JPS5952164B2 - グルコサミノグルカン誘導体、その製造法およびそれを有効成分とする抗脂肪血症剤 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はへバリンを激しく脱硫酸化し、ついでその生成
物を充分にヘミスクシニル化してえられる誘導体、その
製造法およびそれを含有する抗脂肪血症剤に関する。

該誘導体は実質土ほとんど抗凝血活性（１Ｗ９あたわ０
．０５ＵＳＰ単位未満）を示さず、現在治療学土重要で
ある抗脂肪血症活性を示す。

それゆえ本発明の誘導体は脂肪血症の治療にとくに好適
である。種々のプロテオグリカン類やグルコサミノグル
カン類の生理学的な重要性は、その実際の生理学的役割
や作動のメカニズムが充分にあるいは部分的にすら解明
されていないにもかかわらず、古くから認識されてきて
いる。

本明細書において以後使用する用語はジエイ・エフ・ケ
ネデイ（Ｊ．Ｆ．Ｋｅｎｒｌｅｄｙ）の著書ＣＰｒＯｔ
ｅＯｇｌｙｃａｎｓ＄ＩＯｌＯｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｃ
ａｌＡｓ−ＰｅｃｔｓｉｎＨｕｍａｎＬｉｆｅｌ，Ｓｔ
ｕｄｉｅｓｉｎＯｒｇａｎｉｃＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，．
ＶＯｌ２、ＥｌｓｅｖｉｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＰｕ
ｂｌｌｓｈｉｎｇＣＯｍｐａｎｙ，ＡＯｌｓｔｅｒｄａ
ｍ−０ｘｆ０ｒｄ一Ｍ、１９７９）で使用されている用
語に準拠した。

高い薬効を有する種々の天然または合成のグルコサミノ
グルカン類としては、たとえばへバリンや硫酸デキスト
ランなどが知られている。へバリンはエル・ビ一・ジヤ
ツクス（Ｌ．Ｂ．Ｊａｑｕａｓ）の論文６Ｈｅｐａｒｉ
ｎ，．ａｎ０１ｄｄｒｕｇｗｉｔｈａｎｅｗｐａｒａｄ
ｉｇｎ１、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２Ｏ６，５２８（１９７９
》またはフイ・フイ・カツカ一（Ｖ．Ｖ．Ｋａｋｋａｒ
）およびデイ一・ピ一・トーマス（］）．Ｐ．ＴｈＯｍ
ａｓ）らの著書（１Ｈｅｐａｒｉｎ１Ｃｈｅｍ１ｓｔｒ
ｙａｒ１ｄ０１１ｎｉｃａ！Ｕｓａｇｅ−Ａｃａｄｓｍ
ｉｃＰｒｅｓｓ．．ＬＯｎｄＯｎ−ＮＹｌｌ９７６）で
論じられているよらに広範囲の血管内凝血症などの過剰
凝血症の治療や血栓塞栓症の予防または治療に用いられ
、さらにジエイ・エフ・ケネデイ、エル・ビ一・ジヤツ
クス、フィ・フィ・カツカ一らのそれぞれの前記引用文
献またはアール・パオレツテイ（Ｒ．ＰａＯｌｅｔｔｉ
）、エス・カルカー（Ｓ．Ｋａｒｇｅｒ）編、エス・ア
イテムパーク（Ｓ．Ｅｉｓｅｍｂｅｒｇ）の著書（“Ｌ
ｉｐＯｐｒＯｔｓｉｎＭｓｔ−ＡｂＯｌｌｓｍＯ、Ｐｒ
ＯｇｒｅｓｓｉｎＢｉＯｃｈｅｍｉｃａｌＰｈａｒｍ一
ＡｃＯｌＯｇｙｌＯ！１５−Ｂａｓｅｌ，ｌ９７９）で
論じられているように脂質血症の治療に古くから用いら
れてきている。後者のように特殊な病理学的症状のばあ
い、へバリンの治療学上の使用はたとえ少量の投与量で
あつても長期間をかけて行なわれる。

しかし、この長期間にわたる投与によつて患者の血液の
凝固能が減少してしまうという危険が生じる。そのため
、血液の凝固性を減少させると考えられている活性をへ
バリンの抗脂肪血症活性から除外しようとする試みがな
されてきている。それらは、たとえばへバリンの構造を
適当に変換する方法または市販のへバリンのフラクネー
シヨンによる方法などによつている。これら血液の凝固
性を減少させる活性は生体内において、グルコサミノグ
ルカン特異酵素と錯体を形成することに関係があるので
はないかということが現在一般的に認識され、また明ら
かにされてきつつある。これらの錯体形成の効果は、た
とえばへバリンなどの抗脂肪血症活性に関して酵素がそ
の活性を高めること、または酵素の触媒機能を高め循環
血液中（ここでは酵素がはじめに血管壁に送られる）で
酵素が自由に動けるようにすることのいづれかであろう
と考えられている。以上が前記文献で論ぜられている、
とくにリポプロテ，インリパーゼ（以下，ＬＰＬという
）−ヘバリン錯体に訃いて典型的にみられる現象であり
、またグルコサミノグルカンが有する抗脂肪血症を説明
するために用いられているメカニズムである。

これら錯体の性質に関しては多くの疑問点があるが、明
言できることはその活性が相互作用によつているという
ことであり、一般に異議なく受け入れられている。該相
互作用は試験管内ではほとんどへバリンのイオン的な性
質によつて卦ｂ（前記文献中、ジエイ・エフ・ケネデイ
の著書の１７３頁およびエル・ビ一・ジヤツクスの論文
参照）、生体内ではへバリンの高次アニオン構造による
イオン的な性質またはほとんど半極性的な性質によつて
いる。へバリン中には種々のスルフアミド基（Ｎ−スル
フエート基）およびスルフオエステル基（０ースルフエ
ート基）が存在し、スルフアミド基はスルJャIエステル
基にくらべてよシ酸加水分解をうけやすい（前記ジエイ
・エフ・ケネデイの著書２２９頁、アイ・ダニシエフス
キ一（１．Ｄａｎｉｓ−Ｈｅｆｓｋｉ）、エイチ・ビ・
アイバ一（Ｈ．Ｂ．Ｅｉｂｅｒ）、ジエイ・ジエイ・カ
ール（Ｊ．Ｊ．Ｃａｒｒ）らの論文（Ａｒｃｈ．ＢｌＯ
ｃｈｓｍ．ＢｉＯｐｈｙｓ．、９０，１１４（１９６０
））訃よびケイ・エイチ・タイヤ一（ＫＯＨ．Ｍｅｙｅ
ｒ）、デイ一・イ一・シユバルツ（Ｄ．Ｅ．Ｓｃｈｗａ
ｒｔｓ）らの論文（Ｈｅ！Ｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａｌ３
３、１６５１（１９５０））参照）。

このことは多くの実験事実から推論されてきたことであ
）、とりわけ鉱酸を用いたスルフアミド基の加水分解が
進行するにつれて、抗凝血活性が減少し、抗脂肪血症活
性の発現が次第に明らかにな）、最終的に全Ｎ−スルフ
エートおよびわずかの０−スルフエートが加水分解され
ることにより両方の活性が完全に消滅するという事実か
ら推論されてきた（前記ジエイ・エフ・ケネデイの著書
２２９頁、エス・エス・ステーパラ（Ｓ．Ｓ．Ｓｔｉｖ
ａｌａ）、工ル・ユアン（Ｌ．Ｙｕａｎ）、ジエイ・エ
ールリツヒ（Ｊ．Ｅｈｒｌｉｃｈ）、ピ一・エイ・リベ
ルテイ（Ｐ．Ａ．Ｌｉｂｅｒｔｉ）らの論文（Ａｒｃｈ
．ＢｉＯｃｈｅｍ．ＢｉＯｐｈｙｓ．ｌ２２，３２（１
９６７））、エス・エス・ステーパラ、ピ一 ・エイ・
リベルテイらの論文（Ａｒｃｈ．ＢｉＯｃｈｅｍ．Ｂｉ
Ｏｐｈｙｓ．、１２２、４０、（１９６７））およびエ
ス・エン・ステーパラ、エム・ヘルプスト（Ｍ｛．Ｈｅ
ｒｂｓｔ）、オ一・クラッドキー（０．Ｋｒａｔｋｙ）
、アイ・ビルツ（１．Ｐｉｌｔｚ）ちの論文（Ａｒｃｈ
．ＢｉＯｃｈｅｍ− ＢｉＯｐｈｙｓ・１２７，７９５
（１９６８）参照）。該加水分解生成物にピリジン−Ｓ
Ｏ３またはトリエチルアミン−ＳＯ３を反応させてＮ−
スルフエート基を再生させることによりこれらの活性が
定性的におよび定量的に再生できることが報告されてい
る（前記ジエイ・エフ・ケネデイの著書２３０頁および
エル・レビイ（Ｌ．Ｌｅｖｙ）、エフ・ジエ不ペトラセ
ック（Ｖ．Ｊ．Ｐｅｔｒａｃｅｋ）らの論文（ＰｒＯｃ
・ＳＯｃ．Ｅｘｐ．ＢｉＯｌ．Ｍｅｄ．、１０９，９．
０１（１９６２））参照）。

その理由はその操作によりへバリンの高次アニオン性が
再生され、酵素−ヘバリンイオン性錯体を形成しうる能
力が再生されるからである（前記のエス・エス・ステー
パラの論文参照）。しかし、レビイはへバリンのＮ−ス
ルフエートの３３％以上を鉱酸によつて加水分解したば
あい．解重合の開始および（または）０−スルフエート
の加水分解によるものと考えられる種々の非可逆的な変
化を受けた生成物が生じ、そのため再び硫酸化反応（Ｓ
ｕｌｆａｔａｔｉＯｎ）を行なつてもその本来の活性を
復活させることはできないと述べている。いいかえれば
、き’びしい条件下での加水分解ののちにえられる生成
物は構造的にかなク異なつたものに変化して、それ自体
不活性となつてしまうため、該生成物にスルフエート基
を再生させることはできず、そのため抗凝血活性のない
酵素（変換された）へバリン錯体を形成せしめるのに充
分なイオン性が再生されない。ジエイ・エフ・ケネデイ
またはフィ・フィ・カツカ一は前記文献において同様の
実験を行なつており、レビイの行なつた実験と同じ結果
をえている。

凝血性型の酵素およびへバリンからえられる錯体ならび
にＬＰＬおよびへバリンからえられる錯体の性質に関す
る論理的な説明のための仮説は静電気的な性質すなわち
アニオン的な性質にもとづいているが、これら２つの錯
体の性質には違いがある。事実、たとえばＬＰＬおよび
ヘパリンによつてえられる錯体はＬＰＬ自体の活性に比
べて多少高い好脂性を有している。以上に述べた問題点
からつぎの結論にいたつている。

（１）現在市販さわている種々の抗脂肪血症剤の脂肪分
解酵素活性はそれが含有する有効成分，すなわちへパリ
ンまたはそれよ杉もスルフエート基を多く有する天然誘
導体もしくは少なく有する天然物誘導体によつて発現し
ている。

これらの物質が脂肪血症の治療のために長期間にわたつ
て投与されたばあい、凝血性の低下による危険が生ずる
が、その危険性を低減せしめるためには、これらの物質
が有する抗凝血性を低減しなければならない。（２）天
然物から変換され、へパリン自体の典型的な構造や性質
が失なわれていない新規なグルコサミノグルカン誘導体
を開発し、しかもそのばあいえられる誘導体のアニオン
性はほとんど維持されていなければならない。

（３）これらの誘導体をうるために用いる出発物質とし
てはヘパリンそれ自体のみが可能であり、それに種々の
範囲で脱硫酸反応を生ぜしめ、スルフエート基よりもイ
オン化しにくい官能基（例えばカルボキシル基）をチツ
素原子土に導入してイオン的な性質を再生せしめる。

これらの誘導体はリポプロテインリパーゼと同様な活性
を示し、一方抗凝血活性がかなク低減している。そのた
めにこれらの誘導体をヒトの治療に用いたばあい凝血性
の低下の危険性がより低減される。しかし前述したよう
にＮ−スルフエートの加水分解またはチツ素原子土のア
ニオン性官能基の加水分解は３３〜３５％を超えるべき
ではない。その理由は極端に好脂性で、アニオン性が低
すぎる性質を有する再構成された（ＲｅｃＯｎｓｔｉｔ
ｕｔｅｄ）最終生成物はＬＰＬと錯体を形成させるのに
は適当でないからである。

これらの観測結果にもとづいてかなわ多くの研究が行な
われている。

なかんづくアイ・ビ一・クツシング（１．Ｂ．Ｃｕｓｈ
ｉｎｇ）の加水分解されたヘパリンのＮ−サクシニル誘
導体に関する研究は注目すべきである（米国特許第３１
１８８１６号明細書（発明の名称：Ｎ−サクシニルヘパ
リンおよびその製法、特許権者：アボツト・ラボラトリ
ーズ（ＡｂｂＯｔｔＬａｂｓ）、出願日：１９６４年１
月２１日）参照）。該特許のクレームのもつとも重要な
点は、レビ一の研究と同様に、出発物質ヘパリンのＮ−
スルフエート基の３５７０を超えない範囲でＮ−サクシ
ニル基を導入することである。このクレームもまたＮ−
スルフエート基の３５７０以上を加水分解した生成物を
サクシニル化した誘導体はその脂肪分解酵素的活性が極
度に減少するという立場をとつている。その理由はへバ
リンのＮ−スルフエートの３５％以上を加水分解したの
ちＮ−サクシニル化してえられる化合物がわずかにしか
アニオン的な性質を示さず、そのためＬＰＬと変換され
たヘパリンの活性錯体が形成されなくなるからである。
長くとも３時間で０．０８６規定の希塩酸を用いるとい
う酸加水分解の条件はＯ−スルフエートやＮ−アセチル
が加水分解されないでＮ−スルフエートのみを加水分解
した生成物をうるための条件を満足している。この最適
であると考えられている加水分解によつてえられる生成
物はつぎにベンゼＺおよび重炭酸水素ナトリウムの存在
下にサクシニルクロライドと反応させて、サクシニル化
に供することによ）、ＬＰＬと錯体を形成せしめるのに
充分なイオン性を有するＮ−サクシニルヘバリンを形成
することができる。そのため該加水分解生成物は血漿中
の溶解度が低下し相当する抗脂肪血症活性のみを発現す
る。しかしながら、この活性は抗トロンビンとの相互作
用を可能にするには充分でない。そのため凝血現象にお
けるヘパリン特有の抑止活性は失なわれてしまう。いい
かえれば、前記米国特許第３１１８８１６号明細書に開
示されている方法ではヘパリンの抗凝血活性を充分に除
去せしめることができない。該特許明細書のクレーム５
は希酸を用いることを開示しており、また実施例では０
．０８６モル／ｔを超えない濃度の鉱酸を用いることが
開示されている。このようにしてえられる生成物が高い
脂肪酸分解酵素活性を有していることから、前述の研究
者たちによつてなされてきた方法、考え方が正しいこと
が実証される。しかし、残存する抗凝血活性（１ηあた
シ８〜１０ＵＳＰ単位）が出発物質であるヘパリンに較
べて減少したとはいえ、該生成物を長期間にわたつてヒ
トの病気の治療に用いた場合、凝血作用が低減される危
険がまつたくないといえるほどではない。ケイ・ナガサ
ワ（Ｋ．Ｎａｇａｓ一Ａｖｖａ）らは最近の文献（Ｊ．
ＢｉＯｃｈｅｍ．、８１，９８９（１９７９））におい
てＮ−スルフエートを種々の度合で（さらには高い度合
でずら）加水分解したヘパリンはそのもとの抗凝血活性
を６２〜７９？維持しているということを報告している
が、これは前述のレビイやステーパラらの研究によつて
えられた結果ならびに本発明でえられる結果とは明らか
に対照的である。しかし、ナガサワらの行なつた加水分
解反応の条件は室温下でジメチルスルホキサイドおよび
メタノールを用いる方法であう、本発明で用いる加水分
解の条件（ナガサワらの方法とは異なる鉱酸濃度でかつ
室温よりも高い温度）とは異なる条件下で行なわれてい
るということは心にとめておく必要がある。

以上に本発明の従来技術を述べた。

本発明者らは前記米国特許第３１１８８１６号明細書に
開示されている方法またはレビイの方法に較べてよりき
びしい条件下（すなわち０．３３規定の塩酸を用い１０
０℃で６時間）でヘパリンを加水分解し、ついでその生
物学的に不活性となつた加水分解生成物をコハク酸無水
物訃よび水酸化ナトリウムを用いて充分にサクシニル化
することによつてえられる生成物が抗凝血活性をほとん
ど有しておらず（０．０５ＵＳＰ単位／Ｍ９）、しかも
治療学的に充分な坑脂肪血症活性を有しているという驚
くべき事実を見出し、本発明を完成するにいたつた。す
なわち本発明はヘパリンのＮ−スルフエート基数に対し
１０７０未満のＮ−スルフエート基数を有し、２糖類単
位あたＦＯＯ．６ようも高いヘミーサクシニツク単位を
有する式；（式中、Ｎｆｍは８〜１５である）で示され
るグルコサミノグルカ／誘導体およびその製造法に関す
る。

前記式は、フィ・フィ・カツカ一（Ｖ．Ｖ．Ｋａ一Ｋｋ
ａｒ）およびデイ・ビ一・トーマス（Ｄ．Ｐ．Ｔｈ−０
ｍａｓ）編、「ヘパリンーケミストリ アンド クリニ
カル ユーシツジ（Ｈｅｐａｒｉｎ−Ｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙａｌｄＣｌｉｎｉｃａｌＵｓａｇｅ月、アカデミツク
プレス社発行（１９７６年）の１１頁にジエイ・キズ（
Ｊ．Ｋｉｓｓ）が記載しているヘパリンの式二（式中、
ｍ＋ｎは８〜１５である）で示される繰返し単位に基づ
いて示してある。

本発明の加水分解はヘパリン中のすべてのＮーサクシニ
ル基と一部のＯ−サクシニル基を加水分解するのに充分
な酸の濃度と反応時間の条件下で行なわれる。

そのつぎに行なうサクシニル化によつてその生物学的活
性およ物理化学的性質が再生された生成物をうることが
できる。生成物中の２糖類単位はヘパリンの２糖類単位
、すなわちα一Ｌ−イズロン酸−２−０−スルフエート
およびα一Ｄ−グルコサミノ一２−Ｎ−スルフエート一
６−Ｏ−スルフエートの１，４結合したものまたはβ−
Ｄ−グルクロン酸｝よびα−Ｄ−グルコサミノ一２−Ｎ
−アセチル−６−０−スルフエートの１，４結合したも
のが一部変化したものであつた（ヘパリンの構造につい
てはアール・ダブリユ・ジエーンロツ（Ｒ．Ｗ．Ｊｅａ
ｎｌＯｚ）の著書（１琵ｐ一ＡｒｉｎＳｔｒｕｃｔｕｒ
ｅ，．ＦｕｒｌｃｔｉＯｎａｎｄＯｌｉｎｉｃａｌＩｍ
ｐｒｉｃａｔｉＯｎｓｌ）またはアール・エイ・ブラツ
ドシヨウ（Ｒ．Ａ．Ｂｒａｄｓｈｗ）およびエス・ウエ
スラー（Ｓ．Ｗｅｓｓｌｅｒ）らの論文（Ａｄｖ．Ｅｘ
ｐｌ．Ｍｅｄ．ＢｌＯｌ．５２，３（１９７４））参照
）。生成物中にはヘミーサクシニツク単位（Ｈｅｎｌｉ
−Ｓｕｃｃｉｎｉｃｕｎｉｔ）が１つの２糖類単位あた
）１．２単位まで導入されている。これに対し、クツシ
ングによつて報告されている方法によれば、この値は出
発物質のヘパリンがそのＮ−スルフオニル基の３５％を
加水分解された場合に最大値を与えるが、わずかに０．
６である。本発明のサクシニル誘導体の抗凝血活性は出
発物質として用いたヘパリンの種類によつて異なるが、
いずれも１７Ｖあたう０．０５ＵＳＰ単位よ）も低く、
ほとんど失なわれているといつてよい。

それはヘパリンそのものの抗凝結活性が１臂あたシ１５
０〜１８０ＵＳＰ単位であることから明言できる。本発
明の物質にはそのほかに以下にあげる性質がある。（１
）出発物質として種類の異なるヘパリンを用いたとして
も生成物は一定の等電位フオーカリゼーシヨン（ＩｓＯ
ｅｌｅｃｔｒＯｆＯｃａＪｊｚａｌＯｎ）を有する。

さらに、該生成物は前記米国特許明細書に開示されてい
る生成物にくらべて平均のアニオン性の度合が小さい。
該アニオン性の度合は加水分解時間およびＮ−サクシニ
ル化の度合によつて異なる。クツシングの方法によつて
えられる生成物もまた加水分解の時間の違いによつて異
なる性質を示すが、しかしそれらの生成物はいずれも本
発明の誘導体と同様な等電位集中は示さない（第１図参
照）。第１図に示されるように、吸収帯のパターンが異
なるだけでなく、同じ発色方法でえられる色の強度も本
発明の誘導体からえられる色の方が薄いことから、本発
明の誘導体は着色剤との親和性の小さい、従来のサクシ
ニル誘導体とは構造の異なる物質であることがわかる。

（２）本発明の誘導体は以下に述べるように一定の電気
泳動特性を有している。

さらに、該酸導体は出発物質として用いたヘパリンのみ
ならずクツシングの方法によつてえられる誘導体に較べ
てその酸性度は低い。クツシングの方法によつてえられ
る誘導体の酸性度はその加水分解時間によつてかなｂ異
なるが、とくに加水分解の度合が低いものについては酸
性度の違いがよりはつきクしている。（３）本発明の誘
導体の構造は、後述するように、水素核磁気共鳴吸収ス
ペクトル（ＩＨ−ＮＭＲ）および１３ｃ−核磁気共鳴吸
収スペクトル（１３ｃ−ＮＭＲ）によつて分析されるが
、それによるとチツ素原子土のみならず部分的に酸素原
子土にもサクシニル化されていることがわかる。

前述したように、このサクシニル化の度合は１つの２糖
類単位あたク１．２個のヘミーサクシニツク単位である
。これに対しクツシングの方法によつてえられるサクシ
ニル化物を同じ方法で分析したばあい、サクシニル化の
度合は最大でも１つの２糖類単位あたＶＯ．６個のへミ
ーサクシニツク単位でしかない。（４） （一定の抗脂
肪血症活性） 種類の異なるヘパリンを出発物質として用いても、えら
れる生成物の脂肪分解酵素活性はもとのヘパリンの活性
の約５０％（平均値）である。

またその活性値はクツシングの方法（ ２．５〜３時間
の加水分解反応を特徴とする）でえられる誘導体の活性
値と比較した場合も約５０％であつた。しかしながら、
クツシングの方法でえられる誘導体の抗凝血活性は８〜
ＩＯＵＳＰ単位／Ｗ９であり、本発明の誘導体に較べる
とはるかに高い。また、これらの誘導体は両方とも該脂
肪分解酵素活性の有効時間はヘパリンに較べるとかなク
延長されている。（５）本発明の誘導体の急性毒性値（
ＬＤ５Ｏ値）は出発物質として用いたヘパリンまたはク
ツシングの方法によつてえられる誘導体のいずれにもま
さる。

具体的な数値で比較すると、ラツトを用い、静脈内投与
して測定したＬＤ，Ｏ値は、本発明の誘導体では３．４
９／ Ｋ’体重であるのに対し、出発物質として用いた
ヘパリンのナトリウム塩では０．９〜 １．０９／ Ｋ
９体重であり、クツシングの方法でえられる誘導体は２
．３９／ ４体重であつた。つぎに本発明の誘導体の製
造例およびその性質の測定方法について述べる。

なお、つぎの製造例でうることができる本発明のグルコ
サミノグルカン誘導体は以下、ＧＧＭという。製造例 （ＧＧＭの製造） 冷却管、撹拌棒およびチツ素ガス導入管を付した３ｔの
フラスコ中にチツ素気流を逐次導入して不活性雰囲気下
で操作ができるようにした。

ついで該フラスコ中に２ｔの蒸留水およびヘパリンのナ
トリウム塩２００９を加えた。この混合物を室温下で撹
拌して均一溶液とし、ついで２Ｎ−ＨＣｔの４００ｍｔ
を加えた。この反応液をチツ素ガスをパプリングする方
法によつて脱気し、さらにチツ素雰囲気下に保つたまま
沸騰水の水浴土で６時間反応させた。つぎに室温にまで
放冷したのち、氷浴中で反応液を冷却しながら水酸化ナ
トリウムの冷飽和水溶液を滴下してＰＨを８．５に調節
した。反応液の温度を５〜１０℃の範囲に保ちつつ、コ
ハク酸無水物４００ｇを滴下し、そのときＰＨを約８に
保つために水酸化ナトリウム水溶液を同時に滴下した。
滴下終了後、反応液のＰＨを７．４〜７．５に調節した
。さらに冷却下で反応液を３０分間撹拌し、ついで反応
液の３倍容量の９５％エタノールを加えることにより沈
澱をえた。該沈澱は初期において油状であつたが、放置
しておくと固体状となつた。該沈澱は吸引ろ過した後風
乾した。該沈澱はさらに蒸留水３ｔで再び溶解し、公称
カツトーオフ（ＮＯｍｉｎａｌｃｕｔ−０ｆｆ）の６０
０ダルトン（ＤａｌｔＯｎ）を有する透析膜を用いて透
析された水中にサクシン酸ナトリウムがみられなくなる
まで透析した。最後に水溶液を凍結乾燥し、ＧＧＭ２Ｏ
Ｏ９を針状晶としてえた。囚 等電位フオーカリゼーシ
ヨン 等電位フオーカリゼーシヨンの測定はピ一・ジ一・リゲ
ツテイ（Ｐ．Ｇ．Ｒｉｇｈｅｔｔｉ）およびイ一・ギア
ナツツア（Ｅ．Ｇｉａｎａｚｚａ）らの方法に従つて行
なつた（Ｂ．Ｂ．Ａ．、５３２，１３７（１９７８）参
照）。

該方法は７％Ｔ、１％ＬＫＢを２．５〜 ４，含むポリ
アクリルアミドゲル、１％ＬＫＢを３〜５％含むポリア
クリルアミドゲルおよび０．１％ＬＫＢを３．５〜１０
％含むポリアクリルアミドゲルを用いて等電位フオーカ
リゼーシヨンを測定するために用いられる。以下に述べ
る各試料を８Ｍ−尿素水溶液に溶かし、試料濃度を２０
ｍｆｉ／Ｍｔとした。

えられる試料溶液をホワツトマン紙（３ＭＭ）にそれぞ
れ等量ずつ（２５０μｇ）塗布した。このものを１２Ｗ
１００Ｖｍａｘ、温度９℃で３時間半展開し、発色は２
％酢酸に溶解したトルイジンを用いて行つた。えられた
等電位フオーカリゼーシヨン状態図を第１図に示すが、
１および２の番号を付した部分はいずれもＧＧＭの２５
０μ９を試料として用いた場合の等電位フオーカリゼー
シヨンである（ただし、１の番号を付した部分に用いた
ＧＧＭはその原料として用いたヘパリンのナトリウム塩
の抗凝血活性が１６５ＵＳＰ単位／１！１ｆのものであ
勺、２の番号を付した部分に用いたＧＧＭはその原料に
用いたへ？くリンの抗凝血活性が１７８ＵＳＰ単ｑ巧の
ものである）。３または４の番号を付した部分は抗凝血
活性の１６５ＵＳＰ単位／Ｗｉを有するヘパリンのナト
リウム塩をクツシングの方法でそれぞれ３０分間または
１８０分間加水分解したのちサクシニル化してえられる
誘導体の２５０μ９を試料として用いた場合の等電位フ
オーカリゼーシヨンである。

５の番号を付した部分は２，３および４の番号を付した
部分に用いた試料を製造するための出発原料であるヘパ
リンのナトリウム塩（抗凝血活性１６５ＵＳＰ単位／即
）の２５０〜を試料として用いた場合の等電位フオーカ
リゼーシヨンである。

（８）電気泳動特性 第２図に示した電気泳動特性はつぎの条件下で測定した
。

０．１Ｍ−バリウムアセテート溶液（ＰＨ５．８）に浸
漬したセルロースアセテート膜（ＳｅｐｒａｐｈＯｒｅ
一Ｇｅｌｍａｎｌ５．５ｃｒ！Ｌ×１１ｃｍ）を用い、
試刺３μ９を原点にスポツトしたのち、室温下に４０で
４時間電気泳動を行なつた。

つぎにアルシヤン・ブルー（ＡｌｃｉａｎＢ！Ｕｅ）１
５０′Ｖ，９５７Ｏエタノール１００ｒｒｔおよび０．
５Ｍ一酢酸ナトリウム溶液（ＰＨ５．８）１００ｍｔか
らなる呈色液を用いて呈色させた。このものは５％酢酸
で脱色することができた。

ダイアフアニゼーシヨン（ＤｉａｆａｎｉｚａｌｌＯｎ
）は酢酸１５容量７０、メタノール８４容量７０、トル
エン０．５容量％卦よびアセトン０．５容量７０からな
る混合物を用いて１分間行なつた。第２図に示す電気泳
動の特性パターン図においてＡ，ｂおよびｄで示したス
ポツトはそれぞれ異なる種類の市販ヘパリンからえられ
るＧＧＭに相当するスポツトである。

ｃで示したスポツトはクツシングの方法（加水分解時間
：２．５時間）によつてえられる誘導体（抗凝血活性：
１０ＵＳＰ単Ｑ７７Ｖ／に相当する。第３図に示した電
気泳動特性はつぎの条件下で測定した。

０．０５Ｍ−トリフルオロ酢酸に水酸化ナトリウムを加
えてＰＨを３に調節した溶液に浸漬したセルロースアセ
テート膜（ＳｅｐｒａｐｈＯｒｅ−Ｇｅｌｎｌａｎ，５
．５（１Ｘ１１Ｃ！ＩＬ）を用い、試料３μ９を原点に
スポツトしたのち室温下に４５Ｖで３時間電気泳動を行
なつた。

ついで、前述した方法と同じ方法で呈色およびダイアフ
アニゼーシヨンを行なつた。第３図に示す電気泳動の特
性パターン図に卦いて、ｂで示したスポツトは抗凝血活
性１６０ＵＳＰ単位／巧を有するヘパリンに相当し、ａ
で示したスポツトはそのヘパリンから本発明の方法でえ
られるＧＧＭに相当する。ｃまたはｄで示したスポツト
は同種のヘパリン（抗凝血活性１６０ＵＳＰ単位／巧）
を用い、クツシングの方法によつてそれぞれ加水分解時
間を３０分間または１８０分間としたのちサクシニル化
してえられる誘導体に相当する。（０１３０？ＮＭＲス
ペクトル分析 １３０−ＮＭＲスペクトル分析は２５．２ＭＨｚの１３
０−、、分析機を用い、ジオキサン−重水溶媒に溶かし
て行なつた。

またジオキサンを内部標準として用い、測定結果はＰｐ
ｍで表わした（ジ一・ガツテイ（Ｇ．Ｇａｔｔｉ）、ビ
一・ガス（Ｂ．Ｃａｓｕ）、ジ一・ケイ・パーマ一（Ｇ
．Ｋ．Ｈａｎｌｅｒ）｝よびエイ・エス・バーリン（Ａ
．Ｓ．Ｐｅｒｌｉｎ）らの論文（ＭａｃｒＯｍＯｌｅｃ
ｕｌｅｓ，ｌ２，ｌＯＯｌ（１９７９））参照）。（イ
）ＧＧＭの１３０−ＮＭＲスペクトル分析ＧＧＭまたは
ヘパリンのサトリウム塩を同じ条件下で測定した１３Ｃ
−ＮＭＲスペクトルのそれぞれを比較した。

えられたシグナルおよび両者のシグナルの違いをつぎに
示す。（１）サクシン酸残基のＣＯＯ−の炭素原子に相
当する新しいシグナルが１８１．８（Ｐｐｍ、以下同様
）にみられた。

（２）サクシン酸残基のＣＯＮＨの炭素原子に相当する
新しいシグナルが１７７にみられた。

（３）イズロン酸のＣＯＯＨの炭素原子に相当するシグ
ナルが１７６．７にみられ、これはヘパリンに訃いてみ
られるシグナルと一致した。

（４）グルクロン酸の１位の炭素原子に相当する小さな
シグナルが１０２にみられ、これはヘパリンにおいてみ
られるシグナルと一致した。

（５）イズロン酸の１位の炭素原子に相当するシグナル
が１００にみられ、これはヘパリンにおいてみられるシ
グナルと一致した。

（６） Ｎ−サクシニル・グルコサミンの１位の炭素原
子に相当する新しいシグナルが９５．３にみられた。

一方、出発物質であるヘパリンに特有のグルコサミン・
Ｎ−スルフエートの１位の炭素原子に相当する９７．７
のシグナルが消失した。（７） Ｎ−サクシニル・グル
コサミンの２位｝よび４位の炭素原子ならびにイズロン
酸の２位の炭素原子に相当する一連の新しいシグナルが
７２〜７６にみられた。これらのシグナルはヘパリンに
おいては互いに集まつて単一の強いシグナｌルであつた
。（８） Ｎ−サクシニルグルコサミンの３位および５
位の炭素原子ならびにイズロン酸の３位および５位の炭
素原子に相当する２本のシグナルが７０および７１にみ
られ、これはヘパリンの同二じ位置の炭素原子に相当す
るシグナルと同じであつた。

（９） Ｎ−サクシニルグルコサミンの６位の炭素原子
に相当するシグナルが６７にみられ、それはヘパリンの
Ｎ−スルフオニルグルコサミンの６５位の炭素原子に相
当するシグナルと同じであつた。

ＵＯ）Ｎ−サクシニルグルコサミンの２位の炭素原子に
相当する新しいシグナルが５４．５にみられた。一方、
ヘパリンのＮ−スルフオニルグルコサミンの２位の炭素
原子に相当する５８。８のシグナルが消失した。

Ｕ１） ＧＧＷ）−ＣＨ２ＣＯＯ−および−ＣＨ，℃０
−ＮＨ一に相当する２本の新しいシグナルがそれぞれ３
３．０訃よび３３．５にみられた。

（ロ）クツシングの方法（加水分解時間：１８０分間）
でえられる誘導体の１３０？ＮＭＲスペクトル分析クツ
シングの方法（加水分解時間：１８０分間）でえられる
誘導体（以後、Ｃ−１８０という）のの１３０−ＮｌＲ
スペクトルは前述（イ）のＧＧＭの１３０−ＮＭＲスペ
クトル測定結果のうち（１）〜（５）、（９）およびＵ
１）で示したシグナルと同じシグナルを有している。

グルコサミン残基の１位の炭素原子に相当するシグナル
（前言Ｉ２（６）で述べたシグナル）に関して、Ｃ−１
８０はＧＧＭでみられたＮ−サクシニルーグルコサミン
に特徴的なシグナルはみられずＮ一スルフオニルーグル
コサミンに特徴的なシグナルが存在していた。

このことからＣ−１８０はＮースルフオニル基が充分に
加水分解されていないままにサクシニル化されたもので
あ勺、Ｎ−スルフエート基とＮ−サクシニル基の両方を
含有しているものであることがわかる。Ｎ−スルフオニ
ル基またはＮ−サクシニル基を有するグルコサミンの３
位、４位｝よび５位の炭素に相当するシグナルおよびイ
ズロン酸の２位、３位、４位および５位に相当するシグ
ナルは７０付近訃よび７６付近に集まつている。

それゆえＣ−１８０はヘパリンのシグナルパターンとＧ
ＧＭのシグナルパターンの中間的なシグナルパターンを
有しているといえる（前言αイ）の（７）および（８）
参照）。さらには、Ｃ−１８０にはヘパリンに特有の５
８．８のシグナルがみられるが、ＧＧＭに特有の５４．
５のシグナルはみられないＪ前記イ）の０鯵照）。（ハ
）クツシングの方法（加水分解時間：３０分間）でえら
れる誘導体の１３０？ＮＭＲスペクトル分析クツシング
の方法（加水分解時間：３０分間）でえられる誘導体（
以後、Ｃ−３０という）の１３０−ＮＭＲスペクトルは
Ｃ−１８０の１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルとほぼ同じシグ
ナルパターンを示すがややサクシニル化の度合が低いこ
とを示している。

すなわち、Ｃ−１８０と同じ化学シフトのシグナルを示
すが、前記（イ）の（１）および（２）で述べたシグナ
ルに相当するシグサルの強共の（３）で述べたシグナル
に相当するシグナルの強度に対する割合はＧＧＭ｝よび
Ｃ−１８０のそれようも低く、それゆえＣ−３０はＣ−
１８０に較べるとサクシニル化の度合が低いといえる。
前記（イ）の（≦），（４），（５），（９）および（
社）で述べたシグナルに相当するシグナルはＧＧＭ訃よ
びＣ−１８０と一致した。

Ｎ−スルフオニルーグルコサミンの１位の炭素原子に相
当するシグナルが９７．７にみられ、その強度はＮ−サ
クシニルヘバリンの１位０炭素原子に相当する９５．３
のシグナルに較べて弱い。そのためＣ−３０のサクシニ
ル化の度合が低いことが再確認される（前記（イ）の（
６）参照）。さらには、Ｎ−スルフオニル基またはＮ−
サクシニル基を有するグルコサミンの３位、４位および
５位の炭素に相当するシグナルおよびイズロン酸の２位
、３位、４位および５位に相当するシグナルのパターン
（前記（イ）の（７？よび（８）参照）からＣ−３０は
ヘパリンとＣ−１８０の中間的な性質を有していること
がわかつた。Ｎ−サクシニルグルコサミドの２位の炭素
に相当するシグナルが５４．５にみられるが、その強度
はＮ−スルフオニルグルコサミドの２位の炭素に相当す
る５８．８のシグナルの強度に較べて弱い（前言αイ）
のＵＩ参照）。

（Ｄ） １ョ一ＮＭＲスペクトル分析 １Ｈ？ＮＭＲスペクトルはパリアンＸＬ−１００型の１
００ＭＨＺ−１１ｉ−ＮＭＲスペクトル分析機を用いて
測定し、ＧＧＭ．Ｃ−３０およびＣ−１８０のそれぞれ
のサクシニル化の度合を評価した。

その評価の方法は、２糖類単位あたｂに含まれる２個の
カルボン酸性の水素原子のシグナル強度（すなわち１つ
はイズロン酸に相当し、もう１つはＮ一サクシニルグル
コサミドに相当する）｝よびヘミ・サクシニル基（一凸
−ＣＨ，ＣＨ！ＣＯＯ−）の４つの水素原子のシグナル
強度の間の関係から算出することによつている。えられ
た結果についてつぎに述べる。（１） ＧＧＭのサクシ
ニル化の度合は１．２ヘミーサクシニツク単位／２糖類
単位である。

（２） Ｃ−３０のサクシニル化の度合は０．２ヘミー
サクシニツク単位／２糖類単位である。

（３） Ｃ−１８０のサクシニル化の度合は０．６ヘミ
サクシニツク単位／２糖類単位である。

以上の特性試験およびスペクトル分析から、本発明の誘
導体がクツシングの方法によつてえられる誘導体にくら
べてスルフエート基の加水分解訃よびサクシニル化の度
合がかなク高いものであることがわかる。

つぎに本発明の誘導体の毒性試験および薬理学的活性に
ついて述べる。

囚 急性毒性試験 ＧＧＭの急性毒性試験は２種類の実験動物（アルビノ・
スイス・マウス（オス、平均体重２２±１ｆ１）および
アルビノ・ウイスタ一・ラツト（オス、平均体重１８０
±１０９））を用い、静脈内投与、腹腔内投与および経
口投与による方法で行なつた。

これらの投与に使用するキャリヤ一としては生理溶液を
用いた。えられた結果をつぎに示す。アルビノ・スイス
・マウス 静脈内投与：ＬＤ５Ｏ＝３４１４Ｔ１！Ｉ！／り体重ア
ルビノ・ウイスタ一・ラツト静脈内投与：ＬＤ５Ｏ＝２
４００．２Ｔｆ１ｆ／り体重腹腔内投与：ＬＤ５Ｏ〉３
５００巧／！体重経口投与：ＬＤ，Ｏ〉５０００巧゛／
り体重これに対し、クツシングの方法でえられる誘導体
のＬＤ，Ｏ値はマウスを用いて試験したところ約２３０
０ｍｆ／！であつた。

（８）抗コレステリン過剰血症活性および抗トリグリセ
ラード過剰血症活性ＧＧＭの抗コレステリン過剰症活性
および抗トリグリセラード過剰血症活性はトリトン（Ｔ
ｒｉｔＯｎ：ＷＲ−１３３９）によつて生ぜしめたコレ
ステリン過剰血症およびトリグリセラード過剰血症につ
いて行なうエス・ガラツチニ（Ｓ．Ｇａｒａｔｔｉｎｉ
）、ピ一●モルプルゴ一（Ｐ．ｍＯｒｐｕｒｇＯ）１ア
一Ａ′１ゞオレツチ（Ｒ．ＰａＯｉｅｔｔｉ）らの方法
（Ａｒｍ．ＦＯｒｓｃｈ、９，２０６（１９５９）参照
）訃よびイ一・マルモ（Ｅ．ＭａｒｍＯ）、イ一・ラム
パ（Ｅ．Ｌａｍｐａ）らの方法（ＡｒｃｈｉｖＯｐｅｒ
ｌｅＳｃｉｅｎめＭｅｄｉｃｈｅ、１３２ｐ（３），８
３（１９７５）参照）にしたがつて評価した。

実験動物は無作為抽出した体重１９０〜２１０９のオス
のアルビノ・ウイスタ一・ラツトを用いた。

該実験動物をいくつかのグループに分け、１つのグルー
プにはキヤリヤ一として用いる生理溶液のみを２ｍｔＡ
９体重投与し、ほかのグループには（１）生理溶液およ
びトリトン２００７！！ｆ／Ｋｆ体重または、（２）生
理溶液、トリトンに加えてＧＧＭを第１表に示す投与方
法、投与量で投与した。

トリトンは１２時間絶食した（水は自由に与えた）ラツ
トに静脈内投与するが、その投与量は２００η／！であ
る。拮抗質として用いるＧＧＭはトリトン投与の２時間
前卦よび２時間後に腹腔内投与または経口投与した。ト
リトン投与と２回目のＧＧＭ投与の期間中に動物に餌を
与え、そののち食物を取ｖ除いた（水は自由に与える）
。トリトン投与から１２時間経過後、実験動物の心臓か
ら注射器を用いて血液を採取し、血中のトリグリセラー
ド訃よびコレステリン濃度を測定した。トリグリセラー
ド濃度の測定はエム・エツグシユタイン（Ｍ．Ｅｇｇｓ
ｔｅｉｎ）によるトリグリセラードを酒精カリでケン化
したのち、酵素学的に測定する方法によつた（Ｋｌｌｎ
．Ｗｓｃ抽．、４４，２６２（１９６６）参照）。コレ
ステリンの測定はピ一・ロシユラフ（Ｐ．ＲＯｓｈ！Ａ
ｖ）らの方法にしたがつて行なつた（Ｚ．．Ｋｌｌｎ．
Ｃｈｅｍ．Ｋｌｉｎ．ＢｉＯｃｈｅｍ．、１２，４０３
（１９７４）参照）。えられた結果を第１表に示す。ト
リトンを２００ＴＩ９を静脈内投与して過脂肪血症を誘
発せしめ、好脂肪性のギヤリヤーを用いたほかは前述の
方法と同様にして実験を行ない、血中トリグリセラード
濃度訃よび血中コレステリン濃度を測定した。

第２表にはキヤリヤ一としてトウイーン（Ｔｗｅｅｎ）
を用いた結果を示し、第３表にはキヤリヤ一としてトリ
グリセラードを用いた結果を示す。（０リポプロテイン
分解酵素活性（エジオル試験）本発明の誘導体のリポプ
ロテイン分解酵素活性は平均体重１９０±１０９のオス
のアルビノ・ウイスタ一・ラツトを用い、ビアンチニ（
Ｂｉａｎｃｈ一Ｉｎｉ）らの方法（１１！Ｂｉａｎｃｈ
ｉｎｉ．Ｇ．Ｇｕｉｄｉ．Ｂ．Ｏｓｉｍａ，ｌＢｌＯＯ
ｄＬｅｖｅｌｓＯｆｔｈｅＣｌｅａｒｉｎｇＦａｃｔＯ
ｒＡｆｔＥｒＡｄＯｌｉｎｉｓｔｒａｔｉＯｎＯｆａＮ
ａｔｕｒａｌＧｌｕｃｕｒＯｎＯｇｌｕｃＯｓａｍｉｎ
ＯｇｌｙｃａｎｌＢｉＯｃｈｅｍ．Ｅｘｐｌ．ＢｌＯｌ
．、Ｘ，（Ｎ．３）、１９７２．参照）にしたがつて行
なつた。

また実験動物は無作為抽出して６つのグループに分け、
普通に餌を与えた。（１）単投与したときの活性と時間
の関係本発明の誘導体またはクツシングの方法でえられ
る誘導体（抗凝血活性１０ＵＳＰ単位ノη）からなる薬
剤をそれぞれ１０巧／り体重および生理溶液を５ｍｔ／
Ｋ９体重実験動物に静脈内投与した。

つぎに５分後、１０分後、２０分後、４０分後、６０分
後および９０分後のそれぞれ前もつて決めておいた時間
ごとに実験動物にエーテルで麻酔をかけ、前もつてシリ
コネート（Ｓｉｌｉα墳Ａｔｅ）しておいた乾燥注射器
を用いて心臓から５ｍｔずつの血液を採取した。採取し
た血液は２０％クエン酸溶液０．２８ｍｔを含む目盛つ
き遠心分離管にすみやかに加え、４０００回転で１５分
間遠心分離し、清浄な血漿を分離した。一方、前もつて
淵過して安定化しておいたリポストレート（ＬｉｐＯｓ
ｔｒａｔＯ（ＥｄｉＯｌ−ＣａｌｂｉＯｃ一Ｈｅｍ））
の０．１８７０脂質エマルジヨン１ｍｔを含む試験管を
各試刺に対して用意しておいた。

この試験管内に試相の血漿２ｍｔを１分間かけて加え、
３０秒後に試刺液の６００ｎｍにおける光学的濃度を分
光光学的に測定し（そのときの光学的濃度（通常は約０
．７００Ａ）を１００と定める）、ついで１５分後の光
学的濃度を測定した。リポプロテイン分解酵素活性は光
学的濃度の減少値（Δ％）によつて評価した。本発明の
誘導体１０ｍｆ／！体重を投与したばあい、該活性は投
与の５分後に最大値の−２７７０に達した。

一方クツシングの方法でえられる誘導体の１０ワ／！体
重を投与した場合該活性は投与の１０分後に最大値の−
５０％に達した。いずれの場合でも投与の４０分後には
その活性はみられなくなつた。２）投与量と活性の関係 つぎにＧＧＭの投与量に対する活性の関係を調べた。

実験はラツトに静脈内投与する前記（１）の方法に準拠
して行ない、ＧＧＭの投与量を１匹のラツトあたう０．
２ｍｆ，０．３７１！Ｆｌ，Ｏ．６ワ、０．８巧、１即
、２巧、３巧、５哩と段階的に換えてラツトに投与した
。投与ののち５分後にラツトを殺生し、前記１）と同じ
方法でその活性値（Δ％）を測定した。投与量と活性値
（Δ％）をプロツトしてえられる曲線から求めたＧＧＭ
のＥＤ５Ｏ値は１疋のラツトあた）２．３７！１ｆｉ、
すなわち１１．５ｍｆ／！体重であつた。また最小有効
投与量は１匹のラツトあたＢＯ．７５Ｔｌ９、すなわち
３．７５巧／Ｋｆ体重であつた。これらの試験結果のみ
からは本発明の誘導体の治療学的指数は５５０〜１７０
０であう、クッシングの方法でえられる誘導体の治療学
的指数７００〜２３００よシもすぐれていないといえる
。

また、抗脂肪血症活性についてＧＧＭとクツシングの方
法でえられる誘導体を比較した場合、ＧＧＭの活性はク
ツシングの方法でえられる誘導体の活性の半分でしかな
い。

すなわちクツシングの方法でえられる誘導体の有効投与
量は０．５〜５１！９／に９体重であり、最適な投与量
は１〜３７１！ｆ／ＫＰ体重（１人のヒトに対しては約
７０〜２１０１）である。抗脂肪血症活性を発現せしめ
るに必要なＧＧＭの非経口投与の場合の最適投与量は２
〜１０巧／Ｋ９体重、すなわちヒト１人あたｂ約１４０
〜７００〜で）る。これらの結論はトリトＺによつて誘
発せしめた脂肪血症に対する前述の試験結果から導き出
した。しかしながら抗凝血活性を比較した場合、クツシ
ングの方法によつてえられる誘導体の抗凝血活性は１０
ＵＳＰ単位／Ｍｆであり、これに対しＧＧＭの抗凝血活
性はわずかに０．０５｛ＪＳＰ単位／ワである。これら
の活性値をヒト１人あた）の有効投与量に対して換算し
た場合、クツシングの方法でえられる誘導体は約７００
〜２１００ＵＳＰ単位である。そのため本発明の誘導体
の長所は凝血性の低下の危険が非常に少なく、とくに長
期間にわたつて脂肪血症の治療に用いられた場合の該危
険が低減されるということにある。さらにＧＧＭは経口
投与によつても血中トリグリセラード濃度およびコレス
テリン濃度を低下せしめることが可能であるため、経口
投与による脂肪血症の治療が可能になるという長所を有
する。

つぎに臨床実験のデータをあげ、本発明の誘導体の治療
学的な効果をさらに詳しく説明する。

ボランテイアとなつた健康体を有するヒトを以下４つの
グループに分け、それぞれ絶食させたのち、以下に述べ
る量のＧＧＭを蒸留したアピロゲン水（ＡｐｉｒＯｇｅ
ｎＨ２Ｏ）６ｍｔに溶カルて靜脈内に投与した。（グル
ープ １） ２５〜５５才のヒト６名（男性３名、女性３名）投与量
：９０ｍｆ（１．３〜１．６ワ／Ｋ′体重）（グループ
）３５〜５０才の男性６名 投与量：１００ｍｆ（１．３〜１．５１／り体重）（グ
ル＝プ Ｉ［）１回目の投与後、３週間を経過したグル
ープと同じ男性６名投与量：３００７！９（３．９〜４
．５巧／！体重）（グループ ）５０〜６０才のヒト６
名（男性４名、女性２名）投与量：１５０１１９（１．
９〜２．８７７？／！体重）ＧＧＭを投与する直前に採
血し、そのときの時間を０とした。

そののち５分後、１０分後、３０分後および６０分後に
採血した。採血した血液をクエン酸溶液とともに遠心分
離（３０００ｒｐｍ．１５分間）してえられる血漿 ５
（ＰａｒｔＩｙＯｎｌｎｔＯｔ♂ｂ！００ｄ）について
試験を行なつた。

脂肪分解酵素活性（光学的濃度）は前述のエジオル試験
による方法で測定し、血漿中のフリーグリセリン濃度（
ＭｍＯｌ／ｔ）、非エステル化脂肪酸５（ＮＥＦＡ）濃
度（ミリ当量／ｔ）および凝血時間（ＰＴＴ，単位：秒
）は通常の臨床検査方法によつて測定した。

第４表にグループｌのヒトからえられた結果の平均値を
示す。

第４表からつぎのことがわかる。

（１）脂肪分解酵素活性の最良値はＧＧＭ投与から５分
後にすでにみられ、そのときめ６００ｎｍにおけるエジ
オルの混濁度は３３．６％減少している（Δ弊＝−３３
．６７０）。

（２）フリーグリセリン濃度はＧＧＭ投与から５分後に
２００％以上の増加がみられ、６０分後には再び低くな
るが、それでも初期（０分）にくらべれば高い。

（３） ＮＥＦＡ濃度はＧＧＭ投与から５分後に約１０
０７０の増加がみられる。

第５表にグループのヒトからえられた結果の平均値を示
す。

第５表からつぎのことがわかる。

（１） ＧＧＭ投与から５分後に、脂肪分解酵素活性の
最良値（Δ？＝−２４％）、フリーグリセリンの最高濃
度（約１５０％増加）およびＮＥＦＡの最高濃度（約１
２０％増加）がみられる。

（２）凝血時間はいずれの採血時間においてもほとんど
一定であつた。第６表にグループのヒトからえられた結
果の平均値を示す。

第６表からつぎのことがわかる。

（１）ヒトひとクあたクにＧＧＭ３ＯＯｌ！ｆを投与し
た場合、投与から１０分後に脂肪分解酵素活性の最良値
（Δ？＝−４９％）、フリーグリセリンの最高濃度（約
３００％増加）およびＮＥＦＡの最高濃度（約４５０７
０増加）がみられる。

また６０分後に訃いてもＧＧＭが有効に作用しているこ
とを表わす数値を示している。第７表にグループのヒト
かられた結果の平均値を示す。

第７表から、ＧＧＭはグループのヒトにもグループ１，
およびのヒトに対する効果と同じ効果があることがわか
る。

さらにグループ，およびのヒトに対して、りヒト・グラ
ム（１ｉｐｉｄ０ｇｒａｍ：β−リボプロテイン、プレ
一β−リポプロテインおよびキロミクイン）を比濁法に
よつて測定し、測定値はＴｌｌｆ／血清１００ｍｔで表
わした。

それらの結果をつぎに述べる。（グループ１） ＧＧＭ投与直前のβ−リポプロテインの値は４２５〜４
５０であつたが、投与から１０分後には２５０未満に減
少し、６０分後には２５０〜３００となつた。

これに対しプレ一β−リポプロテインおよびキロミクロ
ンの値はほとんど一定に保たれたままであつた（それぞ
れ２７０〜２８０訃よび１１．７〜１２．２）。（グル
ープ） β−リポプロテイｙの値はＧＧＭ投与から１０分後には
１２０に減少し、６０分後には１５０〜２２０となつた
。

プレ一β−リポプロテイン｝よびキロミクロンの値に目
立つた変化はなかつた。（グループ）β−リポプロテイ
ｙの値はＧＧＭ投与の直前に１９０〜２２０であつたが
、投与から１０分後には１２０〜１３０となり、６０分
後もその値を維持していた。

プレ一β−リポプロテインの値はほとんど変化しておら
ず、キロミクロンの値はわずかに減少した。

【図面の簡単な説明】

第１図はＧＧＭ，Ｃ−３０およびＣ−１８０の等電位フ
オーカリゼーシヨンの状態図、第２図はＧＧＭおよびク
ツシングの方法でえられる誘導体の電気泳動特性パター
ン図、第３図はＧＧＭ、ヘパリン、Ｃ−３０およびＣ−
１８０の電気泳動特性パターン図である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ ヘパリンのＮ−スルフェート基数に対し１０％未満
   のＮ−スルフェート基数を有し、２糖類単位あたり０．
   ６よりも高いヘミーサクシニツク単位を有する式；▲数
   式、化学式、表等があります▼ （式中、ｎ＋ｍは８〜１５である）で示されるグルコサ
   ミノグルカン誘導体。 ２ ２糖類単位あたり１．２のヘミーサクシニツク単位
   を有する特許請求の範囲第１項記載のグルコサミノグル
   カン誘導体。 ３ ０．５ＵＳＰ単位／ｍｇよりも小さい抗凝血活性を
   有する特許請求の範囲第１項記載のグルコサミノグルカ
   ン誘導体。 ４ ０．１規定以上の強酸を用い、室温よりも高い温度
   でヘパリンを加水分解し、ついて７よりも高いｐＨ条件
   下で無水コハク酸と反応せしめることからなるヘパリン
   のＮ−ススルフエート基数に対し１０％未満のＮ−スル
   フェート基数を有し２糖類単位あたり０．６よりも高い
   ヘミーサクシニツク単位を有する式：▲数式、化学式、
   表等があります▼ （式中、ｎ＋ｍは８〜１５である）で示されるグルコサ
   ミノグルカン誘導体の製造法。 ５ 前記加水分離を７０〜１００℃の温度で３時間より
   も長い時間行なうことを特徴とする特許請求の範囲第４
   項記載の製造法。 ６ 前記加水分解を０．５規定以上の強酸を用いて行な
   うことを特徴とする特許請求の範囲第４項記載の製造法
   。 ７ 無水コハク酸と加水分解生成物の重量比を１：１〜
   １：５にしてなる特許請求の範囲第４項記載の製造法。 ８ ヘパリンのＮ−スルフェート基数に対し１０％未満
   のＮ−スルフェート基数を有し、２糖類単位あたり０．
   ６よりも高いヘミーサクシニツク単位を有する式：▲数
   式、化学式、表等があります▼ （式中、ｎ＋ｍは８〜１５である）で示されるグルコサ
   ミノグルカン誘導体を有効成分とする抗脂肪血症剤。 ９ 非経口投与に好適な形態に製剤してなる特許請求の
   範囲第８項記載の抗脂肪血症剤。 １０ グルコサミノグルカン誘導体の投与量が０．５〜
   ４０ｍｇ／Ｋｇ体重となるように製剤してなる特許請求
   の範囲第９項記載の抗脂肪血症剤。１１ 経口投与に好
   適な形態に製剤してなる特許請求の範囲第８項記載の抗
   脂肪血症剤。 １２ グルコサミノグルカン誘導体の投与量が３０〜３
   ００ｍｇ／Ｋｇ体重となるように製剤してなる特許請求
   の範囲第１１項記載の抗脂肪血症剤。