JPS6178387A - ヒトリゾチ−ム遺伝子、対応する組換えプラズミド及び組換え体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の背壊 本発明は化学的に合成したヒトリゾチーム遺伝子そのヒ
トリゾチーム遺伝子を含有する組換えプラスミド及びヒ
トリゾチーム遺伝子を含有する組換えプラスミドを保持
する組換え体に関する。

ヒトリゾチームはヒトの涙、唾液、鼻粘液、乳、リンパ
腺、白血球、面談、軟骨、肺、腎臓、瞬臓、肝臓、腸管
、耳下腺、皮膚、精液、白血病患者の尿中等に見い出さ
れる酵素蛋白質であり、Ｎ−アセチルグルコサミンとＮ
−アセチルムラミン酸量のβ−１，４結合を加水分解す
るムラミダーゼ（ｍｕｒａｍ　１ｄａｓｅ　）としての
酵素活性を有している事が知られている。

またヒト乳由来のリゾチームは下記の配列で示される１
８０個のアミノ酸からなる事が知られている（例えば、
船離ら「溶酸酵素」５５〜５８頁、講談社すイエンティ
フイク（１９７７）参照）。

Ｌ’５−Ｖａ　１−Ｐｌ】ｅ−Ｇｌ　ｕ−Ａｒｇ　−Ｃ
ｙ　ｓ　−Ｇ　ｌ　ｕ−Ｌｅ　ｕ−Ａ　１　ａ−Ａｒ　
ｇ　−’ｒｈ　ｒ−Ｌｅ　ｕ−Ｌｙ　５−Ａｒ　ｇ−Ｌ
ｅ　ｕ　−Ｇ　ｌ　ｙ−Ｍｅ　ｔ−Ａｓ　ｐ−Ｇ　ｌ　
ｙ−Ｔｙ　ｒ　−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｉ　１ｅ−８ｅｒ−
Ｌｅｕ　−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ｍｅｔ−Ｃｙｓ　
−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｔｒｐ−Ｇｌｕ　−５ｅ　
ｒ−Ｇ　ｌ　ｙ−Ｔｙ　ｒ−Ａｓ　ｎ−Ｔｈ　ｒ　−Ａ
ｒｇ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ　−Ａｓｎ−Ａ
ｌａ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｒｇ　−５ｅｒ−Ｔｈｒ−Ａ
ｓｐ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ　−Ｉ　　ｌ　　ｅ−Ｐｈ　ｅ　
−Ｇ　Ｉ　　ｎ−１１ｅ−Ａｓ　ｎ　−Ｓｅｒ−Ａｒｇ
−Ｔｙｒ−Ｔｒｐ−Ｃｙｓ　−Ａｓ　ｎ−Ａｓ　ｐ−Ｇ
　Ｉ　　ｙ−Ｌｙ　５−Ｔｉ１ｒ　−Ｐ　ｒ　ｏ−６１
ｙ−Ａ　Ｉ　　ａ−Ｖａ　　１−Ａｓ　ｎ　−Ａｌａ−
Ｃｙｓ−Ｈｉ　　５−Ｌｅｕ−５ｅｒ　−Ｃｙ　ｓ−５
ｅ　ｒ−Ａ　ｌ　ａ−Ｌｅ　ｕ−Ｌｅ　ｕ　−Ａｓ　ｐ
−Ａ　Ｉ　ａ−Ｖａ　ｌ　−Ａ　ｌ　ａ−Ｃｙ　ｓ　−
（１ｇ） Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ　−Ｉ　１ｅ
−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｖａ　ｌ　−Ａｌａ−Ｔｒ
ｐ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ａｒｇ　−Ｃｙ　ｓ−Ｇ　ｌ　ｎ
−Ａ　ｓ　ｎ　−Ａ　ｒ　ｇ−Ａｓ　ｐ　−ｇｔ Ｖａ　ｌ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ｖａ　１−Ｇ　１
　ｎ−Ｇ　ｌ　ｙ−Ｃｙ　ｓ　−Ｇ　ｌ　ｙ−Ｖａ　ｌ
リゾチームは種々の細菌を溶解する作用を有するので、
食品等の防腐剤あるいは医薬品として、リゾチーム単独
又は抗生物質との併用による抗菌剤として利用する事が
できる。

また、血液凝固及び出血作用、抗炎症作用、呼吸器疾患
者に対する喀櫨喀出作用等をも有するのでそれらを対象
とした医薬品としても利用する事ができる。

ヒトリゾチームはヒトの乳、尿等から単離する事ができ
るが医療等を目的とする工業的生産の要求を満すには効
率が戚く実用的ではない、本発明は組換えＤＮＡ技術に
より、安価にしかも多量に純粋なヒトリゾチームを生産
する事を可能にしたものである。

（／メン 合成ヒトリゾチーム遺伝子を用いて組換え１）ＮＡ技術
によりヒトリゾチームを製造する方法は後により詳しく
記述するが基本的には下記の工程より成る。

（１）　　遺伝子の設計 （２）遺伝子の化学合成 （８）　　適当な発現用ベクターへの遺伝子の組込み（
４）　　得られた組換えプラスミドに依る適当な宿主の
形質転換 （５）　　形質転換体の培養によるヒトリゾチームの産
生及び回収 遺伝子の設計において、ヒトリゾチームの′ｒアミノ酸
列からそれに対応する遺伝子のヌクレオチド配列（本文
では以下これをｒｊｌ造遺伝子と呼ぶ）を決定するにあ
たっては、大部分のアミノ酸に関してはそれに対応する
遺伝子ｌｌｆ号（コＦ　：／　）　カ２個以」二存在す
るので１８θイーのアミノ酸より成る配列に対して極め
て多数のヌクレオチド配列を考える廖が可能である。

この多数の可能性の中から望ましい配列を決定するに当
っての判断基準として、例えば、使用すべき宿主細胞に
於いて多頻度に使用されているコドンを使用すべきであ
ること、構造遺伝子を含む配列の両端および内部に適当
な制限酵素認識部位を持たせてプラスミドへの挿入、解
析を行う事を容易にすること、化学合成の過程に於いて
遺伝子断片の集合及び連結が容易にできる様に各構成断
片間で不必要な相互作用が最小になる様にコドンを選択
することなどがあげられるが、これらの条件が相反する
場合があり、自明な論理による推論によって望ましい配
列に到達できるのではなく、試行錯誤を含む種々の実験
的検証が必要である。

さて、所望の構造遺伝子を設計合成したとして、次にこ
れを宿主細胞内で発現させるためには大別して２つの方
法がゐり、本文ではそれらをキメラ発現法及び直接発現
法と呼ぶことにする。ここでいうキメラ発現法とは、用
いる宿主の内在性遺伝子（その宿主の耐性株に本来存在
する遺伝子）に所望の遺伝子を接続させた遺伝子（こ口
をキメラ遺伝子と呼ぶ）を作制し、このキメラ遺伝子を
適当なベクターに組込み、次に宿主を形質転換して発現
させる方法であり、発現された産物は対応する内在性の
ポリペプチドと所望の遺伝子にコードされたポリペプチ
ドが融合した形で生産される（これをキメラポリペプチ
ドと呼ぶ）。

キメラ発現法は、内在性遺伝子の発塩機構を用いて発現
させるので、外来遺伝子を比較的容易に発現させること
ができる場合が多いが所望のポリペプチドのみを単離す
る為にはキメラポリペプチドを化学的、酵素的に処理し
て、所望のポリペプチドを特異的に切り出しｔ＃製する
ことが必要であり製造工程がより長く複雑になるという
λ点を有している。

一万もう一つの発現法である直接発現法とは、所望の構
造遺伝子を翻訳開始信＠（通常ＡＴＧ）の直後に接続し
、得られた配列を発現用ベクターの転写及び翻訳を支配
する領域の適切な位置に挿入した組換えプラスミドを作
成し、次にそ（ｌわ の組換えプラスミドを用いて省土を形質転換して発現さ
せる方法であり、外来ポリペプチドは単独の完成した分
子として産生きれるのでキメラ発現法に比し製造工程が
より単純であり実用的に有利である。

しかしながら、直接発現法の場合外来遺伝子を効率良く
発現させるためには発現用ベクター内の転写と翻訳を支
配している領域（以下５′端の非翻訳領域と呼ぶ）の適
切な位置に外来遺伝子を挿入する必要があるが、この５
′端の非翻訳領域の望ましい化学構造（即ちヌクレオチ
ド配列）は、大腸菌、酵母等の宿主細胞に依って大きく
異なっているのみならず同一宿主細胞であっても所与の
構造遺伝子によって異なるものである事が知られて来つ
つあり、任意の構造遺伝子に対して望ましい非翻訳領域
の構造を予知する事は困難であって、試行錯誤的に最適
構造を探索しなければならないという困難さを伴ってい
る。

さらに、直接発現法によって、本来溶菌酵素（−〇） であるヒトリゾチームを微生物で生産する事に関しては
、発現したヒトリゾチームに依って組換え体が溶菌して
しまう事も考えられ、その可能性に疑念のさしはさまれ
る所であった。

本発明者らは、この様な状況の中でヒトリゾチームの直
接発現法による生産を目的として、構造遺伝子の設計、
５′端の非翻訳領域、宿主細胞及びその培養法等に詳細
な工夫を重ね研究を続けた結果、本発明上合物であるヒ
トリゾチーム遺伝子を用いればヒトリゾチームを高レベ
ルで直接発現させる事が可能である事を確認し、本発明
を完成するに芋った。

発明の構成 １）遺伝子の取得 本発明のヒトリゾチーム遺伝子は通常用いられているヌ
クレオチド合成法によって取得される。

宿主細胞によって種々の条件が考慮され得るが、通常最
も一般的に用いられている大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌ＋）　
　の場合について述べれば下記の通りである。

（１）遺伝子の設計 ｉ）構造遺伝子 ヒトリゾチームを構成するアミノ酸を 指定するいくつかのコドンのうちから下記の条件を満す
ものを選んでＤＮＡを合成する。

＋／％Ｇ−Ｃ塩基対に富む領域に続いてＡ−Ｔ塩基対に
富む領域が続かない様に する。

（均後記する各々の合成フラグメントが分子内あるいは
分子間で望まない相補 噛配列を持たない様にする。

また翻訳を開始終結せしめるため構造遺伝子の５′端に
翻訳開始信号を８′端に翻訳終止信号を付は加える。

；）　リボゾーム結合部位を含む５′端非翻訳領域 リボゾーム結合部位（以下Ｓ　Ｄ配列と傅す）を含む５
′端非翻訳領域のｌ）　Ｎ　Ａを下記の条件を満す様に
合成する。

（八　プロモーターから適当な距離をおいてＳｔ）配列
が配置される様にする。

（ｉ　合成ＳＤ配列は天然に序在するＳＤ配列と共通な
塩基配列を有する部分を 持ちかつ適当な長さのヌクレオチド配 列である様にする。

（ｑＳＩ）配列から適当な距離をおいて翻訳開始信号が
配置される様にする。

い　遺伝子全体 ヒトリゾチーム１ｆ伝子は （〜　プラスミドへの組込み、プラスミドからの切り出
しを容易にするため５′、８′両端に匍」限酵素認識配
列をもたせる。

（ｉ　形′ｉｉｊ帖換体の検索を容易にするため遺伝子
内に一つ又は二つ以上の制限酵 Ｃ〕３） Ｒ認識配列をもｆこせる。

（Ｑ　翻訳開始信号から始まる構造遺伝子部分のみの利
用も可能にするため翻訳 開始信号の直前で遺伝子を切断できる 様に制限酵素認識配列をもたせる。

ことが望ましい。

聾 このＩにして設計された構造遺伝子の一具体例は下記の
ヌクレオチド配列式（１）で表わされる遺伝子であり、
同遺伝子を適当な発現ベクターに組込む事により大腸菌
で発現させる事が可能である。

ヌクレオチド配列式（１） ％式％ Ｔ　ＣＴ　　Ａ　ＣＴ　　Ｇ　Ａ　ＣＴ　Ａ　ＣＧ　Ｇ
　ＴＡＧＡ　　　ＴＧＡ　　　ＣＴＧ　　　ＡＴＧ　　
　ＣＣＡＡＴＣＴＴＣＣＡＡ　　　Ａ′ｒＴ　　　ＡＡ
ＣＴ　Ａ　Ｇ　　　Ａ　Ａ　Ｇ　　　Ｇ　ＴＴ　　　Ｔ
　Ａ　Ａ　　　Ｔ　Ｔ　ＧＴ　　ＣＴ　　　　　Ａ　　
Ｇ　　Ａ　　　　　Ｔ　　Ａ　　ＣＴ　　Ｇ　　Ｇ　　
　　　Ｔ　　Ｇ　　ＴＡＧＡ　　　ＴＣＴ　　　ＡＴＧ
　　　ＡＣＣＡＣＡＡ　Ａ　ＣＧ　Ａ　ＣＧ　Ｇ　Ｔ　
　　Ａ　Ａ　Ｇ　　　Ａ　ＣＴＴＴＧ　　　ＣＴＧ　　
　ＣＣＡ　　　ＴＴＣＴＧＡＣＣＡ　　　Ｇ　Ｇ　ＣＧ
　ＣＣＧ　Ｔ　Ｔ　　　Ａ　Ａ　ＣＧＧＴ　　　ＣＣＧ
　　　ＣＧＧ　　　ＣＡＡ　　　’ｒＴＧＧＣＣＴＧＴ
　　　ＣＡＣＴＴＧ　　　ＴＣＴＣＧ　Ｇ　　　Ａ　Ｃ
Ａ　　　Ｇ　Ｔ　Ｇ　　　Ａ　Ａ　ＣＡ　Ｇ　ＡＴＧＴ
　　　ＴＣＴ　　　ＧＣＴ　　　ＴＴＧ　　　ＴＴＧＡ
ＣＡ　　　ＡＧＡ　　　ＣＧＡ　　　ＡＡＣＡＡＣＣＡ
　Ａ　　　Ｇ　Ａ　ＣＡ　Ａ　ＣＡ　ＴＣＣ；　ＣＴＧ
　’１”　′ｌ″　　ＣＴＧ　　　Ｔ”ｒＧ　　　ｌ’
ＡＧ　　　ＣＧＡＧ　Ａ　ＣＧ　ＣＣＧ　Ｔ　Ｔ’　　
　Ｇ　ＣＣｉ’　Ｇ　ＴＣＴ　Ｇ　　　ＣＧ　Ｇ　　　
ＣＡ　Ａ　　　ＣＧ　Ｇ　　　Ａ　ＣＡＧ　ＣＴ　　　
Ａ　Ａ　Ｇ　　　Ａ　Ｇ　Ａ　　　Ｇ　Ｔ　ＣＧ　Ｔ　
ＴＣＧＡ　　　ＴＴＣＴＣＴ　　　ＣＡＧ　　　ＣＡＡ
Ａ　Ｇ　Ａ　　　Ｇ　Ａ　ＣＣＣＡ　　　ＣＡ　Ａ　　
　Ｇ　Ｇ　ＴＴ　ＣＴ　　　ＣＴ　Ｇ　　　Ｇ　Ｇ　Ｔ
　　　Ｇ　Ｔ　Ｔ　　　ＣＣＡＡ　Ｔ　ＣＡ　Ｇ　Ａ　
　　Ｇ　ＣＴ　　Ｔ　Ｇ　Ｇ　　　Ｇ　Ｔ　Ｃ’ｒＡ　
Ｇ　　　Ｔ　ＣＴ　　ＣＧ　Ａ　　　Ａ　ＣＣＣＡ　Ｇ
Ｇ　Ｃ′ｒ　　　′ＦＧ　Ｇ　　　ＣＧ　′１’　　　
Ａ　Ａ　ＣＡ　Ｇ　ＡＣＧ　Ａ　　　Ａ　ＣＣＧ　ＣＡ
　　　１”　Ｔ　Ｇ　　　ＴＣＴ１”　Ｇ　Ｉ″　　Ｃ
Ａ　Ａ　　　Ａ　Ａ　ＣＡ　ｃ　Ａ　　　Ｇ　Ａ　ＣＡ
　ＣＡ　　　Ｇ　Ｔ　Ｔ　　　′Ｉ”１’　Ｇ　　　Ｔ
　ＣＴ　　　ＣＴ　Ｇ（ツク） Ｇ　Ｔ　ＣＡ　Ｇ　Ａ　　　ＣＡ　Ａ　　　Ｔ　Ａ　Ｃ
Ｇ　Ｔ　ＴＣＡＧ　　　ＴＣＴ　　　ＧＴＴ　　　ＡＴ
Ｇ　　　ＣＡＡ（’、Ａ　Ａ　　　Ｇ　Ｇ　Ｔ　　　Ｔ
　Ｇ　Ｔ　　　Ｇ　Ｇ　Ｔ　　　Ｇ　Ｔ　Ｃに　Ｔ　Ｔ
　　　ＣＣＡ　　　Ａ　ＣＡ　　　ＣＣＡ　　　ＣＡｃ
。

前記のヌクレオチド配列式（＋）で表わされる構造遺伝
子に前記のりボゾーム結合部位を含む５′端非翻訳領域
のヌクレオチド配列及び翻訳路ＩＦ信号を含む８′端の
制限酵素認識配列を付加した一例が下記のヌクレオチド
配列式（２）で表わされる遺伝子であり、同遺伝子は翻
訳開始信号、翻訳終止信号及びＳＤ配列を自からの内に
含んでいるため大腸菌に於いて使用し得る発現ベクター
の制限がより少なくなっている。また同遺伝子を、例え
ばＣ１ａ　Ｉ等の適当な制限酵素（後記の表１を参照）
で処理して適当な発現ベクターに挿入する事も可能であ
る。

ヌクレオチド配列式（２） ％式％ ＴＴＧ　　　ＧＣＣＡＡＧ　　　ＴＧＧ　　　ＧＡＡＡ
ＡＣＣＧＧ　　　Ｔ′ｒＣＡＣＣＣＴＴＴＣ’Ｉ”　　
　ＧＧＴ　　　ＴＡＣＡＡＣＡＣＴＡＧＡ　　　ＣＣＡ
　　　ＡＴＧ　　　ＴＴＧ　　　ＴＧＡＡＧＡ　　　Ｇ
ＣＴ　　　ＡＣＴ　　　ＡＡＣＴＡＣＴＣＴ　　　ＣＧ
Ａ　　　ＴＧＡ　　　ＴＴＧ　　　ＡＴＧＡＡＣＧＣＣ
（ンＧＴ　　　ＧＡＣＣＧＴＴＴＧ　　　ＣＧＧ　　　
ＣＣＡ　　　ＣＴＧ　　　ＧＣＡＴＣＴ　　　ＡＣＴ　
　　ＧＡＣＴＡＣＧＧＴＡＧＡ　　　ＴＧＡ　　　ＣＴ
Ｇ　　　ＡＴＧ　　　ＣＣＡＡＴＣＴＴＣＣＡＡ　　　
ＡＴＴ　　　ＡＡＣＴＡＧ　　　ＡＡＧ　　　ＧＴＴ　
　　ＴＡＡ　　　ＴＴＧＴＣＴ　　　ＡＧＡ　　　ＴＡ
ＣＴＧＧ　　　ＴＧＴＡＧＡ　　　ＴＣＴ　　　ＡＴＧ
　　　ＡＣＣＡＣＡＡ　Ａ　ＣＧ　Ａ　ＣＧ　Ｇ　Ｔ　
　　Ａ　Ａ　Ｇ　　　Ａ　ＣＴＴＴＧ　　　ＣＴＧ　　
　ＣＣＡ　　　ＴＴＣＴＧＡＣＣＡ　　　ＧＧＣＧＣＣ
ＧＴＴ　　　ＡＡＣＧ　Ｇ　Ｔ　　　ＣＣＧ　　　ＣＧ
　Ｇ　　　ＣＡ　Ａ　　　Ｔ　Ｔ　ＧＧ　ＣＣＴ　Ｇ　
Ｔ　　　ＣＡ　Ｃｒ”　Ｔ　Ｇ　　　Ｔ　ＣＴＣＧＧ　
　　ＡＣＡ　　　ＧＴＧ　　　ＡＡＣＡＧＡＴ　Ｇ　Ｔ
　　　Ｔ　ＣＴ　　　Ｇ　Ｃ”］’　　　Ｔ　Ｔ　Ｇ　
　　Ｔ　Ｔ　ＧＡＣＡ　　　ＡＧＡ　　　ＣＧＡ　　　
ＡＡＣＡＡＣＣＡ　Ａ　　　Ｇ　Ａ　ＣＡ　Ａ　ＣＡ　
Ｔ　ＣＧ　ＣＴＧ　Ｔ　Ｔ　　　Ｃ’Ｉ”　Ｇ　　　ｉ
’　Ｔ　Ｇ　　　Ｔ　Ａ　Ｇ　　　ＣＧ　ＡＧ　Ａ　Ｃ
Ｇ　ＣＣＧ　Ｔ　”Ｉ’　　　Ｇ　ＣＣＴ　Ｇ　ＴＣＴ
　Ｇ　　　ＣＧ　Ｇ　　　ＣＡ　Ａ　　　ＣＧ　Ｇ　　
　Ａ　ＣＡＧ　Ｃ′Ｉ’　　　Ａ　Ａ　Ｇ　　　Ａ　Ｇ
　Ａ　　　Ｇ　Ｔ　Ｃに　Ｔ　Ｔ’ＣＧ　Ａ　　　Ｔ　
Ｔ　ＣＴ　ＣＴ　　　ＣＡ　Ｇ　　　ＣＡ　Ａ（Ｊ／） ＡＧＡ　　　ＧＡＣｃＣＡ　　　ＣＡＡ　　　ＧＧＴＴ
　ＣＴ　　　ＣＴ　Ｇ　　　Ｇ　Ｇ　Ｔ　　　Ｇ　Ｔ　
Ｔ　　　ＣＣＡＡＴＣＡＧＡ　　　ＧＣＴ　　　ＴＧＧ
　　　Ｇ１’ＣＴＡＧ　　　ＴＣＴ　　　ＣＧＡ　　　
ＡＣＣＣＡＧＧ　ＣＴ　　　Ｔ　Ｇ　Ｇ　　　ＣＧ　Ｔ
　　　Ａ　Ａ　ＣＡ　Ｇ　ＡＣＧＡ　　　ＡＣＣＧＣＡ
　　　ＴＴＧ　　　ＴＣ’ｌ’ＴＧＴ　　　ＣＡＡ　　
　ＡＡＣＡＧＡ　　　ＧＡＣＡＣＡ　　　ＧＴＴ　　　
ＴＴＧ　　　ＴＣＴ　　　ＣＴＧＧＴＣＡＧＡ　　　Ｃ
ＡＡ　　　ＴＡＣＧＴＴＣＡＧ　　　ＴＣＴ　　　ＧＴ
Ｔ　　　ＡＴＧ　　　ＣＡＡＣＡＡ　　　ＧＧＴ　　　
ＴＧＴ　　　ＧＧＴ　　　ＧＴＣＧＴＴ　　　ＣＣＡ　
　　ＡＣＡ　　　ＣＣＡ　　　ＣＡＧＴＡＡ　　　Ｔ ＡＴＴ　　　ＡＣＴ　　　ＡＧ （３，２） 遺伝子の合成 上記のように設計した遺伝子を合成するには、＋、−両
鎖のそれぞれについて、これをいくつかのフラグメント
に分けて、それらを化学的に合成し各々のフラグメント
を連結するが法によれば良い。

各鎖は１１〜１９塩基からなり各々が少くとも６塩基づ
つ重なる様に５６個程度のフラグメントに分けるのが好
ましい。

フラグメントの合成、精製、５′−水酸基のリン酸化及
びフラグメントの連結はそれ自体公知の方法に従って行
う事ができる。具体的事項に関しては後記の実施例を参
照されたい。

２）　　Ｍ換えプラスミドの１＃袈 （１）　　ヒトリゾチーム遺伝子のプラスミドベクター
への導入 前記の様にｊノで合成したヒトリゾチーム遺伝子を宿主
内で増殖可能なプラスミドベクター又は宿主内で増殖、
発現が可能な様に構成されたプラスミドベクターの適当
な挿入部位に組込む。

組込み操作そのものは分子生物学の分野で公知の常法に
従って行うことができる。

具体的な方法については後記の実施例を参照されたい。

本発明によるヒトリゾチーム遺伝子の増殖は１）ＢＲ８
２２，ｐＡＴ１５Ｂ　（例えばＴｗｉ　ｇｇら、Ｎａｔ
ｕｒｅ　、２８８．２１６〜２１８（１９８０）参照）
等の公知の種々のプラスミドベクターを用いて行う事が
できる。また、ブラダミドＤＮＡ０単離精製も分子生物
学の分野で公知の常法に従って行う事ができる。

本発明遺伝子によるヒトリゾチームの直接発現は宿主細
胞によって適宜の方法をとり得るが大腸菌に於いてはＩ
ａｃプロモーター（例えばＦｕｌｌｅｒ　、　Ｇｅｎｅ
　、　１９　　、４８〜５４（１９ｇ２）　　参照）、
ｔｒｐプロモーター（例えばＷｉｎｄａｓｓら、Ｎｕｃ
ｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、。

１０．６６８９〜６６５７（１９８２）参照）、ｔａｃ
プロモーター（例えばＢｏｙｅｒら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ
ｉＡｃａｄ、Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　、　ｇＱ　　。

２１〜２５（１９８Ｂ）参照）、ＰＲプロモーター（例
えばｄｅＨａｓｅｔｈら、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ　
Ｒｅｓ、、　　１１．　’ＩＴＢ〜７８１（１９８Ｂ）
参照）、ＰＬプロモーター（例えばＤｅｒｏｍら、Ｇｅ
ｎｅ、１７　．４５〜５４　　（１９８２）参照）及び
ｔｐｐ　　プロモーター（例えばＮａ　ｋａｍｕ　ｒ　
ａら、ＥＭＢＯＪ　Ｉ　７７１〜７７５（１９８２）参
照）等を有する公知の舗々の発現ベクター（例えば中村
、化学と生物〜？０４７〜５８（１９８２）及びＭａｎ
ｉａｔｊｓらＭｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　４
０８〜４８ｇ（１９８２）参Ｍ４）を用いて行うことが
できる。

これらの発現ベクターのうちの一興体例はｐＭＹｌ２−
６　Ａｍｐ−１及びｐ　５Ｍ２４０である。

ｐＭＹｌ　２−６　Ａｍ１）−１はｐＭＹｌ２−６（例
えばＴｓｕｒｉｍｏｔｏら、Ｍｏｌ　、Ｇｅｎ　、Ｇｅ
ｎｅｔ（３夕） １８７　　７９〜８６（１９８２）　　参照　ン　と　
ｐＢＶ２８４（例えば０ｈｔｓｕｂｏら、Ｇｅｎｅ　２
０２４５−２５４（１９８２）参照）とから以下のよう
にし丁造成する事ができる。

ｐＢＶ１４をＰＲを夏で切断しアンピシリン耐性遺伝子
の一部を含む約２．Ｂｂｐの断片をとり出し、ｐＭＹｌ
２−６のＰｓｔｌ切断部位にアンピシリン耐性遺伝子が
再生する様に挿入Ｌ　テｐＭｙ　１２−６　Ａｍｐを得
る。ｐＭＹｌ２−６ＡｍｐをＢａｍＨＩで限定分解した
後、その粘着末端をＤＮＡポリメラーゼ（フレノルフラ
グメント）を用いて修復し、ＤＮＡリガーゼで連結して
、ｐＢＶ２８４出来のＤＮＡ断片中に含まれるＢａｍＨ
Ｉ切断部位のみが消失したｐＭＹｌ２−ｅＡｍｐ−１を
ｆｉる。

９８Ｍ２４０はｐＤＲ５４０（例えば Ｒｕ５ｓｅｌｌ　　ら、Ｇｅｎｅ　　２０　２Ｂ１〜２
４Ｂ（１９８２）参照）及びｐＩＮ−ｉｎ−Ａ＋　（例
えばＭａｓｕｉ　　ら、　ｆ３＋ｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇ
ｙ　　２　８　１〜８５（１９８４）参照）から造成す
る事ができ、ｐＤＲ５４０のＢ　ａｍｔ（ｔ　　及（３
〆〕 びＰｓｔ１部位間のｔａｃ　　プロモーターヲ含む約１
．２ＫｂＩ）断片とｐＩＮ−ｌ−ＡｔのＢａｍＨＩ及び
Ｐｓｔ１部位間の１ａｃｉ遺伝子を含む約６．２Ｋｂｐ
　　断片を連結する事によって造成するかができる。

具体的には実施例及び図面２を参照されたい。

（２）　　方向性の判定 プラスミドに組込まれたヒトリゾチーム遺伝子の方向性
の判定は遺伝子内に含まれる特定の塩基配列を認識する
制限酵素（例えば、Ｃ１ａｌ　、　ＢｓｔＥＩＩ　　、
　Ｘｂａｘ等であり、後記の表１を参照されたい） でその部位を切断し、遺伝子外の特定部位を別の制限酵
素を用いて切断１７て、得られた断片のサイズをアガロ
ースゲル電気泳動等の通常用いられている方法で分析す
る事により行う事ができる。

３）形質転換 ｔｌｌ　　１ｄ主菌 ヒトリゾチーム遺伝子を組込んだ組換えプラスミドを用
いて形質転換させる宿主細胞の大腸菌での一具体例はＥ
、　ｃｏｌｉ　Ｃ６００（例えばＮｅ　ｌ　ｓｏｎらＶ
ｉｒｏｌｏｇｙ　１０８８８８〜８５０（１９８１）参
照）である。

ヒトリゾチーム遺伝子を組込んだ組換えプラスミドによ
る形’ｊｉｉ転換は上記の宿主に限定されるものではな
く、公知の種々のＥ、ｃｏｌｉ　Ｋ−１２株誘導体（例
えばＢａｃｈｍａｎｎ　。

Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、Ｒｅｕ、８６　５２５〜５５７（
１９７２）参照）を使用することができる。

これらのＥ、ｃｏｌｉ　Ｋ−１２株誘導体の多くのもの
は公認の微生物機関、例えばＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅ
　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　（ＡＴＣＣ
）　、　Ｉｎ寄託されておりそこから分譲が可能である
（例えばＡＴＣＣカタログ参照）。

また分子生物学の分野で公知の如く、適当なベクターを
選べばより広範囲の細菌種より適当な宿主を選択する事
も可能である。

（２）形質転換 形質転換操作そのものは、分子生物学の分野で公知の常
法に従って行う事ができる。

（例えばＣｏｈｅｎら、Ｒｒｏｃ、　Ｎａｔｌ　、　Ａ
ｃａｄ、　Ｓｃｉ。

ｔＪｓＡ　　６９　２１１０〜２１１４（１９７Ｆ）及
びＭａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎ
ｉｎｇ　　２４９〜２５Ｂ（＋９８２）参照）。

（８）　　形質転換体 大腸菌に於ける形質転換体の具体例は、Ｅ、ｃｏｌｉ　
Ｃ６００１ｐＰＬＨＬＹ−１、又はｐＴＣＨＬＹ−１で
形質転換させて得た形質転換体であって、本発明ではそ
れらを Ｅ、　ｃｏｌｉ　Ｃ６００（１）ＰＬｔ（ＬＹ−１）　
、　Ｅ。

ｃｏｌｉ　Ｃ６００（ｐＴＣＨＬＹ−１”）と命名した
。

４）ヒトリゾチームの生産 この様にして得た形質転換体を分子生物学及び必酵学の
分野で公知の常法に従って培養すればヒトリゾチームが
生産される。

ヒトリゾチーム遺伝子の発現は、試験管内無細胞タンパ
ク質合成系（例えばＺｕｂａｙ　。

Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　６５　
８５６（１９８０）参照）及びＭａｘｉｃｅｌｌ　法（
例えば５ａｎｃａｒ　　ら、Ｊ、Ｍｏｌ　、　Ｂｉｏｌ
、υ１８　４５　　（１９８１）参照）等の公知の方法
を用いて確認する事ができる。

ヒトリゾチームは公知のラジオイムノアッセイ（例えば
Ｙｕｚｕｒｉｈａ　らＣｈｅｍ、　Ｐｈａｒｍ。

Ｂｕｌｌ、２７　２８０２〜２８０６（＋９７９）及び
Ｙｕｚｕｒ　ｉｈａらＣｈｅｍ、　Ｐｈａｒｍ、　Ｂｕ
ｌｌ、　２８９０８〜９１４（１９７８）参照）、酵素
活性測定法（例えば５ｉｄｈａｎら、Ａｇｒｉｃ、　Ｂ
ｉｏｌ、Ｃｈｅｍ。

１下−１８１７〜１８２８（１９８１）及びＭ５ｒｓｋ
ｙＡｎａ１．Ｂｉｏｃｈｅｍ、　　１２８　７７−８５
（１９８Ｂ）参照）等で用いて検出、定量することがで
きる。

また生産したヒトリゾチームは生化学及び醗酵学の分野
で公知の常法を適宜組合わせて回収、精製することがで
きる。

具体的蓼項に関しては後記の実施例を参照されたい。

実施例 ヒトリゾチーム遺伝子の設計 ＣケＯ） 上記の表１に示した塩基配列の遺伝子を設計した。設計
の手順は下記の通りである。

山　コドンの選定 ヒトリゾチーム構造遺伝子のコドンを 表１に示した通りに選ぶ。

（２）　　構造遺伝子の５′端に翻訳開始コドンＡＴＧ
を付加し、８′端に２個の翻訳終止コドン（ＴＡＡ及び
ＴＧＡ）を付加する。

Ｉ８）　ＡＴＧの上流ニｍＲＮＡ　ｃｙ）リポゾーム結
合部位に対応する配列を含み、同時に翻訳開始コドンＡ
　Ｔ　Ｇの直前ニｃｌａＩｉ＠威配列が配置される様な
配列 ＧＴＴＡＧＧＡＧＴＴＴＡＡＴＣＧ　　を付加する。

（４）　　Ｂａｍ　ＨＩ　認識配列の粘着末端に相当す
る配列を５′端にＳａｕ　３ＡＩ　ｍ繊配列の粘着末端
に相当する配列を３゛端に付加する。

以上の様にして設計された遺伝子は、構造遺伝子内部＋
ｃ　Ｃ１ａ　Ｉ　、Ｔａｑ　ｒ　、　Ｂａｌ　ｒ　。

ＨａｅＬ［Ｉ　、Ｍｂｏｎ　　、ＢｓｔＥｎ　、Ｍｓｐ
　■。

１（ｉｎ　ｉｘ　　、Ａｌｕ　■、Ｈｐａｔ［、Ｈｐｈ
　■、ＸｂａＩ。

Ｎａｒ　Ｉ　、Ｈｉｎ　ｃｕ　　、ＨｓｔＮＴ　　、Ｅ
ｃｏＲＩＩ　　。

Ｂｂｅｒ、　ｔ（ｐａｔ、　Ｈｇａｒ及びＩ）ｄｅｌｉ
ｌ識配列を含むものである。

ＣＬ、ｔＪ） １Ｎ開昭６１−７８３８７　（１４） Ｃ／）＜ フラグメントの化学合成 前記のようにして設計したヒトリゾチーム遺伝子は、表
−２に示す５６個のフラグメントに分けて合成した。

これらのオリゴヌクレオチドフラグメントは公知の方法
（例えば、Ｉ　ｔａｋｕｒａら、Ｎｕｃｌｅｉｃ、Ａｃ
１ｄｓＲｅｓ、　　１０　１７５５（１９８２）参照）
に準じ固相合成法に合成した。

ヌクレオシドを導入した架橋度１％のポリスチレン樹脂
は市販のパーＩチム社製のものを用いた。

完全に保護したジヌクレオチドは市販の日本ゼオン社製
、ヤマサ社製及び公知の方法（例えばＧａ５ｊら、Ｎｕ
ｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５９　１６９１（１９８
１）参照）に準じ自ら合成したものを用いた。

オリゴヌクレオチドフラグメントの合成法をペンタデカ
ヌクレオチド ＧｐＡｐＴｐＣｐＣｐＧｐＴｐＴｐＡｐＧｐＧｐＡｐＧ
ｐＴｐＴの合成の場合について述べれば下記の通りであ
る。

完全に保護したチミジン４μ＋ｎｏｌをリンカ−を介し
て結合したポリスチレン樹脂４０■をＩＭＸ化岨姶を含
む塩化メチレン−イソプロパツール（８５：　１５　、
　ｖ／ｖ　）溶液１−でジメトキシトリチルカチオンの
赤色がほぼ生じなくなるまで８０秒間ずつ６回ないし７
回処理することにより５′水酸基のジメトキシトリチル
保護基を除去した。

次に完全に保護したジヌクレオチドｃｐ’ｒｐ（以下保
護基を省略して略記する）２５１Ｉｖをトリエチルアミ
ン：ピリジン（１：１゜ｙ／ｖ　）溶液２−で室温１時
間処理して８′端リン酸のシアノエチル基を除去し、ピ
リジンと共沸することにより水分を除去した後、２．４
．６−トリメチルベンゼンスルホニルー８−ニトロトリ
アゾリド８０ｑ存在下無水ピリジン０．２−中で上記の
ポリスチレン樹脂に導入したチミジンと４０″０５ＢＯ
分間縮合させた。

ピリジン２−で樹脂を洗浄後、５０ｑのジメチルアミノ
ピリジンを含むピリジン−無水酢酸（９：　ｌ　、　Ｖ
／ｖ　）溶液１−で処理して未反応のチミジンの５′位
水酸基をアセチル化した。

以下完全に保護したジヌクレオチドとしてＧｐＡｐ　　
、　ＡｐＧｐ　　、　”ｒｐ’ｒｐ　　、　ｃｐｃｐ　
　。

ＴｐＣｐ及びＧｐＡｐ各々２５りを順次使用し、脱ジメ
トキシトリチル化と縮合反応を繰返すことにより保護し
たペンタデカマーを合成した。

最終縮合後樹脂をピリジン２−で洗浄し、次いで０，５
Ｍピリジンアルドキシム及びテトラメチルグアニジンを
含む９０％ピリジン水ｌ−で４０°Ｃ，１日間処理して
オリゴマーを樹脂から切り離し、２８％アンモニア水８
−で６０°Ｃ１４時間処理することにより５′端のジメ
トキシトリチル基以外はすべて脱保護されたペンタデカ
マーを得た。

同ペンタデカマーを高速液体クロマトクラフィーで逆相
系担体（Ｃｏｓｍｏｓ目　５Ｃ１８・平井化学社製）を
用い０．１Ｍ酢酸−トリエチルアミン緩衝液（ｐＨｓ、
５＞中アセトニトリルの直線濃度勾配による溶出にて精
製１）た。

上記精製液を減圧留去にて約５０　ｏ、ｔ、ｌに濃縮し
た後、最終濃度８０％となるように氷酢酸を加え、室ｍ
１５分間処理することによりジメトキシトリチル基を除
去した。

これを上記の方法により高速液体クロマトグラフィーで
精製し、１０　０Ｄ２６０単位の完全に脱保護したペン
タデカマーを得た。

同様の方法で表−２に示した他の５５個のフラグメント
を合成した。

（！Ｑ） 日ＬＹ−１８ｄ（Ｇ−Ｔ−Ｇ−Ｔ−Ｔ−Ｇ−Ｔ−Ａ−Ａ
−ＨＬＹ−１９ｄ（Ｔ−Ａ−Ｃ−Ａ−Ａ−Ｃ−Ａ−Ｃ−
Ｔ−ＣＣ−Ａ−Ｇ−Ａ−Ｔ）　　　　　　　　　　１５
Ａ−Ｇ−Ａ−Ｇ−Ｃ−Ｔ）　　　　　　　　　　　　１
６ＨＬＹ−２０ｄ（Ｔ−Ａ−Ｇ−Ｔ−Ｔ−Ａ−Ｇ−Ｔ−
Ａ−’ＨＬＹ−２１ｄ（Ａ−Ｃ−Ｔ−Ａ−Ａ−Ｃ−Ｔ−
Ａ−Ｃ−ＨＬＹ−２２ｄ（Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ｃ−Ａ−Ｃ
−Ｃ−Ｇ−ＩＨＬＹ−２８ｄ（Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ｇ−Ａ−Ｃ
−Ｃ−Ｇ−Ｔ−’ＨＬＹ−２４ｄ（Ｃ−Ｃ−Ｇ−Ｔ−Ａ
−Ｇ−Ｔ−Ｃ−Ａ−ＩＨＬＹ−２５ｄ（Ｇ−Ａ−Ｃ−Ｔ
−Ａ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−。

ＨＬＹ−２６ｄ（八−Ｇ−Ｔ−Ｔ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ｔ−Ｔ
−ＩＨＬＹ−２７ｄ（Ｃ−Ａ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ｔ−Ａ−Ａ
−Ｃ−’ＨＬＹ−２８ｄ（Ｃ−Ａ−Ｃ−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ｔ
−Ａ−Ｔ−ＩＨＬＹ−２９ｄ（Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ｇ
−Ｔ−Ａ−Ａ−ＩＨＬＹ−８０ｄ（Ｇ−Ｔ−Ｃ−Ｔ−Ｔ
−Ａ−Ｃ−Ｃ−Ｇ−’（！ｌ） ム−υ　１為−％Ｊ　　ｖ　Ａノ　　　　　　　　　　
　ｌυ：；−Ｃ−Ｔ−Ｃ−Ｔ−Ａ）　　　　　　　　　
　１５へ−Ａ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ｃ）　　　　　　　　　　
１５；　Ｃ−Ｇ−Ｔ−Ｔ−Ｇ）　　　　　　　　　１５
ｒ−Ｃ−Ｔ−Ａ−Ｃ−Ｔ）　　　　　　　　　　１５；
−Ｔ−Ａ−Ｇ−Ａ−Ａ）　　　　　　　　　　１５へ−
Ｔ−Ｃ−Ｔ−Ｔ−Ｃ）　　　　　　　　　　　１５；−
Ｇ−Ａ−Ａ−Ｇ−Ａ−Ｔ−Ａ）　　　　　　　１７ｒ−
Ｃ−Ｔ−Ａ−Ｇ−Ａ−Ｔ−Ａ）　　　　　　　１７：−
Ｔ−Ａ−Ｇ）　　　　　　　　　　　　　１８ニーＧ−
Ａ−Ｃ）　　　　　　　　　　　　　　１８ｒ−Ｃ−Ｇ
−Ｔ−Ｔ−Ａ）　　　　　　　　　　１５リン酸化及び
フラグメントの連結反応 上記の化学合成した５６個の７ラグメントを表１に示し
た如（Ａ、Ｉの９つのプロ９りに分け、各ブロックを連
結し、さらに（Ａ〜Ｃ）、（Ｃ，Ｆ）及び（Ｇ、Ｉ）の
各ブロックを連結した後、（Ａ−Ｃ）、（Ｄ−Ｆ）及び
（Ｇ〜Ｉ）ブロックを連結して全体のヒトリゾチーム遺
伝子を合成した。５６個のフラグメントのうち両端に当
るｔ（ＬＹ−１及び）ＩＬＹ−５６を除＜５４個のフラ
グメントをＡ〜■の各ブロックごとにまとめて、その６
′端の水酸基をリン酸化し、ひきつづいて連結反応を行
った。

リン酸化及び連結反応の詳細を表１のブロックＡの場合
について述べれば下記の通りである。

リン酸化を行う８個のフラグメント （ＨＬＹ−２〜ＨＬＹ−ｇ）各２μｇの混合物を８．４
単位のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ、Ｊユ ９５　ｐｍｏｌのＣｒ−１）３Ａ　Ｔ　Ｐ　（２９００
ＣｉＡｎｍｏｌ）、１ｍＭスペルミジン、５０ｍＭジチ
オスレイトール（Ｄ　ＴＴと略記）１００　ｍＭＭｇｃ
ｚｇ　、　５００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ロＣｔ（ｐＨ７，５
）及びｌ　ｍＭ　ＥＤＴＡを含む７０＃ｔの反応液中で
８７　”０　、６０分間インキュベートした４、次に６
５′Ｃで１０分間インキユベーした後水冷した。

フラグメントＨＬＹ−１２ｔ４ｆを加え２０　ｍＭＴｒ
ｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ７，５）及び１０ｍＭＭｇｃｔ２　
となるようニＩ　Ｍ　Ｔｒｉｓ　−ＨＣｔ（ｐＨ７Ｊ）
及びＩ　Ｍ　ＭｇＣｔｇを添加し６５°ＣＩθ分間イン
キュベートした後８７”Ｃ５８０分間さらに室温（約２
５°Ｃ）、２０分間靜装した。

次に、ＡＴＰ及びＤＴＴを各々０．４　ｍ　Ｍ及びｌＱ
ｍＭとなるように加え１１″Ｃで１０分間インキュベー
トした後２２単位のＴ４リガーゼを加え１１゛Ｃで１２
時間反応させ連結させた。

反応１１Ｔ後フエ／−ル抽出、エタノール沈澱を行いＤ
ＮＡを回収し５０＃ｔのＴＥ緩（Ｉ３） 伽液（１０ｍＭＴｒｉｓ　−ＨＣＬ　ｐＨ７，５。

１ｍＭＥＤＴＡ）　　に溶解して一２０゛Ｃで保存した
。

同様にしてＨＬＹ−１０−１（ＬＹ−１４よりブロック
Ｂを、１−ｊＬＹ−１５・−ｔ（ＬＹ−１８よりブロッ
クＣを、ｆ（ＬＹ−１９〜ｔ（ＬＹ−２２よりプロ・Ｉ
りＤを、ＨＬＹ−２８〜１−ＴＬＹ−２６よりブロック
Ｅを、１（ＬＹ−２７〜ＨＬＹ−８１よりブロックＦを
、ＨＬＹ−！３２〜Ｅ（ＬＹ−８８よりブロックＧを、
ＨＬＹ−８９〜ＨＬＹ−４７よりブロックＨを、■ＬＹ
−４８〜ＨＬＹ−５６よりブロックＩを合成した。

ブロックＡ、Ｂ及びＣの連結反応物のそれぞれ平置（２
５μｔ）を混合しエタノール沈澱により回収した後、プ
ロ・ＩりＡの連結反応に使用しｔコものと同じ組成の反
応液中で１１℃、１２時間反応させた。

１５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動で生成物を分離
して目的の（Ａ−Ｃ）プロツ（夕’Ｉ−） りを得た。

同様にしてブロックＤ−Ｆよりブロック（Ｄ−Ｆ）を、
ブロックＧ、Ｉよりブロック（Ｇ、Ｉ　）を合成した。

次にプローｌり（Ａ、Ｃ）、（１’）〜Ｆ）及び（Ｇ、
Ｉ）を混合し、これをブロックＡの連結反応に使用１・
たものと同じ組成の反応液中で１１°Ｃ５１７時間反応
させ全長遺伝子を得た。この全長遺伝子を含む連結反応
混合物をそのままベクターとの結合反応に使用した。

クローニング プラスミドｐＢＲ８２２１０μｆを１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ
　−ＨＣｔ　（ｐ　ｆ（７，５）、５　Ｑ　ｍＭ　Ｎａ
Ｃ６゜１０　ｍＭ　ＭｇＣｔｇ及び５０単位の制限酵素
ＢａｍＨＩ　　を含む５０μｔの反応液中で８７°Ｃ１
２時間インキュベートした後フェノール抽出、エタノー
ル沈澱を行った。

このＤ　Ｎ　Ａ　８．５　μｆと前述のＨＬＹ全長遺伝
子を含む連結反応混合物の半鳳とを混合し、２０　ｍＭ
　Ｔｒｉｓ　−ｋｌｃＬ　ｐＨ７，５、同ｍＭＭｇＣｔ
２．０．４　ｍｔｖｌＡＴＰ　、　１０ｍＭ　Ｄ′ｒＴ
及び１８単位のＴ４　ＤＮＡ　　リガーゼを含む２００
ｓＬの反応溝中で１１”Ｃ，１８時間反応させた。

次にこの反応液を用いて大腸菌Ｅ、ｃｏｌｉＣ６００株
を形質転換し、アンピシリン抵　。

抗性（４０ａ　Ｉ／ｄ　）　、テトラサイクリン感受性
（］　Ｑ　ｔａｆｌ／ｄ　）の形質転換体を得た。

行ッテ、ｐＢＲ８２２（７）　Ｈａｍ１４Ｉ　　部位に
合成ヒトリゾチーム遺伝子が図面１で示される様に挿入
された組換えプラスミド（以下このプラスミドをｐＨＬ
Ｙ−１と呼ぶ）を含む形質転換体を選び出した。

組換えプラスミドｐＨＬＹ−１をＳａｕ　３ＡＩ　。

ＢａｍＨＩ／１（ｉｎｄ　ｍ及びＢａｍＨｔ　／Ｘｂａ
　Ｉ　　で処理し８％ポリアクリルアミドゲル璽気気泳
動行って各々４１８ｂｐ、５５９ｂｐ及び２０５ｂｐの
フラグメントを単離した。

それぞれのヌクレオチド配列をＭａｘａｒｎ　−Ｇ＋１
ｂｅｒｔ法（例えばＭａｘａｍら、　Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＶＳＡ　　７４　５６０
（？９７７）＃照）で解析した結果ｐＨＬＹ−１ノＳａ
ｕ　３ＡＩ　４１８　ｂｐ　　フラグメントは表１に示
した計画通りのヌクレオチド配列であった。

ブラズεドｐｌ）ｋ５４０　１５μｇ　を１　０　ｍＭ
′ｆ”ｒｉｓ−ｔ（Ｃｚ　ｐＨ７，４、６０ｍＭ　Ｎａ
Ｃｔ。

１０　ｍＭＭｇｓ０４．　ＩｍＭ　ＤＴｌ”　、　　５
０４１位の制限酵素ＢａｍＨｒ及び５０単位の制限酵素
Ｐｓｔｌを含む５０＃ｔの反応液中で８７゛Ｃ１２時間
反応させた後１％アガロースゲル電気泳峻を行い、ｔａ
ｃプロモーターを含む約１．２Ｋｂｐ　　の断片を回収
した。

プラスミドｐｌＮ−ｍ−Ａ＋　１８　μｆ　を上記と全
く同様に処理してＩａｃ　ｒを含む約６，２Ｋｂｐの断
片を回収しｔこ。

（ｔ２） 上記のｔａｃプロモーターを含む約１，２Ｋｂｐ断片１
６０　ｎｇとｌａｃ　Ｉ　　を含む約６．２Ｋｂｐ断片
２００１ｇを２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＬｐ　Ｈ７，６，
１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２、ｌ　ＯｍＭ・ＤＴＴ、５　ｍＭ
　ＡＴＰ及び８単位ｃ７）Ｔ４　ＤＮＡ　　リガーゼを
含む２０μｌの反応液中で１６”Ｃ，１５時間反応して
連結させた。

次にこの反応液を用いて大腸菌Ｅ、　ｃｏｌｉ２９４株
を形質転換しアンピシリン（５０μｆ／−）抵抗性の形
質転換体を得た。

行って図面２に示される様な発現ベクターｐｓＭ２４０
を含む形質転換体を選び出した。

発現用組換え体の作成 プラスミドｐＭＹ１２−６　Ａｍｐ　１２０　ａｌｔを
１０　ｍＭ　Ｔｒ　ｉｓ　−ＨＣｚ　ｐＨ７，５，５０
ｍＭＮａＣｚ、１０　ｍＭ　ＭｇＣｔｓ　　及び４０単
位の制限酵素ＢａｍＨｒ　　を含む４０μｔの反応液中
でＢ７°Ｃ１２時間インキュベートした後エタノ−（、
ｉ″′〜 ル沈鑵を行った。

プラスミドｐＨＬＹ−１２５μｇを１０ｍＭ　　Ｔ　ｒ
　ｉ　５−Ｈ（’、Ｌ　　ｐ　）（７，５、１００ｍＭ
　　ＮａＣｚ　。

１０　ｍＭＭｇｃｚ２　　及び６４単位の制限酵素Ｓａ
ｕ　３ＡＩを含む１００　μｔ　の反応液中で８７′Ｃ
１２時間インキュベートした後５％４？リアクリル？ｉ
ドゲル電気泳動を行い４１　ａｂｐの合成ＨＬＹ遺伝子
を回収した。

上記０）　ｐＭＹｌ　２−６　Ａｍｐ−１０，２ａ　ｇ
及びＨＬ　Ｙ遺伝子ＬＬａｆを６６　ｍＭＴｒｉｓ　−
ＨＣｔ　ｐＨ７，５，１０ｍＭ　ＭｇＣｔ２．１０ｍＭ
ＤＴＴ。

８ｍＭＡＴＰ及び１．５単位のＴ’４　ＤＮＡ　　リガ
ーゼを含む２０ａＬの反応液中で１５”Ｃ１１４時間反
応させた。

次にこの反応液を用いて大腸菌Ｅ、ｃｏｌｉ０６００株
を形質転換しアンピシリン抵抗性（８０ｂｙ／ｄ　）の
形質転換体を得た。

行って図面８に示される様な組換えプラズミドｐ）’Ｌ
ＨＬＹ−１を含む形質転換体を選び出した。

この形質転換体をＥ　、　ｃｏｌｉ　Ｃ６００（ｐＰＬ
）ＪＬＹ−１）を命名した。

プラスミドｐＳＭ２４０を用いて上記と全く同様に１ノ
でそのＢａｍ日■部位に）（ＬＹ遺伝子を挿入しＥ、　
ｃｏｌｉ　Ｃ６００株形質転換した。

上記と同様にして図面８に示される様な組換えプラスミ
ドｐＴＣ１（ＬＹ−１を含む形質転換体を選び出した。

この形質転換体をＥ、ｃｏｌｉＣ６００（ｐＴＣ）（Ｌ
Ｙ−１）と命名した。

ヒトリゾチーム遺伝子の発現を下記の方法によって確認
した。

に）　　試験管内無細泡タンパク質合成系による方法 無細胞タンパク賓合成系及び傾城アミ （〆／） ノ酸は各々Ａｍｅｒｓｈａｍ　社製の ＰＲＯＫＡＲＹＯＴＩＣＤＮＡ−ＤＩＲＥＣＴＥＩ）Ｔ
ＲＡＮＳＬＡＴＩＯＮ　ＫＩＴ　及びＬ−（、Ｓ＋−メ
チオニンを用い、方法は手順書の記載に従って以下のよ
うに実施した。

溶液２７゜５＃ｔ、溶液８８μを及 びＬ−〔）計Ｓ］−メチオニン（８８ μＣｉ　）を混合し、この混合液にテンブレー）、ＤＮ
ＡとしテｐＭＹｌ　２−６　Ａｍｐ−１（ＣＤ）、（Ｅ
ｌ）父はｐｐｒ、ｋＩｔ、ｙ　−１（（’Ｂ）、（Ｃ１
）を２．５ｎｙ加え、溶液５を総量が２５μ乙になる様
に添加した。

また同時にｌ）　Ｎ　Ａを添加しない試料（〔Ｆ〕）も
対照として調製した。

次ＩＣ溶１１　５　ｔｓＬ　ヲ加Ｌ　２８°Ｃ（ｒｃ’
：］。

〔Ｅ〕）又は４２°Ｃ（（Ｂ）　、　（１））　、　Ｃ
Ｆ）　）で６０分間インキュベートした後溶液７５μｔ
を加えさらに５分間２８゛Ｃ又は４２°Ｃでインキュベ
ートした。

（ご−２） 反応終了後、反応混合物を氷冷し、分子渥マーカー（〔
Ａ〕）とともｓｃ　Ｌａｅｍｍｌ　ｉの方法（Ｌａｅｍ
ｍｌｉ、Ｎａｔｕｒｅ　　２２７６８０（１９７０））
に従って１５％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動を行いオートラジオグラフィーを行った、その結果を
図面４に示した。

図面４に示した如く、テンプレート ＤＮＡとしてｐＰＬＨＬＹ−１を用いた場合にのみ、ヒ
トリゾチーム遺伝子産物と考えられる約１．４．７　Ｋ
ダルトンのＩ白質バンドが検出された。

またこのバンドの倫度は２８°Ｃで反応させた場合に比
べて４２°０で反応させた場合に著しく増大しており、
温度で誘導可能なＰＬプロＬ−ター支配下の産物である
と考えられた。

＋ｉ’、ｌ　Ｍａｘｉｃｅｌｌ法 ｇ、　ｃｏｌｉ　Ｃ３Ｒ６０Ｂ　　株の形質転換は公知
の常法（環内、細胞工学　２８８２ （１９８Ｂ））に従って行い、形質転換体はｎｏ”ｃで
培養した。

Ｅ、　ｃｏｌｉ　Ｃ５Ｒ６０Ｂ　（ｐＭＹ　１２−６Ａ
ｍ２−６Ａ　）（（Ａ）　、　ＣＢ）　’）及びＥ、　
ｃｏｌｉ　Ｃ３Ｒ６０Ｂ（ｐＰＬ）ＩＬＹ−１）（（Ｃ
）　、　ＣＤ］）を６０Ａｇ／−のアンピシリンを含む
に培地（１％カザミノ酸、０．１Ａｇ／−チアミンを含
むＭ９培地）５＠を中で２８　’ｒ！で一夜培養した。

この培養液を５０−のに培地に加え２８′Ｃで培養し０
Ｄ６６０　＝　０．２まで増殖させた。各々の培＃液２
０−づつを２枚の！黒画シャーレに移＋７、ゆるやかに
攪拌しながら紫外線ランプ（＊芝製１６Ｗ）直下７０ｃ
１ｎの距離で７秒間（ＣＢ）　、　ＣＤ）　）又は１５
秒間（（Ａ）　、　ｃｃ〕）照射した。

照射後、培養液を２００−の三角フラスコに移し２８°
Ｃ２時間培養した。サイクロセリンを１００　ｔＡｇ／
−になる様に加え２８°Ｃで１５時間培誉した後２５０
０ｒｐｍ、１０分間の遠心分離を行って集菌した。菌体
を５−のＨｅｒｓｈｅｙ　　５ａｌｔで２回洗浄後５−
のＨｅｒｓｈｅｙ培地に懸濁し２８°Ｃで１時間培養し
た。

Ｌ　−（８５５）−メチオニンを５０μＣｉ層になるよ
うに加え４２°Ｃで１時間培養した後１５Ｋｒｐｍ、１
０分間の遠心により集菌した。これを、分子量マーカー
（〔Ｅ〕）とともにＬａｅｍｒｎｌｉの方法に従って１
５％５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行いオ
ートラジオグラフィーを行った、その結果を図面５に示
した。

図面５に示した如く、Ｅ、　ｃｏｌｉ　Ｃ３Ｒ６０Ｂ（
ｐＰＬＨＬＹ−１）にのみヒトリゾチーム遺伝子産物と
考えられる約１４．７にダルトンの蛋白質バンドが検出
された。

【図面の簡単な説明】

図面ｌは合成ヒトリゾチーム遺伝子のクローニングを示
した図である。 図面２は発現用ベクターｐｓＭ２４０の作成法を示した
図である。 図面８は発現用組換えプラスミドｐ　Ｐ　Ｌ　ＨＬ　Ｙ
−ｉ及びｐ’Ｉ’ＣＨＬＹ−１の作成法を示した図であ
る。 図面４及び図面５はヒトリゾチーム遺伝子の発現を示し
た電気泳動の図である。 一 一　　　　閃　虫 図面２ Ｉａ（”　ｌ旧０ １．２Ｋｂｐ ｌ・ ｐａ　１ 図面４ ’、Ａ；　　ＬＢＩ　　　ＪＣｉ　　　［Ｄ］　　　Ｆ
Ｅ］　　　［Ｆ］図面５ −Ａ　：・’　Ｂ　、’　（Ｃ：、　ｊ　Ｄ　：　　’
、　Ｅ　ｌ。 ■　、ビｉ　　？＋ｂ　　ｉｔＥ　　ｔ’ｉ　（自　発
）昭和６０年１月２２１１ １゜事（”１の表示 昭和５９ｑ”、！ｌ鴇１願　第２０１３６７吋２、発明
の名（ｋｊ、 しトリヅ十−１，遺伝ｒ−１り１応するへ１１換えブラ
ズミｌ及び組ＩＱえ体 ：ｉ　、　Ｍｉ　＋ｌ−を４る行 事（′１との関係　　１鴇’Ｎｌ１頭人東東部１代ＩＩ
Ｉ区霞が関−１１１３番Ｉ号（１１，４）１業技術院長
　等々力　達（ばか−名） ４、代理人 入阪山東区１ヒ浜５　］−１１−４１５番地連絡先　′
ｌ”［Ｌ　（０６）２２０　３４０４５、ン市１１−の
女、１象 明１１１１占の’１＋ｆ許請求の範囲の欄及び発明の詳
細な説明の欄 ６　補正の内容 （１）　　特許請求の範囲を別紙のとおりに訂正する。 （２）　　明細書簡１５頁最ド行から８行目Ｉ溶酸酬素
」とあるをｊ溶菌酊素にＪ　ｆＴ正する。 （Ｂ）　　同２０頁第１行目１−作制し」とあるを「作
製しＪに訂正する。 （４）　　同第８４頁第１行目１遺伝子の合成」とある
を［（２）遺伝子の合成］に訂正する。 （５）　　同第８７頁に以下の訂正をする。 ５行目１−Ｐｓｔｔｊとあるを［Ｐｓ　ｔ　ｊＪ　Ｉｃ
、７行目（−ＰｓｔｌとあるをＩＰｓｔｊｌに、１０行
目ｌＢａｍ１ｌＩ」とあるをｌ−Ｂａｒｎｌｉ　ｌ　ｊ
　ニ、下から８行目ＩＢ　ａ　ｍｌ（１とあるを１−Ｂ
ａｍ１（ＩＪ　ｌｉ：、下から４行目１　ｐ　ｌＮ−１
ｎ−Ａ、Ｊとあるを１−ｐＩＮ　−１１−Ａ＋Ｊに、ド
から１行目Ｉ　Ｂ　ａｍＨＩ　］とあるを「Ｂａｒｎｕ
Ｉ　ｊに訂正する。 （６）　　同第８８頁に以下の訂正をする。 １行目［Ｐ　ｓ　ｓ　Ｌ　Ｉ　Ｊとあるをｌ”’　Ｐ　
ｓ　ｔ　ｉ　Ｊに、２行目１−　ｐ　ｌＮ−ｌ１ｌ−Ａ
Ｉ　Ｊとあるをｌ　Ｉ）　ｌＮｍ１　Ａ＋ｊに、下から
９行目１’−ＢｓＬＥｎＪとあるを１ＢｓｔＥＩｌｌニ
、【２） 同行ＩＸｂａＩＪとあるを［ＸｂａＩ　Ｊ　ニ訂正する
。 （７）　　同第３９頁第１０行目、［Ｒｅｕ、　Ｊとあ
るを［Ｒｅｖ、ｊに訂正する。 （８）　　同第４１頁下から９行目「等で用いて検出」
とあるを「等を用いて検出」に訂正する。 （９）　　同頁下から７行目「ヒトリゾチーム」とある
を「ヒトリゾチーム」に訂正する。 （１０）　　同第４２頁、下から９行目、「０１ａＩＪ
　とあるをｌ−Ｃｌ１１Ｉ」ニ、最下行１０１ａＩ　、
　Ｔａｑ　Ｉ　。 Ｂａｌ＋Ｊ　とあるを「ｃｌａＩ　、ＴａｑＩ　、Ｂａ
ｌ　Ｉ　Ｊに訂正する。 （１１）同第４８頁第１〜第５行目を１Ｈａｅｌ［、Ｍ
ｂｏＩ　。 ＢｓＬＥｌ　、ＭｓｐＩ　、ＨｉｎｆＩ　、ＡｌｕＩ　
、ＢｐａＩ［、Ｉ（ｐｈＩ　。 Ｘｂａｌ　、Ｎａｒ　Ｉ　、Ｈｉｎｃｌ［、ＢｓｔＮＩ
　、ＥｃｏＲＩ　、ＢｂｅＩ　。 Ｈｐａ　Ｉ　、　Ｈｇａ　Ｉ及びＤｄｅＩ　　ｇｌ識配
列を含むものに訂正する。 （１３）同第４７頁、８行目「合成法に合成した」とあ
るを「合成法により合成した」に、１０行目「パッチム
社」とあるを「パッチム社」に訂正する。 （１４）同第４８頁第４〜５行目「塩化メチレン−イソ
プロパツール」とあるを「塩化メチレン：イソプロパツ
ール」に訂正する。 （１５）同第４９頁第７行目ｒ　ＧｐＧｐ　ｊとあるを
ｒ　ＣｐＧｐ　Ｊ　　に訂正する。 （１６）同第５２頁下から５行目、［ＨＬＹ−５２ｄ（
Ａ−Ｃ〜Ｇ・中用・・・Ｔ−Ｇ−Ａ−（）−Ｇ）Ｊとあ
るを１１（ＬＹ−５２ｄ　（Ａ−Ｃ−０・・・・・・・
・・Ｔ−Ｇ　−Ａ−Ｃ−Ｇ　’）Ｊに訂正する。 （１７）同第５８頁第５行「ｃ、Ｆ」とあるを１Ｄ−Ｆ
Ｊに訂正する。 （１８）同第５４頁第６行、「インキュベー」とあるを
１−インキュベート」に訂正する。 （１９）同第５７頁下から４〜８行目、「８ａｕ　９Ａ
Ｉ　。 Ｂ　ａｍＨｒ　／Ｈｉ　ｎｄ　Ｉｎ及びＢａｍＨ＋／Ｘ
ｂａｌ」　　とあるを「Ｓａｕ　３ＡＺ、ＢａｍＨＩ／
ｆｆ１ｎｄｌ［及びＢａｍＩ（Ｉ／ＸｂａＩＪに訂正す
る。 （２０）同第５８頁、 ６行目１８ａｕ８Ａｒ　Ｊとあるを「８ａｕ３ＡＩ　Ｊ
にドから８行目Ｉ　ＢａｍＨＩ　Ｊとあるを「ＢａｍＨ
Ｉ」に、下から７行目ＵＰｌｉｔＩＪとあるをｌ’Ｐｓ
ｔ　Ｉ　ｊに、下から８行目１　ｐＩＮ　［Ｉ　ＡＩ　
Ｊとあるを「ｐＩＮ−Ｍ−Ａ、　」に訂正する。 （２１）同第５９頁下から２行目、「ＢａｍＨＩ　Ｊと
あるを「ＢａｍＨＩＪ　　に訂正する。 （２２）同第６０頁５行目、「８ａｕ　３ＡＩ　Ｊとあ
るを１−８ａｕ　３ＡＩ　Ｊ　ニ訂正する、（２８）同
第６１頁２〜４行目１−Ｅ、　ｃｏｌ　１ｃ６００（ｐ
ＰＬＨＬＹ−１）を命名した」とあるを「Ｅ、ｃｏｌｉ
０６００（ＰＬ日ＬＹ−１）と命名した」に、６行目１
　ＢａｍＨｉ　Ｊとあるを「Ｂａｍ１（Ｉ　Ｊ　Ｉｃ、
７行目１−　Ｅ、　ｏｏｌｉＵ６０Ｑ株形′ＩＲ転換」
とあるを「Ｅ、　ｃｏｌｉ０６ＱＱ株を形質転換」に訂
正する。 （２４）　　第６２頁８〜４行目、ｒＬ−（’１ｌｌ）
−メチオニン」とあるをｌ−１，−（８〕−メチオニン
」に訂正する、 （２５）　　第６８頁１１行目１−１．４．７Ｋ」とあ
るを（玄） １−１４．７ＫＪに訂正する。 （２６）　　第６４頁６行目１アンピシリン」とあるを
１−アンピシリンＪに訂正する。 以　　］二 １８開昭６１−７８３８７　（２Ｂ） 特許請求の範囲 ｉｌｌ　　Ｆ記のヌクレオチド配例で表わされるヒトリ
ゾチーム構造遺伝子を含むことを下流に有するヒトリゾ
チーム遺伝子 ＡＡＧ　　ＵＴ’ｌ’　　ＴＴｔ３　　ＵＡＡ　　０Ｇ
ＴＴ　　’１’　　ＯＣＡ　Ａ　　　Ａ　Ａ　Ｕ　　　
ＣＴ　　Ｔ　　　Ｇ　　ＯＡＴＧＴＧＡＡＴ’ｒ（ｊＧ
Ｃ（３ＡＧＡＡ　　ＣＡ　　　Ｃ’Ｐ　　Ｔ　　　Ａ　
Ａ　Ｃ（３０Ｇ　　　Ｔ　　Ｏ’１！ＡＣＴ　　’ｒ’
ｒＧ　　ＡＡＯＡＧＡ　　ＴＴＧ’Ｉ’（ｊＡＡＡＣＴ
Ｔ０ＴＯｉ’ＡＡＯｔＪ（ＪＴ　　ＡＴＧ　　（ＪＡＯ
Ｕ（ＩＴ　　ＴＡＯＣｃＡ　　ＴＡＣＯ′１’（ｊ　　
ｃｃＡ　　ＡＴＧＣＵ　Ｔ　　Ｇ　Ｇ　Ｔ　　Ａ　Ｔ　
ＣＴ　Ｃ’ｆ’　　Ｔ　Ｔ　ＵＵＳＡ　　ＣＣＡ　　Ｔ
Ａ（ｊ　　ＡＵＡ　　ＡＡＯＵ　　Ｕ　’ｌ’　　　Ａ
　Ａ　に　　　’１’　Ｕ　（ｊ　　　Ａ　’１’　υ
　　Ｔ　Ｕ　ＴＯｔｊＡ　　　Ｔ’ｌ’（Ｊ　　　Ａ（
ｊＵ　　　１’ＡＵ　　　ＡＣＡ’ｆ　　Ｔ　０　　０
　ＣＵ　　　Ａ　Ａ　Ｇ　　　ｉ’　Ｇ　（Ｊ　　　Ｕ
　Ａ　　ＡＡ　Ａ　Ｕ　　　Ｃ１４Ｕ　　　ｉ”１’　
　ＯＡ　　ＣＵ　　　（２Ｔ　ＴＴ　　ＯＴ’　　　（
Ｊ　Ｇ　　’ｒ　　　Ｔ　　Ａ　（ｊ　　　Ａ　　Ａ　
ＣＡ　（二　’Ｉ’Ａ（ｊＡ　　　　Ｏ（コＡ　　　Ａ
　　１’　（Ｊ　　　ｉ”ｌ’　　Ｕ　　　’Ｉ’　Ｕ
　　ＡＡ　Ｇ　Ａ　　　Ｇ　（ｊ　　Ｔ　　　Ａ　　Ｕ
　Ｔ　　　Ａ　Ａ　Ｏ’ｌ’　Ａ　ＣＴ　Ｏ’ｒ　　　
（Ｆ　　Ｇ　　Ａ　　　Ｔ　　Ｇ　Ａ　　　ｉ’　Ｔ　
（］　　　ＡＡ　’Ｉ’　　ＵＡ　Ａ　　ＯＧ　Ｃ（ｊ
　　　（Ｊ　Ｕ　’ｌ’　　　Ｇ　Ａ　Ｕ　　　Ｏ（ｉ
　’Ｉ’Ｔ　　’ｌ’　Ｇ　　　Ｏ（Ｊ　　Ｕ　　　Ｏ
ＯＡ　　　Ｃｉ’　　（Ｊ　　　Ｕ　　（ｊ　　ＡＴ　
　ＯＴ　　　Ａ　Ｃ’１’　　　Ｕ　Ａ　　に　　　’
Ｉ’　Ａ　　Ｏ（ｊ　（！　　’Ｌ’Ａ　　（ｊ　Ａ　
　　Ｔ　　Ｕ　Ａ　　　Ｃ’ｌ’　（Ｊ　　　Ａ　　ｉ
’　（Ｊ　　　Ｃに　ＡＡＴＣＩ’　　ｌ’　　０　　
Ｕ　　Ａ　　Ａ　　　Ａ　　’Ｉ”Ｉ’　　　Ａ　　７
＼　（ＪＴ　　Ａ　　Ｇ　　　Ａ　　Ａ　　Ｕ　　　（
Ｊ　　ｉ’　　ｉ”　　　Ｔ　　Ａ　Ａ　　　　ｉ”Ｉ
’　　（Ｊ（υ ｉ’　ｃｌ　’ｉ’　　　Ａ　Ｇ　Ａ　　　’１１’　
Ａ　Ｃ’１’　（ｊ　ｕ　　　’）’　　Ｇ　’ｆＡＵ
Ａ　　　ｉ’ＵＴ　　　ＡＴＧ　　　ＡＯＣＡＯＡＡＡ
Ｕ　　　ＧＡＯ１４（ＪＴ　　　ＡＡＧ　　　ＡＣＴ１
’ｉ’Ｇ　　　Ｏ’ｌ’Ｇ　　　ＣＯＡ　　　ＴＴＯＴ
ＧＡｏｏＡ　　　ＧＧＯＧ（３ＣＧ’ｒ’ｌゝ　　ＡＡ
Ｏ（ｊＧＴ　　　Ｏ（！Ｇ　　　ＣＯＧ　　　ＯＡＡ　
　　ＴＴＧＩｃｅ　　　ＴＧ’ｌ！　　　ＯＡＯＴＴＧ
　　　Ｔ　ＣＴＯＵ　Ｇ　　　Ａ　ＣＡ　　　Ｇ　Ｔ　
Ｇ　　　Ａ　Ａ　ＯＡ　Ｇ　Ａｑ’ｕ　ｔｒ　　　Ｔ（
３Ｔ　　　ｏａ　１１１　　’ｔ１　Ｔｏ　　　’ｒｒ
−ｕＡ　ＯＡ　　　Ａ　Ｇ　Ａ　　　ＯＧ　Ａ　　　Ａ
　Ａ　ＯＡ　Ａ　ｔＩＣＡ　Ａ　　　Ｇ　Ａ　ＣＡ　Ａ
　ＯＡ　Ｔ　Ｕ　　　Ｇ　（３ｒＧ　ＴＴ　　　ＣＴ　
Ｇ　　　Ｔ　Ｔ　Ｇ　　　Ｔ　Ａ　Ｇ　　　ＯＧ　ＡＯ
Ａ　ＣＧ　（Ｅ　ＣＧ　Ｔ　Ｔ　　　（Ｊ　Ｕ　ＯＴ　
ＣＩ　ＴＯＴＧＯＧＧＯＡＡｏｏＯＡ（コＡ ０　０　　’１’　　　Ａ　　Ａ　Ｕ　　　Ａ　　（ｊ
　　Ａ　　　Ｕ　’１’　　（３Ｕ　　ｉ”ｌ’ＯＵ　
　Ａ　　　’ｌ’　　Ｔ　　Ｃ’Ｉ’　　（ｊ　　’１
’　　　ＣＡ　　Ｌｊ　　　（４Ａ　　ＡＡ　Ｇ　Ａ　
　　Ｇ　Ａ　Ｕ　　　Ｕ　ＯＡ　　　（、！　Ａ　Ａ　
　　（ｊ　Ｏ’１’Ｔ　ＯＴ　　　Ｕ　Ｔ　ｉｊ　　　
Ｇ　（ｊ　’１’　　　Ｕ　Ｔ　Ｔ　　　に　に　　Ａ
Ａ　Ｔ　ＯＡ　ｏ　Ａ　　　Ｇ　Ｕ　’ｒ　　　’ｒ　
（］　Ｕ　　　ＧＩＩ゛　ｅＴ　Ａ　Ｇ　　　Ｔ　Ｃ’
ｒ　　　ｌ；　（Ｊ　　Ａ　　　ム　（シ　Ｄ　　　に
　Ａ　（３Ｇ　（ｊ　Ｔ　　　Ｔ　（Ｊ　Ｕ　　　Ｏ（
ｊ　’Ｉ’　　　Ａ　Ａ　ＣＡ　　Ｇ　ＡＯ（Ｊ　Ａ　
　　Ａ　ＣＵ　　　Ｇ　ＣＡ　　　Ｔ　’ｌ’　０　　
　’ｒ　　ｉ：　’１ゝＴ’　Ｕ　Ｔ　　　ＣＡ　　Ａ
　　　Ａ　Ａ　　ＣＡ　Ｕ　　Ａ　　　（３Ａ　　（ｊ
Ａ　Ｕ　Ａ　　　Ｇ　’ｌ”ｒ　　　’ｒ　’ｌ’　ｕ
　　　Ｔ　Ｕ　Ｔ　　　ＯＴ　ＵＧ　’ｌ’　ＯＡ　Ｕ
　Ａ　　　ＯＡ　Ａ　　　’ｌ’　Ａ　Ｌ！　　　（３
’ｌ”ｌ’（ｊ　Ａ　Ｕ　　　’ｌ’　　ＯＴ　　　Ｕ
　　ｉ”　　’１’　　　Ａ　　Ｔ　　（ｊ　　　ＣＡ
　ＡＣＡＡ　　（）ＯＩｖ　　Ｔ（Ｊ　Ｔ　　（）　（
１１ｖ　　０１１１　Ｃ（Ｊ　Ｔ　’１’　　　に　　
ＣＡ　　　Ａ　　（２Ａ　　　００　Ａ　　　（：　Ａ
　Ｕ（２）　　構造遺伝ｆの５′端及び３′端にそれぞ
れ翻訳開始（Ｉｇ　ｌ　Ａ　’１’　（ｊ及び２個の翻
訳終止信号Ｔ　Ａ　Ａ　ｌ’　ＯＡを有する特許請求の
範囲第１項記載のヒトリゾチーム遺伝子 （８）　　リボゾーム結合部位に対応する配列を含み同
時に翻訳開始信号の直前に１ｆｔｌＪ限閘素（ｊ’Ｂ　
ｌ認識配列が叉δ′端に制限隋素８ａｕ　３Ａ　Ｉ認識
配列が配置される様な配列 ＯＡ　’Ｊ’　（シＯ（ｊ　Ｔ　ｉ”　Ａ　Ｕ　（ｊ　
Ａ　（）　’１”Ｉ”ｌ’　Ａ　Ａ　’Ｉ’　ＯＧ　Ａ
　Ｔ　Ｇ　全上流に、翻訳終止信号を含み同時に８′端
に制限耐累Ｓａｕ　３Ａ　Ｉ認識配列が配置される様な
配列゛Ｉ′ＡＡ′ｒ（）ＡＴＣを下流に有する特許請求
の範囲第２項記載のヒトリゾチーム遺伝子（４）　　Ｆ
記のヌクレオチド配列１゛表わされるヒトリゾチーム構
造遺伝子を含有することを下流に有する組換んプラスミ
ド Ａ　Ａ　（Ｊ　　Ｕ　Ｔ　’ｌ”１”ｌ’　ＣＵ　Ａ　
Ａ　　ＯＵ　ｉ’’１’　ｉ’　Ｕ　　ＣＡ　Ａ　　Ａ
　Ａ　（ｊ　　（ｊ　’ｌ”ｌ’　　００　ＡＴ　ｔｊ
　’ｌ’　　　υ　Ａ　Ａ　　　ｉ”ｌ’　（Ｊ　　　
（ｊ　ＣＵ　　　Ａ　（Ｊ　ムＡ　Ｕ　　Ａ　　　Ｃ’
１”　’ｌ’　　　Ａ　Ａ　　ＯＯＵ　Ｕ　　　’ｌ’
　　Ｃｉ’ム（２１’　　　Ｔ　’ｌ’　（ｊ　　　Ａ
　Ａ　Ｇ　　　Ａ　Ｕ　Ａ　　　’ｌ”ｌ’　ＵＴ　（
ｊ　Ａ　　　Ａ　Ａ　（２１”ｌ’　Ｃ！　　　Ｔ　　
ＯＴ　　　Ａ　　ム（コ＋ｊ　（４’Ｌ’　　　Ａ　’
Ｉ’　ｕ　　　（Ｊ　　Ａ　　（Ｅ　　　Ｕ　（１’ｌ
’　　　Ｔ　　Ａ　Ｃに　ＯＡ　　ｉ’　Ａ　（３０Ｔ
　（ｌ　　Ｃｔｊ　Ａ　　Ａ　ｉ’　Ｏｅ　（Ｊ　Ｔ　
　　（］　ＯＴ　　　Ａ　Ｔ　　ＣＴ　　（’、Ｔ’　
　　Ｔ　Ｔ　。 Ｏ（３Ａ　　　Ｇ　Ｄ　　Ａ　　　Ｔ　Ａ　　Ｇ　　　
Ａ　　（Ｊ　Ａ　　　Ａ　Ａ　ＯＵ　（ｊ　ｉ’　　　
Ａ　Ａ　Ｃ’ｌ’　（Ｊ　Ｕ　　　Ａ　ｉ’　（）　　
　Ｔ　（Ｊ　’［’００　　Ａ　　　Ｔ　Ｔ　（ｊ　　
　Ａ　　Ｏ０１”　　Ａ　　Ｄ　　　Ａ　　ＣＡＴ″ｒ
　（ｊ　　　（’ｌ　　Ｏに　　　Ａ　Ａ　Ｇ　　　’
ｌ’　（Ｊ　　Ｕ　　　（Ｊ　Ａ　　ＡＡ　Ａ　　Ｕ　
　　（：　（）　ｔｌ　　　Ｔ　’ｌ’　Ｕ　　　Ａ　
Ｏ（コ　　ＯＴ　ＴＴ　＋２１１’　　　Ｇ　（ｊ　’
ｒ　　　’ｒ　Ａ　　（３Ａ　Ａ　ＯＡ　　Ｏｉ’Ａ（
）Ａ（コＯＡＡ’ｌ’０ＴＴＵ’ｌ’ＵＡ（（つ Ａ　（ｊ　Ａ　　　（Ｊ　に　ｉ’　　　Ａ　Ｕ　Ｔ　
　　Ａ　Ａ　Ｕ　　　Ｔ　Ａ　Ｏ′ｌ′　ＣＴ　　ＣＯ
Ａ　　ＴＯＡ　　１１′ｌ゛（）　　Ａ　ＴＯＡＡＩコ
　　（Ｊ　ＣＵ　　　（ｊ　（Ｊ　Ｔ　　　Ｇ　Ａ　Ｏ
ＯＧ　Ｔｒ　　’ｌ’　（Ｊ　　　Ｕ　（Ｊ　（３０（
ｊ　Ａ　　　ＯＴ　Ｕ　　　（ｊ　ＯＡ’ｒ　（２１’
　　　Ａ　　ＯＴ　　　Ｕ　Ａ　ＯＴ　Ａ　ＣＧ　（ｌ
　ＴＡ　ＯＡ　　　Ｔ　ＯＡ　　　ＣＴ　Ｇ　　　Ａ　
Ｔ　Ｇ　　　（〕　ＯＡＡ　Ｔ　に　　　ｉ’　Ｔ　　
Ｃ（２Ａ　Ａ　　　Ａ　　ｉ”ｌ’　　　Ａ　Ａ　Ｕ’
ｌ’　　Ａ　　ＯＡ　Ａ　Ｇ　　　（Ｊ　’Ｐ　’ｌ’
　　　Ｔ　　Ａ　　Ａ　　　’ｌ’　Ｔ　ＧＴ　（ｊ　
Ｔ　　　Ａ　υ　Ａ　　　’Ｉ’ＡＯＴ　Ｏ（ｊ　　　
ＴＧ’ｌ’Ａ　ＯＡ　　　’ｌ’　　Ｏ’ｒ　　　Ａ　
　Ｔ　　Ｇ　　　Ａ　　ＣＣＡ　ＣＡＡ　　Ａ　（２０
Ａ　　ＣＯＵ　Ｔ　　　Ａ　Ａ　（ｊ　　　Ａ　　（３
’ｌ’’ｌ”ｌ’　　（ｊ　　　ｅ　Ｔ　　Ｕ　　　Ｏ
ＣＡ　　　ｉ’　Ｔ　　＜Ｌ　　　Ｔ　Ｇ　Ａ（］（シ
　Ａ　　　（ｊ　Ｕ　ＯＵ　Ｕ　　（ｊ　　　（Ｊ　Ｔ
　　ｉ’　　　Ａ　　Ａ　ＵＵ　Ｕ　’ｒ　　　に　Ｄ
　Ｕ　　　Ｃ（ｊ　０　　０　Ａ　Ａ　　　’１”ｌ’
　０（に〕 （ｉ　００　　　Ｔ　Ｕ　ｉ’　　　ＯＡ　（ｊ　　　
’１”１’　（Ｊ　　　ｉ’　Ｕ　’ｌ’Ｕ　（Ｊ　Ｕ
　　　Ａ　ＯＡ　　　Ｕ　Ｔ　ＯＡ　Ａ　ＣＡ　（Ｊ　
ＡＴ　Ｇ　Ｔ　　　’ｌ’　ＯＴ　　　（Ｊ　（ｊ　’
ｒ　　　Ｔ　’Ｉ’　（Ｊ　　　’Ｉ’　ｉ’　ＯＡ　
Ｕ　Ａ　　　Ａ　（Ｊ　Ａ　　　ｌｊ　（ｊ　Ａ　　　
Ａ　Ａ　ｌ；　　　Ａ　　Ａ　　（２ＣＡ　Ａ　　　Ｏ
Ａ　Ｕ　　　Ａ　Ａ　（ｊ　　　Ａ　Ｔ　Ｃ（ｊ　（２
’ｒ（Ｊ　’１”Ｉ’　　　０　’Ｉ’　（ｊ　　　Ｔ
　’ｒ　（］　　　ＴＴＡ　Ｕ　　　に　Ｕ　ＡＵ　Ａ
　ＣＧ　ＣＯＧ　Ｔ　Ｔ　　　Ｕ　Ｕ　（〕　　ＴＴ（
Ｊ　Ｔ＜３　Ｔ　（］　　　００　Ｕ　　　（３Ａ　Ａ
　　　００　ＯＡ　（３ＡＯＣＴ　　　Ａ　Ａ　（ｌ　
　　Ａ　ＯＡ　　　（］　ＴＴＣ（Ｊ　Ｔ　’ｒＯＧ　
Ａ　　　Ｔ　’ｌ’　ＣＴ　Ｃ’Ｐ　　　ＣＡ　Ｉ　　
　（３Ａ　ムＡ　Ｕ　Ａ　　　Ｇ　Ａ　ＯＣＣＡ　　　
ＣＡ　Ａ　　　（Ｊ　Ｕ　’ｌ’Ｔ　（ｊ　’ｉ！　　
　Ｏ’１１’　Ｇ　　　ＯＧ　Ｔ　　　Ｇ　Ｔ　ｉ’　
　　ＯＣＡＡ　’ｌ’　ＯＡ　（）　Ａ　　　（Ｊ　（
３Ｔ　　　’１’　Ｇ　Ｇ　　　（ｊ　ｉ’　にＴ　Ａ
　（Ｊ　　　’１’　ＯＴ　　　Ｕ　ＯＡ　　　Ａ　Ｏ
（、！　　　ＣＡ　（ＪＵ　Ｕ　’１”１’　（Ｊ　（
ｉ　　　Ｕ　　（ｊ　’ｌ’　　　Ａ　Ａ　（ｊ　　　
Ａ　Ｕ　ムＵ　Ｕ　Ａ　　　Ａ　　（ｊ　　Ｃ（Ｊ　　
ＣＡ　　　Ｔ　　Ｔ　（Ｊ　　　Ｔ　　（Ｊ　　’ｌ’
１’　０１’　　　ＣＡ　　Ａ　　　Ａ　Ａ　（ｊ　　
　ム（ｊＡ（ＪＡＯＡ　（ｊ　Ａ　　　（Ｊ　’１”ｌ
’　　　Ｔ　Ｔ　　（ｊ　　　’ｒ　Ｃｉ　Ｔ　　　Ｏ
Ｔ　ＧＵ　　’ｌ’　　ＯＡ　Ｇ　　Ａ　　　ＯＡ　Ａ
　　　’ｌ’　　Ａ　　ＣＪ　　　Ｕ　　Ｔ　Ｔ（２Ａ
　Ｇ　　　’Ｉ’　ＣＴ　　　ＯＴ　Ｔ　　　Ａ　’ｌ
’　（ｊ　　　に　Ａ　ＡＯＡ　Ａ　　　（ｊ　（＋　
’１”ｌ’　（］　’ｒ　　　Ｕ　Ｕ　Ｔ　　　（Ｊ　
Ｔ　　（３Ｇ　Ｔ　’１’　　　Ｕ　＜〕ＡＡ　　Ａ　
ＯＡ　　　　００　Ａ　　　ＣＡ　Ｇ（５）構造遺伝子
の５″端及び８′端にそれぞれ翻訳開始信号Ａ　’ｌ’
　０及び２個の翻訳終止信号′ｉ′Ａ　Ａ　’ｒ　ｏ　
Ａを有する特許請求の範囲第４項記載の組換えプラスミ
ド （６）　　リボゾーム結合部位に対応する配列を含み同
時に翻訳開始信号の直前に制限耐素ＣＬａ■認繊配列が
又５′端に制限耐素８ａｕ　８Ａｌ認識配列が配置され
る様な配列 Ｕ　Ａ　Ｔ　Ｕ　Ｕ　（Ｊ　Ｔ　Ｔ　Ａ　（ＪＵ　ＡＧ
　Ｔ　ｉ”ｌ’　ＡＡ　Ｔ　ＣＧＡ　’Ｉ’　（Ｊを上
流に、翻訳終止信号を含み同時に８′端に１ｌｌＩｌ限
歯素８ａｕ１３ＡＩ認繊配列が配置される様な配列Ｔ　
Ａ　Ａ　’Ｉ’　ＯＡ　’ｌ’　Ｃを下流に有する特許
請求の範囲第４項記載の耐換えプラスミ ド（７）　　ベクターとしてｐＭＹ　ｌ　’ｌ−５Ａｍ
　ｐ−１を用いた特許請求の範囲第６項記載の組換えプ
ラスミド ３）　ベクターとしてｐ８Ｍ２４０を用いた特許請求の
範囲第６項記載の組換えプラスミド （９）組換えプラスミド　ｐＰＬＨＬＹ−１（ｌＯ）組
換えプラスミド　ｐＴＬ’１４ＬＹ−１（１１）下記の
ヌクレオチド配列で表わされるヒトリゾチーム構造遺伝
子を含有する事を下流に有する組換えプラスミドを保持
するエンユリシア・コリ（Ｅｓｌ＋ｅｚｃｌ＋ｉａ　ｃ
ｏｌｉ　）Ａ　　Ａ　Ｕ　　　　Ｕ　　’Ｌ’　　Ｔ　
　　　’ｌ”１’　　（２（］　　ＡＡ　Ａ　　　　（
ｊ　　Ｕ　　ｉ’Ｔ１１’Ｕ　　ＯＡＡ　　ＡＡ（Ｊ　
　（シＴ　’ｌ’　　（Ｊ　（Ｆ　Ａ（？〕 ’１’（Ｊ’ｌ’　　　ＢＡＡ　　　’Ｉ”Ｉ’　Ｇ　
　ＧｏＯＡＯＡＡＣＡ　　　Ｃ’ＩＩ　ＩＩ’　　　Ａ
Ａｅ　　　ＯＧＧ　　　’ｉ’（３’ｌ”ＡＣＴ　　　
ＴＴＧ　　　ＡＡＧ　　　ＡＧ　ム　　１１ＴＯＴＯム
　　ＡＡＣＴＴＯ１”ＯＴ　　　ＡＡＯＧＯＴ　　　Ａ
ＴＧ　　　ＧＡＣＧＧＴ　　　ＴＡＯＧＯＡ　　　’ｌ
’ＡＯ（ＥＴＧ　　　０（３Ａ　　　ＡＴＧＣＯＴ　　
　ＧＯＴ　　　ＡＴＣＴ　ＣＴ　　　ＴＴＧＧ　　ＣＡ
　　　ＣＯＡ　　　Ｔ　Ａ　ＯＡ　Ｇ　Ａ　　　Ａ　Ａ
　０００Ｔ　　　ＡＡＯ’ｌ’Ｇ（Ｊ　　　ＡＴＯＴＧ
ＴＯＧＡ　　　ＴＴＧ　　　ＡＵ　ＣＴＡ　ＯＡ（３人
’ｒ　Ｔ　Ｇ　　　Ｕ　Ｃ（〕　　ＡＡＡ　Ｇ　　　’
ｌ’　Ｇ　ＯＧ　Ａ　ＡＡＡＯＣＣＯＧ　　’Ｉ’ＴＯ
ＡＯＣ０ＴＴＴＵ’ｌｒ　　　（［］ＪＴ　　ＴＡ　Ｃ
ＡＡＣＡＣＴＡ　ＯＡ　　　ＯＯＡ　　　Ａ　’ｒ　Ｇ
　　　Ｔ　Ｔ　Ｑ　　　Ｔ　Ｇ　Ａ（／Ｑ〕

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. （１）下記のヌクレオチド配例で表わされるヒトリゾチ
   ーム構造遺伝子を含むことを特徴とするヒトリゾチーム
   遺伝子 【遺伝子配列があります】
2. （２）構造遺伝子の５′端及び３′端にそれぞれ翻訳開
   始信号ＡＴＧ及び２個の翻訳終止信号ＴＡＡＴＧＡを有
   する特許請求の範囲第１項記載のヒトリゾチーム遺伝子
3. （３）リボゾーム結合部位に対応する配列を含み同時に
   翻訳開始信号の直前に制限酵素ＣＩａ I 認識配列が又
   ５′端に制限酵素Ｓａｕ３Ａ I 認識配列が配置される
   様な配列ＧＡＴＣＣＧＴＴＡＧＧＡＧＴＴＴＡＡＴＣＧ
   ＡＴＧを上流に、翻訳終止信号を含み同時に３′端に制
   限酵素Ｓａｕ３Ａ I 認識配列が配置される様な配列Ｔ
   ＡＡＴＧＡＴＣを下流に有する特許請求の範囲第２項記
   載のヒトリゾチーム遺伝子
4. （４）下記のヌクレオチド配列で表わされるヒトリゾチ
   ーム構造遺伝子を含有することを特徴とする組換えプラ
   スミド 【遺伝子配列があります】
5. （５）構造遺伝子の５′端及び３′端にそれぞれ翻訳開
   始信号ＡＴＧ及び２個の翻訳終止信号ＴＡＡＴＧＡを有
   する特許請求の範囲第４項記載の組換えプラスミド
6. （６）リボゾーム結合部位に対応する配列を含み同時に
   翻訳開始信号の直前に制限酵素Ｃｌａ I 認識配列が又
   ５′端に制限酵素Ｓａｕ３Ａ I 認識配列が配置される
   様な配列ＧＡＴＣＣＧＴＴＡＧＧＡＧＴＴＴＡＡＴＣＧ
   ＡＴＧを上流に翻訳終止信号を含み同時に３′端に制限
   酵素Ｓａｕ３Ａ I 認識配列が配置される様な配列ＴＡ
   ＡＴＧＡＴＣを下流に有する特許請求の範囲第４項記載
   の組換えプラスミド
7. （７）ベクターとしてｐＭＹ１２−６Ａｍｐ−１を用い
   た特許請求の範囲第６項記載の組換えプラスミド
8. （８）ベクターとしてＰＳＭ２４０を用いた特許請求の
   範囲第６項記載の組換えプラスミド
9. （９）組換えプラスミドｐＰＬＨＬＹ−１
10. （１０）組換えプラスミドｐＴＣＨＬＹ−１
11. （１１）下記のヌクレオチド配列で表わされるヒトリゾ
    チーム構造遺伝子を含有する事を特徴とする組換えプラ
    スミドを保持するエシェリシア・コリ（Ｅｓｈｅｒｉｃ
    ｈｉａ　ｃｏｌｉ） 【遺伝子配列があります】