JPS6119488A - 大腸菌を用いたマウスβ型インタ−フエロンの生産方法 - Google Patents
大腸菌を用いたマウスβ型インタ−フエロンの生産方法Info
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- JPS6119488A JPS6119488A JP13939984A JP13939984A JPS6119488A JP S6119488 A JPS6119488 A JP S6119488A JP 13939984 A JP13939984 A JP 13939984A JP 13939984 A JP13939984 A JP 13939984A JP S6119488 A JPS6119488 A JP S6119488A
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/555—Interferons [IFN]
- C07K14/565—IFN-beta
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
［産業上の利用分野］
本発明は、マウスβ型インターフェロンを大腸菌内で生
産するように作成された発現プラスミド、および該プラ
スミドによる大腸菌形質転換株を用いたマウスβ型イン
ターフェロンの生産方法に関する。
産するように作成された発現プラスミド、および該プラ
スミドによる大腸菌形質転換株を用いたマウスβ型イン
ターフェロンの生産方法に関する。
［従来の技術］
インターフェロンは抗ウィルス作用、抗癌作用をはじめ
とする多面的作用を持つ糖たんばく質であり、その臨床
応用が期待されている。
とする多面的作用を持つ糖たんばく質であり、その臨床
応用が期待されている。
このようなインターフェロンの作用を前臨床的に評価す
る場合、その種特異性が大きな障害となる。たとえば抗
癌作用を検討する場合、ヌードマウス−ヒトインターフ
ェロンのようなモデル系が用いられているが、この系で
は移植したヒトの癌細胞に対するインターフェロンの直
接作用を見ることはできるが、免疫系を介したインター
フェロンの間接的抗癌作用を評価することはできない。
る場合、その種特異性が大きな障害となる。たとえば抗
癌作用を検討する場合、ヌードマウス−ヒトインターフ
ェロンのようなモデル系が用いられているが、この系で
は移植したヒトの癌細胞に対するインターフェロンの直
接作用を見ることはできるが、免疫系を介したインター
フェロンの間接的抗癌作用を評価することはできない。
インターフェロンの間接作用を評価覆るには、マウス−
マウスインターフェロンのホモジニアスな系を構築する
必要がある。これにより初めてインターフェロンと免疫
系に関連した生体防御機構との関係の解明という興味あ
る問題への取り組みが可能となる。
マウスインターフェロンのホモジニアスな系を構築する
必要がある。これにより初めてインターフェロンと免疫
系に関連した生体防御機構との関係の解明という興味あ
る問題への取り組みが可能となる。
従来はマウス細胞培養により産生されるインターフェロ
ンの学的、質的制約があり、研究進展への隘路となって
いた。上記の目的のため高純度のマウスインターフェロ
ンを大量に入手するには、遺伝子操作の手法を用いるこ
とが効果的である。
ンの学的、質的制約があり、研究進展への隘路となって
いた。上記の目的のため高純度のマウスインターフェロ
ンを大量に入手するには、遺伝子操作の手法を用いるこ
とが効果的である。
すでにマウスα型インターフェロンについてはヂｌ−リ
ッヒ大のワイズマンらが（Ｎｕｃｌ 、 Ａｃ１ｄ 、
Ｒｅｓ、１１，５５５ （１９８３））、また、マウス
γ型インターフェロンについてはジエネンアク社 グツ
デルらが（ｐｒｏｃ 、 Ｎａｔｌ 、△ｃｉｄ 。
ッヒ大のワイズマンらが（Ｎｕｃｌ 、 Ａｃ１ｄ 、
Ｒｅｓ、１１，５５５ （１９８３））、また、マウス
γ型インターフェロンについてはジエネンアク社 グツ
デルらが（ｐｒｏｃ 、 Ｎａｔｌ 、△ｃｉｄ 。
Ｓｃｉ、ＵＳＡ ８０．５８４２（１９８３））
、大腸菌内でのクローニング発現に成功している。
、大腸菌内でのクローニング発現に成功している。
マウスβ型インターフェロンについては、従来マウスし
細胞やＣ−２４３細胞等を用いた細胞培養により得られ
ていたが、この方法ではα型、β型インターフェロンの
混合した状態で生産され、分離が困難である、培養に時
間がかかる、大量生産には不向き、など多くの欠点があ
った。最近、遺伝子操作の手法を用いて癌研 呑口らは
マウスＬ細胞より、マウスβ型インターフェロン構造遺
伝子と、そのシグナル配列を含むｃＤ Ｎ Ａを分則し
、更にサルの００８−７細胞でのその発現を確認してい
る。（Ｊ、１３ｉｏ１ 、 Ｑｈｅｍ 、 ２５８．９
また、筑波大の山板らは、上記ｃＤＮ△を用いてマウス
β型インターフェロンを枯草菌α−アミラーゼどの融合
たんばく質を形成させ、枯草菌、菌体外に分泌生産させ
ている。
細胞やＣ−２４３細胞等を用いた細胞培養により得られ
ていたが、この方法ではα型、β型インターフェロンの
混合した状態で生産され、分離が困難である、培養に時
間がかかる、大量生産には不向き、など多くの欠点があ
った。最近、遺伝子操作の手法を用いて癌研 呑口らは
マウスＬ細胞より、マウスβ型インターフェロン構造遺
伝子と、そのシグナル配列を含むｃＤ Ｎ Ａを分則し
、更にサルの００８−７細胞でのその発現を確認してい
る。（Ｊ、１３ｉｏ１ 、 Ｑｈｅｍ 、 ２５８．９
また、筑波大の山板らは、上記ｃＤＮ△を用いてマウス
β型インターフェロンを枯草菌α−アミラーゼどの融合
たんばく質を形成させ、枯草菌、菌体外に分泌生産させ
ている。
以上の方法は学問的には興味がある方法ではあるが生産
に関する限り、サル細胞の系では従来の 登マウス
の細胞培養の系と何ら変りがなく、生産量が低く、また
培養に時間と手間−のかかることから、大量生産には不
向きである。また枯草菌を用いた系では、その生産量が
低いこと、および得られるたんばく賀がマウスβ型イン
ターフェロンとα−アミラーゼとの融合たんばく質であ
り、純品ではないことが大きな欠点である。すなわち、
実際に前臨床研究に使用できるだけのマウスβ型インタ
ーフェロンを純粋に、かつ大量に得る系は全く確立して
いなかった。
に関する限り、サル細胞の系では従来の 登マウス
の細胞培養の系と何ら変りがなく、生産量が低く、また
培養に時間と手間−のかかることから、大量生産には不
向きである。また枯草菌を用いた系では、その生産量が
低いこと、および得られるたんばく賀がマウスβ型イン
ターフェロンとα−アミラーゼとの融合たんばく質であ
り、純品ではないことが大きな欠点である。すなわち、
実際に前臨床研究に使用できるだけのマウスβ型インタ
ーフェロンを純粋に、かつ大量に得る系は全く確立して
いなかった。
［発明が解決しようと（る問題点］
本発明は、前記の欠点を解消し、前臨床研究へのマウス
β型インターフェロンの大量供給を行な、 うこ
とを目的に、大腸菌を用いたマウスβ型インターフェロ
ン生−系を開発し、多量生産を達成しようとするもので
ある。
β型インターフェロンの大量供給を行な、 うこ
とを目的に、大腸菌を用いたマウスβ型インターフェロ
ン生−系を開発し、多量生産を達成しようとするもので
ある。
［問題を解決するための手段］
本発明は、マウスβ型インターフェロンを大腸菌内で生
産するように作成された発現プラスミド、該プラスミド
により形質転換された大島菌株、および該大腸菌形質転
換株を用いたマウスβ型インターフェロンの生産方法に
関する。
産するように作成された発現プラスミド、該プラスミド
により形質転換された大島菌株、および該大腸菌形質転
換株を用いたマウスβ型インターフェロンの生産方法に
関する。
大腸菌内でのマウスβ型インターフェロン発現プラスミ
ドの作成は、大ｌｌＩ菌内で作用するプロモーターの制
御下にＳＤ領領域配し、さらに翻訳開始の遺伝暗号であ
る△ＴＧまたはＧＴＧコドンを付与したマウスβ型イン
ターフェロン構造遺伝子を連結することにより達成され
る。
ドの作成は、大ｌｌＩ菌内で作用するプロモーターの制
御下にＳＤ領領域配し、さらに翻訳開始の遺伝暗号であ
る△ＴＧまたはＧＴＧコドンを付与したマウスβ型イン
ターフェロン構造遺伝子を連結することにより達成され
る。
大腸菌内で作用するプロモーターとしては大腸菌が本来
持つプロモーターの他に他の菌株由来のＤＮＡであって
も大腸菌内でプロモーター活性を持つもの、また合成さ
れたＤＮＡ断片でプロモーター活性を持つものでもよい
。好ましくは、ｔｒｐ。
持つプロモーターの他に他の菌株由来のＤＮＡであって
も大腸菌内でプロモーター活性を持つもの、また合成さ
れたＤＮＡ断片でプロモーター活性を持つものでもよい
。好ましくは、ｔｒｐ。
Ｉａｃ 、 ｒｅｃ Ａ 、 ｔｕｆβ、 ｏｍｐ Ａ
、 ｏｍｐ Ｃ，ｒｒｎ 。
、 ｏｍｐ Ｃ，ｒｒｎ 。
ｔｏｐの遺伝子のプロモーターのように１次構造の解明
されているいわゆる゛強い″プロモーターを用いること
が良い。
されているいわゆる゛強い″プロモーターを用いること
が良い。
ＳＤ配列は、リボゾームＲＮへの結合部位であり、翻訳
には必須の領域である。本発明においては、ＳＤ配列に
ついても特に限定するものではなく、翻訳を行なうため
の機能を保持しておればよい。また、たとえば、トリプ
トファンプロモーターに対しラクトースオペロンのＳＤ
配列を結合させるというような、雑種形の発現系を構成
してもよい。
には必須の領域である。本発明においては、ＳＤ配列に
ついても特に限定するものではなく、翻訳を行なうため
の機能を保持しておればよい。また、たとえば、トリプ
トファンプロモーターに対しラクトースオペロンのＳＤ
配列を結合させるというような、雑種形の発現系を構成
してもよい。
このようにして作成された発現系にマウスβ型インター
フェロン構造遺伝子を連結する必要がある。マウスβ型
インターフェロン構造遺伝子はプラスミドｐＭβ−３よ
り得られる。ｐＭβ−３の製作方法および構造は、Ｊ、
Ｂｉｏｌ 、 Ｃｈｅｍ 、 ２５８．９５２１−９
５２９ （１９８３）に報告されている。この方法は、
ニューカッスル病ウィルスによりインターフェロン生産
を誘発したマウスし細胞よりメツセンジャーＲＮＡを分
取し、その中のインターフェロンβを生産し得る分画に
よりｃＤ Ｎ Ａを作製し、これをｐＢＲ３２２のｐ
ｓｔ １部位に挿入する。得られたプラスミドのうちヒ
トβ型インターフェロン遺伝子とハイブリダイズするも
のを検索することにより、マウスβ型インターフェロン
構造遺伝子を含むプラスミドｐＭβ−３を得ることがで
きる。ｌ）Ｍβ−３の構造はそのＰＳｔ１部位に、マウ
スし細胞由来のマウスβ型インターフェロン構造遺伝子
と、そのシグナル配列をコードする遺伝子を含むｃＤ
Ｎ Ａを挿入している。このシグナル配列をコードする
遺伝子を除去し、更に成熟型マウスβ型インターフェロ
ンのＮ末端のアミノ酸イソロイシンをコードするＡＴＣ
の前に大腸菌での翻訳開始暗号ＡＴＧまたはＧＴＧコド
ンを付与する必要がある。
フェロン構造遺伝子を連結する必要がある。マウスβ型
インターフェロン構造遺伝子はプラスミドｐＭβ−３よ
り得られる。ｐＭβ−３の製作方法および構造は、Ｊ、
Ｂｉｏｌ 、 Ｃｈｅｍ 、 ２５８．９５２１−９
５２９ （１９８３）に報告されている。この方法は、
ニューカッスル病ウィルスによりインターフェロン生産
を誘発したマウスし細胞よりメツセンジャーＲＮＡを分
取し、その中のインターフェロンβを生産し得る分画に
よりｃＤ Ｎ Ａを作製し、これをｐＢＲ３２２のｐ
ｓｔ １部位に挿入する。得られたプラスミドのうちヒ
トβ型インターフェロン遺伝子とハイブリダイズするも
のを検索することにより、マウスβ型インターフェロン
構造遺伝子を含むプラスミドｐＭβ−３を得ることがで
きる。ｌ）Ｍβ−３の構造はそのＰＳｔ１部位に、マウ
スし細胞由来のマウスβ型インターフェロン構造遺伝子
と、そのシグナル配列をコードする遺伝子を含むｃＤ
Ｎ Ａを挿入している。このシグナル配列をコードする
遺伝子を除去し、更に成熟型マウスβ型インターフェロ
ンのＮ末端のアミノ酸イソロイシンをコードするＡＴＣ
の前に大腸菌での翻訳開始暗号ＡＴＧまたはＧＴＧコド
ンを付与する必要がある。
シグナル配列をコードするＤＮＡの除去については、例
えば、シグナル配列をコードする遺伝子中に存在するＢ
ａｌＨｒ部位で切断した後、３ａ１３１消化し、その後
３ａ１３’１消化がちょうどマウスβ型インターフェロ
ンたんばく質Ｎ末端のイソロイシンをコードするＡＴＣ
の前で停止しているクローンを選択する方法や、インタ
ーフェロン構造遺伝子内の３ＳｔＪ部位で切断し必要な
５−末端のＤＮＡ部位を合成により得る方法などがある
。後者の方法を用いた方が良い結果が得られやすい。
えば、シグナル配列をコードする遺伝子中に存在するＢ
ａｌＨｒ部位で切断した後、３ａ１３１消化し、その後
３ａ１３’１消化がちょうどマウスβ型インターフェロ
ンたんばく質Ｎ末端のイソロイシンをコードするＡＴＣ
の前で停止しているクローンを選択する方法や、インタ
ーフェロン構造遺伝子内の３ＳｔＪ部位で切断し必要な
５−末端のＤＮＡ部位を合成により得る方法などがある
。後者の方法を用いた方が良い結果が得られやすい。
また用いる制限酵素部位は５ｓｔ１部位以外のものでも
良く、極端な場合、マウスβ型インターフェロン構造遺
伝子を全合成し、シグナル配列をコードするＤＮＡ部分
を除去できる。
良く、極端な場合、マウスβ型インターフェロン構造遺
伝子を全合成し、シグナル配列をコードするＤＮＡ部分
を除去できる。
ＡＴＧまたはＧＴＧコドンの付与については、合成りＮ
Ａを用いて、５′末端の遺伝子部分を作製する場合には
、あらかじめマウスβ型インターフェロンたんばく質の
Ｎ末端アミノ酸イソロイシンをコードするＡＴＣの前に
ＡＴＧまたはＧＴＧコドンを連結するようにＤＮＡ合成
を行なうことにより達成される。また、Ｂａ１３１消化
を行なった場合は、ＡＴＧまたはＧＴＧコドンを３′末
端に持つリンカ−ＤＮＡをインターフェロン構造遺伝子
の前部に連結することにより達成される。
Ａを用いて、５′末端の遺伝子部分を作製する場合には
、あらかじめマウスβ型インターフェロンたんばく質の
Ｎ末端アミノ酸イソロイシンをコードするＡＴＣの前に
ＡＴＧまたはＧＴＧコドンを連結するようにＤＮＡ合成
を行なうことにより達成される。また、Ｂａ１３１消化
を行なった場合は、ＡＴＧまたはＧＴＧコドンを３′末
端に持つリンカ−ＤＮＡをインターフェロン構造遺伝子
の前部に連結することにより達成される。
以上のようにプロモーター、ＳＤ配列、ＡＴＧまたはＧ
ＴＧコドン、マウスβ型インターフェロン構造遺伝子を
この順に連結することにより、発現プラスミドの作製は
達成きれる。
ＴＧコドン、マウスβ型インターフェロン構造遺伝子を
この順に連結することにより、発現プラスミドの作製は
達成きれる。
得られたプラスミドを用いて、大腸菌を形質転換するに
は、公知の方法［例χばＪ、 Ｂａｃｔ 、 １１９．
１０７２−１０７４ （１９７４）］に従い、塩化カル
シウム処理した大腸菌とプラスミドＤＮＡを接触させる
ことにより行ない得る。
は、公知の方法［例χばＪ、 Ｂａｃｔ 、 １１９．
１０７２−１０７４ （１９７４）］に従い、塩化カル
シウム処理した大腸菌とプラスミドＤＮＡを接触させる
ことにより行ない得る。
形質転換された大腸菌株について、天然培地、半合成培
地、合成培地を用いて培養することによりマウスβ型イ
ンターフェロンの生産は達成される。
地、合成培地を用いて培養することによりマウスβ型イ
ンターフェロンの生産は達成される。
好ましくは、たとえば発現系にトリプトファンプロモー
ターを用いた場合には、インドールアクリル酸を培養途
中に加え、インターフェロンの生産を誘導することが良
い。他のプロモーターを用いる場合も、それぞれ特有の
誘導剤を用いることが好ましい。このことにより、マウ
スβ型インターフェロンの生産量は増大する。
ターを用いた場合には、インドールアクリル酸を培養途
中に加え、インターフェロンの生産を誘導することが良
い。他のプロモーターを用いる場合も、それぞれ特有の
誘導剤を用いることが好ましい。このことにより、マウ
スβ型インターフェロンの生産量は増大する。
以上の如く得られたマウスβ型インターフェロンを生産
する大腸菌を、公知の方法、たとえば酵素処理、音波処
理、播潰法、加圧処理などにより破砕することにより（
堀江武−１山下仁平編集二［蛋白質・酵素の基礎実験法
ＪＦ１３−７ （１９８１）南江堂）、粗インターフェ
ロン抽出液が得られる。
する大腸菌を、公知の方法、たとえば酵素処理、音波処
理、播潰法、加圧処理などにより破砕することにより（
堀江武−１山下仁平編集二［蛋白質・酵素の基礎実験法
ＪＦ１３−７ （１９８１）南江堂）、粗インターフェ
ロン抽出液が得られる。
さらに、得られた粗インターフェロン抽出液から公知の
方法、たとえば塩析、限外−過、イオン交換、ゲルー過
、アフィニティークロマトグラフィー、電気泳動等の方
法、あるいはこれらを組合わせることによって（堀江武
−１山下仁平編集＝［蛋白質・酵素の基礎実験法Ｊｐ１
８−３８２（１９８１）南江堂）、高純度のマウスβ型
インターフェロンを得ることができる。
方法、たとえば塩析、限外−過、イオン交換、ゲルー過
、アフィニティークロマトグラフィー、電気泳動等の方
法、あるいはこれらを組合わせることによって（堀江武
−１山下仁平編集＝［蛋白質・酵素の基礎実験法Ｊｐ１
８−３８２（１９８１）南江堂）、高純度のマウスβ型
インターフェロンを得ることができる。
上記の操作により得られたインターフェロンは抗マウス
β型インターフェロン抗体により中和される。
β型インターフェロン抗体により中和される。
［発明の効果］
以上のように本発明は、従来なし得なかったマウスβ型
インターフェロンの大腸菌における生産系を確立したも
のである。大腸菌を用いた系は、他の細胞培養や微生物
の系よりもはるかに生産性が高いため、大量生産には非
常に有利である。
インターフェロンの大腸菌における生産系を確立したも
のである。大腸菌を用いた系は、他の細胞培養や微生物
の系よりもはるかに生産性が高いため、大量生産には非
常に有利である。
本発明でも、他の生産系が１万（Ｊ／ｍｌ以下のインタ
ーフェロン生産量であるのに対し９０万Ｕ／１と約１０
０倍の生産量を達成した。
ーフェロン生産量であるのに対し９０万Ｕ／１と約１０
０倍の生産量を達成した。
このように大量のマウスβ型インターフェロンが得られ
れば、前臨床研究への供給も可能となり、インターフェ
ロンの免疫調節剤としての役割が明らかにされるであろ
う。
れば、前臨床研究への供給も可能となり、インターフェ
ロンの免疫調節剤としての役割が明らかにされるであろ
う。
以下にトリプトファンプロモーターを用いて高い発現効
果を持つプラスミドを作成し、マウスβ型インターフェ
ロンの大量生産を実施した例を示す。
果を持つプラスミドを作成し、マウスβ型インターフェ
ロンの大量生産を実施した例を示す。
［実施例１］
マウスβ型インターフェロン発現プラスミドｐ６１ｇｌ
ｕβ１１の作成 ｐ５ｍｕβ１１は、まずＩ）Ｍβ−３のマウスβ型イン
ターフェロン構造遺伝子を含むＤＮＡ断片とｐＫＭ６（
ｔ−リプトフアンプロモーターを持つ発現ベクター）と
を連結してプラスミドｐＫＭ６−ｍｕβを作製し、次に
このＩ）ＫＭ６−ｍｕβのマウスβ型インターフェロン
構造遺伝子内のＳ ｓｔ １部位を切断し、必要な５′
−末端のＤＮＡ部分を合成して作製した。
ｕβ１１の作成 ｐ５ｍｕβ１１は、まずＩ）Ｍβ−３のマウスβ型イン
ターフェロン構造遺伝子を含むＤＮＡ断片とｐＫＭ６（
ｔ−リプトフアンプロモーターを持つ発現ベクター）と
を連結してプラスミドｐＫＭ６−ｍｕβを作製し、次に
このＩ）ＫＭ６−ｍｕβのマウスβ型インターフェロン
構造遺伝子内のＳ ｓｔ １部位を切断し、必要な５′
−末端のＤＮＡ部分を合成して作製した。
（１） １１ＫＭ６−ｍｕβの作製
ｐＫＭ６−ｍｕβ作製方沫の概略作製方図に示す。
Ｊ、Ｂｉｏｌ 、Ｃｈｅｍ 、２５８．９５２２〜２９
（１９８３）に記載の方法に従い作製したｐＭβ−３を
ｐｓｔｉ消化した後、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼにより平
滑末端とする。これにＢａ１ｌｌＨＩリンカ−を結合さ
せ、（３ａｍＨＩ消化した後、アガロースゲル電気泳動
により、マウスβ型インターフェロン構造遺伝子を含む
約０．７ＫｂのＤＮＡ断片を分取した。ｐＫＭ６はトリ
プトファンプロモーター支配下にヒトβ型インターフェ
ロン遺伝子を発現するように組み立てられたプラスミド
ｐＫＴ１−９の５Ｄ−ＡＴＧ間の塩基配列を修飾するこ
とにより得たプラスミドである。５Ｄ−ＡＴＧ間の配列
はＧＧＴＴＴＧＡＡＡＴＣＧＡＴＧである。
（１９８３）に記載の方法に従い作製したｐＭβ−３を
ｐｓｔｉ消化した後、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼにより平
滑末端とする。これにＢａ１ｌｌＨＩリンカ−を結合さ
せ、（３ａｍＨＩ消化した後、アガロースゲル電気泳動
により、マウスβ型インターフェロン構造遺伝子を含む
約０．７ＫｂのＤＮＡ断片を分取した。ｐＫＭ６はトリ
プトファンプロモーター支配下にヒトβ型インターフェ
ロン遺伝子を発現するように組み立てられたプラスミド
ｐＫＴ１−９の５Ｄ−ＡＴＧ間の塩基配列を修飾するこ
とにより得たプラスミドである。５Ｄ−ＡＴＧ間の配列
はＧＧＴＴＴＧＡＡＡＴＣＧＡＴＧである。
ｐＫＴｌ−９の作製方法および構造はすでに報告されて
いるｐＦ Ｉ Ｆｔｒｐ ６９ （Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃ１ｄ 。
いるｐＦ Ｉ Ｆｔｒｐ ６９ （Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃ１ｄ 。
Ｒｅｓ、８．４０５７〜４０７４（１９８０））と同一
であるが、ｐＫＴｌ−，９作製の場合には、ヒトβ型イ
ンターフェロン遺伝子の前の制限酵素部位としてＣ１ａ
ｌを用いた。ｐＫＴｌ−９の作製はヒトβ型インターフ
ェロン構造遺伝子を含むＤＮＡ断片、ベクターＤＮＡで
あるｐＢＲ３２２、トリプトファンプロモーターを含む
ＤＮＡ断片の３者を連結することにより達成される。こ
のプラスミドの５Ｄ−ＡＴＧ間の塩基配列は、ＧＧＴＡ
ＴＣＧＡＴＧである。前記のｐＭβ−３とは別にｐＫＭ
６を３ａｍＨＩ消化し、これと上記のＤＮＡ断片を混合
、Ｔ４ＤＮＡリガーゼにより連結した後、エシェリヒア
コーライ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ。
であるが、ｐＫＴｌ−，９作製の場合には、ヒトβ型イ
ンターフェロン遺伝子の前の制限酵素部位としてＣ１ａ
ｌを用いた。ｐＫＴｌ−９の作製はヒトβ型インターフ
ェロン構造遺伝子を含むＤＮＡ断片、ベクターＤＮＡで
あるｐＢＲ３２２、トリプトファンプロモーターを含む
ＤＮＡ断片の３者を連結することにより達成される。こ
のプラスミドの５Ｄ−ＡＴＧ間の塩基配列は、ＧＧＴＡ
ＴＣＧＡＴＧである。前記のｐＭβ−３とは別にｐＫＭ
６を３ａｍＨＩ消化し、これと上記のＤＮＡ断片を混合
、Ｔ４ＤＮＡリガーゼにより連結した後、エシェリヒア
コーライ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ。
以下Ｅ、（ｉｏｌｉと略す）ＭＣ１０６１ＬＪ、Ｍｏｌ
。
。
Ｂｉｏｌ 、 １３８．１７９ （１９８０） ）を形
質転換した。形質転換株の選択はアンピシリン２００μ
ｇ ／ｍｌを含むＬＢ培地で行なった。得られたアンピ
リジン耐性株２７６株中２１株がテトラサイクリン感受
性であり、新しいＤＮＡ断片を挿入していると考えられ
た。次に断片の挿入方向を決定するため、２１株の上記
形質転換株よりアルカリ−５ＯＳ抽出法によりプラスミ
ドＤ Ｎ−Ａを抽出し、Ｃ１ａ１．５ｓｔ（消化を行な
った。その結果、８株がトリプトファンプロモーターと
マウスβ型インターフエロン椙造遺伝子の転写方向が同
一であるプラスミド１１に、Ｍ ６− ｍｕβを保持し
ていた。
質転換した。形質転換株の選択はアンピシリン２００μ
ｇ ／ｍｌを含むＬＢ培地で行なった。得られたアンピ
リジン耐性株２７６株中２１株がテトラサイクリン感受
性であり、新しいＤＮＡ断片を挿入していると考えられ
た。次に断片の挿入方向を決定するため、２１株の上記
形質転換株よりアルカリ−５ＯＳ抽出法によりプラスミ
ドＤ Ｎ−Ａを抽出し、Ｃ１ａ１．５ｓｔ（消化を行な
った。その結果、８株がトリプトファンプロモーターと
マウスβ型インターフエロン椙造遺伝子の転写方向が同
一であるプラスミド１１に、Ｍ ６− ｍｕβを保持し
ていた。
（２） ｐ６ｍｕβ１１の作製
ｐ６ｍｕβ１１作製の概要について第２図に示す。
（１）で得られたｐＫＭ６−ｍｕβについてＣ１ａｌ−
Ｓ ｓｔ Ｉ消化した後、アガロースゲル電気泳動を用
いて、約５．ＩＫｂのＤＮＡ断片を分取した。
Ｓ ｓｔ Ｉ消化した後、アガロースゲル電気泳動を用
いて、約５．ＩＫｂのＤＮＡ断片を分取した。
これとは別にＣ１ａｌ−８ＳｔＩ部位のＤＮＡ断片につ
いて合成りＮＡオリゴマーより作製した。第３図にその
概略を示す。 目的とするＤＮＡ断片の長さは５８ｂｐ
であり５′末端にＣ１８１部位、３末端に５Ｓｔ１部位
を持つ。さらにこのＤＮＡはマウスβ型インターフェロ
ン構造遺伝子の３ ｓｔ ■部位より上流部位に相当し
、末端のイソロイシンをコードするＡＴＣコドンの前に
、大腸菌の翻訳開始コドンＡ Ｔ Ｇが付与されている
。このＤＮＡを鎖長さ９塩基〜１８塩基の９本に分けて
合成を行なった。次に■と■を除く他のオリゴマーにつ
いてＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて５末端のリ
ン酸化を行なった後、■〜■を混合し、７０℃に加熱し
た後に冷却することによりアニーリングを行なった。次
にＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて各オリゴマーを連結−し
た後、ポリアクリルアミドゲルにより５８ ｂｐのＤＮ
Ａ１！ｉ片を分取した。ここで得た５ ８ ｂｐ□ Ｎ
Ａ断片と先に得た約５．ＩＫｂＤＮＡ断片を混合、Ｔ
４ＤＮＡリガーゼにより連結し、Ｅ、ｃｏｌｉ ＭＣ
１０６１を形質転換することによりＥ、 ｃｏｌｉ
ＭＣ１０６１／ ｐ６ｍｕβ１１（微工研菌寄第７６６
２号）を得た。得られたアンピシリン耐性形質転換株に
ついて、３２ｐ−ラベル化した■の合成オリゴマーをプ
ローブに用いてコロニーハイブリダイゼーションを行な
ったところ、１３０株中１２０株が陽性であった。これ
らの中から代表株１２株を選びプオスミドＤＮＡを抽出
し、その制限酵素地図を決定したところ第２図に示ｔｐ
６ｍｕβ１１の構造を持っていた。
いて合成りＮＡオリゴマーより作製した。第３図にその
概略を示す。 目的とするＤＮＡ断片の長さは５８ｂｐ
であり５′末端にＣ１８１部位、３末端に５Ｓｔ１部位
を持つ。さらにこのＤＮＡはマウスβ型インターフェロ
ン構造遺伝子の３ ｓｔ ■部位より上流部位に相当し
、末端のイソロイシンをコードするＡＴＣコドンの前に
、大腸菌の翻訳開始コドンＡ Ｔ Ｇが付与されている
。このＤＮＡを鎖長さ９塩基〜１８塩基の９本に分けて
合成を行なった。次に■と■を除く他のオリゴマーにつ
いてＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて５末端のリ
ン酸化を行なった後、■〜■を混合し、７０℃に加熱し
た後に冷却することによりアニーリングを行なった。次
にＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて各オリゴマーを連結−し
た後、ポリアクリルアミドゲルにより５８ ｂｐのＤＮ
Ａ１！ｉ片を分取した。ここで得た５ ８ ｂｐ□ Ｎ
Ａ断片と先に得た約５．ＩＫｂＤＮＡ断片を混合、Ｔ
４ＤＮＡリガーゼにより連結し、Ｅ、ｃｏｌｉ ＭＣ
１０６１を形質転換することによりＥ、 ｃｏｌｉ
ＭＣ１０６１／ ｐ６ｍｕβ１１（微工研菌寄第７６６
２号）を得た。得られたアンピシリン耐性形質転換株に
ついて、３２ｐ−ラベル化した■の合成オリゴマーをプ
ローブに用いてコロニーハイブリダイゼーションを行な
ったところ、１３０株中１２０株が陽性であった。これ
らの中から代表株１２株を選びプオスミドＤＮＡを抽出
し、その制限酵素地図を決定したところ第２図に示ｔｐ
６ｍｕβ１１の構造を持っていた。
［実施例２］
トリプトファンプロモーターを持つ発現ベクターとして
ｐＫＭ６の代りに１１ＫＭ４を用い、実施 。
ｐＫＭ６の代りに１１ＫＭ４を用い、実施 。
例１と同様の操作を行なった。ｐＫＭ４はトリプトファ
ンプロモーターの支配下にヒトβ型インターフェロン遺
伝子を発現するプラスミドｐＫ Ｔ ３−８の５Ｄ−Ａ
ｒ１間の塩基配列を修飾することにより得られる。５Ｄ
−Ａｒ１間の塩基配列は、ＧＧＴＴＴＧＧＴＣＴＡＧＡ
ＴＧである。ＤＫＴ３−８はすでに報告されているプラ
スミドｐＦＩＦｔｒｐ ６９ （Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａ
ａｉｄ 、 Ｒｅｓ、 ８．４０５７−４０７４ （１
９８０））と同一である。ｐＫＭ４をベクターとして用
いる場合は実施例１で使用した制限酵素ＱｌａｌをＸ
ｂａ ｌに変更すればよい。ｐＫＭ４のＸｂａｒ−Ｂａ
ＩｌｌＨ１部位にＸｂａｌ−８ｓｔ ｌの合成りＮＡ断
片と５ｓｔＩ −ＢａｍＨＩのマウスｃＤ Ｎ Ａ由来
のＤＮＡ断片を挿入することにより発現プラスミドの作
製は達成された。この場合、合成オリゴマーとしては、
実施例１の■の代りにｄとして５’−ＣＴＡＧＡＴＧＡ
ＴＣＡを用いた。■′を用いることにより得られる合成
りＮＡ断片は５′末端にＸ ｂａ １部位を有すること
になる。以上の操作で得られたマウスβ型インターフェ
ロン発現プラスミドｐ４ｍｕβ■を用い、Ｅ、ｃｏｌｉ
ＭＣ１０６１を形質転換することによりＦ、ｃｏｌｉＭ
Ｃ１０６１／ Ｄ４ｍｕβ１を得た。
ンプロモーターの支配下にヒトβ型インターフェロン遺
伝子を発現するプラスミドｐＫ Ｔ ３−８の５Ｄ−Ａ
ｒ１間の塩基配列を修飾することにより得られる。５Ｄ
−Ａｒ１間の塩基配列は、ＧＧＴＴＴＧＧＴＣＴＡＧＡ
ＴＧである。ＤＫＴ３−８はすでに報告されているプラ
スミドｐＦＩＦｔｒｐ ６９ （Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａ
ａｉｄ 、 Ｒｅｓ、 ８．４０５７−４０７４ （１
９８０））と同一である。ｐＫＭ４をベクターとして用
いる場合は実施例１で使用した制限酵素ＱｌａｌをＸ
ｂａ ｌに変更すればよい。ｐＫＭ４のＸｂａｒ−Ｂａ
ＩｌｌＨ１部位にＸｂａｌ−８ｓｔ ｌの合成りＮＡ断
片と５ｓｔＩ −ＢａｍＨＩのマウスｃＤ Ｎ Ａ由来
のＤＮＡ断片を挿入することにより発現プラスミドの作
製は達成された。この場合、合成オリゴマーとしては、
実施例１の■の代りにｄとして５’−ＣＴＡＧＡＴＧＡ
ＴＣＡを用いた。■′を用いることにより得られる合成
りＮＡ断片は５′末端にＸ ｂａ １部位を有すること
になる。以上の操作で得られたマウスβ型インターフェ
ロン発現プラスミドｐ４ｍｕβ■を用い、Ｅ、ｃｏｌｉ
ＭＣ１０６１を形質転換することによりＦ、ｃｏｌｉＭ
Ｃ１０６１／ Ｄ４ｍｕβ１を得た。
［実施例３］
実施例１および２で得られたマウスβ型インターフェロ
ン発現プラスミドを保持する大腸菌、Ｅ。
ン発現プラスミドを保持する大腸菌、Ｅ。
ｃｏｌｉ ＭＣ１０６１／ ｐ６ｍｕβ１１ 、Ｅ、
ｃｏｌｉＭＣ１０６１／ ｐ４ｍｕβ１にツイテ、そ
れぞれ培養を行ない、インターフェロン力価を調べた。
ｃｏｌｉＭＣ１０６１／ ｐ４ｍｕβ１にツイテ、そ
れぞれ培養を行ない、インターフェロン力価を調べた。
上記２株をＬＢ培地（バクトドリプトン１０ｇ、酵母エ
キス５ｇ、食塩５（］、グルコース２ｇを水１αに溶解
し、水酸化ナトリウムでｐＨ７，１に調整する）を用い
３０℃、８時間培養した後、この培養液０．２１を１０
１のＭ９培地（リン酸１カリウム０．３％、リン８！２
ナトリウム０．６％、食塩０．５％、塩化アンモニウム
０．１％、グルコース１％、カザミノ酸１％、硫酸マグ
ネシウム１１１１Ｍ１ビタミン８１５μＱ／ｉｆ、アン
ピシリン２００μｇ／ｌ）に接種し、３０℃で１５時間
培養を継続した。次に、トリプトファンオペロンの誘導
物質であるインドールアクリル酸を１０μｑ／ｍｌ加え
、さらに４時間培養した後、培養液を１ ｏｏｏｏＱ、
４分の遠心分離により集菌し、生理食塩水で洗浄した。
キス５ｇ、食塩５（］、グルコース２ｇを水１αに溶解
し、水酸化ナトリウムでｐＨ７，１に調整する）を用い
３０℃、８時間培養した後、この培養液０．２１を１０
１のＭ９培地（リン酸１カリウム０．３％、リン８！２
ナトリウム０．６％、食塩０．５％、塩化アンモニウム
０．１％、グルコース１％、カザミノ酸１％、硫酸マグ
ネシウム１１１１Ｍ１ビタミン８１５μＱ／ｉｆ、アン
ピシリン２００μｇ／ｌ）に接種し、３０℃で１５時間
培養を継続した。次に、トリプトファンオペロンの誘導
物質であるインドールアクリル酸を１０μｑ／ｍｌ加え
、さらに４時間培養した後、培養液を１ ｏｏｏｏＱ、
４分の遠心分離により集菌し、生理食塩水で洗浄した。
この菌体を１１のりゾチーム３ｕ、ＥＤＴＡ２ｍ Ｍ、
食塩３０ｍＭを含む１へリス−塩酸緩衝液（１）８７．
５＞に懸濁し、水中で６０分間放置する。凍結融解を２
回くり返し菌体を破砕した後、３００００（］ 、２０
分の遠心分離により細胞残滓を除去したものをインター
フェロン定量用の粗抽出液とした。
食塩３０ｍＭを含む１へリス−塩酸緩衝液（１）８７．
５＞に懸濁し、水中で６０分間放置する。凍結融解を２
回くり返し菌体を破砕した後、３００００（］ 、２０
分の遠心分離により細胞残滓を除去したものをインター
フェロン定量用の粗抽出液とした。
マウスβ型インターフェロンの定量は山水と用出の方法
（Ｖｉｒｏｌｏ（１１０３，８０（１９８０） ）によ
り、マウスＬ細胞、Ｖ ｅｓｉｃｕｌａｒ ｓｔｏｍ
ａｔｉｓｖｉｒｕｓを用いたＣＰＥ５０法をとった。標
準インターフェロンとしてはＮＩＨマウス標準インター
フェロンと、すり合せを行なった培養細胞由来のα型と
β型インターフェロン混合物１８５ＬＪ／ｍ！を用いた
。結果を第１表に示す。
（Ｖｉｒｏｌｏ（１１０３，８０（１９８０） ）によ
り、マウスＬ細胞、Ｖ ｅｓｉｃｕｌａｒ ｓｔｏｍ
ａｔｉｓｖｉｒｕｓを用いたＣＰＥ５０法をとった。標
準インターフェロンとしてはＮＩＨマウス標準インター
フェロンと、すり合せを行なった培養細胞由来のα型と
β型インターフェロン混合物１８５ＬＪ／ｍ！を用いた
。結果を第１表に示す。
第１表
【図面の簡単な説明】
第１図は実施例１のプラスミドｌ）ＫＭ６−ｍｕβ作製
の概要を、第２図は実施例１のプラスミド０６＋ａｕβ
１１作製の概要を示したものである。第３図は実施例１
の合成オリゴマーからのＤＮＡ断片の作製方法の概要を
示したものである。 １・・・マウスし細胞由来のｃＤＮＡ、２・・・マウス
β型インターフェロン構造遺伝子、３・・・トリゾ
゛トフアンプロモーター、４・・・ヒトβ型インターフ
ェロン構造遺伝子 特許出願人 財団法人 癌研究会 特許出願人 東 し 株式会社 代 理 人 中 利 至第２図 １ 釘１０−−慟 一、ｉ／；−。
の概要を、第２図は実施例１のプラスミド０６＋ａｕβ
１１作製の概要を示したものである。第３図は実施例１
の合成オリゴマーからのＤＮＡ断片の作製方法の概要を
示したものである。 １・・・マウスし細胞由来のｃＤＮＡ、２・・・マウス
β型インターフェロン構造遺伝子、３・・・トリゾ
゛トフアンプロモーター、４・・・ヒトβ型インターフ
ェロン構造遺伝子 特許出願人 財団法人 癌研究会 特許出願人 東 し 株式会社 代 理 人 中 利 至第２図 １ 釘１０−−慟 一、ｉ／；−。
Claims (3)
- （１）マウスβ型インターフェロンが大腸菌内で生産さ
れるように、該インターフェロンをコードするＤＮＡ断
片が翻訳開始信号とともに、プロモーター制御下に組み
込まれていることを特徴とする組み換え体プラスミド。 - （２）マウスβ型インターフェロンが大腸菌内で生産さ
れるように、該インターフェロンをコードするＤＮＡ断
片が翻訳開始信号とともに、プロモーター制御下に組み
込まれている組み換え体プラスミドにより形質転換され
た大腸菌株。 - （３）マウスβ型インターフェロンが大腸菌内で生産さ
れるように、該インターフェロンをコードするＤＮＡ断
片が翻訳開始信号とともに、プロモーター制御下に組み
込まれている組み換え体プラスミドにより形質転換され
た大腸菌株を培養し、培養物中にマウスβ型インターフ
ェロンを生成蓄積せしめ、該培養物からマウスβ型イン
ターフェロンを採取することを特徴とする大腸菌を用い
たマウスβ型インターフェロンの生産方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP13939984A JPS6119488A (ja) | 1984-07-05 | 1984-07-05 | 大腸菌を用いたマウスβ型インタ−フエロンの生産方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP13939984A JPS6119488A (ja) | 1984-07-05 | 1984-07-05 | 大腸菌を用いたマウスβ型インタ−フエロンの生産方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6119488A true JPS6119488A (ja) | 1986-01-28 |
Family
ID=15244369
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP13939984A Pending JPS6119488A (ja) | 1984-07-05 | 1984-07-05 | 大腸菌を用いたマウスβ型インタ−フエロンの生産方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6119488A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS63105613U (ja) * | 1986-12-25 | 1988-07-08 | ||
| JPS6480570A (en) * | 1987-09-24 | 1989-03-27 | Tokyo Kikai Seisakusho Ltd | Label forming and affixing device |
-
1984
- 1984-07-05 JP JP13939984A patent/JPS6119488A/ja active Pending
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| NUCLEIC ACIDS RESEARCH=1983 * |
| THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY=1983 * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS63105613U (ja) * | 1986-12-25 | 1988-07-08 | ||
| JPH021210Y2 (ja) * | 1986-12-25 | 1990-01-12 | ||
| JPS6480570A (en) * | 1987-09-24 | 1989-03-27 | Tokyo Kikai Seisakusho Ltd | Label forming and affixing device |
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