JPS6041482A - 新規な熱安定性の耐酸性α−アミラーゼおよびその製造法 - Google Patents
新規な熱安定性の耐酸性α−アミラーゼおよびその製造法Info
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- JPS6041482A JPS6041482A JP59144578A JP14457884A JPS6041482A JP S6041482 A JPS6041482 A JP S6041482A JP 59144578 A JP59144578 A JP 59144578A JP 14457884 A JP14457884 A JP 14457884A JP S6041482 A JPS6041482 A JP S6041482A
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
- C12N9/2405—Glucanases
- C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
- C12N9/2411—Amylases
- C12N9/2414—Alpha-amylase (3.2.1.1.)
- C12N9/2417—Alpha-amylase (3.2.1.1.) from microbiological source
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- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は低いpJ−Iで澱粉を加水分解するのに有用な
新規々α−アミラーゼ、および嫌気性醗酵でのクロスト
リジウム(C1osLridiutn’)属の(重(s
pecies’)の微生物による該α−アミラーゼのM
造法に関する。
新規々α−アミラーゼ、および嫌気性醗酵でのクロスト
リジウム(C1osLridiutn’)属の(重(s
pecies’)の微生物による該α−アミラーゼのM
造法に関する。
大量のグルコース含有シラツブがコーンスターチの酵素
的加水分解により製造されている。
的加水分解により製造されている。
これは一般に2段階で実施される。第1段階では、澱粉
は6と7の間のp■■でα−アミラーゼ酵素での処理で
液化される。ついで、この液化された澱粉tよ4と4.
5の間のpHで作用するグルコアミラーゼ酵素により糖
化される。
は6と7の間のp■■でα−アミラーゼ酵素での処理で
液化される。ついで、この液化された澱粉tよ4と4.
5の間のpHで作用するグルコアミラーゼ酵素により糖
化される。
澱粉の加水分解における第1段階に対し現在用いられて
いる主なα−アミラーゼは、バチルス、サブチリス(1
3acillus 5ubtilis)、バチルス・リ
ケニホルミス(Bacillus lichenifo
rmis)、およびバチルスψステアロザーモフイラス
(13acillus stearothermoph
ilus’)よシ生産される細菌α−アミラーゼである
。これらのα−アミラーゼは、pH6以上の浴液中では
比較的熱安定性であるが、より低いpHではこのよう々
熱安定性を示さない。
いる主なα−アミラーゼは、バチルス、サブチリス(1
3acillus 5ubtilis)、バチルス・リ
ケニホルミス(Bacillus lichenifo
rmis)、およびバチルスψステアロザーモフイラス
(13acillus stearothermoph
ilus’)よシ生産される細菌α−アミラーゼである
。これらのα−アミラーゼは、pH6以上の浴液中では
比較的熱安定性であるが、より低いpHではこのよう々
熱安定性を示さない。
現イ1用いら7しているα−アミラーゼは好気性徴′1
.物、ずkわぢ生長に酸素を要求する微生物に11.1
/l産される。嫌気性微生物により生産されるtトアミ
ラーゼについての報告はほんの少ししかない。71ob
son他[Biochem、 J、 52.671〜6
79(1952)]は、羊の第1胃に存在する2種の嫌
気性菌、クロストリジウム・ブチリクム(Clostr
idium butyricurr+’)とストレグト
コツカス(Streptococcus)から1記のよ
うなアミラーゼを分離したことを報告している。両酵素
は48±1℃の温度で最適活性を示した。
.物、ずkわぢ生長に酸素を要求する微生物に11.1
/l産される。嫌気性微生物により生産されるtトアミ
ラーゼについての報告はほんの少ししかない。71ob
son他[Biochem、 J、 52.671〜6
79(1952)]は、羊の第1胃に存在する2種の嫌
気性菌、クロストリジウム・ブチリクム(Clostr
idium butyricurr+’)とストレグト
コツカス(Streptococcus)から1記のよ
うなアミラーゼを分離したことを報告している。両酵素
は48±1℃の温度で最適活性を示した。
11o cl<en石市他(Biocbem、 J 、
、 39.102−106(1945):)は、嫌気性
菌であるクロストリジウム・アセ]・ブチリクツ、(C
IosLridium acetobutylicum
)が寸だα−アミラーゼを生産することを見い出してい
る。この酵素は、部分的に精製されたものであるが、4
.8という最適i1Hヲ示し、そして澱粉を完全にマル
ト−スに変換した。後に、Ensley他[J、 Ge
n、 Appl、 Microbiol、。
、 39.102−106(1945):)は、嫌気性
菌であるクロストリジウム・アセ]・ブチリクツ、(C
IosLridium acetobutylicum
)が寸だα−アミラーゼを生産することを見い出してい
る。この酵素は、部分的に精製されたものであるが、4
.8という最適i1Hヲ示し、そして澱粉を完全にマル
ト−スに変換した。後に、Ensley他[J、 Ge
n、 Appl、 Microbiol、。
21、5l−59(1975):]は、この酵素の製造
について研究し、そして培地中に澱粉を存在させること
によってこの酵素が誘導されることを見す出している。
について研究し、そして培地中に澱粉を存在させること
によってこの酵素が誘導されることを見す出している。
残存した酵素の約40%が細胞と結合したものであった
。これらの酵素はよシ高い温度において感知し得る程度
の安定性を示さなかった。
。これらの酵素はよシ高い温度において感知し得る程度
の安定性を示さなかった。
同じ反応混合物において、同時に液化工程と糖化工程を
実施することにより澱粉を加水分解することが望ましb
ことである。このことは、もしも4と4.5の間のpi
−Iで澱粉を加水分解するα−アミラーゼを手に入れる
ことができれば、グルコアミラーゼが活性である場合に
達成されることができる。さらに、反応速度が十分に速
くて有用である温度で加水分解反応が行なわれることを
可能にするためには、α−アミラーゼはこのpHにおい
て十分に熱安定性で々ければならない。
実施することにより澱粉を加水分解することが望ましb
ことである。このことは、もしも4と4.5の間のpi
−Iで澱粉を加水分解するα−アミラーゼを手に入れる
ことができれば、グルコアミラーゼが活性である場合に
達成されることができる。さらに、反応速度が十分に速
くて有用である温度で加水分解反応が行なわれることを
可能にするためには、α−アミラーゼはこのpHにおい
て十分に熱安定性で々ければならない。
本発明者等は、嫌気性醗酵にょシ生産される、上記要求
に応するα−アミラーゼを発見したので イある。
に応するα−アミラーゼを発見したので イある。
本発明によれば、クロストリジウムSP、 (Clos
tridium ]Sly、 )ATCC89251、
ATCC39252、その変異株、またはQ゛−アミラ
ーゼ酵素の製造を暗号づける遺伝情報を上記クロストリ
ジウムSP微生物よりとり込む微生物からなる群より選
ばれる微生物から誘導され/こ0−アミラーゼ酵素が提
供される。
tridium ]Sly、 )ATCC89251、
ATCC39252、その変異株、またはQ゛−アミラ
ーゼ酵素の製造を暗号づける遺伝情報を上記クロストリ
ジウムSP微生物よりとり込む微生物からなる群より選
ばれる微生物から誘導され/こ0−アミラーゼ酵素が提
供される。
また、本発明によれば、クロストリジウムSP。
ATCC89251、ATCC89252、その変異株
、またはα−アミラーゼ酵素の製造を暗号づける遺伝情
報をL把りロストリジウムSP、微生物よりとり込む微
生物からなる?71よシ微生物を選び、この選んだ微′
1三物の細胞を栄養培地に培養し、この培地からα−ア
ミラーゼを分離することよりなるlレアミラーゼ酵素の
製造法が提供される。
、またはα−アミラーゼ酵素の製造を暗号づける遺伝情
報をL把りロストリジウムSP、微生物よりとり込む微
生物からなる?71よシ微生物を選び、この選んだ微′
1三物の細胞を栄養培地に培養し、この培地からα−ア
ミラーゼを分離することよりなるlレアミラーゼ酵素の
製造法が提供される。
さらに、本発明によれば、澱粉を加水分解する方法が提
供される。この方法は、澱粉の水性スラリーまたは溶液
を、本発明のα−アミラーゼで3.5〜7.0のpHに
おいて澱粉加水分解物の溶液がトするのに十分々時間処
理することよりなる。
供される。この方法は、澱粉の水性スラリーまたは溶液
を、本発明のα−アミラーゼで3.5〜7.0のpHに
おいて澱粉加水分解物の溶液がトするのに十分々時間処
理することよりなる。
本発明のα−アミラーゼは、ンヨージア大学のしars
G、 Ljungdabl博士およびその協同研究者
等にLリアイスランドのHveragerdiの泥温泉
から分離されたクロストリジウムの2つの新らしい菌株
により生産される。これらの菌株はダラム陽性で、胞子
を形成し、耐熱性で嫌気性の細菌である。Ljungd
ahl博士は、これらの菌株に対し、クロストリジウム
・サーモアミロリテイクム(C1ostri市Llll
lthermoamylolyticumlという名を
与えたOそしてこれらの菌株は、クロストリジウム81
)、 ATCC39251、、kよびATCC3925
2としてアメリカン・タイプ・カルチュア・コレクショ
y (American ’l”ype Cu1tur
eCollection)から−、般に自由に手に入れ
ることができる。
G、 Ljungdabl博士およびその協同研究者
等にLリアイスランドのHveragerdiの泥温泉
から分離されたクロストリジウムの2つの新らしい菌株
により生産される。これらの菌株はダラム陽性で、胞子
を形成し、耐熱性で嫌気性の細菌である。Ljungd
ahl博士は、これらの菌株に対し、クロストリジウム
・サーモアミロリテイクム(C1ostri市Llll
lthermoamylolyticumlという名を
与えたOそしてこれらの菌株は、クロストリジウム81
)、 ATCC39251、、kよびATCC3925
2としてアメリカン・タイプ・カルチュア・コレクショ
y (American ’l”ype Cu1tur
eCollection)から−、般に自由に手に入れ
ることができる。
本発明のα−アミラーゼの製造に対し用いらIシる微生
物は、炭水化物源としてEJ溶性澱粉まだはマルトデキ
ストリン、酵(iJエキス、これに加えてビタミン溶液
卦よびミネラル浴液を含准する培地中で嫌気性条件下に
培養される。培地中のマル1゛−スおよびマル) トI
Jオースの存論三は生成されるα−アミラーゼの量を増
加するが、培地中ノクルコースはα−アミラーゼの生成
全阻害する。α−アミラーゼの生産に対する醗酵用培地
の最適pi(は、菌株ATCC89251にとっては約
6であり、121」株ATCC39252にとっては約
7である。
物は、炭水化物源としてEJ溶性澱粉まだはマルトデキ
ストリン、酵(iJエキス、これに加えてビタミン溶液
卦よびミネラル浴液を含准する培地中で嫌気性条件下に
培養される。培地中のマル1゛−スおよびマル) トI
Jオースの存論三は生成されるα−アミラーゼの量を増
加するが、培地中ノクルコースはα−アミラーゼの生成
全阻害する。α−アミラーゼの生産に対する醗酵用培地
の最適pi(は、菌株ATCC89251にとっては約
6であり、121」株ATCC39252にとっては約
7である。
こItらの微生物によって生産されるα−アミラーゼは
醗酵培地中に分泌された1、微生物411胞の超音波処
理は追加的な酵素をjl+’(放することができなかっ
た。このことは、このn−j’ミラーゼ酵素が細胞外酵
素であることを〕」<す。
醗酵培地中に分泌された1、微生物411胞の超音波処
理は追加的な酵素をjl+’(放することができなかっ
た。このことは、このn−j’ミラーゼ酵素が細胞外酵
素であることを〕」<す。
醗jl+lj培地から細胞を除去し、ついで塩化力ルシ
ウノ・で異物質を沈澱させることによりα−アミラービ
酵素は精製された。酵素溶液は濃縮さit、さらに粒状
澱粉へのアミラーゼの吸着によりA″゛製された。この
部分的に精製されプこアミラーゼQ、L澱粉から分離さ
れ、さらにウルトゲル([lt+“Ogel)カラムで
のクロマトグラフィーにより精製さitだ。この精製さ
れた酵素は、ナ1. +4ウムト゛デ/ルザルフエート
(SDS)ポリアクリルアミ ドゲル1L気体動により
測定すると、75000±3000の分イー1■:、を
もった。
ウノ・で異物質を沈澱させることによりα−アミラービ
酵素は精製された。酵素溶液は濃縮さit、さらに粒状
澱粉へのアミラーゼの吸着によりA″゛製された。この
部分的に精製されプこアミラーゼQ、L澱粉から分離さ
れ、さらにウルトゲル([lt+“Ogel)カラムで
のクロマトグラフィーにより精製さitだ。この精製さ
れた酵素は、ナ1. +4ウムト゛デ/ルザルフエート
(SDS)ポリアクリルアミ ドゲル1L気体動により
測定すると、75000±3000の分イー1■:、を
もった。
以下のα−アミラーゼ酵素の製造および性質の記載にお
いて、すべて部および%は、特に指ノJ、しない限り、
重量部および重量%である。
いて、すべて部および%は、特に指ノJ、しない限り、
重量部および重量%である。
α−アミラーゼの検定
分析さJしるべき溶液は0.0025Mの塩化カルシウ
ム溶液で希釈してmlあたり約0.25単位の活性の最
終濃度にする。適当に希釈した酵素溶液の1mlを、0
.03Mの酢酸緩衝液(pH6,0)および0.03M
の塩化カルシウムを含有する1%可溶性澱粉溶液10m
dに添加する。60℃で10分間反応を実施する。反応
溶液1+nlを、0.02Nの塩酸50mA’を入れた
100meの月盛りつきフラスコに注入し、これに0.
05%沃素溶液3 mlを添加した後、水を加えて全容
量を100m1にする。発色する青色を6201皿にお
ける吸収で測定する。1分間にlQmg/澱粉を分11
1!Nするに要する酵素の量が1単位と定義される。
ム溶液で希釈してmlあたり約0.25単位の活性の最
終濃度にする。適当に希釈した酵素溶液の1mlを、0
.03Mの酢酸緩衝液(pH6,0)および0.03M
の塩化カルシウムを含有する1%可溶性澱粉溶液10m
dに添加する。60℃で10分間反応を実施する。反応
溶液1+nlを、0.02Nの塩酸50mA’を入れた
100meの月盛りつきフラスコに注入し、これに0.
05%沃素溶液3 mlを添加した後、水を加えて全容
量を100m1にする。発色する青色を6201皿にお
ける吸収で測定する。1分間にlQmg/澱粉を分11
1!Nするに要する酵素の量が1単位と定義される。
上記の式において、
D。一対照溶液(酵素溶液の代りに水が添加される)の
吸収 Ds−反応溶液の吸収 α−アミラーゼの製造 1ll(II Ili・L外α−アミラーゼ酵素調製物
はり[1ストリジウムS1)、A’えC39251およ
びATCC39252の2つの菌株からイ;)られだ。
吸収 Ds−反応溶液の吸収 α−アミラーゼの製造 1ll(II Ili・L外α−アミラーゼ酵素調製物
はり[1ストリジウムS1)、A’えC39251およ
びATCC39252の2つの菌株からイ;)られだ。
培地の調製および試料の培養は、1969年ニュ〜ヨー
久のアカデミツク・プレス(Academic l’r
css’)発行、J、 R,Norrisおよびり、W
、 Ribbons 41晶、[微イJE4勿q:に卦
ける方法(lVlcLbods inMicrobio
logy)J Vol、 3B、 p、 117〜13
2のIlungatc、 lζE、による[給体的嫌気
性菌の試験管回転培養法(A I(all ’l’ub
e 1Vletbod for Cu1Livatio
n of 3trictAnaerobcs )jに記
載された、寸だMillerおよびWolinによりA
ppl、Microbiol、 27.985(197
4)に記載さノしたような4°°、°コ準の嫌気性菌の
技術を使用することにより実h10された。
久のアカデミツク・プレス(Academic l’r
css’)発行、J、 R,Norrisおよびり、W
、 Ribbons 41晶、[微イJE4勿q:に卦
ける方法(lVlcLbods inMicrobio
logy)J Vol、 3B、 p、 117〜13
2のIlungatc、 lζE、による[給体的嫌気
性菌の試験管回転培養法(A I(all ’l’ub
e 1Vletbod for Cu1Livatio
n of 3trictAnaerobcs )jに記
載された、寸だMillerおよびWolinによりA
ppl、Microbiol、 27.985(197
4)に記載さノしたような4°°、°コ準の嫌気性菌の
技術を使用することにより実h10された。
接!!ト物を製造し、そして微生物の保存培養物を糾]
、1するために用いられる培地は次の組成をもつもので
あった。
、1するために用いられる培地は次の組成をもつもので
あった。
接種物用培地
成分 濃度(g/6)
澱粉(リンドナー)
KH2PO4’ 1.5
NH,+ Cll 0.5
Na2I−11−’04 ・l 2H204,2MgC
1120,18 酵母エキス 2゜ ビタミン溶液 0.5 ml/l ミネラル溶液 5o mlA レザズリン(o、1%) 1 ml/l還元溶液 4o
mlA ビタミン溶液 ビタミン mgA ビオチン 2 葉酸 2 ピリドキシン@1−LCl 10 リボフラビン 5 チアミン・l−ICd 5 ニコチン酸 5 パントテン酸 5 B12 Q’、l ]〕−アミノ安息香酸 5 チオクト酸 5 還元溶液 成分 量 Na01((0,2N) 200 m1JNa2S49
H202,5g ンステインHCl−1−1zO2,5gミネラル溶液 成分 ’ng/ 100m6 ニトリロトり酢酸 1500 MgSO4・74−1z O8000 1VりllSO4・I−L20 50ONaCe 10
00 FeSO4・71120100 CO(NO3’)2 ・6HzO100CaCdz 1
00 ZnSO,+ ・71(20100 1惺/?(SO4)2. 10 ji3BO31O Na10Na2拳2■−■20 1゜ Na 2 S e O:(1 生存可能な細胞は接種用培地で室温に卦いて無期限に維
持されることができる。酵素の製造に対し微生物を増殖
するには、殺菌した接種用培地に細胞が接種され、嫌気
性条件下に56℃でほぼ30時間培養が行々われだ。こ
れにより迅速に増殖する。t+lII胞が生産され、こ
のものは発酵槽に接種するのに用いられた。接種物の容
量は発酵槽中の”4 !Arl培地の容量の1〜5%で
あった・この培地は次の組成をもつものであった。
1120,18 酵母エキス 2゜ ビタミン溶液 0.5 ml/l ミネラル溶液 5o mlA レザズリン(o、1%) 1 ml/l還元溶液 4o
mlA ビタミン溶液 ビタミン mgA ビオチン 2 葉酸 2 ピリドキシン@1−LCl 10 リボフラビン 5 チアミン・l−ICd 5 ニコチン酸 5 パントテン酸 5 B12 Q’、l ]〕−アミノ安息香酸 5 チオクト酸 5 還元溶液 成分 量 Na01((0,2N) 200 m1JNa2S49
H202,5g ンステインHCl−1−1zO2,5gミネラル溶液 成分 ’ng/ 100m6 ニトリロトり酢酸 1500 MgSO4・74−1z O8000 1VりllSO4・I−L20 50ONaCe 10
00 FeSO4・71120100 CO(NO3’)2 ・6HzO100CaCdz 1
00 ZnSO,+ ・71(20100 1惺/?(SO4)2. 10 ji3BO31O Na10Na2拳2■−■20 1゜ Na 2 S e O:(1 生存可能な細胞は接種用培地で室温に卦いて無期限に維
持されることができる。酵素の製造に対し微生物を増殖
するには、殺菌した接種用培地に細胞が接種され、嫌気
性条件下に56℃でほぼ30時間培養が行々われだ。こ
れにより迅速に増殖する。t+lII胞が生産され、こ
のものは発酵槽に接種するのに用いられた。接種物の容
量は発酵槽中の”4 !Arl培地の容量の1〜5%で
あった・この培地は次の組成をもつものであった。
増殖培地
g/ 100m6
a)
マルトリン(Malti−1oMO01グ・)・(PR
OIi’LO)b) ブリメックx (prymex)c)IMgSO,+
@7H200,5 CaC/?z ・2H200,06 MnC1z ・2H200,001 1(J−12PO40,13 (NH,) 2HJ)041 a) フイオワ州のMuscatineのグレイン・ブ
ロセスイング・カンパニイ(Grain Proccs
sing Company)より手に入れることができ
る10デギストロース・エクイバレ71へ澱粉加水分解
物 b)、テキザス州のli”ort Wortbのトレダ
ース・オイル・ミル拳カンバニイ(Tl′aders
Oil Mill (:ompany)より手に入れる
ことができる綿実粉 C)ウィスコンシン州のMilwaukeeのアムバー
中うボラトリーズ(A+nber I、aborato
rics’)より手に入れることができる酵母エキス 培地のpI−1は、出発菌株がAT、CC39251の
とき(lS1Gに調整された。このpHは、出発菌株が
/V1.”CC39252のときは7に調整された。酵
素の製造ば10/I’の培地を用いた141の発酵槽中
で行なわれた。細胞外0=アミラーゼの収量は発酵ブロ
スの1]】lあたり0.5〜3単位であった。細胞の超
音波処理は追加的な酵素を解放することができず、この
ことは、この酵素が全く細胞外酵素であることを示した
。
OIi’LO)b) ブリメックx (prymex)c)IMgSO,+
@7H200,5 CaC/?z ・2H200,06 MnC1z ・2H200,001 1(J−12PO40,13 (NH,) 2HJ)041 a) フイオワ州のMuscatineのグレイン・ブ
ロセスイング・カンパニイ(Grain Proccs
sing Company)より手に入れることができ
る10デギストロース・エクイバレ71へ澱粉加水分解
物 b)、テキザス州のli”ort Wortbのトレダ
ース・オイル・ミル拳カンバニイ(Tl′aders
Oil Mill (:ompany)より手に入れる
ことができる綿実粉 C)ウィスコンシン州のMilwaukeeのアムバー
中うボラトリーズ(A+nber I、aborato
rics’)より手に入れることができる酵母エキス 培地のpI−1は、出発菌株がAT、CC39251の
とき(lS1Gに調整された。このpHは、出発菌株が
/V1.”CC39252のときは7に調整された。酵
素の製造ば10/I’の培地を用いた141の発酵槽中
で行なわれた。細胞外0=アミラーゼの収量は発酵ブロ
スの1]】lあたり0.5〜3単位であった。細胞の超
音波処理は追加的な酵素を解放することができず、この
ことは、この酵素が全く細胞外酵素であることを示した
。
酵素の精製
粗製α−アミラーゼは次の手順により精製された。醗酵
ブロスは第1にガラスウールを通して濾過され、ゴム様
の不溶性物質が除去された。
ブロスは第1にガラスウールを通して濾過され、ゴム様
の不溶性物質が除去された。
ついで、シャープレスの連続渦巻型遠心分離機モデル7
41−24/ 8R4Cペンシルバニア州のphila
delphiaのシャープvスーーi−ボv −ジョン
(Sharples Corp、 ’))で45ボンド
圧力で操作することにより1>液から細胞が除去された
。清澄な上澄液に、約1.5%W/Vの最終濃度になる
に十分な塩化カルシウムが添加され、そして混合物は1
0分間攪拌された。かさばった沈澱物は濾過により除去
され、廃棄された。ついで、清澄な琥珀色の?lv液は
、マザチュセソソ州(7)Danvers (D アミ
コン・コーポレーシヨン(7unicon Corp、
)より手に入れることのできるアミコン中空繊維(■
IP−10)濃縮機タイプAC2により濃縮された。濃
縮は容量が500m6とiooomgO間になるまで行
なわれ、ついでpHを6にするために濃厚な水酸化アン
モニウムが添加された。この水酸化アンモニウムの添加
は第2の沈澱を形成させ、 ゛この沈澱物は濾過により
除去された。濃縮された濾液は、さらに50mMの酢酸
ナトリウムおよび5mMのCa+1−を含有する酢酸ナ
トリウム緩衝液(p)I6’)で平衡にされた粒状澱粉
で処理することにより精製された。1gの澱粉が酵素の
300単位ごとに使用されん。澱粉と酵素溶液の混合物
は室温で60分間卦だやかに攪拌され、ついで固体が真
空濾過により集められた。結合したα−アミラーゼを含
有する澱粉ケーキは小量の氷で冷却した酢酸ナトリウム
緩衝液に再懸濁され、短時間の攪拌後に+ITび4v過
された。この洗滌操作は冷酢酸すトす1クム緩衝液で3
回繰返された。洗滌された澱粉ケーキは新鮮な酢酸ナト
リウム緩衝液に!跡濁さJし、時々攪拌したから60分
間60℃に保温された。この期間中、吸着されたα−ア
ミラーゼは、澱粉を十分に加水分解して溶液中に解放さ
せる。
41−24/ 8R4Cペンシルバニア州のphila
delphiaのシャープvスーーi−ボv −ジョン
(Sharples Corp、 ’))で45ボンド
圧力で操作することにより1>液から細胞が除去された
。清澄な上澄液に、約1.5%W/Vの最終濃度になる
に十分な塩化カルシウムが添加され、そして混合物は1
0分間攪拌された。かさばった沈澱物は濾過により除去
され、廃棄された。ついで、清澄な琥珀色の?lv液は
、マザチュセソソ州(7)Danvers (D アミ
コン・コーポレーシヨン(7unicon Corp、
)より手に入れることのできるアミコン中空繊維(■
IP−10)濃縮機タイプAC2により濃縮された。濃
縮は容量が500m6とiooomgO間になるまで行
なわれ、ついでpHを6にするために濃厚な水酸化アン
モニウムが添加された。この水酸化アンモニウムの添加
は第2の沈澱を形成させ、 ゛この沈澱物は濾過により
除去された。濃縮された濾液は、さらに50mMの酢酸
ナトリウムおよび5mMのCa+1−を含有する酢酸ナ
トリウム緩衝液(p)I6’)で平衡にされた粒状澱粉
で処理することにより精製された。1gの澱粉が酵素の
300単位ごとに使用されん。澱粉と酵素溶液の混合物
は室温で60分間卦だやかに攪拌され、ついで固体が真
空濾過により集められた。結合したα−アミラーゼを含
有する澱粉ケーキは小量の氷で冷却した酢酸ナトリウム
緩衝液に再懸濁され、短時間の攪拌後に+ITび4v過
された。この洗滌操作は冷酢酸すトす1クム緩衝液で3
回繰返された。洗滌された澱粉ケーキは新鮮な酢酸ナト
リウム緩衝液に!跡濁さJし、時々攪拌したから60分
間60℃に保温された。この期間中、吸着されたα−ア
ミラーゼは、澱粉を十分に加水分解して溶液中に解放さ
せる。
つぎに、混合物は濾過され、そしてα−アミラーゼ酵素
を含有する無色の濾液は、10000M、rカットのY
M 10膜を備えだアミコン限外濾過セル〔アミコ/−
j−ポL/−ショy(Amicon Corp、’)、
Danvers、 マザチュー七ソツ州〕により約3
m6の容量に濃縮された。この混合物は10000 X
gで10分間遠心分離することにより清澄にされ、1
00I〕IMのNaCl卦よび5n1MのCa+を含有
する50mMの酢酸ナトリウム緩衝液で予め平衡にされ
たアクリルアミドアガロースゲル。
を含有する無色の濾液は、10000M、rカットのY
M 10膜を備えだアミコン限外濾過セル〔アミコ/−
j−ポL/−ショy(Amicon Corp、’)、
Danvers、 マザチュー七ソツ州〕により約3
m6の容量に濃縮された。この混合物は10000 X
gで10分間遠心分離することにより清澄にされ、1
00I〕IMのNaCl卦よび5n1MのCa+を含有
する50mMの酢酸ナトリウム緩衝液で予め平衡にされ
たアクリルアミドアガロースゲル。
ウルトロゲル(Ultrogel)A、qA54D、K
Bグロダククー(Pi−oducter)AB、 Br
onuna、スエーデン〕の1.5 X 85 cm
カラムの上に装填された。このカラムは同じM 衝Qで
16111d/時間の流量割合で溶出されゾζ。3 m
lのフラクションが集められ、そしてα−アミラーゼ活
性に対するチェックが行々われだ。酵素活性を含有する
フラクションが一緒され、そして冷蔵庫中に貯蔵された
。これらの蛋白質含量は、標準として牛の血清アルブミ
ンを用いる]、owry他の方法CJ、 Biol、
Cbem、 198265−275(1951’)〕に
より測定され/こ。2つの酵素試料に対する精製工程の
結果は第1表および第■表に示される。これらの結果は
、精製したα−アミラーゼ回、蛋白mgあたり70酵素
単位と80酵素単位の間の特別々活性をもつことを示す
。
Bグロダククー(Pi−oducter)AB、 Br
onuna、スエーデン〕の1.5 X 85 cm
カラムの上に装填された。このカラムは同じM 衝Qで
16111d/時間の流量割合で溶出されゾζ。3 m
lのフラクションが集められ、そしてα−アミラーゼ活
性に対するチェックが行々われだ。酵素活性を含有する
フラクションが一緒され、そして冷蔵庫中に貯蔵された
。これらの蛋白質含量は、標準として牛の血清アルブミ
ンを用いる]、owry他の方法CJ、 Biol、
Cbem、 198265−275(1951’)〕に
より測定され/こ。2つの酵素試料に対する精製工程の
結果は第1表および第■表に示される。これらの結果は
、精製したα−アミラーゼ回、蛋白mgあたり70酵素
単位と80酵素単位の間の特別々活性をもつことを示す
。
第1表
ATCC39251からのα−アミラーゼの精製醗酵ブ
r1ス 6485 0.7−100澱粉親和性 120
16.35 33.03 43.3第■表 八TCC89252からのa−アミラーゼの精製hy酵
ブ■]ス 6920 2.69 −− 100澱粉親A
I+1性 100 77.4 41.6ウルトロゲルA
CA 54 カラム 70 87.2 78,8 32.8酵素の分
子量 精製したα−アミラーゼは、ポリアクリルアミドゲル電
気泳動させたときに単一の蛋白バンドとして移動により
均一であることが決定された。
r1ス 6485 0.7−100澱粉親和性 120
16.35 33.03 43.3第■表 八TCC89252からのa−アミラーゼの精製hy酵
ブ■]ス 6920 2.69 −− 100澱粉親A
I+1性 100 77.4 41.6ウルトロゲルA
CA 54 カラム 70 87.2 78,8 32.8酵素の分
子量 精製したα−アミラーゼは、ポリアクリルアミドゲル電
気泳動させたときに単一の蛋白バンドとして移動により
均一であることが決定された。
この酵素の分子量は、Laenunli U、 K、、
Nature、 227゜680−685(1970
)K He 載(7) 方法K J、 I) SDS
ホIJ 7 りlJル了ミドゲル電気泳動により測定さ
れた。このα−アミラーゼの移動度と標準蛋白の移動度
を比較することにより、この酵素に対しては75000
±aoo。
Nature、 227゜680−685(1970
)K He 載(7) 方法K J、 I) SDS
ホIJ 7 りlJル了ミドゲル電気泳動により測定さ
れた。このα−アミラーゼの移動度と標準蛋白の移動度
を比較することにより、この酵素に対しては75000
±aoo。
の分子H4が算出された。この分子量はバチルス・リケ
ニホルミス(B、 1iqhcniforn+is)か
ら誘導された(トアミラーゼであるザーマミル(’1.
’hcrmamyl) 60Lの精製試別に対し測定さ
れた51000の分子量よりかなり大きい。バチルス・
リケニホルミスの他の菌株から誘導されたα−アミラー
ゼであるタヵーサーム(Taka−’、l’herm)
は62000の分子1けをもっと報告されている[Cb
iang他、 1)ie 5tarke、 81.86
−92゜(1979))。
ニホルミス(B、 1iqhcniforn+is)か
ら誘導された(トアミラーゼであるザーマミル(’1.
’hcrmamyl) 60Lの精製試別に対し測定さ
れた51000の分子量よりかなり大きい。バチルス・
リケニホルミスの他の菌株から誘導されたα−アミラー
ゼであるタヵーサーム(Taka−’、l’herm)
は62000の分子1けをもっと報告されている[Cb
iang他、 1)ie 5tarke、 81.86
−92゜(1979))。
酵素の熱安定性
精製したα−アミラーゼの熱安定性が3つノ他の知られ
ているα−アミラーゼの熱安定性と比較さit フt。
ているα−アミラーゼの熱安定性と比較さit フt。
rndあだり1単位の酵素活性を含有する溶液をつくる
ために、酵素は5fTIMのCa++を含む所望のp1
■の5On+Mの酢酸緩衝液で希釈さノLだ。牛の血清
アルブミンがこの希釈溶液に添加されて約40μg/1
11の蛋白濃度とされた。この溶液はテープを巻きねじ
蓋をした小びんに入れ、60℃、80℃および90℃の
水浴中で保温された。適当な時間の間隔で(通常、1O
120,30,60、および90分)、小びんは水浴か
ら取シ出され、直接水浴中で冷却された。残存する酵素
活性が標準検定方法を用いて60℃で測定された。酵素
の半減期が回帰線により泪nされた。この結果は第1且
表に示すとおりである。そして第■表は、本発明の酵素
が、pH4,2−4,5において、バチルス・スデアロ
サーモフイラス(B、 5tearotberrnop
hilus)およびバチルス拳すケニホルミ、X(B、
licheniformis)からの耐熱性酵素よりも
ずっと大きな熱安定性をもつことを示す。本発明の酵素
はp114.2および60℃で70時間よりも大きい半
減期をもつ。
ために、酵素は5fTIMのCa++を含む所望のp1
■の5On+Mの酢酸緩衝液で希釈さノLだ。牛の血清
アルブミンがこの希釈溶液に添加されて約40μg/1
11の蛋白濃度とされた。この溶液はテープを巻きねじ
蓋をした小びんに入れ、60℃、80℃および90℃の
水浴中で保温された。適当な時間の間隔で(通常、1O
120,30,60、および90分)、小びんは水浴か
ら取シ出され、直接水浴中で冷却された。残存する酵素
活性が標準検定方法を用いて60℃で測定された。酵素
の半減期が回帰線により泪nされた。この結果は第1且
表に示すとおりである。そして第■表は、本発明の酵素
が、pH4,2−4,5において、バチルス・スデアロ
サーモフイラス(B、 5tearotberrnop
hilus)およびバチルス拳すケニホルミ、X(B、
licheniformis)からの耐熱性酵素よりも
ずっと大きな熱安定性をもつことを示す。本発明の酵素
はp114.2および60℃で70時間よりも大きい半
減期をもつ。
第1II表
α−アミラーゼの熱安定性
90℃ 80℃ 80℃ 60℃
本発明のα−アミラーゼ 115 66 20 432
0a) ザーマミル(’[”llennamyl)266 13
2.3 86ω二)a)コネチカソト州Wilton
のノボ・ラボラドリース(Nova l、aborat
ries)より手に入れることのできるバチルス・リケ
ニホルミスからのα−アミラーゼ。
0a) ザーマミル(’[”llennamyl)266 13
2.3 86ω二)a)コネチカソト州Wilton
のノボ・ラボラドリース(Nova l、aborat
ries)より手に入れることのできるバチルス・リケ
ニホルミスからのα−アミラーゼ。
b)Tamuri他、米国特許第4284722 月。
C)イリノイ州1)es plainesのGD3了−
メンティーション拳インダストリーズ(GB Ferm
entationIndustries’)より手に入
れることのできるバチルス・ザブチリス(B、 5ub
tilis)がらのα−アミラーゼ。
メンティーション拳インダストリーズ(GB Ferm
entationIndustries’)より手に入
れることのできるバチルス・ザブチリス(B、 5ub
tilis)がらのα−アミラーゼ。
酵素に関するpl(の影響
α−アミラーゼ酵素活性が、次の組成:クエン酸塩(p
H8,5)、酢酸塩(pH4〜6)、およびHEPES
(pH6,5〜7.0)の10On+Mの緩衝溶液を
用いて、基質のpHが3.5〜7.0に変えられた以外
は標私の方法により分析された。1種々のpl〜Iに赴
ける相対的活性は下記の表に示すと訃りであり、この表
はこの酵素がpl−15,0にふ・いて最高活性をもつ
ことを示す。
H8,5)、酢酸塩(pH4〜6)、およびHEPES
(pH6,5〜7.0)の10On+Mの緩衝溶液を
用いて、基質のpHが3.5〜7.0に変えられた以外
は標私の方法により分析された。1種々のpl〜Iに赴
ける相対的活性は下記の表に示すと訃りであり、この表
はこの酵素がpl−15,0にふ・いて最高活性をもつ
ことを示す。
pH最高活性の%
3.5 55.1
4.0 91.7
4.5 97.0
5・0100
5.5 92.6
6.0 86.6
6.5 77.7
?、0 59.8
酵素に対する最適温度
種々の温度およびpi(値で10分間酵素溶液を保温し
/こ後のα−アミラーゼ酵素活性を標準検定法で調べる
ことにより、精製した酵素に関する反応温度の影響が測
定された。pH6では、最適温度―、90℃より僅かに
上であった。pl(4,,5では、最高活性に対する温
度は、70℃および90℃で観察された最高活性の8(
)%をもって85℃であった。
/こ後のα−アミラーゼ酵素活性を標準検定法で調べる
ことにより、精製した酵素に関する反応温度の影響が測
定された。pH6では、最適温度―、90℃より僅かに
上であった。pl(4,,5では、最高活性に対する温
度は、70℃および90℃で観察された最高活性の8(
)%をもって85℃であった。
乾燥固体基準で20団量%の8〇−流動度の澱粉を含む
澱粉溶液に、澱粉のgあたり20単位のα−アミラーゼ
酵素が添加された。この混合物の[)11は4.5に調
整され、ついで70℃に保温さハた。加水分解された澱
粉の試別は24時間ふ・よび96時間後に取り出され、
酵素を不活性化するためにボイルされ、そして次の技術
にしたがって高性能液体クロマトグラフィーにより炭水
化物成分が分4J↑された。成分はカルシウム型のカチ
オン交換樹脂からの水での溶出によりクロマトグラフィ
ー処理された。溶出した成分は示差屈折言−(により検
出された。すべての炭水化物は電子積分器を用いて定量
された。一般的方法は、Aln、 Soc。
澱粉溶液に、澱粉のgあたり20単位のα−アミラーゼ
酵素が添加された。この混合物の[)11は4.5に調
整され、ついで70℃に保温さハた。加水分解された澱
粉の試別は24時間ふ・よび96時間後に取り出され、
酵素を不活性化するためにボイルされ、そして次の技術
にしたがって高性能液体クロマトグラフィーにより炭水
化物成分が分4J↑された。成分はカルシウム型のカチ
オン交換樹脂からの水での溶出によりクロマトグラフィ
ー処理された。溶出した成分は示差屈折言−(により検
出された。すべての炭水化物は電子積分器を用いて定量
された。一般的方法は、Aln、 Soc。
Brew、Chem、 1)roe、、 1973.
p、 43−46の“液体クロマトグラフィーによる炭
水化物混合物の分析″に記載されている方法である。使
用した樹脂は、カリフAルニア州の1く訂:]ooon
dのバイオ−ラドeラボラトリーズ(Bio−Rad
l、aboratories’)のカルシウム型の了ミ
ネソクス(AMINI艶X)50’W−X4 (20−
30μ)である。結果は沖合度(Dl))という言葉で
与えられる。すなわ“jL+、I])。
p、 43−46の“液体クロマトグラフィーによる炭
水化物混合物の分析″に記載されている方法である。使
用した樹脂は、カリフAルニア州の1く訂:]ooon
dのバイオ−ラドeラボラトリーズ(Bio−Rad
l、aboratories’)のカルシウム型の了ミ
ネソクス(AMINI艶X)50’W−X4 (20−
30μ)である。結果は沖合度(Dl))という言葉で
与えられる。すなわ“jL+、I])。
(は単)、;ljj類グルコースであり、1)J〕2は
二糖類フラクショノであり、J〕■〕3iIi三糖類フ
ラクションであり、以下同様である。炭水化物の分布は
第■表に/J’%すと」、−りである。第■表は寸た市
j仮のα−アミラーゼであるサーマミルを用いて、比+
liQしイ:)るデキスI・ロース・エクイバレット(
D、 F、、 )tD 溶Vjl k 4する条イ′1
下に、澱粉を処理することにより調製した澱粉加水分解
物の炭水化物分布も含む。これらの結果は、本発明の酵
素が、サーマミルにより調製されたものとは非常に異な
る炭水化物成分をもつ澱粉加水分解物を製造することを
示す。
二糖類フラクショノであり、J〕■〕3iIi三糖類フ
ラクションであり、以下同様である。炭水化物の分布は
第■表に/J’%すと」、−りである。第■表は寸た市
j仮のα−アミラーゼであるサーマミルを用いて、比+
liQしイ:)るデキスI・ロース・エクイバレット(
D、 F、、 )tD 溶Vjl k 4する条イ′1
下に、澱粉を処理することにより調製した澱粉加水分解
物の炭水化物分布も含む。これらの結果は、本発明の酵
素が、サーマミルにより調製されたものとは非常に異な
る炭水化物成分をもつ澱粉加水分解物を製造することを
示す。
第■表
澱粉に関するα−アミラーゼの作用
り、E、21’i、6 28.5 24 88.4 3
7.5 88DP、 5.7 5.0 2.0 10.
9 10.5 9.3DP27.8 6.9 B、5
14.1 13.7 17.0DI)35.3 5.0
13.5 17.9 17.2 16.2DP、1 7
.6 に、7 4.6 13.8 18.3 5.5D
P5 9.3 8.9 16.5 11.1 11.4
22.7DI)68.6 7.8 13.6 8.0
8.0 3.8DP7 7.4 6.6 3.9 9
.6 12 4.0I)P8+48.3 511 37
.7 14.6 19.7 22.0(注)a)24時
間の加水分解後。
7.5 88DP、 5.7 5.0 2.0 10.
9 10.5 9.3DP27.8 6.9 B、5
14.1 13.7 17.0DI)35.3 5.0
13.5 17.9 17.2 16.2DP、1 7
.6 に、7 4.6 13.8 18.3 5.5D
P5 9.3 8.9 16.5 11.1 11.4
22.7DI)68.6 7.8 13.6 8.0
8.0 3.8DP7 7.4 6.6 3.9 9
.6 12 4.0I)P8+48.3 511 37
.7 14.6 19.7 22.0(注)a)24時
間の加水分解後。
b’) 80−流動iのコーンスターチがサーマミルを
用いて、70℃、pH6,0で所定のり、 E、まで加
水分角イされた。
用いて、70℃、pH6,0で所定のり、 E、まで加
水分角イされた。
C)96時間の加水分解後。
上記の試験は、本発明により4と4,50間のpI(値
で澱粉を加水分解するα−アミラーゼ酵素が提1共され
ることを示す。さらに、このアミラーゼは、このpHに
おいて十分に熱安定性であり、反応速度が十分に速くて
有用である温度で澱粉を加水分フカするのに用いること
を可能にする。
で澱粉を加水分解するα−アミラーゼ酵素が提1共され
ることを示す。さらに、このアミラーゼは、このpHに
おいて十分に熱安定性であり、反応速度が十分に速くて
有用である温度で澱粉を加水分フカするのに用いること
を可能にする。
本発明については、その特別な具体例を用いて記載(2
だが、さらに酵素および澱粉加水分解の業vトの専問家
達にとって明白であるような改良、適用、または変化が
可能であることは理解されるべきである。
だが、さらに酵素および澱粉加水分解の業vトの専問家
達にとって明白であるような改良、適用、または変化が
可能であることは理解されるべきである。
代理人 江 崎 光 好
代理人 江 崎 光 史
第1頁の続き
[株])Int、CI、’ 識別記号 庁内整理番号0
発 明 者 ショー・ソング・ヤン アメリカ合衆国、
・グ イントロツブΦつ: イリノイ州、ダウナーズ・グローブ、つ[イ、7300
−6
発 明 者 ショー・ソング・ヤン アメリカ合衆国、
・グ イントロツブΦつ: イリノイ州、ダウナーズ・グローブ、つ[イ、7300
−6
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 (1) り0ストリジウムSp、 (Clostrid
ium 5P)ATCC39251、ATCC3925
2、その変異株、まだはα−アミラーゼ酵素の製造を暗
号づける遺伝情報を上記クロス) IJジウムSP、微
生物よりとり込む微生物からなる群より選ばれる微生物
から誘導されたα−アミラーゼ酵素。 (2’) 5DS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に
より測定したとき約75000±3000の分子量をも
つことを特徴とする特許請求の範囲第1項記載の酵素。 (3’l 5mMのCa+の存在において、pH4,2
および60℃で70時間より大きい半減期をもっことを
特徴とする特許請求の範囲m1項記載の酵素。 (4)約5.0のpHで最高α−アミラーゼ活性をもっ
ことを特徴とする特許請求の範囲第1項記載の酵素。 (5)約85℃でpH4,5で最高α−アミラーゼ活性
をもつことを特徴とする特許請求の範囲第1項記載の酵
素。 (6) クロストリジウムSP、 (C1ostrid
iuIn SP、 ’)ATCC39251゜ATCC
3,9252、その変異株、またはα−アミラーゼ酵素
の製造を暗号づける遺伝情報を上記クロストリジウムS
P、微生物よりとり込む微生物からなる群より微生物を
選び、この選んだ微生物の細胞を栄養培地に培養し、つ
いでこの培地からα−アミラーゼを分離することからな
るa−アミラーゼの製造法。 (7)澱粉の水性スラリーまたは溶液を、特許請求の範
囲第1項記載のα−アミラーゼ酵素で、3.5〜7.0
のpHにおいて澱粉加水分解物の溶液が生ずるのに十分
な時間処理することよりなる澱粉の加水分解方法。 (8)変換が約り0℃〜約100℃の範囲の温度で、約
4.0・〜約6.0のpI−Iで行々われる特許請求の
範囲第7項記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US06/513,517 US4578352A (en) | 1983-07-13 | 1983-07-13 | Novel thermostable, aciduric alpha-amylase and method for its production |
US513517 | 1983-07-13 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS6041482A true JPS6041482A (ja) | 1985-03-05 |
Family
ID=24043610
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP59144578A Pending JPS6041482A (ja) | 1983-07-13 | 1984-07-13 | 新規な熱安定性の耐酸性α−アミラーゼおよびその製造法 |
Country Status (16)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US4578352A (ja) |
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