JPS61254862A - ヘモグロビン測定用分析素子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野］ 本発明はヘモグロビン濃度を測定するための分析素子に
関し、更に詳しくはアジドメトヘモグロビン法によって
ヘモグロビンを定量するための保存安定性が改良された
分析素子に関する。

〔従来の技術〕

従来、流体試料中の特定成分を分析する方法は、多数開
発がなされてきたが、これらは大別して、溶液内で反応
が行われる反応系と、固相担体内で行われる反応系との
２種類に別けることができる。溶液系における分析反応
（以下、ウェット・グミストリーという。）は、用手法
と呼ばれる全く機械を用いない方法から、自動分析機器
まで幅広く知られている。特に臨床化学の分野ではその
進歩が著しく、近年種々の臨床検査用自動定量分析機器
が病院の臨床検査室などに導入されている。

しかしながら、上述の方法は、基本的には水＊＊の形で
反応を行わせるために、種々の欠点を有している。すな
わち、その分析過程で大量の水、特に精製された純水あ
るいは蒸留水を必要とすることからエネルギー消費の増
大を招く。

また、種々の自動分析機器はそれ自体著しく高価であシ
、かつその操作に多大の熟練を必要とし、美大な時間と
労力を必要とするばかシでなく、その廃液は必然的に環
境汚染を引起ζすという欠点を有している。

これに対して固相系における分析反応（以下、ドライ・
ケミストリーという。）を用いる分析方法も広範に用い
られているが、これらは濾紙等に試薬を含浸させた形で
行われる。

上記の濾紙は、例えば米国特許第へ０５α３７３号ある
いは同第３．０６１．５２３今冬明細書等に記載されて
いるように濾紙のごとき吸水性繊維質担体に試薬溶液を
含浸させ、乾燥させて作られるものである。これらは一
般に分析試験紙又は単に試験片と呼ばれるもので、試験
片上に流体試料を滴下するか、又は流体試料中へ試験片
を浸漬させ試験片の色変化又は濃度変化を肉眼判定か、
又は反射濃度計によシ測定し、流体試料中の特定成分の
濃度レベルを決定するものである。

これらの試験片は、その取扱いが簡便であシ、かつ直ち
に結果が得られるので有用ではあるが、その構成上から
半定量又は定性分析の領域にとどまっている。

一方上述のごとき従来の分析方法に対して操作性の簡便
なドライ・ケミストリーを用い、その上高い定量性を有
する多層分析素子が知られている。例えば、特公昭５５
−２１６７７号、特開昭５５−１１ｓ４５５６号、同５
７−１２５８４７号、同５７−１９７４６６号、並びに
同５８−９０１６７号等の各明細書に多層分析素子が記
載されている。

これら（記載の素子によれば、分析反応に用いられる一
切の試薬類を一枚の分析素子中に含有しておシ、血清又
は全血液を一定容量、上記素子上に滴下し、一定温度で
一定時間保温した後、支持体側から反射濃度の測定を行
い、この反射濃度から物質濃度を決定することが可能で
ある。

上記方法は、従来の試験紙型のものに対して飛躍的な分
析精度を有し、かつあらかじめ試薬を調製することなく
ウェット・ケミストリーと同等以上の性能を有するもの
でおる。

他方、ドライケミストリーにおける血中ヘモグロビン測
定法としては特開昭５２−１４５８８５号公報、ドイツ
特許出願公開第２８８２７６０号明細書、特開昭５６−
９７８７２号公報記載の各方法が開示されている。前２
者に関しては濾紙や織布等の多孔質媒体中に酸化チタン
などの屈折率の高い粒子を含浸させた血液吸収マトリッ
クスを作成し、これに血液試料を含浸飽和させるかフィ
ルムベース上に酵素及び発色試薬を含むゼラチンをバイ
ンダーとした層の上に酢酸セルロースをバインダーとし
た酸化チタン微粒子分散層を塗布し、更にサリチル酸及
びケイ藻土を含む酢酸セルロース層を積層した構成であ
る。以上の２方法は酸化チタン等から成る多孔質膜上に
血液を付着させ滴下面からその光学的反射濃度を測定す
るものである。また、後者に関してはフィルムベース上
に親水性バインダ一層及び親水性多孔性展開層が順次積
層され、多孔性展開層中にある空隙を持ち血液試料を均
一展開させその光学反射濃度をフィルムベース側から測
定するものである。

〔発明が解決しようとする問題点］ これらの方法は測定精度の維持という・面で血液マトリ
ックスから内蔵される空気を放出除去する手段が必要で
あるという非常に煩雑な方法を用いていたシ、血液病に
よる貧血、悪性腫瘍、胃潰瘍、腎疾患、肝硬変、多血症
等の疾患に対する診断には欠くべからざる重要な検査項
目でｓｂながら感度が低いために不確実な測定にとどま
っていた。

このため乾式分析素子の有用性を維持しつつ測定精度の
優れた分析素子の開発が強く望まれていた。

本発明の目的は、測定精度及び試薬の安定性に優れ、血
液中ヘモグロビンを簡便に分析するための乾式分析素子
を提供することにある。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明を概説すれば、本発明はヘモグロビン測定用分析
素子に関する発明であって、アジドメトヘモグロビン法
を用いて流体試料中のヘモグロビンを測定するための分
析素子において、ヘモグロビンを酸化しうる物質とアジ
化物とを、互いに分離しているが、流体試料の適用によ
シ相互作用の生起が可能な状態に配備したことを特徴と
する。

本発明に用いられるヘモグロビンを酸化しうる物質とし
ては代表的にはアルカリ金属亜硝酸塩が挙げられる。具
体的には亜硝酸ナトリウム、亜硝酸カリウムなどを使用
することができ、特に好ましくは亜硝酸ナトリウムが用
いられる。

本発明に用いられるアジ化物としては好ましくはアジ化
ナトリウムがある。

そこで、以下の説明ではアルカリ金属亜硝酸塩とアジ化
ナトリウムを例として本発明を具体的に説明する。

本発明においては検体中のヘモグロビンは代表的には下
記の反応によりアジドメトヘモグロビンに定量的に変換
され５４０　ｎｍ　に特異的な吸収を示す。

ヘモグロビン＋アルカリ金属亜硝酸塩 →メトヘモグロビン メトヘモグロビン＋アジ化ナトリウム →アジドメトヘモグロビン 本発明の分析素子に含有されるヘモグロビンを酸化しう
る物質及びアジ化物は流体試料が適用されるまでは保存
安定性を維持させるために実質上、互いに分離している
状態で含有されていることが必要である。

本発明の分析素子は支持体上に流体試料中の成分と反応
する少なくとも一種の試薬を含む少なくとも一層の試薬
層とその上方に前記流体試料中の成分を前記試薬層へ透
過させる展開層を順次積層してつくられる。

したがって、この場合、最も好ましい態様としては試薬
層を二つの層として、一方の層中にヘモグロビンを酸化
しうる物質を、もう一方の層中にアジ化物を含有させる
ことであるが、試薬層を一つの層とし、一方の試薬を該
試薬層に、また他方の試薬を展開層に含有させてもよい
。

また両方の試薬をそれぞれ粒子の状態とした場合には同
一の試薬層に含有させることもできる。

アルカリ金属亜硝酸塩及びアジ化ナトリウムを別異の層
に含有させる場合、これらの含有層を設ける方法として
は、アルカリ金属亜硝酸塩又はアジ化ナトリウムをバイ
ンダー水溶液に溶解させ、更（具体的には水に溶解させ
た後、この溶液を水に溶解させ九バインダー中に加えて
溶解させたものを塗設する方法が挙げられる。

少なくとも１層の試薬層及び少なくとも１層の展開層の
うちの同一層に、アルカリ金属亜硝酸塩及びアジ化ナト
リウムが別々の粒子として含有されているとき、これら
のアルカリ金属亜硝酸塩及びアジ化ナトリウムの粒径が
それぞれ１１μｍ以上となっていることが好ましい。

更に、アルカリ金属亜硝酸塩及びアジ化ナトリウムが別
異の層に含有されている場合にも、これらアルカリ金属
亜硝酸塩及び／又はアジ化ナトリウムは粒子状とするこ
ともできる。

アルカリ金属亜硝酸塩及びアジ化ナトリウムを粒子とし
て含有する層を設ける方法としては、あらかじめ微粉砕
したアルカリ金属亜硝酸塩及びアジ化ナトリウムをそれ
ぞれ有機溶媒中に懸濁させ、同一の有機溶媒に溶解させ
たバインダー中に得られた懸濁物を加えて均一に分散さ
せたものを塗設する方法、あるいは、アルカリ金属亜硝
酸塩及びアジ化ナトリウムをそれぞれ有機溶媒中に懸濁
させて微粉砕し、同一の有機溶媒に溶解させたバインダ
ー中に加えて均一に分散させたものを塗布する方法、な
いしはアルカリ金属亜硝酸塩及びアジ化ナトリウムをバ
インダーを含む有機溶媒中で微粉砕した後、均一に分散
したものを塗設する方法などが挙げられる。

また、展開層が濾紙のごとき繊維質多孔質物質で構成さ
れる場合は、バインダーを含む有機溶媒中にアルカリ金
属亜硝酸塩及びアジ化ナトリウムを加えた後、多孔質物
質を加えて均一に分散させて塗布する方法が挙げられる
。

本発明く係るアルカリ金属亜硝酸塩を本発明の分析素子
に含有させる量は、通常は１．５ｒ／ｌｆｌ　”　〜４
０　ｆ／Ｊ、好ましくは５　ｔ　／　ｍ”　〜２０ｆ／
ｍ’である。

また本発明に係るアジ化ナトリウムを本発明の分析素子
に含有させる量は、５００１９７ｍ”〜１ｏ　ｆ／ｍ”
、好ましくは１００　＊／ｍ”　〜Ｊ　ｋ；　ｆ／ｍ工
で多る。

該アルカリ金属亜硝酸塩とアジ化ナトリウムの比率は広
範（選択された割合を用いる事が可能であるが、重量で
１対３０〜４００対１が好ましく、特に１対１０〜５対
１の比率の範囲で用いることが特に好適である。

分析素子におけるＰＨは中性〜弱アルカリ性のものであ
ればアジドメトヘモグロビンを効率よく生成させ且つ安
定（保つことができるので流体試料を滴下した時の１が
約ｚＯ〜ａ５程度であることが好ましい。

この時の緩衝剤は種々のものが用いられる。

緩衝剤の例としては、トリス緩衝剤、グツドの緩衝剤な
どが用いられる。これらの緩衝剤はいずれの層に含有さ
れてもよい。

更に促進剤としてアルカリ金属塩化物を添加することも
可能である。

本発明に係る支持体は、従来公知のものでよく、好適な
ものには、液体不浸透性で、且つ光透過性のものがあシ
、例えば酢酸セルロース、ポリエチレンテレフタレート
、ポリカーボネート、又はポリスチレンのような種々の
重合体材料が、との使用目的に適する。更には、上記重
合体材料のみならず、ガラスのごとき無機材料も同様に
用いることが可能でおる。本発明に係る支持体の厚さは
任意であるが、好ましくは約５０〜約２５０μｍである
。また、本発明に係る支持体の観測側の一側面は、その
目的に応じて任意に加工することが可能である。更に試
薬層を積層する側の支持体面に、場合によっては光透過
性の下塗シ層を使用して試薬層と支持体との接着性を改
良することができる。

本発明に係る展開層は、（１）一定容量の流体試料を単
位面積当シ一定容量を試薬層に均一に配布する機能を有
するものである。その上、更に、特公昭５３−２１６７
７号明細書く記載された性能、すなわち（２）流体試料
中の分析反応を阻害する物質又は要因を除去する機能、
及び／又は（３）分光光度分析を行うときに支持体を経
て透過する測定光を反射するバックグランド作用を行う
機能を有するものであれば好ましい。し九がって、本発
明に係る展開層は、上記（１）の機能のみを有する層、
（υに加えて（２）及び／又は（３）の機能を併せて有
する層のいずれかとすることができ、あるいは、（１）
を包含する複数の機能を適宜分離し、各機能ごとに別の
層を使用することも可能である。更に（１）、（２）及
び（３）の機能のうち、２つの機能を有する層と、残シ
の１つの機能を有する層を組合せて使用することもでき
る。例えば、前述の特公昭５Ｂ−２１６７７号公報に記
載された二酸化チタン及び二酢酸セルロースから成るブ
ラックエボリマーと呼称される非繊維多孔質媒体の展開
層、特開昭５５−１４４３５６号明細書く記載された親
水化処理した織物の展開層、特開昭５７−９４６５８号
明細書に記載された繊維構造展開層が挙げられる。本発
明の分析素子における展開層の膜厚は、その空隙率によ
って決定されるべきであるが、好ましくは約１００〜約
５００μｍ１更に好ましくは約１５０〜３５０μｍであ
る。また、空隙率は好ましくは約２０〜約ａＳＳである
。

また他の付加的な添加剤として、例えば保恒剤、緩衝剤
、界面活性剤等、種々の添加剤も所望に応じて添加する
ことができる。

特に界面活性剤は流体試料を本発明の素子に適用した際
の浸透速度の調節等有効に用いることができる。

使用可能な界面活性剤としては、イオン性（アニオン性
又はカチオン性）、非イオン性ヲ問わず使用することが
可能であるが、非イオン性界面活性剤が有・効である。

非イオン性界面活性剤の例としては、例えば２．５−ジ
−ｔ−ブチルフェノキシポリエチレンクリコール、ｐ−
オクチルフエノキシポリエテレングリコール、ｐ−イソ
ノニルフェノキシポリエチレングリコール等のアルキル
置換フェノールのポリアルキレングリコール誘導体、高
級脂肪酸のポリアルキレングリコールエステル等が挙げ
られる。これらの界面活性剤は流体試料の受容層への浸
透速度を調節し、同時に好ましからざる「クロマトグラ
フィ現象」発生を抑制する効果を有する。

上記界面活性剤は広範に選択された量を用いることが可
能であるが、塗布液の重量に対して１０重量係〜α００
５重量％、好ましくは６重量壬〜Ｑ、０５重量係用いる
ことができる。

本発明に係る試薬層は親水性バインダーから構成される
ものであり、二層以上の試薬層に分離することも可能で
ある。

バインダーとしては、ゼラチン、酸処理ゼラチン、フタ
ル化ゼラチン等のゼラチン誘導体、ヒドロキシエチルセ
ルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム塩等
Ｏ水ｍ　性セ＃　ｏ　−ス誘導体、ポリ−Ｎ−ビニルピ
ロリドン、ポリ−Ｎ−ビニルイミダソール、ポリビニル
アルコール、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミ
ド、ポリ（モノ又はジアルキル置換）アクリルアミド、
ポリ（モノ又はジアルキル置換）メタクリルアミド、及
びこれらの水溶性共重合体等が挙げられる。好ましくは
ゼラチン類である。

本発明における分析素子の試薬層の厚さは任意であるが
、特に、呈色安定性を増大させるという点からは試薬層
の厚さは、好ましくは１０ｐｍ　−Ｓ　ＯＯｐｒｎ、更
に好ましくは２０　ｐｍ　〜８０μｍの範囲である。こ
の場合の試薬層の厚さとは、試薬層が２層以上存在する
場合にはその和である。

そして、試薬層は親水性バインダーから構成されている
ものが好ましい。

本発明の分析素子は、必要に応じて、例えば米国特許第
３，９９２，１５８号明細書記載の反射層、下塗り層、
米国特許第４０６４４０３号明・細書記載のバリヤ一層
、米国特許第４．１６４０９３号明細書記載のマイグレ
ーション阻止層、特開昭５５−９０８５９号公報記載の
スカベンジャ一層及び米国特許第４１１（１，０７９号
明細書記載の破壊性ボッド状部材等を任意に臘合せて本
発明の目的に合わせた任意の構成とすることができる。

これら分析素子の種々の層は、本発明に係る支持体上に
所望の構成に従い、従来写真工業において公知のスライ
ドホッパー塗布法、押出し塗布法、浸漬塗布法等を適宜
選択して用い、贋次積層することで任意の厚みの層を塗
設することができる。

本発明の分析素子を用いて、流体試料中の特定成分の量
を、本発明に係る支持体側から反射スペクトロフォトメ
トリーによシ初速変法又は反応終結法に従って測定する
ことができる。このようにして得られた測定値は、予め
作成しておいた検量線に当てはめることで特定成分の量
を決定することができる。

本発明の分析素子に適用される流体試料の量は任意に定
めることができるが、好ましくは約５μｔから約５０μ
ｔであ）、更に好ましくは５μｔから２０μｔである。

通常的１０μｔ。

流体試料を適用するのが好ましい。

本発明の分析素子は、全血液分析に不都合なく用いるこ
とができる。更には尿等の他の体液も不都合なく用いら
れる。

〔実施例］ 以下、実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが
、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。

なお、各実施例において、特に断わシのない限シ試薬層
はすべて水溶液として調製し、塗布層とした。

実施例１ 膜厚１８０μｍの透明な下引済ポリエチレンテレフタレ
ート支持体上に表−１に示す組成の試薬層−Ｉを設け、
試薬層−■がある場合にはその上に試薬層−■を設けて
５０μｍの厚さとし、次いで試薬層上に、カレンダリン
グ処理した一紙〔東洋Ｆ紙（株）ｋ７）（８−１）又は
同−紙にＰ−ノニルフエノキクボリエテレンオキッドを
重量比でｔ５％（（１１０５ｒ／ａｍ寞）含浸させたも
の（Ｓ−２）をそれぞれ展開層としてはシ合わせ本発明
の分析素子（１）、　（２）、　（４）を作成し、一方
、綿１００係のブロード（８０双）に（Ｌ２９６のポリ
オキシエチレｙノニルフエノキシエーテルを含浸させた
もの（Ｓ−３）を展開層としてはシ合わせ本発明の分析
素子（３）とした。

他方、表−１に示す組成の試薬層Ｒ−５を支持体上に塗
設し、この上に上記各展開層Ｓ−１〜日−３をはり合わ
せ、それぞれ比較の分析素子（１）〜（３）を作成した
。

これらの試料に対して製造直後及び４０℃で３日間保存
した後の性能について、それらの試料にユニキットヘモ
グロビン〔中外製薬（株）社製〕による測定値が各々Ｚ
４、ａ７．９６．１１．０．１　ｔ　９　ｔ／ｄｔであ
る採血直後のヒト血液を用意し、各検体を１０ｐｔ滴下
した後、３７℃１０分間保温し、サクラデンクトメータ
ー　ＰＤＡ　−６５（小西六写真工業社製）を用いて発
色スポットの５４０　ｎｍにおける反射濃度を測定した
。その各結果を表−５Ｋ示す。

表−１ 簀　ｎ−ブタノールを溶媒として用いているため亜硝酸
ナトリウム及びアジ化ナトリウムはそれぞれ分散状態と
なっている。したがって上記２試薬は互いに混ざシ合わ
ない状態で存在している。

表−２ 表−３で明らかなように、比較の分析素子では、各ヘモ
グロビン濃度の血液を滴下し、その反射濃度から性能を
見た場合、４０℃、３日間の保存で識別能が低下し、明
らかな性能の劣化が認められるのに対して、本発明の分
析素子では、４０℃で３日間保存した後でも、充分な識
別能を有し、４０℃の保存による性能の劣化は〔発明の
効果コ 以上詳細に説明したように、本発明の分析素子は、その
ヘモグロビンの測定感度が優れていると共に、保存安定
性が良好であるという顕著な効果を奏するものである。

特許出願人　　小西六写真工業株式会社同　　　中外製
薬株式会社

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １、アジドメトヘモグロビン法を用いて流体試料中のヘ
   モグロビンを測定するための分析素子において、ヘモグ
   ロビンを酸化しうる物質とアジ化物とを、互いに分離し
   ているが、流体試料の適用により相互作用の生起が可能
   な状態に配備したことを特徴とするヘモグロビン測定用
   分析素子。