JPS6023840B2 - スエヒロタケによるグルコアミラーゼの製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はスェヒロタケ（ＳｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｍｍＣ
ｏｍｍ皿ｅＦｒｊｅｓ）を培地に培養して、その培養物
からグルコアミラーゼを生産する方法に関するものであ
る。

本発明者らは、担子菌によるアミラーゼの製造法につき
鋭意研究した結果、本発明者が用いたマツタケ目スェヒ
ロタケが、糠質又はでんぷん買物を基質とした靖地で好
気的に培養することによりグルコァミラーゼを菌体外に
多量に生成し、生成したグルコアミラーゼが生でんぶん
及び種々の生でんぷん質物を容易に分解し、グルコース
を大量生成するという新知見を得た。

この知見に基づき本発明を完成した。すなわち本発明は
スェヒロタケ（ＳｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｍｍＣｏｍｍ肌
ｅＦｒｉｅｓ）を培地に培養し、培養物からグルコアミ
ラーゼを採取することを特徴とするグルコアミラーゼ製
造法である。以下、本発明について詳細に説明する。

本発明において使用したスェヒロタケは、グルコアミラ
ーゼ生産能を有する菌であれば適宜使用し得るが、例え
ばスェヒロタケＩＦ０４９２８ スェヒロタケＩＦ○４
９２以 スエヒロタケＩＦ０６５０３ スエヒロタケＩ
Ｆ０６５０５力ミ特に利用される。

上記菌株は、財団法人発酵研究所に標準株としてｍ○番
号で保存されており、ィンスティチュ−ト・フオア・フ
アーメンテ−シヨンオーサ力；リスト・オブ・カルチヤ
ーズ（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒＦｅｍｅｎｔａｔｉ
ｏｎ０ｓａｋａ；ＵｓｔｏｆＣｕｌｔｕｒｅｓ）第６版
（１９７８）に記載されている。本発明で用いられる菌
の培養に際しては菌が同化し得る炭素源、資化し得る窒
素源、その他を含有する培地が用いられる。

炭素源としては同化し得るものであれば何でもよいが、
特にふすま、米ぬか、米粉、洗米廃水、洗米廃水により
生じた堆積物又は沈殿物、穀物、でんぷん、可溶性でん
ぷんなどがよい。窒素源としてはべプトン、酵母エキス
、アンモニウム塩類、硝酸塩類、その他の有機又は無機
の窒素含有物が用いられ得る。その他少量の無機塩類、
例えばリン酸塩類、カルシウム、マグネシウム、マンガ
ン、鉄などの金属塩類、チァミンなどの徴量栄養物質等
も、必要に応じて適宜に添加される。培養は静置あるし
、は振とう培養のいずれでもよいが、好気的条件下に深
部培養するのが一般に有利である。

培養温度は２０〜３５００の範囲が望ましく、級性をｐ
Ｈ３〜１０、好ましくはｐＨ５〜８の範囲に保持し、３
〜１６日程度培養するのがよい。培養の結果得られた培
養物中にはグルコァミラーゼが生成、蓄燈されており、
グルコアミラーゼは、液体培養の場合は培養ろ液中に存
在するので、培養物を遠心分離あるいはろ過により菌体
等の園型物を除去した液体部分からグルコアミラーゼを
得るが、固体培養の場合は水又は温水で抽出し、抽出液
を得る。この培養ろ液又は抽出液をグルコアミラーゼ粗
酵素原液とし、酵素の一般的分別採取法、すなわち、ア
ルコール沈殿法、硫安塩折法、イオン交≠鰯樹脂、セル
ロース等のクロマトグラフィー、ゲルろ過法等を組合せ
ることによりグルコアミラーゼを採取することができる
。次に、本発明法によって得られるグルコアミラーゼの
性質について述べる。‘１｝ 基質特異性 本酵素はでんぷん、でんぷん質物の糊化物、糠質からグ
ルコースを生成するほか、特に各種の生でんぶん、生で
んぷん質物に作用する。

例えば、２％の各種生でんぷん、生でんぷん質物１．０
地、０．２モル酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）、酵素液（３
１０４単位／地、単位については、｛３’で述べるグル
コアミラーゼ活性単位）０．１の【で４０ｏｏ、２０分
間作用させた場合第１表、第２表で示すように大量のグ
ルコースが生成した。なお、グルコースの定量はグルコ
アミラーゼ活性測定法糊で述べるグルコスタット法（以
下のグルコースの定量は、この方法によった。

）により定量した。‘２｝ 至適ｐＨ及び安定ｐＨ範囲 ４０００で至適ｐＨはｐＨ４．０〜６．０であり、ｐＨ
３．０〜７．０が安定ｐＨである。

測定は各種ｐＨのマッキルヴヱン（Ｍｃｌｌｖａｔｉｏ
ｎ）氏緩衝液を用い、４０こ０で生成するグルコースを
定量する方法で行った。‘３１ グルコァミラーゼ活性
測定法グルコアミラーゼの力価は２％可溶性でんぷんを
基質とし、酢酸緩衝液中３０℃で酵素と反応後、生成す
るグルコースを測定して求めた。

グルコアミラーゼ１単位（Ｕ）は、酵素反応液中に６０
分間に１の９のグルコ−スを生成する活性を示すものと
した。なお、グルコースの定量には藤沢薬品工業株式会
社販売のグルコスタット試薬を用い、ＯＤ認ｏで比色定
量するグルコスタット法によって求める岩野らの方法に
よった。

〔岩野、風間、布川：日本醸造協会雑誌、７１、斑３〜
滋６（１９７６）〕■ 温度、ｐＨなどによる失活条件 本酵素はｐＨ４．０〜７．０で３０ｏ○、２４時間放置
しても安定であるが６５こ０、１雌ご間の加熱により失
活する。

‘５ｉ 分子量 ＳＤＳ−アクリルアミドゲル電気泳動法により、べ−リ
ンガー・マィンハィム山之内株式会社販売の標準たんぱ
くを用いて測定した結果、約６６０００である。

以下実施例をもって、さらに詳細に本発明の内容を説明
するが、これによって本発明が限定されるものではない
。

実施例 １ ふすま５％、リン酸１カリウム０．１％、硝酸アンモニ
ウム０．１％、硫酸マグネシウム・７水塩０．０５％、
塩化カリＯ．０５％、硫酸マンガン・４水塩０．０００
１５％、チアミン１そ培地量当り５０〃夕からなる種培
地６０の【を５００の‘容坂口フラスコに分注し、滅菌
後、これにスェヒロタケ『０４９２８の−斜面培養を接
種し、往復式振とう機上で３０００、７日間培養した。

別に耐圧ガラス製５ク発酵槽に、上記塔地と同組成の培
地３〆を仕込み、常法に従って滅菌後、冷却した。これ
に上記種培養物を無菌的に接種し、３０００で通気かく
はん培養（通気量毎分２ぞ、かくはんは毎分１００回転
）した。７日間培養した後培養物を取り出し、遠心分離
とる過によって菌体及び岡型物を除き「２．５その培養
ろ液が得られた。

このろ液中には、グルコアミラーゼ２１２単位／地が含
まれていた。このろ液を５％濃度の酸性白土処理を行い
、硫安塩析を行った後沈殿物を再溶解し、再び酸性白土
を５％濃度まで加えて５℃で２０分間かくはん処理後、
遠心分離により酵素濃縮液１９０の‘を得た。この濃縮
液をセフアデツクスＧ−１００を充てんしたカラムを用
いてゲルろ過を行い、分画後再び同じカラムで再ゲルろ
過を行い「この分画液を濃縮してグルコアミラーゼ溶液
４３の‘が得られた。この濃縮液のグルコアミラーゼ活
性は３１０△単位／机存在し、ＳＤＳアクリルアミド電
気泳動で単一のたんぱくの発色バンドを与えた。実施例
２ 実施例１の培地組成のうち、ふすま５％にかえて各種の
炭素源を５％加えた培地を５００の‘客坂口フラスコ中
に調製、滅菌後スェヒロタケＩＦ０４９２８を接種し往
復式糠とる機上で３ぴ○、９日間培養した。

この培養物をろ過して得られた培養ろ液中には第３表の
ようにグルコアミラーゼが存在した。この培養ろ液に各
々アルコール分７７％となるようにエチルアルコールを
加え、沈殿物を遠心分離により採取し、乾燥して酵素製
剤を得た。実施例 ３実施例１の靖地組成の培地を５０
０の【容坂口フラスコ中に調製、滅菌後各種スェヒロタ
ケを接種」実施例２と同様往復振とう機上で３０００、
１１日間培養した。

この培養物をろ過して得られた培養ろ液中には、第４表
のようにグルコアミラーゼが存在した。この培養ろ液か
ら実施例２と同様アルコール沈殿により酵素製剤を得た
。第１表ｐＨ５．０ ，４０℃ ，２０分反応 第２表 ｐＨ５．０ ，４０℃，２０分反応 第３表 ３０℃，９日間培養 グルコアミラーゼ生成量は、培養ろ液１の【当りの酵素
活性（単位）で示した。

第４表 ３０℃，１１日間培養 グルコアミラーゼ生成量は、培養ろ液１叫当りの酵素活
性（単位）で示した。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ スエヒロタケ（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ Ｃｏ
   ｍｍｕｎｅＦｒｉｅｓ）を培地に培養した培養物からグ
   ルコアミラーゼを採取することを特徴とするグルコアミ
   ラーゼの製造法。