JPS61177951A - 粗製タンパク質の品質の改良 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 動物用飼料のためのバイオマスの生産における工業的発
酵方法には長い伝統（亜硫酸法廃液からの酵母生産）が
あり、最近では新しい方法開発（メタノールを原料とす
る細菌を用いる生産）の対象となっている。

牛および家族の肥育のような動物用栄養飼料の分野、養
魚、産卵鶏飼育、豚の肥育および家畜の飼育で使用され
る発酵方法のバイオマスは生物タンパク質とも呼ばれて
おり、微生物（＃母、細ｍ）の種類、使用される炭素源
（亜硫酸法廃液、エタノール、メタノール、またはパラ
フィン留分）、および発酵と方法技術のタイプにより、
異なる童のタンパク質、脂質、炭水化物および核酸〔リ
ボ核＃１（ＲＮＡ）およびデオキシリポ核＃！　（ＤＮ
Ａ）　］を含んでいる。

バイオマスの栄養価は第１にはタンパク質含有歓、アミ
ノ酸組成および有効性の関数であり、脂質と炭水化物画
分が完全飼料混合物のエネルギー含有量に寄与するもの
であり、核酸の含有１は、そのせ有室累は体を形成する
ためには使用されないか、使用されてもわずかの範囲の
量であるような２次的な要素である。

動物の種に特有な代謝により、ＲＮＡとＤＮＡの窒素構
造単位（プリンおよびピリミジン）は水に非常に溶は易
いもの（アラントイン）またはやや溶は易いもの（尿酸
）として生成物中に排出される代謝物にまで分解される
。

この理由から飼料混合物中の核酸含有ｔは、核酸分解生
成物から代謝および機能の過剰なストレスを避けるため
に制限されるものである。

一方、核酸（ＤＮＡとＭＡ　）の分子量による核酸含有
量とバイオプロティンの栄養有効性（消化性と許容性）
との関わりはこれまでに何も記述されていない。

ＲＮＡおよびＤＮＡの化学的組成（リボース、デオ午シ
リボース、リン酸、プリンおよびピリミジン）からの結
果である上記した代謝効果に加えて、核酸は生物タンパ
ク質の消化性への未知の逆効果を有していて、それはこ
れらの化合物の分子量が大きいことによりもたらされる
ものであることが発見された。

特に、ＤＮＡのポリヌクレオチドは分子量が１×１０５
からＩ　Ｘ　１０７の範囲に違するのに対し、これより
短いＲＮＡのポリヌクレオチド鎖は分子量が５，０００
からｓｏ、ｏｏｏである。

バイオプロティンの消化性および許容性に対する核酸の
分子量の影響は、ひなに試験給餌することではじめて観
察されたが、このことから分子量の消化器官に対する影
響を測定するテストモデルが展開された。

飼料における分子量の大きい核酸の逆効果は体重と比較
して腸の重置における濃度依存性の増加という結果をも
たらし、これにより吸収過程におけるマイナス変化によ
る代謝の一般゛的な劣化をもたらす。観察された代表的
な結果は貧弱な成長であり、これにより核酸を含む生物
タンパク質は外見上低タンパク価であることになる。

ＲＮＡおよびＤＮＡの分子量は水溶液の−、温度、塩の
含有量により減少できることが知られている。ＲＮＡは
アルカリ性範囲で加水分解されるのに対し、ＤＮＡは酸
性条件で分解される。加水分解の程度（分子量の減少）
はそのために選択される条件に依るものであり、一部の
加水分解しか起こらず、高められ次温度（８０〜９０ｃ
）で、ＭＡに対しては−８〜１１、ＤＮＡに対しては−
１，５〜４．５、処理時間１〜４時間の条件下でもＲＮ
Ａは５００〜１０，０００、ＤＮＡはｔｏ　ｏ　Ｏ〜４
０，０００の分子量のオリゴヌクレオチドにしかならな
い場会もある。さらに、生物夕／パ、り質のその他の構
成物、特にたんばく質はこの条件で逆に影響（色、味、
変性、塩含有量、ラセミ化）を受け、これにより栄養価
が減少する。さらに、ＲＮＡとＤＮＡの部分的な加水分
解ではその消化性に対する不利な影響を除くのにはなお
不十分である。

粗製生物タンパク質の許容性に対する分子量の大きなポ
リヌクレオチドの不利な影響は、本発明によりＲＮＡと
ＤＮＡを実質的、好ましくは質量的に、酵素により穂か
な条件で分解し、オリゴマーの、好ましくは七ツマ−の
ヌクレオチドにすることによって除かれるものである。

即ち、本発明は、核酸に富み、分子量の大きな核酸がヌ
クレアーゼで処理されることにより分解されている粗製
タンパク質の動物用栄養飼料への用途に関する。

適当な粗製タンパク質は、まず、微生物タンパク質、特
に酵母のような単細胞タンパク質、とシわけ細菌タンパ
ク質であるが、フィツシュミールまたは内臓のような核
酸に富んだ他の物質も使用できる。

使用される酵素はヌクレアーゼであり、特に、ホスホジ
ェステラーゼ、好ましくは５′−ホスホジエステラーゼ
であり、これはＲＮＡおよびＤＮＡを加水分解して対応
する３′−および５′−ヌクレオチドにする。

ホスホジェステラーゼは天然に広く存在しており、微生
物（ストレプトマイセス（８ｔｒｅｐｔｏ町ｃｅｓ）、
ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）　、スタフィ
ロコッチ（８ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ）　）、動物細
胞およびその生産物（牛の心臓、牛および修生の屏風、
蛇毒）または植物細ｌｌ１１（麦芽）から単離すること
ができる。

ホスホジェステラーゼｆｌ　ＲＮＡおよびＤＮＡの分子
構造のみを加水分解するので、生物タンパク質の、その
他の要素（脂質、炭水化物、タン／４！り質）に好まし
くない剛反応が起こることはない。

ホスホジェステラーゼは微生物の細胞壁を通過すること
ができるので、ＲＮＡおよびＤＮＡの酵素的加水分解の
ために粗製タンパク質に特別に前処理を施すということ
をしなくてもよい。即ち、本発明方法の工程は発酵によ
って製造されるバイオマスのどのような製造の過程へも
付加しうるものである。

必要な＃素濃度（ｆ）および基Ｊｊ［濃度（ｆ）の比は
１：ｔｏｏｏから１＝５０へ０００であり、好ましくは
１：１０．０００から１：１０へ０００である。

微生物および植物から粗製酵素を調製する他に、次のよ
うな商業的に入手可能な酵素も好ましく使用することが
できる。

５、アマノ社製：　　ヌクレアーゼＲＰ。

この目的の之めに酵素はその処理工程に応じて本来の形
態であるかまたは担体にイオン結合または共有結合的に
吸着させて固定化し次形態のどちらででも使用すること
ができる。

酵素的加水分解の反応溶媒は水または水−混和可能な有
機溶媒の混合物であり、核酸濃度はバイオマスの＃度お
よびタイプにより０．０５〜１０、好ましくは０．５〜
７、特に好ましくは１〜５Ｍ量チである。好ましい一領
域は４．５〜６．５、好ましくは１）ｌ−１５〜６であ
り、これは加水分解反応の間、ＮＨａＯＨ，ＮａＯＨ，
ＫＯＨ，Ｃａ（ＯＨ）２または塩基塩のようなアルカリ
で核酸のオリゴマーま友は七ツマ−から調製した酸基の
緩衝液により、好ましい領域に維持される。

反応は３０から６０Ｃ１好ましくは４５〜５５℃の温度
にて行なわれる。加水分解に必要な時間ハ便用されるバ
イオマスのタイプ、温度、酵素に依るものであるが、一
般的には、０．５〜８時間である。

ＲＮＡおよびＤＮＡの加水分解の進行度を満ぺるために
は、次のようにして、高圧液体クロマトグラフィーによ
りヌクレオチドの濃度が測定される。

固定相：　ＬｉＣｈｒｏｓｏｒｂ　（登録商標）ＲＰ１
８７μ（Ｍｅｒｃｈ）カラム長さ＝２０国、直径０、４
６ｍ 移動相：２回蒸留した蒸留水と一諸の濃ＨｓＫ）ａ（μ
２．１） 流　　量：　　２．　Ｏｄ／ｍｉｎ 圧　　カニ　〜１００ｂａｒ 波　長：２５４ｎｍ 対照物質 ａ）　ＲＮＡ用＝５′−ヌクレオチド（５’−ＣＭＰ、
　５’−ＵＭＰ、５′一層、ｓ’−ＧＭＰ　） ｂ）　ＤＮＡ用二デオキシ−５′−ヌクレオチド（ｄ−
５′−ＣＭＰＳｄ−５’−贋、ｄ−５’−ＧＭＰ。

ｄ−５’−ＴＭＰ） 動物実験調査 体重に対する腸重量の比を測定するために、４日間の予
備期間の後、ニワトリに低ビタミンで低微童元素の飼料
を与え、栄養等価のコントロールおよび試験糧食（ｔｒ
ｉａｌ　ｒａｔｉｏｎｓ）とともに９日間飼育する。こ
こで、試験期間が予備期間の直後であるかそれともより
多くまたは少なく（たとえば１〜２１日間）のコントロ
ール飼料を与える期間を試、験期間の前に置いたほうが
よいのかは、重要ではない。

実試験列の糧食には、約３１−の純タンパク　。

質（アミノ酸タンパク質）、ｔ８８ＬｓのＣａ、１．５
チのｐ、ｏ、１８％のＮａおよび０．６％Ｋが含まれて
おり、それらは等エネルギー（転換できるエネルギーに
基づいて、１４　ＭＪ／Ｋｆ）に計算されている。

コントロール糧食においては大豆タンパク質が唯一のタ
ンパク源である。ＤＬ−メチオニンおよびグリシンが必
要性をカバーするために用いられる。試験例の唯一のタ
ンパク源は細菌タンパク質である。これはＤＬ−メチオ
ニンおよびＬ−アルギニン・ＨＣｌが必要性をカバーす
るために補充される。

表１は糧食の組成の例を示すものである。

我１：　コントロールおよび試験糧食の組成（重１１コ
ントロール糧食　試験糧食 精製大豆粉　　　　　　２９２６ 細菌タンパク質　　　　　　　　　　４　Ｂ、４０ＤＬ
−メチオニン　　　　０．４５　　　０．４ＳＬ−アル
ギニン・ＨＣＬ　　　　　　　　　　　　　　α２０グ
リシン　　　　０．６５ ビタミン混合物１）　　　　　　１．００　　　　１．
００微量元素混合物２）　　　　　α１０　　　　０．
１０プロピオン酸カルシウム　　　　　ｏ、ｓｏ　　　
　　　ｏ、ｓ。

ミネラル類　　　　７．５５　　　４．８０コーンスタ
ーチ　　　　　　３１１３　　　　４１０５大　　豆　
　油　　　　　　　　７．００　　　　　３．５０１０
０．００　　１００．００ Ｄ（各試験の記載中に示され重量）、１０′ｑのビタミ
ンＥ％２Ｑのビタミンに３．４ｑのチアミン、８叩のリ
ボフラビン、２哩のピリドキシン、２０μｆのビタミン
Ｂ１２、α１ｑのビオチン、ｔ５ηの葉酸、２０ｗＩの
パントテン酸カルシウム、６０ｑのニコチン酸、１ｆの
塩化コリン、および１００１９のアスコルビン酸を１Ｏ
ｆ（糧食に当り）中に含むものである。

２）微量元素混合物は１ｆ（＝糧食２００ｆ）中に、１
００■のＦｅ、８０ＱのＺｎ、８０１１ｇの扁、１２■
のＣｕ１２．５１１ｇのＬｌｑのＣｏ、　０．５１１９
のＳｓおよび５ｍ＋１？のＦを含んでいる。

ブロイラーを金あみの上にのせて２４時間照明のかごの
中で飼う。飼料と水（かいばから与える）は自由に与え
られる。飼料は常に粒状（直径３謹）にして与えられる
。

試験変数は重量増７ＪＯ１小腸（腸の内容物を含まず）
の絶対および相対重量および長さである。

結果 それぞれの一連の試験において、細菌タンパク質（過酸
化物で処理され友ものも含む）は大豆コントロールグル
ープと比較して生体重量増加（ｌｉｖｅ　ｍａｓｓ　ｇ
ａｉｎ）の減少および小腸の重量の増加につながること
が示された。表２に結果を示す。

試験データを比較すると、細菌タンパク質（粗製または
過酸化物処理されたもの）は試験期間にわたって大豆コ
ントロール値の４９％（±１３％）まで生体重量増加が
減少させｔことが明確にわかる。相対動重量はコントロ
ールグループの値の１５２±１２１であった。

表３はヌクレアーゼで処理された細菌タンパク實のパッ
チが使用されたときの類似の値を示すものである。

ヌクレアーゼ処理されたｌａ菌タンパ゛り質と比較する
と、コントロール値の１２８±１６５にである相対動重
量はヌクレアーゼ処理されないも、のよりやや少ない範
囲の増加であることが明白になる。さらに、相対動重量
の減少が体重の増加を伴うときは、ａｍタンパク質な与
えられ九トリが常にコントロールのトリよりも著しく低
い重量であることからして、これらの違いはさらに評価
されるべきものである。

即ち、生物学的実験から生物タンパク質のヌクレアーゼ
処理はニワトリに細菌タンパク質を非常に多量に投与す
るときに現れる副効果を減少するのに適当な方法である
ことが示される。

とりわけ、小腸の重量に対して好ましい効果がある。測
定されｔ小腸の長さはヌクレアーゼ処理されない細菌タ
ンパク質の投与後ではコントロールのトリに比較してき
わめて大であり、ヌクレアーゼ処理され之細菌タンパク
質の＃Ｊ＠−のコントロール値に近いものであった。

表３；　ヌクレアーゼ処理されたａｍタンパク質の試験
結果ＴＳ＝試験開始、ＴＥ＝試験終了、ＬＭ＝生体重量
、Ｓ＝分散 次の実施例は粗製タンパク質の品質の向上を示すもので
ある。

実施例　１ メチロモナス・クララ（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ　ｃ
ｌａｒａ）（ＡＴＣＣ３１２６６）を好気的環境下、唯
一の炭素源としてメタノール、唯一の窒素源としてアン
モニア、リン酸、鉄塩およびマグネシウム塩、およびそ
の他の慣例的な微量元素（米国特許４．１６６．００４
号参照）を含む栄養溶液中で培養する。これにより生産
される細−細胞の量の濃度は分離することにより１．５
から１５１に増加した。

このペース）　１００（ｌを５５Ｃになるまでゆっくり
攪拌しながら加熱し、声をもとの６．９から５．１まで
硫酸を使用して変え、１哩のヌクレアーゼ（アマノＲＰ
　８　）　（Ａｍａｎｏ　ＲＰ８　）を１０ｍの水に溶
解させたものを加えた。

−と温度を一定に保ちながら、核酸の加水分解を４時間
かけて行い、生成したモノマーの５′−ヌクレオチドの
含有量を高圧液体クロマトグラフィーにて測定した。反
応は実際上３．５時間後に完了し、即ち、使用されるバ
イオマス（１５０ｔ）中の５１−ヌクレオチドの含有量
（重量９６）はバイオマス中の大分子の核酸の含有量（
１２，６重量％）に実際上質量的に（９６％）対応する
ものである。

それから水酸化ナトリウムにて−を６．５に調整し、攪
拌を８０℃にて１０分間続け、このようにして得られた
バイオプロティンを乾燥した。

実施例　２ 実施例１と同様の方法が行なわれるが、Ｏ，ＯＳ真２の
ホスホジエステラーセ（クロタルス・トリサス（Ｃｒｏ
ｔ、ａｌｕｓ　ｄｕｒｉａｓｕａ）から得られるもので
、べ−リンガ−・マンハイム社により販売されるＥＣ３
，１，４，１）が使用される。加水分解された遊離の５
′−ヌクレオチドの収率は８９％であった。

実施例　３ 実施例１と同様の方法が行なわれるが、０．１５婁１の
ヌクレアーゼＰ１　（Ｓｉｇｍａにより販売され、ペニ
シリウム・シトリナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍｃｉｔ
ｒｉｎｕｍ）から）が使用される。３．５時間の加水分
解の後の収率は９７チであった。

実施例　４ 実施例１と同様の方法が行なわれるが、１０ｆの麦芽（
ｗｈｅａｔ　５ｐｒｏｕｔ）が粗製ヌクレアーゼ調製物
として使用された。３，５時間後の５′−ヌクレオチド
収＊ｒ！７８％であった。

実施例　５ 実施例４と同様の方法が行なわれるが、粗製＃累インキ
エベーション時間は５時間とする。

５′−ヌクレオチドの収率は９４％であった。

実施例　６ バイオマスの調製は実施例１と同様に行なわれるが、粗
製バイオプロティンは分離後、８５Ｃにて１０分間加熱
し、５５Ｃまで冷やして０．０５ｇ＋９のヌクレアーゼ
ＲＰ８（アマノ）を加え友。

２時間の加水分解の後の５１−ヌクレオチドの収率は９
７チであった。

実施例　７ 米国特許４，１６５，００４号に従いメチロモナス・ク
ララ（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ　ｃｌａｒａ）　（Ａ
ＴＣＣ３１２６６）の連続発酵ののち、バイオマスな３
０重量ｓｔで＃に縮し粉霧乾燥して得られた１５にの乾
燥生成物（残存水分４．５俤、核故含有ｔ　１１．８＊
、ただし乾物に対して）を８５リツトルの水に懸濁させ
、＋７１酸で…を６．８から５．４に合わせて、温度を
５５０まで上げ、１０−の水に溶かした１５０ｑのヌク
レアーゼ（Ｓｉｇｍａ、　ＥＣ！、１．３０．１　）を
加え念。

−と温度を制御しながら（ｐＨｓ、４．５５℃）、混合
物を３時間攪拌し、−を水酸化ナトリウム溶液で６５に
合わせ、懸濁液を９５℃にて粉勝乾燥した。加水分解か
らの遊離の５′−ヌクレオチドの収率は高圧液体クロマ
トグラフィーで測定すると９７％であった。

実−施例　８ 実施例７の方法が行なわれるが、脂質は１５〜の乾燥粗
製バイオプロティ／から米国特許４．２０６，２４３号
、実施例１の方法により抽出され、１３に４Ｉの脱脂バ
イオプロティンの残存量を実施例７０条件下にて７５■
のヌクレアーゼ（Ｓｉｇｍａ）にて処理した。加水分解
からの遊離５′−ヌクレオチドの収＊ｆ１９９％であっ
た。

実施例　９ 酵母カンジダ・リボリティカ（Ｃａｎｄｉｄａ　ｌｉｐ
ｏｌｙ−ｔｉｃａ）　（ＡＴＣｏ　２０３８３）の炭水
化物使用菌株を水性栄養培地およびｔＲ素金含有ガス存
在下にてｎｏ−パラフィンで培養する（米国特許４，２
０６．２４５号、実施例８）。酵母菌体の塊りを栄養溶
液から分離して乾燥させると、乾物に対する核酸含有量
は１９％であった。

該乾物１５０ｔを５５Ｃにて８５０−の水に懸濁させ、
リン酸にて−を５．５に甘わせ、混合物を６ｑのヌクレ
アーゼ（Ａｍａｎｏ　ＲＰ　８）とともに４時間、攪拌
しながらおよび−と温度を一定に保ちながらインキュベ
ートする。それから温度を１０分間９０℃にまで上げて
、水酸化ナトリウム溶液にて−を６．５に会わせ、混合
物を乾燥させた。

加水分解からの５′−ヌクレオチドの収率は９１チであ
った。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）高分子量の核酸がヌクレアーゼで処理されることに
   より開裂されている核酸の富化された粗製タンパク質の
   動物用栄養飼料としての用途。 ２）粗製タンパク質が微生物タンパク質である特許請求
   の範囲第１項に記載の用途。 ３）粗製タンパク質が単細胞タンパク質である特許請求
   の範囲第１または２項に記載の方法。 ４）粗製タンパク質が酵母タンパク質または細菌タンパ
   ク質である上記特許請求の範囲の１つまたはそれ以上の
   項に記載の用途。 ５）粗製タンパク質がメチロモナス・クララ（Ｍ．ｃｌ
   ａｒａ）ＡＴＣＣ３１２２６からの単離物質である上記
   特許請求の範囲の１つまたはそれ以上の項に記載の用途
   。 ６）単離物質が、有機溶媒の重量に対して３０％より多
   くない水を含んでいるような低級アルカノール中のアン
   モニアの溶液、低級グリコール中のアンモニアの溶液、
   または低級アルカノールと低級グリコールのエステル中
   のアンモニアの溶液により脱脂されたものである特許請
   求の範囲第５項に記載の用途。 ７）ヌクレアーゼが３′−または５′−ホスホジエステ
   ラーゼである上記特許請求の範囲の１つまたはそれ以上
   の項に記載の用途。 ８）開裂が、３０から６０℃、ｐＨ４．５から６．５、
   酵素濃度が基質の重量に対して０．１から０．００５％
   、および核酸の濃度が０．０５から１０重量％の条件で
   行なわれる上記特許請求の範囲の１つまたはそれ以上の
   項に記載の用途。 ９）開裂が、４５から５５℃、ｐＨが５から６の範囲、
   酵素濃度が基質の重量に対して０．０１から０．００１
   ％、および核酸の濃度が０．３から７重量％の条件で行
   なわれる特許請求の範囲第８項に記載の用途。 １０）核酸がモノヌクレオチドの段階まで開裂される上
   記特許請求の範囲の１つまたはそれ以上の項に記載の用
   途。