JPS60126297A - マクロフア−ジ活性化特性を有するムラミルペプチド−ステロイド誘導体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、ムラミルペプチド（ｍｕｒａｍｙｌ　−ｐｅ
ｐｔｉｄｅ　）とステロイド、よシ特定的にはマクロフ
ァージ活性化特性を有するステロールとの誘導体に係シ
、よシ特定的には、垣呂亘での非特異的抗腫瘍耐性機序
を刺激する働きのあるムラミルペプチドとステロイド、
好ましくｔまステロールとから得られる誘導体を含有す
る組成物に係る。

マクロファージの活性化は、免！Ｅ節剤（１ｍ−ｍｕｎ
ｏｍｏｄｕｌａｔｏｒ　）の抗腫瘍活性の主袂桧序の１
つである。すなわち、活性化されたマクロファージはｉ
ｎ　ｖｌｔｒｏのみならずｉｎ　ｖｉｖｏでも同系Ｍ筋
細胞（ｓｙｎｇｅｎｌｃ　ｔｕｍｏｒａｌ　ｃｅｌｌｓ
　）を破壊する能力を有する（１）。本明細書末尾に目
録として添付した文献を、技術水準を示す１考として括
弧で括った番号で引用する。

ムラミルペプチドがｉｎ　ｖｉｔｒｏでマクロファージ
の抗腫瘍活性を増大し得ることが示されている（２．３
）。しかし、これらの物質を生理食塩水溶液として用い
たときｉｎ　ｖｉｖｏでは活性増大は認められない（４
）。明らかにこの不活化の原因は、ムラミルペプチドが
おそらく流体飲作用によってマクロファージ中にゆつく
シと取シ込まれる（５）ためと、ムラミルペプチドが腎
によって急速に生体から排出される（６．７）ためであ
る。

これらの２種の現象が共に作用する結果、生理食塩水溶
液として注入されたムラミルペプチドはマクロファージ
中でこれらを活性化し得る程の充分な濃度にならない。

このような欠点を克服するためいくつかの解決法が考え
られ、特に、ムラミルペプチドをリポソーム内にカプセ
ル化して封入し、これを食作用によシ取シ込ませて細胞
自体内部での濃度を増加することが可能である。

ＦＩＤＬＥＲ等はこの観点にたって研究をし、７／３の
比のホスファチジルコリン（ＰＣ）およびホスファチジ
ルセリン（ＰＳ）から構成されＭＤＰを内包する多重ラ
メラリポソームを使用した。その結果、この免疫調節剤
は循環単球を標的として取シ込まれたが、との単球はそ
れが取シ込んだＭＤＰの作用によって分化して活性マク
ロファージになる（８，９．１０）。

す４ソームの組成およびその性＊（多重ラメラ）によっ
て、すｄ？ソームが特に肺循環の毛細血管を指向するこ
とになる（８，９．１０）。

次いで、食作用によりリポソームを取シ込んだ単球は肺
の内に移入し、そこで分化して活性マクロファージにな
る。これら活性マクロファージはマウスでのメラノーマ
Ｂ綽と同様に原油性（ｐｕｌｍｏｎａｆｆｔｒｏｐｉａ
ｍ　）を有する腫瘍の転移を阻止し得る（１゜４．１０
）。

しかしながら、可溶性ムラミルペプチドの使用には多く
の欠点がある。特に、肺循環の単球を標的とし易くする
ような組成のリポソームでは漏出が起こる。すなわち、
カプセル化した溶液が消失してしまう。このような漏出
はＰＣ／ＰＳリポソームが血清に接触したときに特に起
こシ易い。

一方、このような漏出が起こるとリポソームの貯蔵（蓄
積）が不良となる。

この欠点は多重ラメラリポソームを使用すると部分的に
克服される。すなわち、最も内側のラメラ間隙（ｉｎｔ
ｅｒｌａｍｅｌｌａｒ　５ｐａｃｅ　）に物質が内包さ
れ、リポソームの食作用以前の漏出が制限されると考え
られる。しかし、このように修正することによって標的
特異性が失なわれる。実際、単ラメラリポソームまたは
２，３のラメラからなるリポソームを使用すると、肺以
外の他の器官を標的とするという利点を示すであろう（
８）。

これらの欠点を克服するため、ＦＩＤＬＥＲ等はＮ−ア
セチルムラミル−Ｌ−アラニル−〇−イソグルタミン（
ＭＤＰ）またはＮ−７セテルムラミルーＬ−アラニル−
Ｄ−イングルタミル−Ｌ−アラニン（ＭＴＰ）の親脂性
前導体、例えばＭＴＰ−ホスファチジル−エタノールア
ミンを使用することを既に推奨している。

本発明は、上述した困難を更に有効に除去することを目
的とし、特に、がなシのマクロファージ活性化卯を有し
、よシ特定的には１ｎ　ｖｉｖｏでの抗腫瘍活性を有し
、更に特定的にはリポソームに内包した形態で投与した
ときに前記の活性を示す’４ｒ〃ＬなＭＤＰ誘導体を提
供することを目的とする。

本発明のｙｕｖｐｕ導体は、本質的に、ＭＤＰ″または
その類似体もしくは同族体、通常はムラミルペプチドと
・膜層性（ｍｅｍｂｒａｎａｌ　ｔｒｏｐｉｓｍ　）を
有するステロイド、例えばコレステロール、その生合成
前駆体、これから誘導されるステロイドまたは類似分子
とから共有結合によって複合体を形成して得られる。こ
れらステロイド系の種々の可能な分子はヒドロキシルま
たはアミン官能基を含有するであろう。

本発明の好ましい化合物は次の一般式を有する。

１゛ Ｈ２ ＣＨ！ 「 Ｃ０−（Ａ）ｎ−Ｚ ここで、置換基Ｒ，Ｘ、　Ｙ、　ＡおよびＺは以下の意
味を有する。すなわち、 −Ｒは水素原子または炭素原子１〜５個を有するアルキ
７７基、 −ＸＵＬ−アシエル、グリシル、Ｌ−バリル。

Ｌ−イ：／ロイシル、Ｌ−ノルロイシル、Ｌ−ロイシル
、Ｌ−セリル、Ｌ−）レオニル、Ｌ−プロリル、　Ｉ、
−クルタミニル、Ｌ−アス／Ｑ　ラキニル、Ｌ−メチオ
ニル、Ｌ−トリプト７アニル。

−ＹはＮ山もしくはＯＨ基または炭素原子１〜ｌＯ個を
有するアルキル基ｔ −ｈは０′またけ１〜５の整数、 −Ａ　ｉｔ　（ｎが１〜５の値をとるとき）、上記群か
ら選択されるアミノアシル残基または式：　−Ｎｘｉ　
−（ＣＩＩ＊）Ｘ−ＣＯ−＜ただし、式中Ｘは２〜１０
である）で表わされる基（但し、同一化合物中に存在す
る複数の基Ａは同一でも異なってもよい）、 −２はケト／官能基または炭素原子１〜１０゜特に２〜
８個を有する炭化水素鎖を０１７位に有する３−ヒドロ
キシアントロスタンまたは３−ヒドロキシアンドロステ
ンの誘導体である。

前記の炭化水素鎖は脂肪族鎖であると有利である。

この場合鎖は１個または数個のケトン基、オール基また
はアミノ基で修飾または置換し得る・ムラミルペプチｒ
と３−ヒドロキシアントロスタンまたは３−ヒドロキシ
アンドロステンの誘導体との共有結合はこのヒドロキシ
基の位置であると好ましいＯコレステロールの使用が好
ましいが、他のステロールまたはステロイドも本発明の
化合ｑ＃Ｊｔ−形成するのに使用しイＯる。

？＋１＋！：ＬテＵシトステロール、スチグマステロー
ル、フレグネノロンが挙げられる。’ｒ：＋定の器官を
標的としたして本発明のステロールームラミルペゾチド
傾合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ　）を構成°ｊ−ると有利
でろろう。

本発明の竹に好ましい化合物は、ムラミルージペプチＦ
−（γ）−Ｌ−アラニル−コレステロール由来ニスデル
類でめシ、よ＃）％定的にはＮ−アセチル−ムラミル−
し本発明の化合物はリポソームに内包させてまたはこれ
らのリポソームを生理学的に許容し得る水性溶液中に懸
濁させて使用すると好ましく、これらの組成物を非経口
投与に用いる場合には無菌かつ等張水溶液に懸濁させて
用いるのが好ましい。

リポソームの形成に使用する脂〃組成物については、文
献特に本明細書゛末尾に挙ける参考文献を引用すること
ができる。

好ましい脂質組成物は、リン脂質として作用するもの、
特にホスファチジルコリン（ｐｃ）およびホス７アチジ
ルセリン（ＰＳ）の混合物である。ＰＣ７容対ＰＳ３容
の比でまたは目的とする標的に応じてリポソームを作製
すべ〈使用する他の適当な比で前記リン脂質を含有する
混合物からリポソームを形成すると有利である。本発明
の誘導体を含有するリポソームの生物活性は、このリポ
ソームを単ラメラ構造としても多重ラメラ構造としても
発現される。

本発明の誘導体は以下に述べる方法で製造される。

同一の化合物を得るのに種々のルートが可能である。い
ずれの場合でも、合成には一連のステップが含まれ、そ
の合成過程では本発明の化合物の全体構造を構成する種
々の「７ラグメント」を順次組立てる。可能なルート同
士の土製な相違点は、７ラグメ／トを組立てる１１Ｈ序
の選択である。１つの断片をそれに続く１つ以上の断片
に固定する反応方法は全体としてこの固定を行なう順序
によってはあまシ変わらない。勿論この７＋１１序は、
一方では反応する官能基したがって関与するステップで
は遊離になってぃなけれはならない官能基の選択に依存
し、他方ではこの同じステップの間干渉することのない
ようにブロックしなければならない基の選択に依存する
。

本発明の誘導体の製造は対応するムラミルペプチド型化
合物から行ない得る。この化合物の製造は多くの刊行物
に記載されておシ、特にムラミン酸。

そのアナログ（Ｉｊ似体）ｔたはその誘導体の製法に関
する刊行物がある。これらの酸、アナログまたは誘導体
は次の構造を共通に有している。

ここで、Ｒは前述した意味を有する。

本発明の化合物は多くの方法で有利に合成し得る。使用
し得るいくつかの好ましい方法を以下に説明する。

Ｎ−アセチルムラミン酸誘導体または上記した如きこの
アナログにペプチド鎖を固定するには、ペプチド合成分
野で慣用の方法を用いる。このような方法は広く先行文
献に記載されてお夛、特に後述するフランス国特許出願
に記載されている。

一般に、糖ペプチド合成は、第１アミノ酸をムラミル基
に固定し、次に得られた化合物に第２アミノ酸を固定し
、以下順に繰り返して行ない得る。また、アミノ酸から
全ペプチド鎖を別個に調製し、次にこれをムラミル基に
固定して製造することも可能である。あるいはこの中間
の方法も可能でラシ、鎖のフラグメントを製造し、次に
、これらのフラグメントを互いに組立てて完全な鎖を作
ってからこれをムラミル基に固定するか、または、第１
７ラグメントをムラミル基に固定し次に第２７ラグメン
トを得られた生成物に固定しても製造し得る。配列順序
の選択は主として収率によって決定する。

Ｙによる置換は鎖の合成前にグルタミル基に対して行な
うと有利である。同様に、ｎがＯでも０ではなくても、
末端アミノアシル基をペプチド鎖に組み込む前に、基２
を先ず末端アミノアシル基に固定しておくと好ましい。

ペプチド合成は慣用方法に従って行なう。例えば、カル
ボキシルの活性化による方法を選ぶことができる。これ
らの例としては、活性エステル法、混合無水物法、また
は、Ｎ、　Ｎ’−ジシクロへキシルカルボシイミドもし
くは同等なカルボジイミド類の如きカルボジイミド型化
合物を使用する方法がある。

この慣用ペプチド合成方法の概説はＪ、Ｈ，ＪＯＮＥＳ
。

Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ’　ａｎｄ　Ｉｎｄｕｓｔｒｙ、　
７２３　（１９７４）にある。

同様に、上記のフランス国特許出願またはフランス国特
許出願第７５２９６２４号、第７６０６８１９号。

第７６０６８２０号、第７６０６８２１号、第７６２１
８８９号、第７７０２６４６号が参照でき、更にＩＪＦ
’ＲＡＮＣＩ凪等のＩｎｔ、　ｓＬ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　
Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｒｅａ−＋　１９７’Ｌ　Ｌ２４９お
よび１９７８．遅、２８９がおる。

基Ｙに対応するエステル化銹導体またはアミド化訪導体
は公知の方法で形成される。特に上記のフランス国特許
出願が引用でき、特に第７６０６８２０号、第７６０６
８２１＠、第７６２１８８９号および第７７０２６４６
号が挙げられる。

残基２をそのヒドロキシル官能基を介してペプチド鎖の
Ｃ−末端に位置するアミノ酸に固定するには、ペプチド
合成で周知の方法によってこのアミノ酸のカルボキシル
基を活性化してエステル結合を形成する（後述）。

（ａｌ　ｎがＯとは異なる場合の一般式の化合物に対Ｃ
−末端アミノ酸のアミン基を暫定保護基例えばｔ−ブチ
ルオキシカルボニルＣＢＯＣ）またはペプチド合成でこ
の目的に通常使用される他の任意の基で置換する。次に
、このアミノ酸のカルボキシル基を活性化して２残基の
ヒドロキシル基と複合体を形成させ、エステル基を生成
する。種々の方法が使用し得る。例えば、ベンゼンスル
ホニルクロライド（Ｍ、ＳＨＥＭＹＡＫＩＮ。

Ａｎｇｅｗ、　Ｃｈｅｍ、、　７２．　（１９６０）　
３４２　）、混合無水物（Ｍ、ＢＲＥＮＮＥＲ，Ｊ、Ｐ
、ＺＩＭＥＲＭＡＮＮ。

Ｐ、　ＱＵＩＴＴ、　Ｗ、　５ＣＨＮＥＩＤＥＲおよび
Ａ。

ＨＡＲＴＭＡＮＮ、　Ｈｅ１ｖ、　Ｃｈｉｍ、　Ａｃｔ
ａ、＋　４０　（１９５１）６０４）、カルボニルジイ
ミダゾール（Ｈ，Ａ、　５ＴＡＡＢ。

ＲＯＨＲＷ、ＭＡＮＮＳＣＨＲＥＣＫ　Ａ、、Ａｎｇｅ
ｗ。

Ｃｈｅｍ、、　７３　（１９６１）　１４３　）、触媒
例えばヒドロキシベンゾトリアゾールまたはイミダゾー
ルの存在下での活性化エステルＣＦ、　Ｈ，Ｃ，５ＴＥ
ＷＡＲＴ。

Ａｕａｔ、　Ｊ、　Ｃｈｅｍ、、　２１　（１９６８）
　１６３９）、Ｍ−ＣＲＯＲＥＶ。

Ｙ、　ＫＮＯＢＬＥＲ，Ｙ、　Ｓ、　ＫＬＡＵＳＮＥＲ
，Ｊ、　Ｃｈｅｍ。

Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　（１９７７）　２２４６　）、触
媒例えばジメチルアミノピリジンの存在下でのジシクロ
ヘキシＡ・カルボジイミドＣＣ，ＧＩＬＯＮ、Ａ、ＨＡ
ＳＳＮＥＲ。

Ｙ、　ＣＬＡＵＳＮＥＲ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌ
ｅｔｔ−＋旦（１９７９）　３８１１　）が使用できる
。

次に、適当な方法、例えばＢＯＣの場合には塩酸の氷酢
酸規定溶液の作用により暫定保諜基を除去する。こうし
て得られた誘導体をペゾチド合成で公知の方法に従って
第２のアシルアミノ酸と結合（ｃｏｕｐｌｅ　）するこ
とができ、式Ａ！　−Ａ＋　−Ｚ−のジペプチド化合物
が得られる。このようＶＣ，アミド配列を合成し得、次
いで、例えはα−０−ベンジル−４，６−０−ベンジリ
ゾルーＮ−アセチル−合成できる。最後に、（例えば水
素化分解によって）保＠基を除去すると遊離状態の糖ペ
プチド誘導体が得られる。

他の好ましｈルートでは、例えば（限定するわけではな
いが）混合無水物法を使用して、Ｎ−７−にチルムラミ
ル−Ｌ−アシエル−Ｄ−グルタミン酸のα−置換誘導体
を直接（一般式のアミドまたはエステルを介して）予め
調製した残基Ｈ−（Ａ）ｎ−Ｚと結合する。

ｎがＯに等しい場合、Ｄ−グルタミル残基のｒ−カルボ
キシル基を残基２とエステル結合させる。次に、上記（
ａ）の方法を使用して、アシル−Ｄ−グルタミックα−
（アミドまたはエステル）γ−２Ｗの誘導体を調製する
か、または直接アシル−Ｘ−Ｄ−グルタミックα−（ア
ミドまタハエステル）γ−ＺＷのジペプチＩ″銹導体を
調製する。これらの誘導体からアシル基を除去した後、
ムラミン酸の適切な誘導体例えばα−Ｏ−ベンジルー４
．６−０−ベンジリデン−Ｎ−アセチル−ムラミン酸と
結合する。最後に、例えば水素化分解によって暫定保護
基を除去すルト本発明の糖ペプチドが得られる。

（以１・゛余白） 本発明の別の特徴は、非限定的な好ましい具体例に基く
以下の記載より明らかにされるであろう。

ｘ、５４６．ｌｉ’（４ミリモル）のコレステロールと
１．１２．９（５ミリモ＃）（７）Ｚ−Ｌ−７ラニンと
５００１１１９（４ミリモル）のジメチルアミンピリジ
ンとを、２０罰のジメチルホルムアミドと５ｍｌの・テ
トラヒト°ロフランとに溶解する。

０℃で１．１１２ｇ（５，４ミリモル）のジシクロへキ
シルカルボジイミドを添加する。反応混合物を常温で１
晩攪拌し、次ｌこ、沈殿ジシクロへキシルウレアを濾過
し、Ｆ液を濃縮乾固する。

得られた残渣を再度メチレンクロリド１に入れ、ＮａＨ
ＣＯ３Ｍ、Ｈ２Ｏ，ＫＨＳＯ３５％、Ｈ２Ｏで洗い、Ｍ
ｇＳＯ４で乾燥する。濃縮乾固後、生成物をシリカカラ
ムで精製し、トルエン／エーテル（１０／１　ｖ／ｖ）
溶媒系で溶出させる。ベンゼン／エーテル（７／３　ｖ
／ｖ）溶媒系を用いシリカゲル薄層クロマトグラフィー
で両分をテストし、生成物を含む両分を収集し、濃縮し
ジオキサ元素分析：　０３８Ｈ５７Ｎ０４．０．２５ジ
オキサン計算値Ｃ７６，３％、Ｉ（９，７％、Ｎ２−３
％；測定値Ｃ７６，３％、）［９，５％、Ｎ２，３％。

２８４■（０，４８ミリモル）のＮ−ベンジルオキシカ
ルボニル−Ｌ−アラニル−コレステリルエステルを、２
０ゴの乾燥し脱退酸したテトラヒト９０フランと３ｍｌ
の氷酢酸とに溶解した。３００ｒｖの５％Ｐｄを含む炭
素を存在させて水素化を２時間継続する。触媒を濾過し
、濃縮後の生成物をジオキサン溶液から凍結乾燥する：
２２６ｍ９（９１％）。

元素分析：　Ｃｓｏ　Ｈｓ１ＮＯ２、ＣＨｓ　ＣＯＯＨ
。

０．２５Ｈ２Ｑ 計算値Ｃ７３，６％、）ｔｌｏ、７％、Ｎ２．７％；測
定値Ｃ７３，５％、Ｉ（１０，７％、Ｎ２．５％。

１）９８．５■（０，２ミリモル）のＮ−アセチル−ム
ラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミンを、８５η
ｙ（０，２ミリモル）のＮ−シクロへキシル−Ｎ′−（
β−（Ｎ−メチルモルフォリノ）−エチルツーカルボジ
イミド’＋ｐ−トルエンスルホネートと３２■（０，２
ミリモル）のヒ１！口キシはンゾトリアゾールと共に５
ｍｌのジメチルホルムアミド９中で室温で１時間インキ
ュベートする。次に、３ｍｌのメチレンクロリド中の１
０３．５６■（０，２ミリモル）のＬ−アラニル−コレ
ステリル酢酸エステルと２２μ７（０，２ミリモル）の
Ｎ−メチル−モルフォリンとを加える。４８時間後、反
応混合物を濃縮乾固し、生成物をシリカカラムで精製シ
、クロロホルム／メ／）／−Ｊｌｚ（４／１　ｅマ／ｖ
〕混合溶媒で溶出させる：４５ｑ（２５％）。

２）２２１．６ダ（０，４５ミリモル）の同じくＮ−ア
セチル−ムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン
を使用し、これを２０１ｎｔの無水ジメチルホルムアミ
ドで２回濃縮乾固する。最後に２，５ｒｎｌの該溶媒を
加え、−１５℃に冷却した溶液に５ＣμＡ（０，４５ミ
リモル）のＮ−メチルモルフォリンと６０μＡ（０，４
５ミリモル）のイソブチルクロロホーメート　とを加え
る。３分後、３ｄのテトラヒドロフランに溶解させた２
１０ｒｖ（０，４ミリモル）のＬ−アラニル−コレステ
リル−酢酸エステルと４５μｊ（０，４ミリモル）のＮ
−メチルモルフォリンとを加える。混合物を一１５℃で
１晩静置し、次に濃縮乾固して前記の如＜　ｆ＊製する
。

氷酢酸溶液から凍結乾燥して生成物を得る：２１５η（
５７，７％）。

クロロホルム／メタノール（４／１　ｔ　Ｖ／ｖ　）溶
媒系とクロロホルム／テトラヒト９０フラン／メタノー
ル（５／２／１　、Ｖ／Ｖ　）溶媒系とを用いシリカ薄
層クロマトグラフィーにかけ、更に、アミノ酸とコレス
テロールとの定量を行なって生成物の純度を測定する。

２５ 〔α）Ｄ　＝＋３．９（ｃ　、＝０．５．氷酢酸）。

元素分析：Ｃ４ｑＨＢＩＮ５０１２，２ＣＨｓＣＯＯＨ
。

Ｈ２０ 計算値：Ｃ５９，５％、Ｈ８，６％、　Ｎ　Ｏ，６％。

測定値：　Ｃ５９，７％、　Ｈ８，５％、Ｎ６．９％。

ＰＣ（ＣＡＬＩＢＩＯ−ＣＨＥＭのジステアロイルｐｃ
）とＰＳ（ＳＩＧＭＡのオウシ脳からのＰＳ〕とをクロ
ロホルムに溶解し、エーテル／エタノール（４／１　）
に溶解したＭＴＰ−ｃｈｏｌを加えて　ｐｃ＋ｐｓ のｍ２当りＭＴＰ−ｅｈｏｌ　５μｇの濃度にする６得
られた脂質溶液をフラスコに入れ回転蒸発器で溶媒を蒸
発させてフラスコの表面に薄膜を形成させる。

リン酸塩で緩衝した等張Ｎ　ａ　Ｃ、Ｌ溶液（ＰＢＳ６
リン酸緩衝生理食塩水°′）を存在させたＶＯＲＴＥＸ
型装置内で薄膜を水和し振盪する。これに抗生物質を添
加する。得られたリポソームを１６，３００ｙで３０分
間遠心し、次にＰＢＳ＋抗生物質に再度懸濁させて脂質
濃度を５　ｍｙ　／　ｍｌとする。

同じ条件下で空すポソーム即ちＭ　Ｔ　Ｐ　−ｃｈｏｌ
を含まないリポソームを調製しコントロールとして使用
する。

２）リポソーム中のＭＴＰ−ｃｈｏｌ　によるマＩ　マ
クロファージとしては、生後８週間のメスＢＤＦＩマウ
スの腹腔マクロファージを使用する。これらのマウスに
は、無菌炎症刺激原たるチオグリコール酸塩培地（Ｉｎ
５ｔｉｔｕｔ　Ｐａ５ｔｅｕｒＰｒｏｄｕｃｔ１ｏｎの
製品）１．５ｍ／を４日前に腹腔内に注射しておいた。

頚部脱臼によって予め殺し首を切断して出血させたマウ
スの腹腔を５ｍｌのＭＥＭ培地（後出）で洗って腹腔細
胞を入手する。

これらの細胞を遠心後、５％の失活胎仔牛血清（ｇｉｂ
ｃｏ　）と抗生物質（はニジリン＋ストレプトマイシン
）とを加えたＭＥＭ（最小必須培地、Ｉｎｇｔｉｔｕｔ
　Ｐａｇｔｅｕｒ　Ｐｒｏｄｕｃｔｌｏｎ　）に再度懸
濁させる。

部分サンプルについて、細胞封入ニュトラルレツ白こ対
するマクロファージの挙動を顕微鏡観察してマクロファ
ージを同定し計数する。

次に懸濁液を１１０６マクロフアージ／　ｍｌに調整し
、９６カツプのＭｉｃｒｏｔｅｓｔ　Ｍ　（ＮＵＮＣＬ
ＯＮ）プラスチックプレートにカップ当り２５０μ！ず
つ分取する。

該プレートを、大気＋５％水飽和ｃｏ２を含む３７℃の
オープン（Ｈ］１ｍＲＡＥＵＳ）に入れる。

４時間のインキュは−ジョン後にマクロファージが付着
する。付着しない細胞（主としてリンパ球）を、インキ
ュ（−ジョン培地の（注射器による）吸引とＰＢＳによ
る２回の洗浄とによって除去する。次に、リポソーム含
有又は非含有（リポソームは空リポソーム又はＭＴＰ−
ｃｈｏｌ　含有）の培地２５０μノをカップに補充する
。

２４時間のインキュば一ジョン後、カップをＰＢＳで洗
い、２５０μノの肥満細胞腫Ｐ８１５　の懸濁液（０，
３Ｘ１０’細胞／ゴ）を充填し、トリチウム標識チミジ
ン（５ａｅｌａｙ　）を濃度１．２μＭ（比活性ＩＣ１
／ミＩＪモル）で加える。

Ｐ８１５肥満細胞腫を、１１日毎にＤＢＡ２マウスの腹
腔に再注射して腹水液中に維持する。

２４時間の同時培養後、６コレクタ”（５ＫＡＴＲＯＮ
、ＬＩＥＲＢＹＥＮ、ノルウェー）を用いて各カップの
細胞をガラスファイバフィルターに収集する。

蒸留水流でカップを洗浄して行なうこの収集過程で細胞
の溶解によって細胞のＤＮＡが遊離してフィルターに固
定される。Ｐ８１５の細胞の増殖が生じるとこれら細胞
はトリチウム標識チミジン内爪退動れ、ＤＮＡが放射性
になる。この放射能は腫瘍の増殖に比例する（これら条
件下でマクロファージは増殖しない）（１２）。

各カップに対応するフィルタ一部分を切り離し、シンチ
レーションカウンタ（ＲＡＣＫ−ＢＥＴＡ。

ＬＫＢ）によりシンチレーション液（ＬＩＰＯＬＵＭＡ
Ｃ。

ＬＵＭＡ　）の存在中でカウントする。各テストを３組
ずつ実施し、３つのカップの平均値を対応結果と考える
。

マクロファージの抗腫瘍活性を増殖阻止のノで−センテ
ージ（％ＩＣ）で示す。

〔式中、Ｔ＝非処理マクロファージ＋ＩＩＩＩＭ細胞同
時培養物中へのチミジンの取込み。

Ｘ＝処理マクロファージ＋腫瘍細胞同時培養物中へのチ
ミジンの取込みを示 す〕 次表は、空リポソーム又は脂質ダ当り５μｓのＭＴＰ−
ｃｈｏｌ　を含有するリポソームによって処理したマク
ロファージの存在中で同時培養された肥満細胞腫Ｐ８１
５の増殖阻止％を示す。

、リポソーム中にＭＴＰ−ｅｈｏｌ　が一度２ｐｇ／ｍ
ｊ（培地ＷＩｇ当りリポソーム４００μｇ）又はｌｐＶ
ｍｌ　（樟地ｍｌ当りリポソーム２００μｇ）で存在す
ると、マクロファージは５０ｐ９のＭＤＰが存在すると
きよりも有意に活性化される。

活性化 マクロファージとして２００　ｇｍのＦ３４４オスラッ
ト肺胞マクロファージを使用する。マクロファージを得
るためζこ、０．５ｍ／の５％Ｎｅｍｂｔａｌ腹腔注射
（Ｌａｂｏｒａｔｏｌｒｅｇ　Ａｂｂｏｔｔ　Ｓ、Ａ、
）で麻酔し腎動脈を切開して出血させたラットの肺を、
カルシウム又はマグネシウムを含まないＰＢＳ＋ＤＵＬ
ＢＥＣＣＤ培地５ｍｌを用いて９回培地５ゥｌ心後、５
％の朱活胎仔牛血清（Ｇｌｂｃｏ　）とグルタミンとビ
リビン酸ナトリウムと非必須アミノ酸とビタミンと抗生
物質（ペニシリンとストレプトマイシン）とを加えたＭ
ＥＭ（最小必須培地）に再懸濁さぜる。

次に懸濁液を５　Ｘ　１０５マクロフア一ジ／ｍｌに調
整し、９６カツプのＴＩＴＥＲＴＥＫプラスチックプレ
ートにカップ当り１００μ！の割合で再分配する。４時
間のインキュベーション後マクロファージが付着してい
た。培地を吸引しインキュベーション培地で２回洗浄し
て非付着細胞（５％未満）を除去する。次に（空す７］
εソーム又はＭＴＰ−ｅｈｏｌ　含有リポソームのいず
れかを含む）リポソーム含有培地又は非含有培Ｊｌｋ又
はＭＤＰ済液のいずれか２００μｌをカップに補充する
。

マクロファージを２４時同インキュベートし、カップを
３回洗浄し１００μｌの培地を入れる。

２５ 次に、　ニーデオキシウリジンで標識したＢ１６−ＢＬ
６メラノーマ細胞の＠１蜀液（５Ｘ１０　ＭＪ１胞／ｙ
ｎｌ）１００ｐｌを加える。

Ｂ１６メラノーマのサプラインたるＢ　１６−　ＢＬ６
メラノーマをｌｎ　ｖｉｔｒｏ　培養する。

９６時間の同時培養後、２００μｌのｐｎｓ＋ＤＵＬＢ
ＥＣＣＯ培地で各カップを３回洗浄して死細胞を除去す
る。次にカップに２００μ杉の０．５Ｍ　ＮａＯＨを補
充する。細胞の溶解によって細胞のＤＮＡが遊離される
。細胞がマクロファージによって殺されるとこれら細胞
のＤＮＡは培地中に遊離しており、ＮａＯＨ添加以前の
洗浄によって除去される。（ムラミル：）−′−！プチ
ド含有のリポソームによるマクロファージの腫瘍破壊性
の活性化４２．１６１−１６７（１９８２））。各カッ
プに残存する放射能をガンマカウンタ（ＢＥＣＫＭＡＮ
ＧＡＭＭＡ　４０００　）でカウントする。各テストを
３組ずつ行なって３つのカップの平均値を対応結果と考
える。

マクロファージの抗腫瘍活性を細胞毒性ノぞ−センテー
ジ（％ＣＹＴ）として示す。

〔式中、Ｔ＝非非処理マクロファージ肺腫瘍細胞同時培
養物中残存する　！−デオ キシウリジン； Ｘ＝処理マクロファージ＋腫瘍細胞四時２５ 培養物中に残存する　！−デオキ シウリジン。

表 表は、空リポソーム又はリン脂質η当り０．０４゜０．
４及び４．０μｙのＭＴＰを含有するリポソームで処理
したマクロファージの存在中で同時培養されたＢ１６−
ＢＬ６メラノーマの％ＣＹＴを示す。

リポソーム中にＭＴＰ−ｃｈｏｌ　が０．０１７μｇ／
ｍ／（ＩＪン脂質ｍ６当り４００μｇ）より高いか又は
ｏ、ｏ　０１７μｌｉ／ｍｌ（、リン脂ｙｔｍｙ当り４
０／ｊｇ）より高い礎度で存在すると、マクロファージ
が有意ζこ活性化される。１０乃至５００μ９／ｍｌの
濃度のＭＤＰ溶液によっても同程度の活性化が得られる
。

以下余白 本発明のタイプの化合物の１つの代表例によって得られ
た結果によれば、ステロールとムラミルペプチド°とを
結合するとこの結合体（複合体）は容易にリポソームに
取込丈れてミクロファージを活性化し強力な抗腫瘍活性
を与えることが判明した。

同様に注目すべきは、ステロール−ムラミルはプチド結
合体がアジュバント特性をも維持しており、また同時に
ＭＤＰに特有の抗感染性（特にタレノシエラ菌ｋｌｅｂ
ｓｉｅｌｌａ　ｌζ対する抗感染性）を維持しているこ
とである。

本発明の化合物は本発明の部類の代表的化合物の１つ、
すなわぢＭＴＰコレステロールに関して次のテストの結
果が示すように、抗ウイルス性をも有する。

この抗ウィルス活性は実験的感染システムで測定した。

この実験には生後１０週間のスイス・マウスとインフル
エンザ・ウィルスＡ／ＰＲ８とを使用した。

Ｄ−０８目、前記動物に５０μｌの１／１０　ウィルス
希釈物を鼻腔内投与した。

テストした化合物の抗ウィルス活性は予防実験及び治療
実験の双方で観察された（予防）。即ち、前記ウィルス
希釈物投与の１日前にｘｍｇｇ＞テスト化合物を鼻腔内
投与すると前記動物の６７％が生き残った。

該化合物を治療に使用する実験では前記ウィルス希釈物
投与の１日後に０．５　ｍ９のテスト化合物を皮下投与
した時に最良の結果が得られ、７１％の一動物が生き残
った。

これらの結果は、前記化合物を前記局部経路を介して投
与すると、ＭＴＰコレステロールの治療的抗ウィルス活
性が示されるのに加えて特に予防効果が得られろという
利点を強調するものである。

この局部経路は免疫的防御メカニズムを粘Ｊ漠部分でよ
り直接的に刺激し得るものと思われる。ウィルス病理学
分野の治療における前記投与経路の利点を考えると、こ
れは極めて重要なことである。

本発明はまた、本発明の化合物によって構成し得る生物
学的試薬にも係る。これらの試薬はテストされる化合物
のマクロファージ活性化特性を調べるための参照又は比
較化合物として有用である。

的防御の刺激、中でもこれら組成物を投与した宿主の抗
感染性抗ウイルス耐性及び抗腫瘍耐性を刺激するのに使
用される。

本発明の前記製薬的組成物は所望の効果を得るのに適し
た任意の方法で宿主−ヒト又は動物−に投与し得る。

本発明はより特定的には本発明の化合物を必要に応じ他
の活性物質と合わせて内包し生理学的に許容し得る脂質
と共に形成したリポソームをは−スとする製薬的組成物
に係る。

これら製薬的組成物は有利には本発明の少なくとも１種
の化合物を有効量含むリポソームの注射可能な懸濁液で
構成される。これら懸濁液は無菌等張水相、好ましくは
食塩水又はグルコース添加溶液を用いて製造するのが望
ましい。

本発明はより特定的には皮肉投与、筋肉内投与、皮下投
与、静脈注射又は乱刺法に適した前記の如き懸濁液に係
る。

本発明は更に、好ましくはリボン・−人形状であって別
の経路特に経口又は直腸経路で投与し得るか、又は粘膜
特に眼、鼻、肺もしくは腟の粘膜と接触させるのに適し
た形状をもつ製薬的組成物にも係る。

即ち、本発明は本発明の化合物の少なくとも１種が経口
、眼球又は鼻腔内投与用組成物の形成に適した固体もし
くは液体の製薬上ｒ許容し得る賦形剤と共に、又は直腸
投与用組成物の形成に適した賦形剤と共に、又は腟内投
与に適したゼラチン状などの賦形剤と共に含まれている
製薬組成物に係る。本発明は更に、線経路に適した組成
物、特に従来のアエロゾル・デバイスにより投与するた
めの溶液にも係る。

宿主の抗ウィルス及び抗腫瘍防御を強化すべく投与し得
る量は一例として体重１　ｋｇ当り０．１乃至１．００
０μｇであり、例えば非経口投与の場合は０．１乃至１
００μｙ１経口投与の場合は体重１４当り１乃至ｉ、ｏ
ｏｏμＩであり得る。これら投与量はリポソームに含ま
れるＭＤＰによって示される〇 これら組成物は乳腺タイプの腫瘍、黒色腫及び他の固形
状腫瘍への病巣内注射（Ｉｎｔｒａｌ＠ｓｌｏｎａ１１
ｎＪｅａｔｌｏｎｍ　）に使用し得る。

本発明は勿論前述の非限定的具体例には限定さ能である
。

特に、本発明は、２次的意味しかもたない［換によって
特許請求の範囲に点接合まれている接合体（複合体、結
合体）との微差を示すにすぎない式で表わされる全ての
ステロール−ムラミル−はプチド接合体を包含する。こ
のような等価化合物としては例えばムラミル−ペプチド
９のサツカリド９核の６位で置換したものなどが挙げら
れる。前記仏国特許又は対応外国特許には１１１々の置
換基（前記サツカリド９核の６位もしくは別の部位、又
ははプチド鎖上の）が例示されているが、これら置換基
は全て参照として本明細書に包含される。特許請求の範
囲に含まれる他のステロールームラミルイゾチド接合体
としてはペプチド基とステロール基との結合が多核性核
の３位以外の部位に位置するか又は該核に１７位で固定
されていることもある炭素鎖上に位置するオール官能基
−又は他の官能基−を介して形成されているものが挙げ
られる。

最後に、本発明は前記化合物が形成し得る全ての塩、特
に製薬上許容し得る塩をも包含するものと理解されたい
。

次に本明細書で参照した参考文献を列挙する。

これら関連論文も参考として本Ｆ１１ＪＭｌ誉に包含さ
れるＯ 参考文献 １、　１．Ｊ、Ｆ１ｄｌ＠ｒ、Ｚ＊Ｂａｒｎｅｓ、Ｗ、
Ｅ、Ｆｏｇｌｅｒ。

Ｒ，Ｋｌｒｇｈ、　Ｐ、　Ｂｕｇｅｌｓｋｌ及びＧ、　
Ｐｏ５ｔｓ著、「マクロファージ活性化因子含有リポソ
ームを静脈内注射した後の確立された転移の根絶におけ
るマクロファージの働きＪ　Ｃａｎｃ＠ｒＲ＠Ｉ、　（
１９８２年）、土旦、４９６−５０１゜２、Ｄ、Ｊｕｙ
及びり、　Ｃｈｅｄｌｄ著「マクロファージ活性化とマ
イコバクテリアルイムノアジュバントによる対ｌｉ＆瘍
非特異的耐性の向上との比較」 Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ、　Ａｅａｄ、　Ｓｅｔ、　（１９７
５年）、７２゜４１０５−４１０９゜ ３、Ｊ、Ｐ、　Ｔｅｎｕ、　Ｅ、　Ｌｅｄｅｒｅｒ及び
Ｊ、Ｆ、Ｐｅｔｌｔ著 「胸腺細胞マイトジェン蛋白分泌とトレノＡローズジマ
イクロレート及びムラミルジヘ０プチドによるマウス腹
腔マクロファージの細胞増殖抑制活性との刺激」 Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、（１９８０年）、　
１０．　Ｇ４７−６５３゜ ４、Ｉｊ、　Ｆｉｄｌ＊ｒ、Ｓ、　５ｏｎｅ、　Ｗ、　
Ｅ、　Ｆｏｇｌｅｒ及びＺ、　Ｌ、　Ｂａｒｎｓ＋ｓ著 「自然転移の根絶とムラミルジはブチｒ含イ１リポソー
ムの静脈注射による胞状マクロファージの活性化」 Ｐｒｏｅ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｅｉ、　Ｕ、
８．Ａ　（１９８１年）、、乙８，１６８０−１６８４
゜ ５、Ｊ、Ｐ、　Ｔｅｎｕ、　Ａ、Ｃ，Ｒｏａｈｅ、Ａ、
　Ｙａｐｏ。

Ｃ，Ｋｉ＠ｄａ、　Ｍ、　Ｍｏｎｓｌｇｎｙ及びＪ、Ｆ
、Ｐｅｔｌｔ著 「マウス腹腔マクロファージ内のムラミルペプチド用細
胞表面レセプタの不在」 Ｂｉｏｌ、　Ｃｅ１ｌ　（１９８２年）、４４，１５７
−１６４゜６、Ｍ、　Ｐａｒａｎｔ、　Ｆ、　Ｐａｒａ
ｎｔ、Ｌ、　Ｃｈｅｄｌｄ。

Ａ、　Ｙａｐｏ、　Ｊ、Ｆ、　Ｐｓｔｉｔ及びＥ、Ｌｅ
ｄｅｒｅｒ著「合成イムノアジュバント、ムラミルジは
プチド（１４Ｃ−ラベル化）、、のマウス体内における
宿命」 Ｉｎｔ、Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｅ、　（１９
７９年）、１゜３５−４ｉ　。

７、Ａ、Ｙｏｐｏ、Ｊ、Ｆ、　Ｐｅｔｌｔ、　Ｅ、　Ｌ
ｅｄｅｒｅｒ。

Ｍ、　Ｐａｒａｎｔ、Ｆ、　Ｐａｒａｎｔ及びり、　Ｃ
ｈｅｄｌｄ著「２つの１４Ｃうはル化ムラミルはプチド
即ちＡｃ　−ｍｕ　ｒ−Ｌ−ＡＩ（−ｒ−Ｄ−Ｇｌ　ｕ
　−ｒｙｅ　ｔｒ　ｏ　−Ａ２　ＰＭ及びＡ　ｅ　−Ｍ
ｕ　ｒ−Ｌ−Ａ１１Ｌ−ｒ−Ｄ−Ｇｌ　ｕ　−ｍｅ　ｉ
　ｏ　−Ａ２ＰＭ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌｌのマウス体
内における宿命。

タレプシエラ（Ｋ１５ｂｓｉｅ目１）感染に対する非特
異的耐性を増加させる能力の評価」Ｉｎｔ、Ｊ、　Ｉｍ
ｍｕｎｏｐｂａｒｍａｃ、　（１９８２年）、４゜１４
３−１４９゜ ８、Ｇ、　Ｐｏ５ｔｓ、Ｃ，’Ｂｕｃａｎａ、　Ａ、　
Ｒａｚ、　Ｐ。

Ｂｕｇｅｌｓｋｉ、　Ｒ，Ｋｌｒｓｈ及びＩ、Ｊ、　Ｆ
ｉｌｄｅｒ著 ［系統的に投与したリポソームの宿命の分析及びＰラッ
グ・デリノ２リ−でこれらリポソームを使用することの
意味コ Ｃａｎｃｅｒ　Ｒ６１１，（１９８２年）、旦、　１４
１２−１４２２゜ ９、Ａ、Ｊ、５ｅｈｒｏｌｔ　及びＩ、Ｊ、　Ｆｌｌｄ
ｅｒ著「ムラミルジペプチＦ含有リポソームによりマク
ロファージの腫瘍破壊性の活性化に与えられるリポソー
ム構造と脂質組成物きの効果」Ｃａｎｃ＠ｒ　Ｒａｍ、
　（１９８２年）ｔ　４２．１６１−１６７゜１０、Ａ
、Ｊ、　５ｃｈｒｏｉｔ、　Ｅ、Ｇａ１１１ｇ１ｏｎｉ
及び１．Ｊ、　Ｆｉｄｌｏｒ著 「ムラミルジペプチド合宿リポソームによるマクロファ
ージのその場での活性化を作用する要因」 Ｂｉｏｌ、　Ｃ＠ｌｌ　（１９８３年）、４７．８７−
９４゜１１、　Ａ、Ｊ、　５ａｈｒｏｉｔ及び　Ｉ、　
Ｊ、　Ｆｉｄｌｅｒ著「ムラミルジペプチドの親脂性誘
導体を含むリポソームによる腫瘍細胞のマクロファージ
媒介破壊の刺激」 Ｅｌｓ＠ｖｌｅｒ　Ｂｉｏｍ６ｄｌｃａｌ　Ｐｒｏｍｓ
、　Ｂ、Ｖ。

（１９８２年）、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　ｐｐ６３１−
６３７．　Ｅ。

８＠ｒｏｕ　（編）： ［ヒトの免疫と癌の免疫質ＲＩＭ（ｉｍｍｕｎｏ　−ｍ
ｏｄｕｌａｔｌｏｎ　）とにおける一般的概念」１２、
Ｍ、　Ｌｅｐｏｉｖｒｅ　、　Ｊ、Ｐ、Ｔ＠ｎｕ、　Ｇ
、　Ｌｅｍａｌｒｅ及びＪ、Ｆ、Ｐ＠ｔ１を著 ［トレハローズジエステルにより引き出されたマクロフ
ァージによる抗腫瘍活性と過酸化水素の放出」 Ｊ、ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌ、（１９８２年）ｔ　１２９
　、８６０−８６６゜ 代理人弁理士今　村　元 第１頁の続き ［相］発　明　者　ジャン−アリ・ベルナ　フール　ン ０発　明　者　ジャンーフランソワ・　フプチ　４ ＠発明者　ニジエル・フィリッフフ ス　エ ランス国７８３３０・フォントネイ・ル・フルー９、レ
ジダス・ドユ・バルク、スフワール・クプラン、７ラン
ス国、７５０１５・パリ、リュ・エルネスト・ルナン、
２ランス国、７８８７０・パイイ、スフワール・デ・マ
ロニ、２９

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）ムラミルペプチドが膜層性を有するステロイド例
   りはコレステロール、その生合成前駆体またはこれらか
   ら誘導されたヒドロキシルもしくはアミン基を含有する
   ステロイドと共有結合によって複合体を形成している化
   合物。 （２）一般式： ％式％） 〔式中、Ｒは水素原子または炭素原子１〜５個を有する
   アルキル基でｓ、ｂ、ｘはＬ−アラニル。 グリシル、Ｌ−バリル、し−イソロイシル、Ｌ−ノルロ
   イシル、Ｌ−ロイシル、Ｌ−セリル。 Ｌ−トＤオニル、Ｌ−プロリル、Ｌ−グルタミル、Ｌ−
   アスパラギニル、Ｌ−メチオニル、Ｌ−）　リフ）ファ
   ニル、Ｌ−フ′エニルアラニルおよびＬ−チ胃シルから
   成る群から選択されるアミノアシル残基でおシ、ＹＩ′
   ｉＮルもしくＣユＯＨ基または炭素原子１〜１０個を有
   するアルキル基であシ、ｎは（）または１〜５の整数で
   あ夛。 Ａは、ｎが１〜５の値をとる場合、上記群のアミノアシ
   ル残基であるか、または式−ＮＨ（ＣＨ３）ｘ−ＣＯ−
   （式中、Ｘは２〜１０でるる）の残基であシ（同一化合
   物中にＡが複数個存在するときそれらは同一でも異なっ
   てもよい）、２はケトン官能基もしくは炭素原子１〜１
   ０個、特に２〜８個を有する炭化水素鎖を含有する３−
   ヒドロキシアントロスタンまたは３−ヒドロキシアンド
   ロステンの誘導体である〕を有することを特徴とする特
   ｆＦ請求の範囲９’ｒ　１項に記載の化合物。 （３１式： （式中、Ｒ１は水素を表わし、＆は−ＣＨｓ基を表わし
   、ｎおよびＡは特許請求の範囲第２狛に記載の惹味を有
   する）を有することを特徴とする特許請求の範囲第２功
   に記載の化合物。 （４）特許請求の範囲第１ｆＡ〜第３項のいずれかに記
   載の化合物を含有する薬剤上許容し得るリポソーム。 （５）特許請求の範囲第１ｇ４〜第３項のいずれかに記
   載の化合物を薬剤担体または希釈剤と共に含有し、生体
   内（旦聾）マクロ７アージ活性化特性を有する薬剤組成
   物。 （６）前記化合物を含む薬剤上ｔｆ容し得るリポソーム
   の懸濁物の形態であることを特徴とする特許請求の範囲
   第５項に記載の組成物。 （力　前記リポソームが水性溶液中に懸濁されているこ
   とを特徴とする特許請求の範囲第６項に記載の組成物。 （８）注射可能であることを特徴とする特許請求の範囲
   第７項に記載の組成物。