JPS6144826A - γ型インタ−フエロン組成物 - Google Patents
γ型インタ−フエロン組成物Info
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- JPS6144826A JPS6144826A JP60148093A JP14809385A JPS6144826A JP S6144826 A JPS6144826 A JP S6144826A JP 60148093 A JP60148093 A JP 60148093A JP 14809385 A JP14809385 A JP 14809385A JP S6144826 A JPS6144826 A JP S6144826A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
本発明は、ヒトγ型インターフェロン組成物に関する。
町米−９模−１
ヒトインターフェロンは現在、α型、β型およびγ型の
３種類に分類されている。α型およびβ型インターフェ
ロンは比較的安定で、主として非経１−．１投、ｌｊ剤
の形態で臨床に供せられ、組織的臨床研究ら進んでいる
。一方、γ型インターフェロン（ＩＦＮ−γと略称する
ことがある）は極めて不安定で、水溶液の保存、凍結あ
るいは凍結乾燥の操作中において、容易にその活性を減
し、また凍結乾燥品を再溶解しノこ液に濁りを認める等
の問題点を何し、臨床」１使用するに値する安定な組成
物を得ることを、極めて困難にしている。その為、イン
ターツボロンの中でも昔しく強い抗ウィルス作用や抗腫
鳴作用［ザルヒンら、ツヤ−ナル オブナノヨナル ギ
ャノザ インスチチ、−ト、第５５巻、 ｌ ２ ：
’、 ：（頁（１９７５）コを何し、医薬として最も期
待の大きい口” Ｎ−７の臨床応用への大きなＩＩＪ５
げとなっている。
３種類に分類されている。α型およびβ型インターフェ
ロンは比較的安定で、主として非経１−．１投、ｌｊ剤
の形態で臨床に供せられ、組織的臨床研究ら進んでいる
。一方、γ型インターフェロン（ＩＦＮ−γと略称する
ことがある）は極めて不安定で、水溶液の保存、凍結あ
るいは凍結乾燥の操作中において、容易にその活性を減
し、また凍結乾燥品を再溶解しノこ液に濁りを認める等
の問題点を何し、臨床」１使用するに値する安定な組成
物を得ることを、極めて困難にしている。その為、イン
ターツボロンの中でも昔しく強い抗ウィルス作用や抗腫
鳴作用［ザルヒンら、ツヤ−ナル オブナノヨナル ギ
ャノザ インスチチ、−ト、第５５巻、 ｌ ２ ：
’、 ：（頁（１９７５）コを何し、医薬として最も期
待の大きい口” Ｎ−７の臨床応用への大きなＩＩＪ５
げとなっている。
ところで、製剤に供せられるインターフ１ロンの原体は
通常、粗インターフエ〔１ンから各種のクロマトグラフ
ィー等を駆使した分離・精製工程を経て高純度のものと
して得られろ。本分離・精製工程では、種々の無機、有
機化合物が使用され、例えばｐＨおよびイオン強度の調
整に用いられた無機イオンも精製インターフェロン水溶
液中に存在するが、該無機イオン（無機塩）は製剤化し
た場合にも、安定化剤等として有利に作用すると煮えら
れていた。
通常、粗インターフエ〔１ンから各種のクロマトグラフ
ィー等を駆使した分離・精製工程を経て高純度のものと
して得られろ。本分離・精製工程では、種々の無機、有
機化合物が使用され、例えばｐＨおよびイオン強度の調
整に用いられた無機イオンも精製インターフェロン水溶
液中に存在するが、該無機イオン（無機塩）は製剤化し
た場合にも、安定化剤等として有利に作用すると煮えら
れていた。
たとえば、糖鎖を持たないβ型インターフェロンにおい
ては、無機塩を添加することにより安定化されるとの知
見が開示されている（特開昭５９−２５３６４号公報）
。
ては、無機塩を添加することにより安定化されるとの知
見が開示されている（特開昭５９−２５３６４号公報）
。
発明が解決しようとする問題点
本発明晋らはかかる技術背景下、無機塩の濃度を低下せ
しめたＩＦＮ−γ水溶液を用いて製剤化するとき外にも
、凍結および凍結乾燥の操作において、従来の無機塩含
有ＩＦＮ−γ水溶液の」−記操作におけるよりも、一層
ＩＦＮ−γ活性の低下が少なく、また得られた組成物を
再溶解した液に副りを認めることのない安定なＩＦＮ−
γ組成物か得られることを見い出し、さらに研究を重ね
本発明を完成した。
しめたＩＦＮ−γ水溶液を用いて製剤化するとき外にも
、凍結および凍結乾燥の操作において、従来の無機塩含
有ＩＦＮ−γ水溶液の」−記操作におけるよりも、一層
ＩＦＮ−γ活性の低下が少なく、また得られた組成物を
再溶解した液に副りを認めることのない安定なＩＦＮ−
γ組成物か得られることを見い出し、さらに研究を重ね
本発明を完成した。
問題を解決するための手段
木２発明は、実質的に無機塩が存在せず、アミノ酸か共
（７−する条件下に凍結もしくは凍結乾燥したヒトγ型
インターフェロン組成物を提供するものである。
（７−する条件下に凍結もしくは凍結乾燥したヒトγ型
インターフェロン組成物を提供するものである。
本発明に用いられるＩＦＮ−γは、ヒト山来のらのであ
れば天然の、あるいは遺伝子組み換え技術で得られろい
ずれのＩＦＮ−γでもよい。とりわ（Ｊ遺伝子組み替え
技術で得られるヒトＩ ＦＮ−γ（ｒｌＦＮ−γ）が有
利に使用される。
れば天然の、あるいは遺伝子組み換え技術で得られろい
ずれのＩＦＮ−γでもよい。とりわ（Ｊ遺伝子組み替え
技術で得られるヒトＩ ＦＮ−γ（ｒｌＦＮ−γ）が有
利に使用される。
より具体的には、上記ｒｌ ＦＮ−γは、第１図で例示
される１４６個のアミノ酸からなるポリペプチドやその
ポリペプチドの種々のフラグメントを包含する。種々の
フラグメントとしては、例えば」−記ボリベブチドのＮ
末端部分の４個以下のアミノ酸か欠落したＮ末端部欠落
スピーシーズや上記ポリペプチドもしくはＮ末端欠落ス
ピーシーズの第１３１番アミノ酸残基以降の部位で切断
されたＣ末端部欠落スピ−ンーズなどが挙げられる。
される１４６個のアミノ酸からなるポリペプチドやその
ポリペプチドの種々のフラグメントを包含する。種々の
フラグメントとしては、例えば」−記ボリベブチドのＮ
末端部分の４個以下のアミノ酸か欠落したＮ末端部欠落
スピーシーズや上記ポリペプチドもしくはＮ末端欠落ス
ピーシーズの第１３１番アミノ酸残基以降の部位で切断
されたＣ末端部欠落スピ−ンーズなどが挙げられる。
さらに上記ｒｌ ＦＮ−γは上記ポリペプチドのシステ
ィン残基がセリンもしくはスレオニンに置換されたもの
も包含する。
ィン残基がセリンもしくはスレオニンに置換されたもの
も包含する。
上記様々のフラグメントの中では、第１図で示される１
４６個のアミノ酸からなるポリペプチドのＮ末端部分の
４個以下のアミノ酸が欠落したＮ末端部欠落スビ−ンー
ズまたは当該Ｎ末端部欠落スピーシーズのＣ末端部分が
切断されたものが好ましい。
４６個のアミノ酸からなるポリペプチドのＮ末端部分の
４個以下のアミノ酸が欠落したＮ末端部欠落スビ−ンー
ズまたは当該Ｎ末端部欠落スピーシーズのＣ末端部分が
切断されたものが好ましい。
とりわけ本発明のヒトＩＦＮ−γとしては第１図で示さ
れる１４６個のアミノ酸からなるポリペ１１”Ｎ−γ］
が好ましい。
れる１４６個のアミノ酸からなるポリペ１１”Ｎ−γ］
が好ましい。
また遺伝子組み換え技術で得られるヒトＩＦＮ−γを高
濃度に含有する水溶液が有利に使用されろ。
濃度に含有する水溶液が有利に使用されろ。
ヒトＩＦＮ−７の非活性は、１ｘ１０５〜ｌ×１０’国
際単位／ｍｇ ｆ：Ｉ Ｕ／ｍｇ）であることが好まし
く、■ＦＮ−γ水溶液としては、ｌＸｌ０’〜ｌ ｘ
ｌ Ｏ′Ｉ Ｕ／ｍｌ、とりわけｌＸｌ０’ 〜ｌＸｌ
０”ＩＵ／ｍｌの活性を有するものが好ましい。
際単位／ｍｇ ｆ：Ｉ Ｕ／ｍｇ）であることが好まし
く、■ＦＮ−γ水溶液としては、ｌＸｌ０’〜ｌ ｘ
ｌ Ｏ′Ｉ Ｕ／ｍｌ、とりわけｌＸｌ０’ 〜ｌＸｌ
０”ＩＵ／ｍｌの活性を有するものが好ましい。
１−記ＩＦＮ−γ水溶液として実質的に無機塩を含有し
ないものが用いられるが、ここで無機塩の濃度は０．１
Ｍ以下であればよく、０．０５Ｍ以下、とりわけＩｍＭ
以下であることが好ましい。また無機イオン強度として
は、無機イオンから計算されろイオン強度が０１以下で
あればよく、００５以下、とり４つ＋１０．００１以下
であることが好ましい。さらに凍結乾燥組成物において
は、その全重量に対し、無機塩か３０％以下であればよ
＜１５％以下、とりわけ０３％以下であることが好まし
い。
ないものが用いられるが、ここで無機塩の濃度は０．１
Ｍ以下であればよく、０．０５Ｍ以下、とりわけＩｍＭ
以下であることが好ましい。また無機イオン強度として
は、無機イオンから計算されろイオン強度が０１以下で
あればよく、００５以下、とり４つ＋１０．００１以下
であることが好ましい。さらに凍結乾燥組成物において
は、その全重量に対し、無機塩か３０％以下であればよ
＜１５％以下、とりわけ０３％以下であることが好まし
い。
実質的に無機塩を含まないＩＦＮ−γ水溶液は、たとえ
はＩＦＮ−γの精製工程とりわけその最終−１程のり［
Ｊマドグラフィー操作で用いる緩衝液として無機塩非含
有緩衝液を用いろことにより、あるいは精製されたＩＦ
Ｎ−γ水溶液から無機塩を除去することにより製造する
ことができる。
はＩＦＮ−γの精製工程とりわけその最終−１程のり［
Ｊマドグラフィー操作で用いる緩衝液として無機塩非含
有緩衝液を用いろことにより、あるいは精製されたＩＦ
Ｎ−γ水溶液から無機塩を除去することにより製造する
ことができる。
アミノ酸としては、グリシン、α−アラニン、β−アラ
ニン、ロイノン、グルタミン酸、アスパラギン酸なとモ
ノアミノ脂肪族アミノ酸が好ましく、とりわけグリシン
が好ましい。またこれらの生理学的に許容される塩もし
くは誘導体でもよい。これらアミノ酸は１種または２種
以上使用することができ、使用するアミノ酸は市販のも
のを使用できろが、本組成物を臨床応用する為には、非
経口投与に用いられる程度の品質のらのが好ましい。
ニン、ロイノン、グルタミン酸、アスパラギン酸なとモ
ノアミノ脂肪族アミノ酸が好ましく、とりわけグリシン
が好ましい。またこれらの生理学的に許容される塩もし
くは誘導体でもよい。これらアミノ酸は１種または２種
以上使用することができ、使用するアミノ酸は市販のも
のを使用できろが、本組成物を臨床応用する為には、非
経口投与に用いられる程度の品質のらのが好ましい。
アミノ酸はそれらの全量として、ＩＦＮ−γ水溶液１ｍ
ｌ当り１ｍｇ以上、好ましくは５−５０ｍｇ配合するこ
とが好ましい。
ｌ当り１ｍｇ以上、好ましくは５−５０ｍｇ配合するこ
とが好ましい。
また本発明の組成物は、Ｉ ＦＮ−γがノステイン残基
を有する場合還元性硫黄化合物を共存せしめてもよい。
を有する場合還元性硫黄化合物を共存せしめてもよい。
該還元性硫黄化合物として、ゲルタデオン（還元型）、
チオクト酸、チオジグリコール。
チオクト酸、チオジグリコール。
チオエタノールアミン、モノチオグリセロール、ジヂオ
スレイトールおよび炭素数１〜７のチオアルカン酸か挙
げられるがとりわけ、グルタチオン（還元型）が好まし
い。還元性硫黄化合物を共存せしめる場合、ＩＦＮ−γ
水溶液１ｍｌ当り還元性硫黄化合物０．１ｍｇ以上、と
りわけ０．５〜ｌｏｍｇが好ましい。
スレイトールおよび炭素数１〜７のチオアルカン酸か挙
げられるがとりわけ、グルタチオン（還元型）が好まし
い。還元性硫黄化合物を共存せしめる場合、ＩＦＮ−γ
水溶液１ｍｌ当り還元性硫黄化合物０．１ｍｇ以上、と
りわけ０．５〜ｌｏｍｇが好ましい。
更に他の安定化剤としてヒト血清アルブミン（Ｈ９Ａ）
または（および）糖類を加えることができる。
または（および）糖類を加えることができる。
ＩＩＳΔとしては、いかなるものでもよいが、本組成物
を臨床応用ずろためには、非経口投与に用いる程度の品
質のものが好ましい。例えば、健康人血漿を原料として
Ｃｏｈｎのエタノール分画第６法によって、分画精製し
たもの［ジャーナル オブアメリカン ケミカル ソザ
イエティ、第６８巻、４５Ｌ−４７５頁（＋９４６）コ
が用いられる。また！−Ｉ Ｓ Ａは安定剤としてアセ
ヂルトリプトファンナトリウノ・や、カプリル酸ナトリ
ウムを含有するものであ−）でもよい。
を臨床応用ずろためには、非経口投与に用いる程度の品
質のものが好ましい。例えば、健康人血漿を原料として
Ｃｏｈｎのエタノール分画第６法によって、分画精製し
たもの［ジャーナル オブアメリカン ケミカル ソザ
イエティ、第６８巻、４５Ｌ−４７５頁（＋９４６）コ
が用いられる。また！−Ｉ Ｓ Ａは安定剤としてアセ
ヂルトリプトファンナトリウノ・や、カプリル酸ナトリ
ウムを含有するものであ−）でもよい。
ＨＳΔはＩＦＮ−γ水溶液に対し水溶液１１ｎｌ当り１
ｍｇ以−１−１とりわｒ）２ｍｇ−２０ｍｇ含有させる
ことが好ましい。
ｍｇ以−１−１とりわｒ）２ｍｇ−２０ｍｇ含有させる
ことが好ましい。
本発明の組成物がＨ８Ａを含有する場合においては、溶
液状態でｐｌ（４，０〜５０または７５〜８５を示すよ
うに調整することが好ましい。より詳しくは、上記アミ
ノ酸類が中性アミノ酸類である場合は、ｐｉ−１４，０
〜５０に、酸性アミノ酸類である場合はｐＨ７５〜８５
に調整することが好ましい。
液状態でｐｌ（４，０〜５０または７５〜８５を示すよ
うに調整することが好ましい。より詳しくは、上記アミ
ノ酸類が中性アミノ酸類である場合は、ｐｉ−１４，０
〜５０に、酸性アミノ酸類である場合はｐＨ７５〜８５
に調整することが好ましい。
糖類としては、例えばデキストラン、ヒドロキシエチル
澱粉のような多糖類、ノヨ糖、マルトースおよび乳糖の
ような三糖類およびブドウ糖、果糖、マンノースおよび
ガラクトースのような単糖類から選ばれた１種または２
種以上の物質が挙げられる。
澱粉のような多糖類、ノヨ糖、マルトースおよび乳糖の
ような三糖類およびブドウ糖、果糖、マンノースおよび
ガラクトースのような単糖類から選ばれた１種または２
種以上の物質が挙げられる。
上記デキストランおよびヒドロキシエチル澱粉に関し、
これらは市販のものを使用できるが、本組成物を臨床応
用するためには、代用血漿として非経口投与に用いられ
る程度の品質のものが好ましい。デキストランは、平均
分子ｆｆ１１万〜１０万、とりわけ４万〜７万のものか
、ヒト〔ノキノエチル澱粉は、平均分子量１万〜２０万
、とりわけ２万〜６万または２０万のらのが有利に使用
される。
これらは市販のものを使用できるが、本組成物を臨床応
用するためには、代用血漿として非経口投与に用いられ
る程度の品質のものが好ましい。デキストランは、平均
分子ｆｆ１１万〜１０万、とりわけ４万〜７万のものか
、ヒト〔ノキノエチル澱粉は、平均分子量１万〜２０万
、とりわけ２万〜６万または２０万のらのが有利に使用
される。
上記した糖類を加える場合は、ＴＦＮ−γ水溶液１ｍｌ
当り１ｍｇ以上、好ましくは３ ｍｇ〜５０ ｍｇ含有
さ且ることか好ましい。
当り１ｍｇ以上、好ましくは３ ｍｇ〜５０ ｍｇ含有
さ且ることか好ましい。
本組成物は、更に浸透圧の」］整剤としての前記糖類ま
たは（および）アミノ酸類等を含有していてしよいか、
塩化ナトリウムのような無機塩を添加することは、反っ
て組成物の品質を劣化させるので、好ましくない。」−
記の好ましい浸透圧の調整剤は該組成物に予め加えてお
くか、凍結乾燥品を再溶解する溶媒中に加えてもよい。
たは（および）アミノ酸類等を含有していてしよいか、
塩化ナトリウムのような無機塩を添加することは、反っ
て組成物の品質を劣化させるので、好ましくない。」−
記の好ましい浸透圧の調整剤は該組成物に予め加えてお
くか、凍結乾燥品を再溶解する溶媒中に加えてもよい。
本発明の凍結および凍結乾燥したヒトＩ ＦＮ−γ組成
物は、例えば以下の方法により製造ずろことかできろ。
物は、例えば以下の方法により製造ずろことかできろ。
実質的に無機塩か存在しないヒトＩＦＮ−γ１ｘ１０２
−１×ＩＯ７１Ｕ／ｍｌ含有水溶液に、アミノ酸を１ｍ
ｇ／ｍｌ以」−１好ましくは５−５０ｍｇ／＋ｈｌの濃
度になるように加える。なお該ＩＦＮ−γ含打水溶液に
は、その製造過程において上記アミノ酸を添加すること
かでき、このアミノ酸をら含有するＩＦＮ−γ水溶液を
用いる場合は、そのまま、または必要により上記アミノ
酸の濃度までアミノ酸を追加して以下の工程に付すこと
ができる。
−１×ＩＯ７１Ｕ／ｍｌ含有水溶液に、アミノ酸を１ｍ
ｇ／ｍｌ以」−１好ましくは５−５０ｍｇ／＋ｈｌの濃
度になるように加える。なお該ＩＦＮ−γ含打水溶液に
は、その製造過程において上記アミノ酸を添加すること
かでき、このアミノ酸をら含有するＩＦＮ−γ水溶液を
用いる場合は、そのまま、または必要により上記アミノ
酸の濃度までアミノ酸を追加して以下の工程に付すこと
ができる。
更に上記したＨ Ｓ Ａや糖類なとも合せて加えること
かできる。
かできる。
上記ＪＰＮ−７水溶液にはＯ，１ｍｇ／ｍ１以上、好ま
しくは０５〜１０ｍｇ／ｍｌの還元性硫黄化合物や微量
の界面活性剤を含有していてもよく、また上記安定剤と
同様、これらを新たに加えろこともてきる。
しくは０５〜１０ｍｇ／ｍｌの還元性硫黄化合物や微量
の界面活性剤を含有していてもよく、また上記安定剤と
同様、これらを新たに加えろこともてきる。
また所望によりｐＨ調整を行う場合は、鉱酸（塩酸、硫
酸なと）または（および）無機塩基（水酸化ナトリウム
、炭酸ナトリウムなど）水溶液を加え所定のｐｔ−ｒに
調整する。
酸なと）または（および）無機塩基（水酸化ナトリウム
、炭酸ナトリウムなど）水溶液を加え所定のｐｔ−ｒに
調整する。
本発明の凍結したヒトＩＦＮ−γ組成物は、例えば上記
水溶液を通常−８０°〜−３０℃で凍結することにより
製造できる。該凍結組成物は一８０°〜−１０°Ｃで保
管ずろことが好ましい。
水溶液を通常−８０°〜−３０℃で凍結することにより
製造できる。該凍結組成物は一８０°〜−１０°Ｃで保
管ずろことが好ましい。
本発明の凍結乾燥したヒ） ］ Ｆ Ｎ γ組成物は
、例えは上記凍結組成物を常法により減圧乾燥するか上
記水溶液または上記凍結組成物の融解により得られる水
溶液を、所望により小分けし、上記同様凍結した後、常
法により減圧乾燥することにより製造することができる
。
、例えは上記凍結組成物を常法により減圧乾燥するか上
記水溶液または上記凍結組成物の融解により得られる水
溶液を、所望により小分けし、上記同様凍結した後、常
法により減圧乾燥することにより製造することができる
。
注射用製剤としての本発明の凍結乾燥したヒトＩ ＦＮ
−−γ組成物を製造する場合は、小分けする前に該組成
物水溶液あるいはその成分をそれぞれ除菌ろ過等により
精製し、無菌操作によりバイアル瓶等に分注小分けした
後上記凍結乾燥処理に付すことが好ましい。
−−γ組成物を製造する場合は、小分けする前に該組成
物水溶液あるいはその成分をそれぞれ除菌ろ過等により
精製し、無菌操作によりバイアル瓶等に分注小分けした
後上記凍結乾燥処理に付すことが好ましい。
本発明の凍結もしくは凍結乾燥したヒトＩＦＮ−γ組成
物は、その凍結あるいは凍結乾燥操作お、及び保存中の
ＴＦＮ−γ活性や品質の低下が極めて少なくまたその再
溶解時に濁りが生じないため何用である。また凍結乾燥
した組成物は、安定化されたヒ１ｉＦＮ−γの粉末とし
て得られとりわ（」非経Ｌ」投ＬＪ製剤として有利に用
いることができる。この場合さらに）（ＳＡを加えた組
成物は、器壁への付着が少なく有利に用いることができ
る。
物は、その凍結あるいは凍結乾燥操作お、及び保存中の
ＴＦＮ−γ活性や品質の低下が極めて少なくまたその再
溶解時に濁りが生じないため何用である。また凍結乾燥
した組成物は、安定化されたヒ１ｉＦＮ−γの粉末とし
て得られとりわ（」非経Ｌ」投ＬＪ製剤として有利に用
いることができる。この場合さらに）（ＳＡを加えた組
成物は、器壁への付着が少なく有利に用いることができ
る。
本発明の凍結乾燥したヒトＩＦＮ−γ組成物を注射用製
剤として用いる場合は、通常用時、凍結乾燥組成物をバ
イアル当り１〜１００ｍ１の注射用蒸留水またはブドウ
糖注射液等に溶解し、溶液の浸透圧が生理的に許容され
る範囲内て使用する。
剤として用いる場合は、通常用時、凍結乾燥組成物をバ
イアル当り１〜１００ｍ１の注射用蒸留水またはブドウ
糖注射液等に溶解し、溶液の浸透圧が生理的に許容され
る範囲内て使用する。
また適当な担体、賦形剤、希釈剤を用いて眼、耳、鼻内
投与用の剤形ど°して用いることができる。
投与用の剤形ど°して用いることができる。
本発明の凍結したもしくは凍結乾燥したヒトＩＦＮ−γ
組成物は、低毒性で、公知のヒトＩＦＮ−γと同様の目
的に同様の用法により使用することができる。
組成物は、低毒性で、公知のヒトＩＦＮ−γと同様の目
的に同様の用法により使用することができる。
本願萌細書中、ＩＦＮ−γの活性（抗ウィルス活性）と
して国際単位（ＩＵ）は以下により求めた。
して国際単位（ＩＵ）は以下により求めた。
単位（ユニット）の確定した国際標準ｒＦＮ−γと目的
とする資料をヒト羊膜由来Ｆ■７細胞株に対するシンド
ビス ウィルス（Ｓ １ｎｄｂｉｓ Ｖ １ｒｕｓ）
の細胞変性効果阻止試験を用いて測定し、その比率から
力価を算出して求めた。
とする資料をヒト羊膜由来Ｆ■７細胞株に対するシンド
ビス ウィルス（Ｓ １ｎｄｂｉｓ Ｖ １ｒｕｓ）
の細胞変性効果阻止試験を用いて測定し、その比率から
力価を算出して求めた。
なお溶液中の蛋白量は、Ｅ：２８０ｎｍ＝１．Ｏを１ｍ
ｇとして計算して求めた。
ｇとして計算して求めた。
作用および実施例
以下に実施例および参考例により本発明を具体的に説明
するが、本発明はこれらに限定されるものてはない。
するが、本発明はこれらに限定されるものてはない。
実施例で用いたＩＦＮ−γは、特に注意しない場合は、
参考例１に記載した方法で製造した実質的に無機塩を含
まない高濃度ヒトｒｌＦＮ−γ水溶液を使用した。なお
該ヒトｒｌＦＮ−γは第１図に示すアミノ酸配列を有す
る。
参考例１に記載した方法で製造した実質的に無機塩を含
まない高濃度ヒトｒｌＦＮ−γ水溶液を使用した。なお
該ヒトｒｌＦＮ−γは第１図に示すアミノ酸配列を有す
る。
実施例１〜８に記載の組成物の製造においては、積極的
な叶１調整を行なっていないが、これら注射用蒸留水に
よる再溶解時のｐＨはｐＨ５，５〜７の範囲である。
な叶１調整を行なっていないが、これら注射用蒸留水に
よる再溶解時のｐＨはｐＨ５，５〜７の範囲である。
実施例１
除菌ろ過して得たグルタチオン（還元型）３ｍｇを含む
２．４Ｘ ｌ Ｏ°１０／ｍｌのヒトＩＦＮ−ｙ水溶液
１ｍｌにクリシン１５ｍｇを含有する除菌ろ過した水溶
液０５ｍ１を加え、バイアル瓶中で凍結乾燥を行った。
２．４Ｘ ｌ Ｏ°１０／ｍｌのヒトＩＦＮ−ｙ水溶液
１ｍｌにクリシン１５ｍｇを含有する除菌ろ過した水溶
液０５ｍ１を加え、バイアル瓶中で凍結乾燥を行った。
凍結乾燥品は注射用蒸留水１ｍｌで再溶解して、溶液の
溶状の肉眼観察とｒＦＮ−γの力価測定を行−）た。そ
の結果は第１表に示す。
溶状の肉眼観察とｒＦＮ−γの力価測定を行−）た。そ
の結果は第１表に示す。
実施例２
実施例１において、グリシン１５ｍｇと共にヒドロキシ
エチル澱粉（平均分子量２０万）３７．５ｍｇを配合し
た以外は実施例１と同様に行った。その結果は第１表に
示す。
エチル澱粉（平均分子量２０万）３７．５ｍｇを配合し
た以外は実施例１と同様に行った。その結果は第１表に
示す。
実施例３
実施例ｉにおいて、グリシンを３０ｍｇに増量し、更に
グルタミン酸ナトリウム７ 、５ｍｇを配合した以外は
実施例１七同様に行った。その結果は第１表に示す。
グルタミン酸ナトリウム７ 、５ｍｇを配合した以外は
実施例１七同様に行った。その結果は第１表に示す。
実施例４
除菌ろ過して得たグルタチオン（還元型）３ｍｇを含む
３．７ｘ ｌ Ｏ”ｌ Ｕ／ｍｌのヒトＩＦＮ−７水溶
液１ｍｌにグリシン３０ｍｇを含有する除菌ろ過した水
溶液０．５ｍｌを加え、バイアル瓶中で凍結乾燥を行っ
た。凍結乾燥品は注射用蒸留水１ｍｌで再溶解して、溶
液の溶状の肉眼観察とＩＦＮ−γの力価測定を行った。
３．７ｘ ｌ Ｏ”ｌ Ｕ／ｍｌのヒトＩＦＮ−７水溶
液１ｍｌにグリシン３０ｍｇを含有する除菌ろ過した水
溶液０．５ｍｌを加え、バイアル瓶中で凍結乾燥を行っ
た。凍結乾燥品は注射用蒸留水１ｍｌで再溶解して、溶
液の溶状の肉眼観察とＩＦＮ−γの力価測定を行った。
対象としてグリシンを配合せずに、除菌ろ過してゲルタ
デオン（還元型）３ＩＩ１ｇを含むヒトｌ ＦＮ−γ水
溶液１ｍｌをバイアル瓶中で凍結乾燥を行い、同様にＩ
ＦＮ−γの力価を測定した。その結果は第１表に示す。
デオン（還元型）３ＩＩ１ｇを含むヒトｌ ＦＮ−γ水
溶液１ｍｌをバイアル瓶中で凍結乾燥を行い、同様にＩ
ＦＮ−γの力価を測定した。その結果は第１表に示す。
第 １ 表
８凍結乾燥前の溶液に対する凍結乾燥品の力価残存率
実施例５
除菌ろ過して得たグルタチオン（還元型）３ｍｇを含む
４．６ｘ ］ Ｏ°ＴＵ／ｍｌのヒトＴＦＮ−７水溶液
１ｍｌにグリシン３０ｍｇを含有する除菌ろ過した水溶
液０５ｍ１を加え、−３０℃に１週間凍結保存しノコ後
、ＩＦＮ−γの力価を測定した。該凍結品は凍結前の溶
液に対して９７％の力価を示した。
４．６ｘ ］ Ｏ°ＴＵ／ｍｌのヒトＴＦＮ−７水溶液
１ｍｌにグリシン３０ｍｇを含有する除菌ろ過した水溶
液０５ｍ１を加え、−３０℃に１週間凍結保存しノコ後
、ＩＦＮ−γの力価を測定した。該凍結品は凍結前の溶
液に対して９７％の力価を示した。
実施例６
参考例２で得たｒｌＦＮ−γ食合溶液を除菌ろ過して得
たグルタチオン（還元型）３ｍｇ／ｍｌおよび塩化ナト
リウム２．５ｍｇ／ｍｌを含む４．６Ｘ１０”ｌＵ／ｍ
ｌのヒトＩＦＮ−γ水溶液０．２５ｍ１にグリシン１５
ｍｇを含有する除菌ろ過した水溶液０．７５ｍ１を加え
、バイアル瓶中で凍結乾燥を行った。凍結乾燥品は注射
用蒸留水１ｍｌで再溶解すると少量の微細不溶物が生し
、そのままこれのＩＦＮ−γの力価測定を行った。
たグルタチオン（還元型）３ｍｇ／ｍｌおよび塩化ナト
リウム２．５ｍｇ／ｍｌを含む４．６Ｘ１０”ｌＵ／ｍ
ｌのヒトＩＦＮ−γ水溶液０．２５ｍ１にグリシン１５
ｍｇを含有する除菌ろ過した水溶液０．７５ｍ１を加え
、バイアル瓶中で凍結乾燥を行った。凍結乾燥品は注射
用蒸留水１ｍｌで再溶解すると少量の微細不溶物が生し
、そのままこれのＩＦＮ−γの力価測定を行った。
その結果、凍結乾燥府のヒｌ−Ｉ Ｆ Ｎ−γ溶液の力
価に対して９８％であった３、 実施例７ 除菌ろ過して得たゲルタデオン（還元型）３ｍｇ／ｍｌ
を含む２．６ｘ Ｉ Ｏ６１Ｕ／ｍｌのヒトＩＦ′Ｎ−
γ水溶液０．５ｍｌにグリシンｌ０ｍｇおよびヒドロキ
ノエチル澱粉（平均分子量４万）１５ｍｇを含有する除
菌ろ過した水溶液０．２５ｍ１を加えバイアル瓶中で凍
結乾燥を行った。凍結乾燥品は注射用蒸留水０．５ｍｌ
で再溶解して溶液か澄明であることを確認し、Ｉ ＦＮ
−一γの力価測定を行った。
価に対して９８％であった３、 実施例７ 除菌ろ過して得たゲルタデオン（還元型）３ｍｇ／ｍｌ
を含む２．６ｘ Ｉ Ｏ６１Ｕ／ｍｌのヒトＩＦ′Ｎ−
γ水溶液０．５ｍｌにグリシンｌ０ｍｇおよびヒドロキ
ノエチル澱粉（平均分子量４万）１５ｍｇを含有する除
菌ろ過した水溶液０．２５ｍ１を加えバイアル瓶中で凍
結乾燥を行った。凍結乾燥品は注射用蒸留水０．５ｍｌ
で再溶解して溶液か澄明であることを確認し、Ｉ ＦＮ
−一γの力価測定を行った。
その結果、凍結乾燥前のヒトＩＦＮ−γ溶液の力価に対
して９４％であった。また４０°ＣＩカ月保存後の保存
開始時の力価に対する残存率は１００％と安定であった
。
して９４％であった。また４０°ＣＩカ月保存後の保存
開始時の力価に対する残存率は１００％と安定であった
。
実施例８
除菌ろ過して得たグルタチオン（還元型） ３ｍｇ／ｍ
１を含む２．６Ｘ Ｉ ０６１ Ｕ ／ｍｌのヒト［Ｆ
Ｎｍ−水溶液０．５ｍｌにクルタミン酸ナトリウム１５
ｍｇおよびヒｌ−’ ｃｒギノＪ−、デル澱粉（平均分
子量４万）１５ｍｇを含（ｊ′ずろ除菌ろ過した水溶液
０．２５ｍ１を加えバイアル）ｌＬ中て凍１−３乾燥を
行った。凍結乾燥品は注射用７Ａ留水０５ｍ１で再溶解
して溶液が澄明であることを確認し、ＩＦＮ−γの力価
測定を行った。
１を含む２．６Ｘ Ｉ ０６１ Ｕ ／ｍｌのヒト［Ｆ
Ｎｍ−水溶液０．５ｍｌにクルタミン酸ナトリウム１５
ｍｇおよびヒｌ−’ ｃｒギノＪ−、デル澱粉（平均分
子量４万）１５ｍｇを含（ｊ′ずろ除菌ろ過した水溶液
０．２５ｍ１を加えバイアル）ｌＬ中て凍１−３乾燥を
行った。凍結乾燥品は注射用７Ａ留水０５ｍ１で再溶解
して溶液が澄明であることを確認し、ＩＦＮ−γの力価
測定を行った。
その結果、凍結乾燥前のヒトＩＦＮ−γ溶液の力佃ｊに
対して１０２％であった。また４０’Ｃｌ力月保存後の
保存開始時のツ２価に対する残存率は１０６％と安定で
あった。
対して１０２％であった。また４０’Ｃｌ力月保存後の
保存開始時のツ２価に対する残存率は１０６％と安定で
あった。
実施例９
ゲルタデオン（還元型）３ｍｇ／ｍｌを含む３８×１０
ＪＵ／ｍｌのヒｌ−１１−” Ｎ−７水溶液０．１６ｍ
１ ＋−ＩＳＡ５ｍｇ／ｍｌおよびグリシン２３ｍｇ／
ｍｌを含有し、Ｑ、ｌＮ ＭＣＩでｐＨ４，５に調製し
た除菌ろ過した水溶液の各１ｍｌをバイアル瓶に分注し
、凍結乾燥を行った。凍結乾燥品は注射用蒸留水１ｍｌ
で再溶解して溶液の溶状の肉眼観察、ｐ Ｉ−１の測定
およびＩＦＮ−γの力価測定を行った。その結果は第２
表に示す。
ＪＵ／ｍｌのヒｌ−１１−” Ｎ−７水溶液０．１６ｍ
１ ＋−ＩＳＡ５ｍｇ／ｍｌおよびグリシン２３ｍｇ／
ｍｌを含有し、Ｑ、ｌＮ ＭＣＩでｐＨ４，５に調製し
た除菌ろ過した水溶液の各１ｍｌをバイアル瓶に分注し
、凍結乾燥を行った。凍結乾燥品は注射用蒸留水１ｍｌ
で再溶解して溶液の溶状の肉眼観察、ｐ Ｉ−１の測定
およびＩＦＮ−γの力価測定を行った。その結果は第２
表に示す。
実施例１０
実施例９において、Ｉ−Ｉ ＳＡをｌ０ｍｇ／ｍｌに増
量した以外は実施例９と同様に行った。その結果は第２
表に示す。
量した以外は実施例９と同様に行った。その結果は第２
表に示す。
実施例１１
実施例１０において、ＨＳ Ａを２０ｍｇ／ｍｌに増量
した以外は実施例９と同様に行−）た。その結果は第２
表に示す。
した以外は実施例９と同様に行−）た。その結果は第２
表に示す。
実施例１２
実施例９において、更にヒドロキノエチル澱粉（平均分
子量４万）を５ｍｇ／ｍｌになるように加えた以外（Ｊ
実施例９と同様に行った。その結果は第２表に示す。
子量４万）を５ｍｇ／ｍｌになるように加えた以外（Ｊ
実施例９と同様に行った。その結果は第２表に示す。
実施例１３
実施例１０においてグリシンのかわりにグルタミン酸ナ
トリウムを ２７ｍｇ／ｍｌになるように加えＯ，ｌＮ
ＮａＯＨ水溶液でｐＨ７，８に調整した以外は実施例
１０と同様に行った。その結果は第２表に示す。
トリウムを ２７ｍｇ／ｍｌになるように加えＯ，ｌＮ
ＮａＯＨ水溶液でｐＨ７，８に調整した以外は実施例
１０と同様に行った。その結果は第２表に示す。
第 ２ 表
８ 凍結乾燥前の溶液に対する凍結乾燥品の力価残存率
参考例３〜５で得た実質的に無機塩を含まない高濃度ｒ
ｌＦＮ−γ水溶液を用いても上記実施例とドｉ］様の結
果が得られる。
ｌＦＮ−γ水溶液を用いても上記実施例とドｉ］様の結
果が得られる。
実施例１４
参考例６に記載の方法で得た２、５Ｘ Ｉ ０１ｌｌ
Ｕｌｏ、２５ｍＬ ＨＳ Ａ ５ ｍｇ／ ｍｌおよび
グリシン２３ｍｇ／ｍｌを含有し、Ｏ，ｌＮ ＨＣＩ
でｐｌ−１４，５に調整した除菌ろ過した水溶液の各１
ｍｌをバイアル瓶に分注し、凍結乾燥を行った。凍結乾
燥品は注射用蒸留水１ｍ、１で再溶解した。溶液の溶状
は澄明で、ｐＨ４５であった。また凍結乾燥する前の水
溶液の力価に対する残存率は９６％であった。
Ｕｌｏ、２５ｍＬ ＨＳ Ａ ５ ｍｇ／ ｍｌおよび
グリシン２３ｍｇ／ｍｌを含有し、Ｏ，ｌＮ ＨＣＩ
でｐｌ−１４，５に調整した除菌ろ過した水溶液の各１
ｍｌをバイアル瓶に分注し、凍結乾燥を行った。凍結乾
燥品は注射用蒸留水１ｍ、１で再溶解した。溶液の溶状
は澄明で、ｐＨ４５であった。また凍結乾燥する前の水
溶液の力価に対する残存率は９６％であった。
実施例１５
参考例６に記載の方法で得た２、５ｘ ｌ Ｏ’［Ｕｌ
ｏ、２５ｍ１、ヒドロキンエヂル澱粉（平均分子量４万
）を１５ｍｇ／ｍｌおよびグリシン２３ｍｇ／ｍｌを含
有するように調整された除菌ろ過した水溶液の各ｌ−を
バイアル瓶に分注し、凍結乾燥を行った、実施例１４と
同様に再溶解したときの溶液の溶状は澄明でｐｌ−１６
，５であった。また凍結乾燥する前の水溶液の力価に対
する残存率は１０１％であっノこ。
ｏ、２５ｍ１、ヒドロキンエヂル澱粉（平均分子量４万
）を１５ｍｇ／ｍｌおよびグリシン２３ｍｇ／ｍｌを含
有するように調整された除菌ろ過した水溶液の各ｌ−を
バイアル瓶に分注し、凍結乾燥を行った、実施例１４と
同様に再溶解したときの溶液の溶状は澄明でｐｌ−１６
，５であった。また凍結乾燥する前の水溶液の力価に対
する残存率は１０１％であっノこ。
参考例Ｉ 実質的に無機塩を含まない高濃度ｒｌＦＮ−
γ水溶液の製造 ■ （１）ＥＰＣ００Ｂ９ ６７９号公開公報実施例８の記
載に準じ発現用ヒトＩＦＮ−γ遺伝子を有する菌株ＲＲ
Ｉ（ｐＲＫ２４８ｃｌｔｓ、 ｐＲＣ２３１／ＩＰ＋
−９００）を培養してえた凍結菌体１０００ｇに７Ｍ塩
酸グアニジンおよび２ｍＭフェニルメヂメチルポニルフ
ルオライドを含むｌｏｏｍＭ ｌ−リス塩酸緩衝液（ｐ
ｌ−１７，０）を３０００ｍｌ加え、４°Ｃで１ｌＩＪ
ｉ間攪拌したのち遠心分離機（１７，０００ｒｐｍ／３
０分）に付し、澄明な上清液をえた。この上清液を１３
７ｍＭ塩化ナトリウム、２７ｍＭ塩化カリウム、８ｍＭ
リン酸二ナトリウムおよび１４７ｍＭリン酸カリウムか
ら成る緩衝液（以下ＰＢＳと略す）で７０倍に希釈し、
生じてくる沈澱物をシャープレス遠心分離機（Ｉ Ｏ，
００Ｏｒｐｍ）に付して除去した。次いてえられた上清
液２２０ρをペリコン（ミリポア社製９分画分子量 １
０，０００）で１５ｇにまで濃縮した。ごの濃縮液を４
℃で一夜放置し、牛しノー沈澱物をさらにンヤープレス
遠心分離機にかけて除去した。この上清液を予め充填し
た５Ｘ３０ｃｍの抗体カラム［Ａｂ（Ｍｏ・７２−１１
．１）；ＥＰＣＯ１０３８９８号公開公報実施例１２参
照］に流速１．０００ｍｌ／時間で負荷したのち、ＰＢ
Ｓの２，５００ｍ１，１Ｍ塩化ナトリウムおよび０．１
％ツイーン２０を含んだ１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐｔ−
ｒ７．ｏ）の５，０００ｍ１．Ｐｔ３Ｓの２，５００ｍ
１および０．５Ｍ塩酸グアニジンを含んた２０ｍＭリン
酸緩衝液（１）Ｈ７，０）の２．５００ｍ１の各洗浄液
を遂次抗体カラムを通過させたのち、２Ｍ塩酸グアニジ
ンを含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＬＩ７．０）で溶出
し、抗ウィルス活性を有ずろ溶出画分５００ｍ１を集め
た。
γ水溶液の製造 ■ （１）ＥＰＣ００Ｂ９ ６７９号公開公報実施例８の記
載に準じ発現用ヒトＩＦＮ−γ遺伝子を有する菌株ＲＲ
Ｉ（ｐＲＫ２４８ｃｌｔｓ、 ｐＲＣ２３１／ＩＰ＋
−９００）を培養してえた凍結菌体１０００ｇに７Ｍ塩
酸グアニジンおよび２ｍＭフェニルメヂメチルポニルフ
ルオライドを含むｌｏｏｍＭ ｌ−リス塩酸緩衝液（ｐ
ｌ−１７，０）を３０００ｍｌ加え、４°Ｃで１ｌＩＪ
ｉ間攪拌したのち遠心分離機（１７，０００ｒｐｍ／３
０分）に付し、澄明な上清液をえた。この上清液を１３
７ｍＭ塩化ナトリウム、２７ｍＭ塩化カリウム、８ｍＭ
リン酸二ナトリウムおよび１４７ｍＭリン酸カリウムか
ら成る緩衝液（以下ＰＢＳと略す）で７０倍に希釈し、
生じてくる沈澱物をシャープレス遠心分離機（Ｉ Ｏ，
００Ｏｒｐｍ）に付して除去した。次いてえられた上清
液２２０ρをペリコン（ミリポア社製９分画分子量 １
０，０００）で１５ｇにまで濃縮した。ごの濃縮液を４
℃で一夜放置し、牛しノー沈澱物をさらにンヤープレス
遠心分離機にかけて除去した。この上清液を予め充填し
た５Ｘ３０ｃｍの抗体カラム［Ａｂ（Ｍｏ・７２−１１
．１）；ＥＰＣＯ１０３８９８号公開公報実施例１２参
照］に流速１．０００ｍｌ／時間で負荷したのち、ＰＢ
Ｓの２，５００ｍ１，１Ｍ塩化ナトリウムおよび０．１
％ツイーン２０を含んだ１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐｔ−
ｒ７．ｏ）の５，０００ｍ１．Ｐｔ３Ｓの２，５００ｍ
１および０．５Ｍ塩酸グアニジンを含んた２０ｍＭリン
酸緩衝液（１）Ｈ７，０）の２．５００ｍ１の各洗浄液
を遂次抗体カラムを通過させたのち、２Ｍ塩酸グアニジ
ンを含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＬＩ７．０）で溶出
し、抗ウィルス活性を有ずろ溶出画分５００ｍ１を集め
た。
（ＩＩ） 参考例１ （１）の方法で得た溶出画分４
２０ｍ１に還元型グルタチオンを１０ｍＭ、！添加した
。
２０ｍ１に還元型グルタチオンを１０ｍＭ、！添加した
。
このヒトＩＦＮ−γ水溶液の４２０ｍ１を予め１ｍＭエ
チレンジアミン四酢酸塩、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、
１０ｍＭ還元型グルタチオンおよび２Ｍ塩酸グアニジン
を含んだ２５１Ｍ酢酸緩衝液（ｐｉ−１６０）で平衡化
したセファクリールＳ−２００（ファルマンア社Ｉ！り
のカラム（９ｘ ｌ ＯＯｃｍ）に負荷し、同一緩衝液
で溶出し、モノマー溶出画分４５０ｍ１を集めた。本操
作により比活性３．４Ｘ １０’Ｉ ＴＪ７ｍｇタン白
のＩ Ｆ Ｎ −７（０，４１０ｍｇ／ｍｌ）を得た。
チレンジアミン四酢酸塩、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、
１０ｍＭ還元型グルタチオンおよび２Ｍ塩酸グアニジン
を含んだ２５１Ｍ酢酸緩衝液（ｐｉ−１６０）で平衡化
したセファクリールＳ−２００（ファルマンア社Ｉ！り
のカラム（９ｘ ｌ ＯＯｃｍ）に負荷し、同一緩衝液
で溶出し、モノマー溶出画分４５０ｍ１を集めた。本操
作により比活性３．４Ｘ １０’Ｉ ＴＪ７ｍｇタン白
のＩ Ｆ Ｎ −７（０，４１０ｍｇ／ｍｌ）を得た。
（［１１） 参考例１（■）でえたヒトＩＦＮ−γ（
モノマー）溶出画分４５０ｍ１に１０ｍＭ還元型グルタ
チオン、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、０．５Ｍ塩塩酸グ
アノノンよび０．０１％ツイーン２０を含む２５ｍＭ酢
酸緩衝液（ｐｌ（６，０）の希釈液３，２４０ｍ１を添
加、混合し、タン白含量０．０５ｍｇ／ｍｌの低濃度溶
液を調整した。この溶液を予め、ｌ０ｍＭ還元型ゲルタ
デオン、１５０ｍＭ塩化ナトリウムおよび０．０１％ツ
イーン２０を含む２５ｍＭ酢酸緩衝液（ｐｌ−ｒ６．０
）で≦＋１衡化したセファデックスＧ−２５のカラム（
１４Ｘ１００ｃｍ）に負荷し、同一緩衝液でケルろ過を
行い、塩酸グアニジノを除去したヒトＩ ＦＮ−γの溶
出画分３ 、 Ｉ ８０ ｍｌ（１５５，８ｍｇ）をえ
た。ごの溶液のタン白含量はＯ，０Ｌ９ｎ＋ｇ／ｍｌで
あった。タン白回収率は８４４％であった。その比活性
は３５×１０°ＩＵ／ｍｇタン白であった。この溶液を
４℃て ４８時間熟成さｌｏたのち、ダイアワｌニア−
ＰＭ−Ｉ０．４３ｍｍφ（アミコン社製限外ろ過膜）を
用い、限外ろ過により１５９ｍ１まで濃縮した。この濃
縮液は澄明て、そのタン白金債は０．９２ｍｇ／ｍｌで
あった。タン白回収率は９３．９％（１４６，３ｍｇ）
であった。なお、ヒトＩＦＮ−γの比活性は６．８Ｘｌ
−０６ＩＵ／ｍｇタン白であった。
モノマー）溶出画分４５０ｍ１に１０ｍＭ還元型グルタ
チオン、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、０．５Ｍ塩塩酸グ
アノノンよび０．０１％ツイーン２０を含む２５ｍＭ酢
酸緩衝液（ｐｌ（６，０）の希釈液３，２４０ｍ１を添
加、混合し、タン白含量０．０５ｍｇ／ｍｌの低濃度溶
液を調整した。この溶液を予め、ｌ０ｍＭ還元型ゲルタ
デオン、１５０ｍＭ塩化ナトリウムおよび０．０１％ツ
イーン２０を含む２５ｍＭ酢酸緩衝液（ｐｌ−ｒ６．０
）で≦＋１衡化したセファデックスＧ−２５のカラム（
１４Ｘ１００ｃｍ）に負荷し、同一緩衝液でケルろ過を
行い、塩酸グアニジノを除去したヒトＩ ＦＮ−γの溶
出画分３ 、 Ｉ ８０ ｍｌ（１５５，８ｍｇ）をえ
た。ごの溶液のタン白含量はＯ，０Ｌ９ｎ＋ｇ／ｍｌで
あった。タン白回収率は８４４％であった。その比活性
は３５×１０°ＩＵ／ｍｇタン白であった。この溶液を
４℃て ４８時間熟成さｌｏたのち、ダイアワｌニア−
ＰＭ−Ｉ０．４３ｍｍφ（アミコン社製限外ろ過膜）を
用い、限外ろ過により１５９ｍ１まで濃縮した。この濃
縮液は澄明て、そのタン白金債は０．９２ｍｇ／ｍｌで
あった。タン白回収率は９３．９％（１４６，３ｍｇ）
であった。なお、ヒトＩＦＮ−γの比活性は６．８Ｘｌ
−０６ＩＵ／ｍｇタン白であった。
（ＩＶ） 上記（ｌＩｌ）の方法で得たヒｌ−Ｉ Ｆ
Ｎ−γを高濃度に含有する水溶液（タン白金Ｔ−Ｔｆ
ｔｔ；０．９５２ｍｇ／ｍｌ）の３８ｍ１を予めｌ０ｍ
Ｍ還元型ゲルタデオンを含んだ２５ｍＭ酢酸緩衝液（ｐ
Ｔ−１６，０）で平衡化したセファデックスＧ−２５の
カラム（５，Ｏｘ ５０．Ｏｃｍ）に負荷し、同一緩衝
液で展開し、タン白含量０５８９ｍｇ／ｍｌの実質的に
無機塩を含まない（１０ｐｐｍ未満）澄明なＩＦＮ−γ
溶液５７ｍ１をえた。
Ｎ−γを高濃度に含有する水溶液（タン白金Ｔ−Ｔｆ
ｔｔ；０．９５２ｍｇ／ｍｌ）の３８ｍ１を予めｌ０ｍ
Ｍ還元型ゲルタデオンを含んだ２５ｍＭ酢酸緩衝液（ｐ
Ｔ−１６，０）で平衡化したセファデックスＧ−２５の
カラム（５，Ｏｘ ５０．Ｏｃｍ）に負荷し、同一緩衝
液で展開し、タン白含量０５８９ｍｇ／ｍｌの実質的に
無機塩を含まない（１０ｐｐｍ未満）澄明なＩＦＮ−γ
溶液５７ｍ１をえた。
このＩＦＮ−７の比活性は３．７ｘ ｌ ０６１ Ｕ／
ｍｇ・タン白てあった。
ｍｇ・タン白てあった。
参考例２ 高濃度ｒｌ ＦＮ−γ水溶液の製造参考例１
（ＩＩＩ）の方法で得たヒトＩＦＮ−γを高濃度に含有
する水溶液（タン白金＜Ｔ ｂｔ ：０．９５２ｍｇ／
ｍｌ）（１１） ３８ ｍ１４：予めｌ０ｍＭ還元型
グルタチオンおよび４０ｍＭ塩化すトリウムを含んた２
５ｍＭ酢酸緩衝液（ｐｌ（６，０）で平衡化したセファ
デックスＧ−２５＝ｈうＪ、（５，Ｏｘ ５０． Ｏｃ
＋＋＋）に負荷し、同一緩衝液て展開し、タン白金ｆｆ
１０．６５８ｍｇ／ｍｌの塩化ナトリウムを０．０４Ｍ
含む澄明なＩＩｌ’Ｎ−γｉ’８液５２ｍ１をえノご１
１ ごのＩＦＮ−７の比活性は４．６Ｘ Ｉ Ｏ’ Ｉ Ｕ
／ｍｇ・タン白であった。
（ＩＩＩ）の方法で得たヒトＩＦＮ−γを高濃度に含有
する水溶液（タン白金＜Ｔ ｂｔ ：０．９５２ｍｇ／
ｍｌ）（１１） ３８ ｍ１４：予めｌ０ｍＭ還元型
グルタチオンおよび４０ｍＭ塩化すトリウムを含んた２
５ｍＭ酢酸緩衝液（ｐｌ（６，０）で平衡化したセファ
デックスＧ−２５＝ｈうＪ、（５，Ｏｘ ５０． Ｏｃ
＋＋＋）に負荷し、同一緩衝液て展開し、タン白金ｆｆ
１０．６５８ｍｇ／ｍｌの塩化ナトリウムを０．０４Ｍ
含む澄明なＩＩｌ’Ｎ−γｉ’８液５２ｍ１をえノご１
１ ごのＩＦＮ−７の比活性は４．６Ｘ Ｉ Ｏ’ Ｉ Ｕ
／ｍｇ・タン白であった。
参考例３ 実質的にイｌｌ（機塩を含まない高濃度ｒＴ
１７Ｎ γ水溶液の製造 （１）特開昭５９−８０６４６号公報参考例２に記載の
形質転換体」、ノ上すヒア コリ（Ｅｓｃｌ＋ｅｒｉｃ
ｈｉａ ｃｏｌ １）２９４／ｐ＋−［ＩＴｔｒｐ
２１０１の培養、凍結菌体１ｋｇに７Ｍ塩塩酸グアニ
シン含む０．０５Ｍホウ酸緩衝ＩｔＪＬ（１１７，２）
を３．０００ｍ１加え、４°Ｃて１時間攪拌したのし、
遠心分離（１７，００Ｏｒｐｍ／ ３０分）にか＋Ｊ澄
明な抽出液２．７０Ｆ１ｍｌをえた。この抽出液を０．
１３７Ｍ塩化ナトリウム、２．７ｍＭ塩化カリウム、８
ｍＭリン酸２ナトリウムおよび１．４７ｍＭリン酸ｌカ
リウムから成る緩衝液（以１ζＰ、ＢＳと略す）で１０
倍に希釈した。次いてこの希釈液にノリカゲル（セパレ
イジョン・インダストリーズ社製）０．４ｋｇを加え、
４℃で４５分間攪拌、１５分間静置したのち、傾斜法で
１−６液を棄てノこ。このンリカケルを１Ｍ塩化ナトリ
ウムを含む００５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，２）で十分
洗浄１またのら、カラム（ｌ ｌ ｘ ｌ Ｉｃｍ）に
充填した。次いで０．５Ｍ塩塩化テトラメルルアンモニ
ウム含むＯ，ＯＩＭホウ酸緩衝液（＋）８８．０）で溶
出し、溶出液２０Ｑを５ｘ８ｃｍの抗体カラム［Ａｂ（
Ｍｏ・７２ｉ１．ｌ）：前Ｌｌｔ］に負荷、７５０ｍ１
のＰ、Ｂ、Ｓて洗浄したのら、２Ｍ塩塩酸グアノノン含
む００２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７０）で溶出し、抗ウィ
ルス（以下ＡＶと略す）活性を有する両分１８３ｍ１を
採集した。この溶出液に還元型ゲルタデオンを Ｏ，０
１Ｍ量（５６２ｍｇ）を添加して比活性２．ｌＸ Ｉ
Ｏ６１ｔＪ／ｍｇ・タン白の ｒｌＦＮ−７１７２ｍｇ
を含む水溶液をえた。
１７Ｎ γ水溶液の製造 （１）特開昭５９−８０６４６号公報参考例２に記載の
形質転換体」、ノ上すヒア コリ（Ｅｓｃｌ＋ｅｒｉｃ
ｈｉａ ｃｏｌ １）２９４／ｐ＋−［ＩＴｔｒｐ
２１０１の培養、凍結菌体１ｋｇに７Ｍ塩塩酸グアニ
シン含む０．０５Ｍホウ酸緩衝ＩｔＪＬ（１１７，２）
を３．０００ｍ１加え、４°Ｃて１時間攪拌したのし、
遠心分離（１７，００Ｏｒｐｍ／ ３０分）にか＋Ｊ澄
明な抽出液２．７０Ｆ１ｍｌをえた。この抽出液を０．
１３７Ｍ塩化ナトリウム、２．７ｍＭ塩化カリウム、８
ｍＭリン酸２ナトリウムおよび１．４７ｍＭリン酸ｌカ
リウムから成る緩衝液（以１ζＰ、ＢＳと略す）で１０
倍に希釈した。次いてこの希釈液にノリカゲル（セパレ
イジョン・インダストリーズ社製）０．４ｋｇを加え、
４℃で４５分間攪拌、１５分間静置したのち、傾斜法で
１−６液を棄てノこ。このンリカケルを１Ｍ塩化ナトリ
ウムを含む００５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，２）で十分
洗浄１またのら、カラム（ｌ ｌ ｘ ｌ Ｉｃｍ）に
充填した。次いで０．５Ｍ塩塩化テトラメルルアンモニ
ウム含むＯ，ＯＩＭホウ酸緩衝液（＋）８８．０）で溶
出し、溶出液２０Ｑを５ｘ８ｃｍの抗体カラム［Ａｂ（
Ｍｏ・７２ｉ１．ｌ）：前Ｌｌｔ］に負荷、７５０ｍ１
のＰ、Ｂ、Ｓて洗浄したのら、２Ｍ塩塩酸グアノノン含
む００２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７０）で溶出し、抗ウィ
ルス（以下ＡＶと略す）活性を有する両分１８３ｍ１を
採集した。この溶出液に還元型ゲルタデオンを Ｏ，０
１Ｍ量（５６２ｍｇ）を添加して比活性２．ｌＸ Ｉ
Ｏ６１ｔＪ／ｍｇ・タン白の ｒｌＦＮ−７１７２ｍｇ
を含む水溶液をえた。
（１１）参考例３（Ｉ）でえ八ｒ Ｉ Ｆ Ｎ −７含
存水溶液の１８３ｍ１を予め Ｉａ＋Ｍエチレンジアミ
ン四酢酸塩、Ｏ，１５Ｍ塩化ナトリウム、０．０１膜還
元型ゲルタデオンおよび２Ｍ塩酸グアニジンを含む２５
ｍＭ酢酸緩衝液（ｐｉ−１６，０）で平衡化したセファ
クリールＳ−２００（ファルマシア社製）のカラム（９
Ｘ ７９ ｃｍ）に負荷し、同一緩衝液で展開し、モノ
マー溶出画分４３３ｍ１を採集した。このようにしてえ
られた画分はドデシル硫酸ナトリウムのスラブ電気泳動
（以下５ＤＳ−ＰＡＧＥと略す）でモノマーに収斂した
。このゲルろ過処理により比活性３、Ｏｘ ｌ Ｏ”
Ｉ Ｌｌ／ｍｇ ・タン白のｒｌＦＮ−７を１４２ｍｇ
含む水溶液をえた。
存水溶液の１８３ｍ１を予め Ｉａ＋Ｍエチレンジアミ
ン四酢酸塩、Ｏ，１５Ｍ塩化ナトリウム、０．０１膜還
元型ゲルタデオンおよび２Ｍ塩酸グアニジンを含む２５
ｍＭ酢酸緩衝液（ｐｉ−１６，０）で平衡化したセファ
クリールＳ−２００（ファルマシア社製）のカラム（９
Ｘ ７９ ｃｍ）に負荷し、同一緩衝液で展開し、モノ
マー溶出画分４３３ｍ１を採集した。このようにしてえ
られた画分はドデシル硫酸ナトリウムのスラブ電気泳動
（以下５ＤＳ−ＰＡＧＥと略す）でモノマーに収斂した
。このゲルろ過処理により比活性３、Ｏｘ ｌ Ｏ”
Ｉ Ｌｌ／ｍｇ ・タン白のｒｌＦＮ−７を１４２ｍｇ
含む水溶液をえた。
（Ｉｌｌ ） 」−記（［＋）でえたｒｌＦＮ−７含有
水溶液の３６゜６ｍ１（１２，０ｍｇ）に０．ＯＩＭ還
元型グルタチオンおよび０゜５Ｍ塩酸グアニジンを含む
２５ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６０）の１６３．４ｍｌを添
加し、０．０６ｍｇ／＋ｎｌ１度溶液を２００ｍ１調製
した。この溶液を予め０．ＯＩＭ還元型ゲルタデオンを
含む２５ｍＭ酢酸緩衝液（ｐｌ−１６，０）で平衡化し
たセファデックスＧ−２５（ファルマンア社製）カラム
（５ｘ ６０ｃｍ）に負荷し、同一緩衝液で展開溶出し
、ｒｌＦＮ−７画分２２０ｍ１をえた。この溶液のｒｌ
ＦＮ−７濃度は０．０４７ｍｇ／ｍｌであった。次いで
この溶液を４℃で２日間熟成したのち、グイアフロ−Ｐ
Ｍ−１０膜（アミコン社製限外ろ過膜）の限外ろ過法で
１４ｍ１にまで濃縮し、タン０含ｇＱ、７１１ｎ＋ｇ／
ｍｌで実質的に無機塩を含まない（ＩＯｐｐｍ未満）
澄明なｒ Ｉ Ｆ Ｎ−γ溶液をえた。このようにして
えられた高濃度ｒｌ ＦＮ−γは５ＤＳ−ＰＡＧＥでモ
ノマーに収斂した。このｒＩＦＮ−７の比活性は３．６
ｘ １０Ｊ ０７ｍｇ・タン白であった。
水溶液の３６゜６ｍ１（１２，０ｍｇ）に０．ＯＩＭ還
元型グルタチオンおよび０゜５Ｍ塩酸グアニジンを含む
２５ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６０）の１６３．４ｍｌを添
加し、０．０６ｍｇ／＋ｎｌ１度溶液を２００ｍ１調製
した。この溶液を予め０．ＯＩＭ還元型ゲルタデオンを
含む２５ｍＭ酢酸緩衝液（ｐｌ−１６，０）で平衡化し
たセファデックスＧ−２５（ファルマンア社製）カラム
（５ｘ ６０ｃｍ）に負荷し、同一緩衝液で展開溶出し
、ｒｌＦＮ−７画分２２０ｍ１をえた。この溶液のｒｌ
ＦＮ−７濃度は０．０４７ｍｇ／ｍｌであった。次いで
この溶液を４℃で２日間熟成したのち、グイアフロ−Ｐ
Ｍ−１０膜（アミコン社製限外ろ過膜）の限外ろ過法で
１４ｍ１にまで濃縮し、タン０含ｇＱ、７１１ｎ＋ｇ／
ｍｌで実質的に無機塩を含まない（ＩＯｐｐｍ未満）
澄明なｒ Ｉ Ｆ Ｎ−γ溶液をえた。このようにして
えられた高濃度ｒｌ ＦＮ−γは５ＤＳ−ＰＡＧＥでモ
ノマーに収斂した。このｒＩＦＮ−７の比活性は３．６
ｘ １０Ｊ ０７ｍｇ・タン白であった。
参考例４ 実質的に無機塩を含まない高濃度ｒｌＦＮ−
γ水溶液の製造 ■ 参考例１（■）でえたｒｌＦＮ−γ水溶液の３５ｍ１（
１１，４８ｍｇ）に００１膜還元型グルタチオンおよび
０．５Ｍ塩酸グアニジンを含む２５ｍＭ酢酸緩衝液（ｐ
ｌ−１６，０）の１６５ｍ１を添加して調製した０、０
５７ｍｇ／ｍｌ濃度溶液２００ｍ１を予め００１膜還元
型グルタチオン溶液（ｐＨ６，０）で平衡化したセファ
デックスＧ−２５カラム（５Ｘ６０ｃｍ）に負荷し、０
０１膜還元型タルタヂオノ溶液（ｒ）Ｈ６，０）で展開
し、ｒｌ ＦＮ−γの溶出画分２３５ｍ１をえた。この
溶液のｒｌＦＮ−γ濃度は０．０４６ｍｇ／ｍｌであっ
た。次いでこの溶液を４℃で１日間熟成したのち、グイ
アフロ−１）Ｍ−１０膜の限外ろ過法にて ｌ０ｍ１に
まで濃縮し、タン白濃度１．０８ｍｇ／ｍｌで実質的に
無機塩（１０ｐｐｍ未満）および酢酸緩衝液を含まない
澄明なｒＩＦＮ−γ水溶液をえた。このようにしてえら
れたｒ Ｉ Ｆ Ｎ −７は５ＤＳ−ＰＡＧＥでモノマ
ーに収斂した。このｒｌＦＮ−γの比活性は３．６Ｘ
１０６１Ｕ／ｍｇ・タン白であった。
γ水溶液の製造 ■ 参考例１（■）でえたｒｌＦＮ−γ水溶液の３５ｍ１（
１１，４８ｍｇ）に００１膜還元型グルタチオンおよび
０．５Ｍ塩酸グアニジンを含む２５ｍＭ酢酸緩衝液（ｐ
ｌ−１６，０）の１６５ｍ１を添加して調製した０、０
５７ｍｇ／ｍｌ濃度溶液２００ｍ１を予め００１膜還元
型グルタチオン溶液（ｐＨ６，０）で平衡化したセファ
デックスＧ−２５カラム（５Ｘ６０ｃｍ）に負荷し、０
０１膜還元型タルタヂオノ溶液（ｒ）Ｈ６，０）で展開
し、ｒｌ ＦＮ−γの溶出画分２３５ｍ１をえた。この
溶液のｒｌＦＮ−γ濃度は０．０４６ｍｇ／ｍｌであっ
た。次いでこの溶液を４℃で１日間熟成したのち、グイ
アフロ−１）Ｍ−１０膜の限外ろ過法にて ｌ０ｍ１に
まで濃縮し、タン白濃度１．０８ｍｇ／ｍｌで実質的に
無機塩（１０ｐｐｍ未満）および酢酸緩衝液を含まない
澄明なｒＩＦＮ−γ水溶液をえた。このようにしてえら
れたｒ Ｉ Ｆ Ｎ −７は５ＤＳ−ＰＡＧＥでモノマ
ーに収斂した。このｒｌＦＮ−γの比活性は３．６Ｘ
１０６１Ｕ／ｍｇ・タン白であった。
参考例５ 実質的に無機塩を含まない高濃度ｒ１１”Ｎ
−γ水溶液の製造 ■ 参η例１（Ｉ＋）でえたｒｌＦＮ−７の３５ ｍｌ（１
１，４８ｍｇ）にＯ，ＯＩＭ還元型グルタチオンおよび
０．５Ｍ塩酸グアニジンを含む２５ｍＭ酢酸緩衝液（ｐ
Ｈ６，０）のｌＧ５ｍ１を添加して、０．０５７ｍｇ／
ｉｔ濃度の溶液を２００ ｍｌ？Ａ製した。この溶液を
予め０．２６７Ｍグリシンと０．０１膜還元型ゲルタデ
オンを含む溶液（ｐｌ−１６，０）で平衡化したセファ
デックスＧ−２５カラム（５ｘ６０ｃｍ）に負荷し、同
一−溶液で展開し、ｒｌＦＮ−γの溶出画分２２０ｍ１
をえた。この溶液のｒｌＦＮ−７濃度は０．０４６ｍｇ
／ｍｌであった。次いてこの溶液を４℃で２日間熟成し
たのち、グイアフロ−ＰＭ−１０膜の限外ろ過法で９４
ｍ１まで濃縮し、タン白含量１ 、０７ｍｇ／ ｍ ｌ
で実質的に無機塩（ｌＱｐｐｍ未満）および酢酸緩衝液
を含まない澄明なｒｌ ＦＮ−γ溶液をえた。このｒｌ
ＦＮ−γは５ＤＳ−ＰＡＧＥでモノマーに収斂し、その
比活性は３．６２Ｘ １０６１０７ｍｇ・タン白であっ
た。
−γ水溶液の製造 ■ 参η例１（Ｉ＋）でえたｒｌＦＮ−７の３５ ｍｌ（１
１，４８ｍｇ）にＯ，ＯＩＭ還元型グルタチオンおよび
０．５Ｍ塩酸グアニジンを含む２５ｍＭ酢酸緩衝液（ｐ
Ｈ６，０）のｌＧ５ｍ１を添加して、０．０５７ｍｇ／
ｉｔ濃度の溶液を２００ ｍｌ？Ａ製した。この溶液を
予め０．２６７Ｍグリシンと０．０１膜還元型ゲルタデ
オンを含む溶液（ｐｌ−１６，０）で平衡化したセファ
デックスＧ−２５カラム（５ｘ６０ｃｍ）に負荷し、同
一−溶液で展開し、ｒｌＦＮ−γの溶出画分２２０ｍ１
をえた。この溶液のｒｌＦＮ−７濃度は０．０４６ｍｇ
／ｍｌであった。次いてこの溶液を４℃で２日間熟成し
たのち、グイアフロ−ＰＭ−１０膜の限外ろ過法で９４
ｍ１まで濃縮し、タン白含量１ 、０７ｍｇ／ ｍ ｌ
で実質的に無機塩（ｌＱｐｐｍ未満）および酢酸緩衝液
を含まない澄明なｒｌ ＦＮ−γ溶液をえた。このｒｌ
ＦＮ−γは５ＤＳ−ＰＡＧＥでモノマーに収斂し、その
比活性は３．６２Ｘ １０６１０７ｍｇ・タン白であっ
た。
該可倒６
実質的に無機塩を含まない高濃度デス（Ｃｙｓ−（ｉ）
形質転換体の製造 ＩＦＮ−γ発現プラスミドｐＲ０２３／ＩＦＩ−９００
［Ｅｌ）Ｃ公開第００８９６７６号公報実施例７参照］
を制限酵素Ｎｄｅ１．Ｎｃｏｌで消化し、ＩＦＮ−７遺
伝子部分を含むＮｄｅＴ −Ｎｃｏｌ ７１０ｂｐｌ
）ＮＡ断片 （Ａ）を分取した。一方、プラスミドｐＲ
０２３を制限酵素Ｂｇｌ ＩＩ 、ＥｃｏＲＩで消化し
、λＰＬプロモーターを含む２６５ｂｐのＤＮＡ断片（
Ｂ）を分取した。（Ａ）、（Ｂ）と化学合成して得た蛋
白合成開始コドンを含むオリゴヌクレオヂトアダプター Ａ Ａ Ｔ Ｔ ＣＡ Ｔ Ｇ ＣＡ Ｇ Ｇ Ａ ’
ｌ’ ＯＣＡＧＴＡＣＧＴＣＣＴＡＧＧＴＡＴ をＴ ４ Ｄ Ｎ Ａリガーゼを用いてＮｄｅｌとＥｃ
ｏＲＩののりしろ部分に結合させた。得られたＤＮＡ断
片をＮｃｏＩとＢｇｌＩｌで処理して得たプラスミドｐ
Ｒｃ２３／ＩＦＩ−９００に結合させ、Ｃｙｓ−トオろ
発現プラスミドｐＬＣ２を構築した（第２図す。このプ
ラスミＦ’ｐＬＣ２を用いてＣｏｈｅｎらの方法１プ〔
１）−ジンゲス オブ ナノヨナルアカデミ−オブ ザ
イエンス、６９．２＋１０（１９７２）］に従って大腸
菌ＲＲＩ（ｐＲＫ２４８ ｃＩｔＳ）を形質転換し、
形質転換体エンエリヒア コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉ
ａ ｃｏｌｉ ＝Ｅ、 ｃｏｌｉ）ＲＲＩ（ｐＬＣ２
，ｐＲＫ２４８ ｃｌｔｓ）を得た。
形質転換体の製造 ＩＦＮ−γ発現プラスミドｐＲ０２３／ＩＦＩ−９００
［Ｅｌ）Ｃ公開第００８９６７６号公報実施例７参照］
を制限酵素Ｎｄｅ１．Ｎｃｏｌで消化し、ＩＦＮ−７遺
伝子部分を含むＮｄｅＴ −Ｎｃｏｌ ７１０ｂｐｌ
）ＮＡ断片 （Ａ）を分取した。一方、プラスミドｐＲ
０２３を制限酵素Ｂｇｌ ＩＩ 、ＥｃｏＲＩで消化し
、λＰＬプロモーターを含む２６５ｂｐのＤＮＡ断片（
Ｂ）を分取した。（Ａ）、（Ｂ）と化学合成して得た蛋
白合成開始コドンを含むオリゴヌクレオヂトアダプター Ａ Ａ Ｔ Ｔ ＣＡ Ｔ Ｇ ＣＡ Ｇ Ｇ Ａ ’
ｌ’ ＯＣＡＧＴＡＣＧＴＣＣＴＡＧＧＴＡＴ をＴ ４ Ｄ Ｎ Ａリガーゼを用いてＮｄｅｌとＥｃ
ｏＲＩののりしろ部分に結合させた。得られたＤＮＡ断
片をＮｃｏＩとＢｇｌＩｌで処理して得たプラスミドｐ
Ｒｃ２３／ＩＦＩ−９００に結合させ、Ｃｙｓ−トオろ
発現プラスミドｐＬＣ２を構築した（第２図す。このプ
ラスミＦ’ｐＬＣ２を用いてＣｏｈｅｎらの方法１プ〔
１）−ジンゲス オブ ナノヨナルアカデミ−オブ ザ
イエンス、６９．２＋１０（１９７２）］に従って大腸
菌ＲＲＩ（ｐＲＫ２４８ ｃＩｔＳ）を形質転換し、
形質転換体エンエリヒア コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉ
ａ ｃｏｌｉ ＝Ｅ、 ｃｏｌｉ）ＲＲＩ（ｐＬＣ２
，ｐＲＫ２４８ ｃｌｔｓ）を得た。
（１１）形質転換体の培養
」１記（１）で構築したプラスミドを含む菌株Ｅｃｏｌ
ｉ 、ＲＲＩ（ｐＬＣ２，ｐＲＫ２４８ ｃａｔｓ
）を１％バクトドリプトン ７μｇ／ｍｌテトラサイクリンを含む液体培地５０ｍｌ
中で、３５℃１１２時間振とう培４ｉを行った。培養液
を０５％カザミノ酸．０５％クルコース、７μｇ／ｍｌ
のテトラザイクリンを含むＭ９培地２５０に移し、３５
°Ｃ４時間、ついで４２℃で３時間培養した。遠心分離
して菌体を集め、 −８０°Ｃで保存した。
ｉ 、ＲＲＩ（ｐＬＣ２，ｐＲＫ２４８ ｃａｔｓ
）を１％バクトドリプトン ７μｇ／ｍｌテトラサイクリンを含む液体培地５０ｍｌ
中で、３５℃１１２時間振とう培４ｉを行った。培養液
を０５％カザミノ酸．０５％クルコース、７μｇ／ｍｌ
のテトラザイクリンを含むＭ９培地２５０に移し、３５
°Ｃ４時間、ついで４２℃で３時間培養した。遠心分離
して菌体を集め、 −８０°Ｃで保存した。
（畜ｉｉ）精製
上記（１１）と同様の方法で得た凍結菌体７．１ｇを７
Ｍ塩酸グアニジンおよび２ｍＭフＪニルメヂメチルフォ
ニルフルオライトを含む０．１Ｍ＋ーリス塩酸緩衝液（
ｐｌ−［ ７．０） ２ ２ ｍｌに懸濁し、４℃で１
時間攪拌したのち１０．（１（ｊｏｘｇで３０分間遠心
分離にかけて＋ｔｒ）２４ｍｌを得た。この−１−清に
１３７ｍＭ塩化すｌ・リウム，２．７ｍＭ塩化カリウム
、８．１ｍＭリン酸二すトリウムおよび１．５ｍＭリン
酸−カリウムから成る緩衝液（ｐＨ ７．４） ３ ０
０ ｍｌを加えて希釈し、抗体カラム（Ｍｏ ７ ２
−１１．１．カラム容ｆｉ１５ｍｌ）に流速１ｍ１／分
でか（Ｊた。そののち、０．５Ｍ塩酸グアーノンを含む
２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ７．０） ６
０ ｍｌてカラムを洗浄し、ついて、２Ｍ塩酸グアニ
ジンを含む２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐｔ１７
．０） ４． ５ ｍｌで溶出し、抗ウィルス活性を＜
ｉする両分２５ｍｌを得た。この両分２５ｍｌをあらか
じめ１ｍＭエヂレンンアミン四酢酸，０．１５Ｍ塩化す
トリウム、ＩＯｍＭシスティンおよび２Ｍ塩塩酸グアノ
ノン含む２５ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐ１１６．
０）で平衡化したセファクリールＳ −、− ２ ０
０（ファルマンア社製）のカラム（２，６ｘ −９ ４
ｃｍ）、カラノ、容！？１５００ｍｌにかけ、同一緩
衝液で溶出して抗ウィルス活性を何する両分４．０ｍｌ
を得た。
Ｍ塩酸グアニジンおよび２ｍＭフＪニルメヂメチルフォ
ニルフルオライトを含む０．１Ｍ＋ーリス塩酸緩衝液（
ｐｌ−［ ７．０） ２ ２ ｍｌに懸濁し、４℃で１
時間攪拌したのち１０．（１（ｊｏｘｇで３０分間遠心
分離にかけて＋ｔｒ）２４ｍｌを得た。この−１−清に
１３７ｍＭ塩化すｌ・リウム，２．７ｍＭ塩化カリウム
、８．１ｍＭリン酸二すトリウムおよび１．５ｍＭリン
酸−カリウムから成る緩衝液（ｐＨ ７．４） ３ ０
０ ｍｌを加えて希釈し、抗体カラム（Ｍｏ ７ ２
−１１．１．カラム容ｆｉ１５ｍｌ）に流速１ｍ１／分
でか（Ｊた。そののち、０．５Ｍ塩酸グアーノンを含む
２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ７．０） ６
０ ｍｌてカラムを洗浄し、ついて、２Ｍ塩酸グアニ
ジンを含む２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐｔ１７
．０） ４． ５ ｍｌで溶出し、抗ウィルス活性を＜
ｉする両分２５ｍｌを得た。この両分２５ｍｌをあらか
じめ１ｍＭエヂレンンアミン四酢酸，０．１５Ｍ塩化す
トリウム、ＩＯｍＭシスティンおよび２Ｍ塩塩酸グアノ
ノン含む２５ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐ１１６．
０）で平衡化したセファクリールＳ −、− ２ ０
０（ファルマンア社製）のカラム（２，６ｘ −９ ４
ｃｍ）、カラノ、容！？１５００ｍｌにかけ、同一緩
衝液で溶出して抗ウィルス活性を何する両分４．０ｍｌ
を得た。
ごごて得られたＣｙｓ−’ＦｙｒーＣｙｓ欠落ＩＦＮー
７のボリペプヂＩ・「デス（Ｃｙｓ−Ｔｙｒ Ｃｙｓ
）ＩＦＮ−γ］は、７．０ｍｇであり、比活性は２．７
ｘ ｌ ＯＪ ＬＪ／ｍｇてあった。
７のボリペプヂＩ・「デス（Ｃｙｓ−Ｔｙｒ Ｃｙｓ
）ＩＦＮ−γ］は、７．０ｍｇであり、比活性は２．７
ｘ ｌ ＯＪ ＬＪ／ｍｇてあった。
（１ｖ）高濃度水溶液の製造
γを含む溶出画分 ２．２ｍｌ（タンパク濃度０．１
８ｍｇ／ｍｌ）を０．５Ｍ塩酸グアニジンを含む２５ｍ
Ｍ酢酸アンモニウム緩衝液（１）Ｈ ６．０）１７６ｍ
ｌで希釈した。
８ｍｇ／ｍｌ）を０．５Ｍ塩酸グアニジンを含む２５ｍ
Ｍ酢酸アンモニウム緩衝液（１）Ｈ ６．０）１７６ｍ
ｌで希釈した。
この溶液をあらかしめ２５ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液
（ｐ＋４６．ｏ）で平衡化したセファデックスＣ−２５
カラム（２．６ｘ Ｉ ５ ｃｍ）に負４ｉｊ して、
同一緩衝液で溶出し、塙酸りアニノノを除去したデス（
タンパク濃度０．０１６ｍｇ／ｍｌ）を得た。
（ｐ＋４６．ｏ）で平衡化したセファデックスＣ−２５
カラム（２．６ｘ Ｉ ５ ｃｍ）に負４ｉｊ して、
同一緩衝液で溶出し、塙酸りアニノノを除去したデス（
タンパク濃度０．０１６ｍｇ／ｍｌ）を得た。
本溶出画分を４℃で２４時間熟成したのち、ダイアフａ
−ＹＭ− １ ０（２ ５ｍｍφ，アミコン社）を用い
て限外ろ過により濃縮し、フィルター（０．２μｍ）で
ろ過し０．６８ｍｌの澄明な溶液を得た。タンパク濃度
は０．４１ｍｇ／ｍｌであった。
−ＹＭ− １ ０（２ ５ｍｍφ，アミコン社）を用い
て限外ろ過により濃縮し、フィルター（０．２μｍ）で
ろ過し０．６８ｍｌの澄明な溶液を得た。タンパク濃度
は０．４１ｍｇ／ｍｌであった。
発明の効果
本発明の実質的に無機塩が存在せず、アミノ酸が共存す
る条件下に凍結もしくは凍結乾燥したヒトＩＦＮ−γ組
成物は、その凍結あるいは凍結乾燥操作および保存中に
おいてＩＦＮ−γ活性の低下が極めて少なくまたその再
溶解時に濁りが生じないため医薬品等として有利に使用
することができろ。
る条件下に凍結もしくは凍結乾燥したヒトＩＦＮ−γ組
成物は、その凍結あるいは凍結乾燥操作および保存中に
おいてＩＦＮ−γ活性の低下が極めて少なくまたその再
溶解時に濁りが生じないため医薬品等として有利に使用
することができろ。
Claims (26)
- （１）実質的に無機塩が存在せず、アミノ酸が共存する
条件下に凍結もしくは凍結乾燥したヒトγ型インターフ
ェロン組成物。 - （２）アミノ酸がモノアミノ脂肪族アミノ酸である特許
請求の範囲第１項記載の組成物。 - （３）ヒトγ型インターフェロンが遺伝子組み換え技術
で得られるヒトγ型インターフェロンである特許請求の
範囲第１項記載の組成物。 - （４）遺伝子組み換え技術で得られるヒトγ型インター
フェロンの高濃度含有水溶液由来のヒトγ型インターフ
ェロンである特許請求の範囲第３記載の組成物。 - （５）ヒトγ型インターフェロンの比活性が１×１０＾
５〜１×１０＾７ＩＵ／ｍｇである特許請求の範囲第１
項記載の組成物。 - （６）ヒトγ型インターフェロンが水溶液として１×１
０＾２〜１×１０＾７ＩＵ／ｍｌの濃度である特許請求
の範囲第１項記載の組成物。 - （７）ヒトγ型インターフェロンが第１図で示される１
４６個のアミノ酸配列からなるポリペプチドである特許
請求の範囲第１項記載の組成物。 - （８）ヒトγ型インターフェロンがデス（Ｃｙｓ＾１−
Ｔｙｒ＾２−Ｃｙｓ＾３）ＩＦＮ−γである特許請求の
範囲第１項記載の組成物。 - （９）アミノ酸が水溶液として５〜５０ｍｇ／ｍｌの濃
度である特許請求の範囲第１記載の組成物。 - （１０）モノアミノ脂肪族アミノ酸に加えヒト血清アル
ブミンを含有する特許請求の範囲第２項記載の組成物。 - （１１）ヒト血清アルブミンが水溶液として２〜２０ｍ
ｇ／ｍｌの濃度である特許請求の範囲第１０項記載の組
成物。 - （１２）モノアミノ脂肪族アミノ酸が中性モノアミノ脂
肪族アミノ酸である特許請求の範囲第１０項記載の組成
物。 - （１３）中性モノアミノ脂肪族アミノ酸がグリシンであ
る特許請求の範囲第１２項記載の組成物。 - （１４）水溶液としてｐＨ４．０〜５０を示すように調
整された特許請求の範囲第１２項記載の組成物。 - （１５）モノアミノ脂肪族アミノ酸が酸性モノアミノ脂
肪族アミノ酸である特許請求の範囲第１０項記載の組成
物。 - （１６）水溶液としてｐＨ７５〜８５を示すように調整
された特許請求の範囲第１５項記載の組成物。 - （１７）さらに糖類を含有せしめた特許請求の範囲第２
項または第１０項記載の組成物。 - （１８）糖類が多糖類である特許請求の範囲第１７項記
載の組成物。 - （１９）糖類が水溶液として３〜５０ｍｇ／ｍｌ濃度で
ある特許請求の範囲第１７項記載の組成物。 - （２０）無機塩の濃度が水溶液として０．１Ｍ以下であ
る特許請求の範囲第１項記載の組成物。 - （２１）無機塩の濃度が水溶液として０．０５Ｍ以下で
ある特許請求の範囲第１項記載の組成物。 - （２２）無機塩の濃度が水溶液として１ｍＭ以下である
特許請求の範囲第１項記載の組成物。 - （２３）凍結品である特許請求の範囲第１項記載の組成
物。 - （２４）凍結乾燥品である特許請求の範囲第１項記載の
組成物。 - （２５）ヒトγ型インターフェロンを含有する実質的に
無機塩が存在しない水溶液にアミノ酸を添加して凍結し
、所望により得られる凍結組成物を減圧下乾燥すること
を特徴とする実質的に無機塩が存在せず、アミノ酸が共
存する条件下に凍結もしくは凍結乾燥したヒトγ型イン
ターフェロン組成物の製造法。 - （２６）ヒトγ型インターフェロンを含有する実質的に
無機塩が存在しない水溶液にアミノ酸を添加して凍結し
、所望により得られる凍結組成物を減圧下乾燥すること
を特徴とするヒトγ型インターフェロンの安定化法。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PCT/JP1984/000352 WO1986000531A1 (en) | 1984-07-10 | 1984-07-10 | Gamma-interferon composition |
| WO84/00352 | 1984-11-06 | ||
| WO85/00190 | 1985-04-12 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6144826A true JPS6144826A (ja) | 1986-03-04 |
Family
ID=13818367
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60148093A Pending JPS6144826A (ja) | 1984-07-10 | 1985-07-04 | γ型インタ−フエロン組成物 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6144826A (ja) |
| KR (1) | KR860000869A (ja) |
| WO (1) | WO1986000531A1 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6156195A (ja) * | 1985-03-01 | 1986-03-20 | Asahi Chem Ind Co Ltd | 新規生理活性ペプチド |
| JPS63146829A (ja) * | 1986-07-18 | 1988-06-18 | Chugai Pharmaceut Co Ltd | 安定な顆粒球コロニ−刺激因子含有製剤 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS55102519A (en) * | 1979-01-31 | 1980-08-05 | Green Cross Corp:The | Stabilization of interferon |
| JPS5821691A (ja) * | 1981-07-29 | 1983-02-08 | Mochida Pharmaceut Co Ltd | α−及びβ−インタ−フェロンの精製方法 |
| JPS5892622A (ja) * | 1981-11-28 | 1983-06-02 | Sunstar Inc | インタ−フエロン安定配合製剤 |
-
1984
- 1984-07-10 WO PCT/JP1984/000352 patent/WO1986000531A1/ja unknown
-
1985
- 1985-07-04 JP JP60148093A patent/JPS6144826A/ja active Pending
- 1985-07-09 KR KR1019850004888A patent/KR860000869A/ko not_active Application Discontinuation
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6156195A (ja) * | 1985-03-01 | 1986-03-20 | Asahi Chem Ind Co Ltd | 新規生理活性ペプチド |
| JPS63146829A (ja) * | 1986-07-18 | 1988-06-18 | Chugai Pharmaceut Co Ltd | 安定な顆粒球コロニ−刺激因子含有製剤 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO1986000531A1 (en) | 1986-01-30 |
| KR860000869A (ko) | 1986-02-20 |
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