、ｔ−RNALys、ｔ−
RNAGlu及びｔ−RNAGlyの混合物である。親和性
クロマトグラフイーのため、アクリルフエニルニ
ユートラルレツド−アクリルアミド共重合体がグ
ラフトされたポリビスアクリルアミド粒子で充填
された寸法16cm×1.5cmのカラムを使用した。
第７図は、超螺旋及び線状DNAの分離に関す
る溶離線図である。親和性クロマトグラフイーの
ため、９−（アクリロイルアミノ−エチル−アミ
ノ）−２−メトキシ−６−クロル−アクリジン粒
子がグラフトされたポリビスアクリルアミド粒子
を使用した。
前記のように、親和性クロマトグラフイーによ
り核酸混合物を分離するため本発明による吸着剤
を使用する場合、溶離剤としては濃度勾配を有す
る塩水溶液を使用し、塩としてはアルカリ金属
塩、例えば塩化ナトリウム、過塩素酸ナトリウ
ム、過塩素酸リチウム等を使用するのが有利であ
る。場合により、緩衝液、例えば燐酸塩緩衝液を
使用することもでき、塩基特異性錯体形成剤とし
てマラカイトグリーンの残基を含む吸着剤には、
PH5.5〜６の弱酸性緩衝液、例えばPH5.5〜６の
0.01M燐酸塩緩衝液を使用する。
その目的に最適の塩勾配、その成分、濃度、PH
−値及び使用する緩衝液は、当業者に容易に判
る。
要するに、高分子物質、特に生体重合体、例え
ば核酸混合物の親水性特異性分離には、本発明に
よる吸着剤が好適であることが判る。この吸着剤
は簡単に製造でき、その塩基特異性を目的に応じ
て調節することができる。
例 ３ アクロイルアミノ−マラカイトグリーンの製造 (1a) ４−ニトロ−ベンズアルデヒド15.1ｇ（0.1
モル）及びＮ・Ｎ−ジメチルアニリン36.3ｇ＝
38ml（0.3モル）及び塩化亜鉛40.5ｇ（無水）
を混合し、浴温100℃に加熱する。初めは容易
に動きうる混合物は反応時間の経過中にもはや
撹拌できない固体の緑色塊になる。５時間の反
応時間後、冷却する。生成物をアセトン150ml
中に取り、しばらく後撹拌しながら生成物を溶
解し、亜鉛塩を沈出させる。不溶性塩を吸引
過し、アセトンで洗浄し、液を結晶が生じる
程度の多量の水と混合する。結晶を吸引過
し、水、イソプロパノール及びエーテルで洗浄
する。収量：28.7ｇ（理論量の76.6％）；融点
168℃（物質は感光性である）。
(1b) 1aにより得たニトロ化合物3.75ｇ（0.01モ
ル）を氷酢酸（99％）200ml及び水20ml中に溶
かし、塩化亜鉛４ｇと混合する。引続き、撹拌
及び室温（20〜30℃）で冷却しながら、亜鉛末
20ｇを少量ずつ加える。室温で30分撹拌し、過
剰の亜鉛を吸引過し、氷酢酸で洗浄する。
液を50℃で真空中で蒸発し、残分をクロロホル
ム150ml及び水100mlに溶かし、分離し、引続き
クロロホルム−相を2N−炭酸ナトリウム溶液
80ml及び水100mlと共に振盪する。クロロホル
ム−相を吸引過し、硫酸ナトリウムで乾燥
し、過し、50℃で真空中で約100mlに濃縮
し、直ちに更に反応させる（淡すみれ色溶
液）。
(1c) 得られたアミノ化合物のクロロホルム溶液
100mlをメタノール50mlと混合する。炭酸ナト
リウム（無水）10ｇ及び１・３−ジニトロベン
ゼン微量（スパーテルの先端）を加え、続いて
撹拌し、氷冷（０〜５℃）下に塩化アクリロイ
ル1.65ml（２倍モル量）を滴加する。懸濁液を
室温で一夜撹拌し、炭酸ナトリウムを吸引過
し、液を35〜40℃で真空中で蒸発する。残分
をクロロホルム100ml及び水50ml中に取り、振
盪し、クロロホルム相を分離し、水50mlで抽出
し、硫酸ナトリウムで乾燥し、35〜40℃で真空
中で蒸発する。油状の帯緑色残分をイソプロパ
ノール20mlと摩擦し、冷却して結晶させる。結
晶を吸引過し、イソプロパノール及びエーテ
ルで洗浄し、乾燥器中で乾燥する。工程1b及
び1cを経ての収量；2.9ｇ（理論量の72.7
％）；融点175℃ Ｃ、Ｈ、Ｎ−分析 Ｃ Ｈ Ｎ 計算値 78.2 7.27 10.52 実測値 75.9 7.21 9.999 NMR−スペクトル（ヘキサデユーテロジメチ
ルスルホキシド）； CH3−（Ｎ−メチル） Ｓ 2.83ppm（ｓ） ＝CH−（アクリル） Ｑ 5.7ppm（ｑ） CH2＝（アクリル） Ｐ 6.3ppm（ｍ） 芳香族プロトン 6.5〜7.5ppm (1d) クロラニル250mg（0.001モル）をテトラヒ
ドロフラン15mlに溶かし、アクリロイル化合物
（1c）0.4ｇ（0.001モル）と混合する。溶液は
直ちに青色になり、室温で約２時間放置した
後、結晶する。室温で一夜放置し、結晶を吸引
過し、テトラヒドロフラン及びエーテルで洗
浄し、乾燥器中で乾燥する。更に精製するた
め、再び水中に取り、HClで中和し、酢酸エス
テルで振出する。塩化ナトリウムを添加して、
純粋な生成物を水溶液から沈殿させる。
収量；0.335ｇ（理論量の84.2％） 1dのNMR−スペクトルにおいて、1cに比べ
てＮ−メチルプロトンシグナルが3.3ppmにシ
フトしているのが観察される。
例 ４ アクリロイルアミノフエニルニユートラルレツ
ドの製造 (1a) ４−ニトロ−アニリン6.9ｇ（0.05モル）
１：１のテトラヒドロフラン／クロロホルムの
混合物150ml中に溶かし、１・３−ジニトロベ
ンゼン微量（スパーテルの先端）及びトリエチ
ルアミン８mlと混合する。10〜20℃で撹拌しな
がら塩化アクリロイル９ml（0.1モル）を徐々
に滴加する。溶液を室温で一夜撹拌すると、ト
リエチルアンモニウムクロリドを晶出する。次
に真空中50℃でテトラヒドロフラン−クロロホ
ルム混合物を蒸発させ、残分を水と摩擦し、吸
引過し、水、イソプロパノール及びエーテル
で洗浄する。生成物を真空中で50℃で乾燥す
る。
(1b) アクリロイル化合物（2a）2.5ｇをテトラ
ヒドロフラン60ml中に50℃に撹拌しながら溶か
し、氷酢酸（99％）60mlで希釈し、30℃に冷却
する。続いて亜鉛末10ｇを少量ずつ滴加し、そ
の際温度は氷冷下に35〜40℃に上昇する。次
に、室温で10分間撹拌し、過剰の亜鉛を吸引
過し、氷酢酸で洗浄する。液を45℃で真空中
で蒸発させる。油状の蒸発残分はクロマトグラ
フイーで実際に純粋であり、次の反応に使用す
る。
(1c) 水400ml中のＮ・Ｎ−ジメチル−ｐ−フエ
ニレンジアンモニウムジクロリド4.2ｇ（0.02
モル）及びｏ−トルイジニウムクロリド2.88ｇ
（0.02モル）の溶液に撹拌下に水100ml中のクロ
ム酸ナトリウム12ｇ（0.04モル）の溶液を徐々
に加える。析出した緑色生成物を15分後に吸引
過し、水で３回洗浄すると、その際洗液は緑
色である。次に沈殿を少量の水中に懸濁し、均
質化することにより再処理する。均質な懸濁液
を水で1.6に希釈する。水100ml中のＮ−アク
リロイル−ｐ−フエニレン−ジアンモニウムア
セテート1.15×0.02モルを添加した後、反応混
合物を3M酢酸ナトリウム溶液130mlでPH4.9に
調節する。続いて、混合物を撹拌下に加熱沸騰
させる。その際溶液は初めは深青色であり、沸
騰させると暗いすみれ色に着色する（反応を完
結させるため、５分煮沸させる）。次に、沸騰
している溶液を吸引ロートにより吸引過し、
液（約２）を塩化ナトリウム240ｇで2M溶
液に調節し、冷室中で一夜放置する。沈殿した
結晶を吸引過し、乾燥器中で乾燥する（この
物質は水に易溶性であるから、水で洗浄しては
ならない）。
収量；粗生成物2.4ｇ 更に精製するため、粗生成物1.3ｇをメタノ
ール25ml及び0.1M塩化ナトリウム（４：１）
中に溶かし、シリカゲル60−カラム（４×95
cm）に装入する。次に、同じ溶剤で溶離する
（フラクシヨン量＝20ml）。フラクシヨン22〜55
を合し、真空中で約15mlに濃縮する。結晶を吸
引過し、少量の0.1M塩化ナトリウムで洗浄
し、乾燥器中で乾燥する。
収量；クロマトグラフイーにより純粋な染料
0.665ｇ。
例 ５ ９−（アクリロイルアミノ−エチルアミノ）−３
−クロル−７−メトキシ−アクリジンの製造 ３・９−ジクロル−７−メトキシ−アクリジン
854mgをエチレンジアミン１ml及びフエノール7.7
ｇと共に30分間油浴中で60℃に加熱する。融液を
クロロホルム200ml及び水150ml中に取り、酢酸で
PH４に調節し、平衡させる。有機相を0.1M酢酸
ナトリウム緩衝液で３〜４回抽出し、捨てる。
水性抽出液をソーダ溶液でPH9.5に調節し、ク
ロロホルム／ｎ−ブタノールの混合物（20：１）
で抽出し、有機相をシリコーン紙で過し、真空
中で蒸発する。残分を0.1M酢酸ナトリウム緩衝
液中に溶かし、二量体化した生成物の残分を別
し、溶液をPH10に調節する。室温で１時間後、沈
殿を別し、少量の希アンモニア溶液（４℃）で
洗浄し、乾燥する。
収量；理論量の50〜80％ 得られたアミノ化合物206mgをクロロホルム25
ml中で熱時溶解させ、冷却後塩化アクリル0.3ml
を加える。数分後、アクロイル誘導体が析出す
る。吸引過し、若干のクロロホルムで洗浄した
後、９−アクリロイルアミノ−エチルアミノ）−
３−クロル−７−メトキシ−アクリジン122mg
（理論量の50％）がクロマトグラフイーで純粋な
形で得られる。
【図面の簡単な説明】
第１図は、二段階重合により本発明による有利
な吸着剤を製造する略示図、第２図は、本発明に
よる吸着剤を使用しての、３種の剪断された細菌
デオキシリボ核酸の混合物の溶離線図、第３図は
本発明による別の吸着剤を使用して得た、３種の
剪断された細菌デオキシリボ核酸の混合物の溶離
線図、第４図は、本発明による吸着剤を使用して
得た、λ−フアージ−デオキシリボ核酸のEcoRI
−加水分解物の溶離線図、第５図は、黄色小球菌
（M.luteus）の溶解液からDNA−RNA−混合物を
分離する際に本発明による吸着剤を使用して得た
溶離線図、第６図は、本発明による吸着剤を用い
て得た、酵母から４種の異なる転位−リボ核酸の
混合物の溶離線図、第７図は超螺旋及び線状
DNAを分離する溶離線図である。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １ 重合体担体材料を基礎とする核酸の親和性特
    異性分離用吸着剤において、核酸に対する塩基特
    異性及び／又は構造特異性錯体形成基が直接又は
    重合体“スペーサ”を介して重合体担体材料に共
    有結合しており、かつ重合体担体材料が核酸に対
    する塩基特異性及び／又は構造特異性錯体形成基
    として、一般式（）及び（）： ［式中ＸはCH−基又は窒素原子を表わし、Ｙは酸
    素原子、硫黄原子、NH−基又は式： の基を表わし、R1はそれぞれ独立して水素原子
    又はメチル基を表わし、R2は水素原子又はメチ
    ル基を表わし、R3は水素原子又はメチル基を表
    わし、R4は水素原子又はメチル基を表わし、Ａ
    は塩素イオン、過塩素酸イオン又は蓚酸イオン
    のような陰イオンを表わす］の染料の残基、又は
    ヘテロ原子、例えば窒素、酸素及び硫黄を含んで
    いてよい、平面構造の多環式、例えば双環式、三
    環式又は四環式縮合環系を含めて、内位添加染料
    の残基を有することを特徴とする核酸の親和性特
    異性分離用吸着剤。 ２ 少なくとも２種の共重合性単量体から成り、
    そのうちの１種は核酸に対する塩基特異性及び／
    又は構造特異性錯体形成基を有する単量体から成
    る共重合体が重合体“スペーサ”としてグラフト
    されている微孔性で、あまり圧縮されない重合体
    担体材料である特許請求の範囲第１項記載の吸着
    剤。 ３ 重合体担体材料が塩基特異性及び／又は構造
    特異性錯体形成基として、マラカイトグリーン、
    クリスタルヴアイオレツト、メチルグリーン、オ
    ーラミン、ヘキスト染料33258、ジ−ｔ−ブチル
    −プロフラビン、ジ−ｔ−ブチルアクリルフラビ
    ン、ジアミジノ−フエニル−インドール
    （DAPI）、１−メチルフエニル−ニユートラルレ
    ツド、エチジウムブロミド、アクリジン、９−
    （アクリロイルアミノ−エチル−アミノ）−２−メ
    トキシ−６−クロルアクリジンの残基を有する特
    許請求の範囲第１項記載の吸着剤。 ４ 塩基特異性及び／又は構造特異性錯体形成基
    が下記の式： に相当する特許請求の範囲第１項記載の吸着剤。 ５ 塩基特異性及び／又は構造特異性錯体形成基
    が式： に相当する特許請求の範囲第１項記載の吸着剤。 ６ 重合体担体が、重合体又は共重合体の形成に
    必要な官能基の他に、少なくとも１個の別の官能
    基を有し、この基を介して重合体“スペーサ”が
    錯体形成基と共有結合しうる単量体の重合体又は
    共重合体である特許請求の範囲第１項から第５項
    までのいずれか１項に記載の吸着剤。 ７ 重合体担体材料が、核酸に対する塩基特異性
    及び／又は構造特異性錯体形成基が過剰の別の共
    重合性単量体の存在で共重合によりグラフトされ
    ているポリビスアクリルアミドであるか、又は担
    体材料が、後からアクリロイル基が導入されてい
    る、水酸基又はアミノ基を有する網状親水性重合
    体、例えばセルロース、セフアロース、アミノア
    ルキル−セルロース、及びアミノアルキルセフア
    ロースであるか、又は担体材料がアミノ化エポキ
    シプロピルメタクリレートである特許請求の範囲
    第６項記載の吸着剤。 ８ 遊離二重結合を有し、核酸に対する塩基特異
    性及び／又は構造特異性錯体形成基がアクリルア
    ミドの存在でポリビスアクリルアミドの遊離二重
    結合を介して共重合によりその重合体担体材料に
    共有結合されている特許請求の範囲第７項記載の
    吸着剤。 ９ 重合体担体材料を基礎とし、核酸に対する塩
    基特異性及び／又は構造特異性錯体形成基が直接
    又は重合体“スペーサ”を介して重合体担体材料
    に共有結合しており、かつ重合体担体材料が核酸
    に対する塩基特異性及び／又は構造特異性錯体形
    成基として、一般式（）及び（）： ［式中ＸはCH−基又は窒素原子を表わし、Ｙは酸
    素原子、硫黄原子、NH−基又は式： の基を表わし、R1はそれぞれ独立して水素原子
    又はメチル基を表わし、R2は水素原子又はメチ
    ル基を表わし、R3は水素原子又はメチル基を表
    わし、R4は水素原子又はメチル基を表わし、Ａ
    は塩素イオン、過塩素酸イオン又は蓚酸イオン
    のような陰イオンを表わす］の染料の残基、又は
    ヘテロ原子、例えば窒素、酸素及び硫黄を含んで
    いてよい、平面構造の多環式、例えば双環式、三
    環式又は四環式縮合環系を含めて、内位添加染料
    の残基を有する核酸の親和性特異性分離用吸着剤
    において、付加的に１個の官能基を有し、この官
    能基を介して前記核酸に対する塩基特異性及び／
    又は構造特異性錯体形成基が直接又は重合体“ス
    ペーサ”を介して結合されうる単量体少なくとも
    １種をまず重合又は重縮合により常法で重合体担
    体材料を形成させ、重合体担体材料を場合により
    所望の粒径に砕解し、前記錯体形成基を直接又は
    少なくとも１種の単量体の存在で共重合により共
    重合体としてグラフトするか、又は常法で粒状重
    合により所望の大きさの粒子を製造することを特
    徴とする核酸の親和性特異性分離用吸着剤の製
    法。 １０ 共重合性二重結合を有し、核酸に対する塩
    基特異性及び／又は構造特異性錯体形成基を過剰
    の別の共重合性単量体の存在で共重合体としてポ
    リビスアクリルアミドにグラフトする特許請求の
    範囲第９項記載の方法。 １１ グラフト共重合を水又は不活性溶剤中で常
    用の重合触媒の存在で実施する特許請求の範囲第
    １０項記載の方法。 １２ 共重合性二重結合を有し、核酸に対する塩
    基特異性及び／又は構造特異性錯体形成基として
    アクリル−フエニルニユートラルレツド又はアク
    リル−マラカイトグリーンを使用し、別の共重合
    性単量体としてアクリルアミドを使用する特許請
    求の範囲第１０項記載の方法。 １３ アクリルアミド及びアクリル−フエニルニ
    ユートラルレツド又はアクリル−マラカイトグリ
    ーンから成る重合度200〜300の共重合体をグラフ
    トする特許請求の範囲第１２項記載の方法。 １４ 共重合性二重結合を有し、核酸に対する塩
    基特異性及び／又は構造特異性錯体形成基及び別
    の共重合性単量体を１：100〜１：5000の重量比
    で使用する特許請求の範囲第１２項記載の方法。 １５ 約１：3000の割合で操作する特許請求の範
    囲第１４項記載の方法。 １６ 親和性クロマトグラフイーにより核酸を分
    離するため、重合担体材料を基礎とし、核酸に対
    する塩基特異性及び／又は構造特異性錯体形成基
    が直接又は重合体“スペーサ”を介して重合体担
    体材料に共有結合しており、かつ重合体担体材料
    が核酸に対する塩基特異性及び／又は構造特異性
    錯体形成基として、一般式（）及び（）： ［式中ＸはCH−基又は窒素原子を表わし、Ｙは酸
    素原子、硫黄原子、NH−基又は式： の基を表わし、R1はそれぞれ独立して水素原子
    又はメチル基を表わし、R2は水素原子又はメチ
    ル基を表わし、R3は水素原子又はメチル基を表
    わし、R4は水素原子又はメチル基を表わし、Ａ
    は塩素イオン、過塩素酸イオン又は蓚酸イオン
    のような陰イオンを表わす］の染料の残基、又は
    ヘテロ原子、例えば窒素、酸素及び硫黄を含んで
    いてよい、平面構造の多環式、例えば双環式、三
    環式又は四環式縮合環系を含めて、内位添加染料
    の残基を有する核酸の親和性特異性分離用吸着剤
    を使用することを特徴とする核酸の分離法。 １７ 一条及び／又は二条核酸の混合物、特に
    DNA−混合物を分離するための特許請求の範囲
    第１６項記載の分離法。
JP2403078A 1977-03-02 1978-03-02 Adsorbent for separating affinity and singularity og high polymer substance* manufacture thereof and method of separating living polymer with affinity chromatography Granted JPS53131294A (en)

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Families Citing this family (28)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2534486B1 (fr) * 1982-10-15 1987-11-20 Commissariat Energie Atomique Support particulaire greffe en surface, son procede de preparation et adsorbants pour chromatographie d'affinite incorporant ce support, ainsi que leur utilisation, notamment en biologie
US4665184A (en) * 1983-10-12 1987-05-12 California Institute Of Technology Bifunctional molecules having a DNA intercalator or DNA groove binder linked to ethylene diamine tetraacetic acid
DE3407814A1 (de) * 1984-03-02 1985-09-12 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V., 3400 Göttingen Phasentraeger fuer die verteilungschromatographie von makromolekuelen, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung
US5368737A (en) * 1984-03-29 1994-11-29 Daicel Chemical Industries, Ltd. Separation agent comprising acyl-or carbamoyl-substituted polysaccharide
US5229002A (en) * 1984-03-29 1993-07-20 Daicel Chemical Industries, Ltd. Separation agent comprising acyl- or carbamoyl-substituted polysaccharide
US5489387A (en) * 1984-03-29 1996-02-06 Daicel Chemical Industries, Ltd. Separation agent comprising acyl- or carbamoyl-substituted polysaccharide
US5562614A (en) * 1993-11-22 1996-10-08 Advanced Cardiovascular Systems, Inc. Programmable manifold system for automatic fluid delivery
JPS60226829A (ja) * 1984-03-29 1985-11-12 Daicel Chem Ind Ltd 多糖誘導体より成る分離剤
DE3619303A1 (de) * 1986-06-07 1987-12-10 Merck Patent Gmbh Optisch aktive adsorbentien
DE3811042A1 (de) * 1988-03-31 1989-10-19 Merck Patent Gmbh Ionenaustauscher
US5342785A (en) * 1988-07-05 1994-08-30 Tanabe Seiyaku Co., Ltd. Method for determining pyrogen content
US4957620A (en) * 1988-11-15 1990-09-18 Hoechst Celanese Corporation Liquid chromatography using microporous hollow fibers
JP2925753B2 (ja) * 1990-02-23 1999-07-28 ダイセル化学工業株式会社 光学異性体の分離方法
ATE171276T1 (de) * 1993-07-16 1998-10-15 Merck Patent Gmbh Trennmaterialien für die hydrophobe chromatographie
DE4333674A1 (de) * 1993-10-02 1995-04-06 Merck Patent Gmbh Nukleotidhaltiges Sorbens für die Affinitätschromatographie
DE4333821A1 (de) * 1993-10-04 1995-04-06 Merck Patent Gmbh Ionenaustauscher
DE4334353A1 (de) * 1993-10-08 1995-04-13 Merck Patent Gmbh Verfahren und Träger für die Gelpermeationschromatographie
JP3249408B2 (ja) 1996-10-25 2002-01-21 昭和シェル石油株式会社 薄膜太陽電池の薄膜光吸収層の製造方法及び製造装置
US7214410B2 (en) * 2002-10-04 2007-05-08 Shipley Company, L.L.C. Process for selecting solvents for forming films of ferroelectric polymers
RU2257200C1 (ru) * 2004-05-12 2005-07-27 Кутушов Михаил Владимирович Лекарственное средство
EP2018669B1 (en) * 2006-04-18 2009-11-11 Dow Corning Corporation Copper indium diselenide-based photovoltaic device and method of preparing the same
EP2333841A3 (en) * 2006-04-18 2013-06-05 Dow Corning Corporation Cadmium telluride-based photovoltaic device and method of preparing the same
CN101473448B (zh) * 2006-04-18 2011-05-11 道康宁公司 硒化铟铜基光伏器件及其制造方法
EP2620508B1 (en) * 2010-09-22 2017-09-06 Kaneka Corporation Method and device for detecting nucleic acid, and kit
BR112013006030B1 (pt) * 2010-09-29 2020-03-17 Intervet International B.V. Composto e sais ou n-óxidos farmaceuticamente aceitáveis, e, uso do composto
TWI538235B (zh) 2011-04-19 2016-06-11 弗里松股份有限公司 薄膜光伏打裝置及製造方法
US20140196894A1 (en) * 2013-01-15 2014-07-17 University Of Kansas Fluorescent tags for detection of swellable polymers
US9958364B2 (en) * 2013-10-03 2018-05-01 3M Innovative Properties Company Ligand functionalized substrates with enhanced binding capacity

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3640983A (en) * 1966-11-09 1972-02-08 Shojiro Horiguchi Method of making coupler-bonded-polymers and chromogen-bonded-polymers nd polymers made thereby
US3983001A (en) * 1972-05-10 1976-09-28 Ceskoslovenska Akademie Ved Isolation of biologically active compounds by affinity chromatography
DE2443119A1 (de) * 1973-09-10 1975-03-13 Research Corp Selektive entfernung von albumin aus blutfluessigkeiten sowie substanzen zur durchfuehrung des verfahrens
US4017476A (en) * 1974-03-15 1977-04-12 Mobil Oil Corporation Preparation of finely divided styrene-divinylbenzene organic pigments
FR2268022B1 (ja) * 1974-04-22 1977-06-24 Rhone Poulenc Ind
US4046750A (en) * 1974-09-30 1977-09-06 California Institute Of Technology Ionene modified small polymeric beads
LU73094A1 (ja) * 1975-07-29 1977-03-24
US4035316A (en) * 1975-11-24 1977-07-12 California Institute Of Technology Cell specific, variable density, polymer microspheres
US4213860A (en) * 1976-06-30 1980-07-22 Board of Regents, State of Florida for and on behalf of the University of Florida Affinity chromatography and substrate useful therefor
US4194877A (en) * 1977-11-28 1980-03-25 United States Of America Dye-containing polymer composition

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CS188180A2 (en) 1984-02-13
JPS53131294A (en) 1978-11-15
GB1597891A (en) 1981-09-16

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