LU83435A1 - Glucosaminoglycanes modifiees exercant une activite antilipemique et essentiellement exemptes d'activite anticoagulante - Google Patents

Description

La pi1* >î-rit e h,\ ont ion concerne un cl·-rivé vb\ ‘ nu par une forte K-dcsulxatation d’héparine, puis par- une liei'.i-.svccî-nyiation complète du produit d’hydrolyse, Le produit- ainsi obtenu n’exerce pratiquement aucune activité anticoagulante (<0,05 unité U.S,P./mg (ü.S,P. = Pharmacopée des Etats-Unis d’Amérique)), mais il exerce une activité hypolipidémiante qui est encore thérapeutiquement importante et qui est particulièrement appropriée pour la thérapie d’états dyslipidémiques - Depuis longtemps, on connaît l’importance physiolo gique de plusieurs protéoglycanes et glucosaminoglycanes en dépit du fait que, fréquemment, on ne connaisse ni parfaitement ni même partiellement le rôle physiologique réel et le mécanisme ** de fonctionnement» Les expressions utilisées dans la présente spécification sont celles adoptées par J,F. Kennedy dans ·» "Proteoglvcans-Biological and Chemical Aspects in Human Life” — Studies in Organic Chemistry - volume 2 E sevier Scientific Publishing Company, Amsterdam-Oxford-K.Y, - 1979·

On connaît également la haute activité thérapeutique de plusieurs glycosaminoglycanes (naturelles ou synthétiques) telles que, par exemple, l’héparine et le sulfate de dextr-ane. La première a été utilisée longtemps pour la thérapie d’états d’hypercoagulabilité, pour la coagulation intravasculaire largement répandue, pour le traitement de la préthromboembolie et de la post-thromboembolie, comme décrit, par exemple, par « L,B. Jaques dans "Heparin, and old drug with a new paradigm1’ -

Science, 200, 526, (1979) : Y.V. Kakkar, B,P. Thomas - "Heparin Chemistry and Clinical Usage" - Academie Press, Londres-h.Y, I976, ainsi que dans des états de dyslipidémie, comme décrit par J,F, Kennedy, L.B. Jaques, Y.V. Kakkar, loc.cit. ; "Lipoprotein Métabolisme’ — Editor S, Eisemherg - Progress in Bio-ehemical Pharmacology, volume 15 ~ Sériés Ed. R, Paoletti, S. Karger. Bâle. 107c,

Bans le cas spécifique de ces derniers états pathologiques, l’ util isation t-hérapeut ique de l'héparine est basée sur un traitement- prolongé, même en faibles doses» A la Ion eue, ce traitement prolongé risque de provoquer, chez le patient, des états dangereux d’hypocoagulabilité. C’est pourquoi, on a tenté d’établir une séparation entre l’activité hypolipidé— miante de l’héparine et 1’activité qui a été considérée comme étant d’une nature hypocoagulatrice,par exemple, par des modifications structurales appropriées de l’héparine ou par fractionnement de l’héparine disponible dans le commerce. A présent, on a généralement reconnu et démontré que ces activités étaient associées à la formation, 11 in vivo1!, de complexes de „ glycosaminoglycanes/enzymes spécifiques. Ces complexes ont pour but, soit d’activer l’enzyme, par exemple, dans le cas du complexe antithrombine Ill/héparine en ce qui concerne l’activité anticoagulante de l’héparine, soit de rendre la catalyse plus aisée afin de mobiliser l’enzyme dans la circulation du sang, cette enzyme étant initialement· fixée aux parois des vaisseaux.

Tel est le cas spécifique pour le complexe lipoprotéine lipase (LPL)/héparine (Hep), qui constitue le mécanisme utilisé pour expliquer l’activité hypolipidémiante également appelée "activité clarifiante" qu’exercent, les glycosaminoglycanes comme décrit, par J.F. Kennedy i L.B. Jaques ; V.V. Kakkar et S. Eisemberg dans les publications mentionnées ci-dessus.

Il existe pas mal de doutes à propos de la nature de ces complexes, mais il est unanimement admis que le phénomène en cause est une interaction "in vitro" de nature exclusivement ionique comme décrit par J.F. Kennedy, page 173, et par L,B. Jaques dans les publications mentionnées ci-dessus, et également une Luteraet-ion vin vivo” de natixre ionique ou, tout au plus , d'une nature presque seul—polaire compte tenu de la structure polyanïonique de l'héparine, in fait, dans l'héparine, il existe plusieurs groupes sulfamidiques (Κ-sulfate), ainsi que plusieurs groupes sulfoesters (O-sulfate), les premiers étant plus labiles que les seconds vis-à-vis de l'hydrolyse acide (voir, par exemple, J,F,

Kennedy, page 229 J I, Danishefski, H,B. E-iber, J,J, Carr-Arch, Biochem. Biophys# £0j 114j I960 ; K,H, Meyer, D.E.

Schwartz - Helv, Chim. Acta, 3_3, 1651 j 1950)·

Cette constatation générale dérive d'un grand nombre d'observations expérimentales parmi lesquelles on * mentionnera la perte progressive d’activité anticoagulante et clarifiante suite à l'hydrolyse acide (avec des acides minéraux) des groupes X-sulfate jusqu’à l’élimination complète des deux types d'activité en raison de la N-désulxatation totale et de 1’0-désulfatation très réduite (voir J,F, Kennedy, page 229 ; S»S. Stivala, L. Yuan, J, Ehrlich, P,A, Liberti-Arch, Biochem, Biophys, 122, 32, I967 5 S,S, Stivala, P,A, Liberti-Arch, Biochem. Biophys. 122 « 40, 1967 ß S.S. Stivala, M, Herbst, 0, Kratky, I, Piltz-Arch, Biochem, Biophys, 127, 795 * 19 6 S J,

Il a été mentionné que ces activités pouvaient être rétablies à la fois qualitativement et quantitativement en régénérant les groupes K-sulfate par· réaction des produits „ d'hydrolyse avec le complexe pyridine/SO^ ou le complexe triméthylamine/SO^ (voir J.F. Kennedy, page 230, et L. Levy, F.J, Petracek - Proc, Soc. Exp. Biol. Med. 109, 901, 1962) ; en effet, grâce à cette opération, le caractère polyanionique de la glycosaminoglycane est rétabli au même titre que l'aptitude à former* le complexe ionique enzyme/héparine (voir S,S. Stivala, op. cit. 1967 ; et S.S. Stivala, op. cit. I96S)·

En dépit c’es remarques qui précèdent, Levy a stipuJ é que 1*hydrolyse acide (avec des acides minéraux) de 1*héparine avec un degré de K-sulfatâtion supérieur à 33k conduisait à un produit ayant subi plusieurs modifications irréversibles pouvant être attribuées à un début de dépolymérisation et/ou d'O-désulfatation, si bien qu'il est impossible de rétablir l'activité initiale après avoir à nouveau effectué la sulfatation. En d'autres mots, si l'on régénère les groupes sulfate du produit que l'on obtient après une forte hydrolyse, dont la structure est modifiée et qui, en lui—même est inactif, on ne rétablit pas pour autant le degré d'ionicité qui est suffisant pour créer le complexe enzyme/héparine modifiée avec perte de l'activité biologique jusqu'à des valeurs qui ” ne sont pas significatives.

Ces observations expérimentales, ainsi que d'autres telles que, par exemple, les rapports de J.F* Kennedy et V.V. Kakkar, op. cit., concordent avec les observations de Levy et avec l'hypothèse logique selon laquelle l'interaction entre des enzymes de type coagulant et l'héparine, ainsi que l'interaction entre L.F.L. et l'héparine sont, pour les deux types de réaction, basées sur une affinité de nature électrostatique, c'est-à-dire anionique, cependant qu'il existe une différenciation entre ces deux mêmes types d'interaction.

Etant donné que l'interaction de L.P.L./héparine est d'une nature lipophile légèrement plus forte en raison de la nature » de l'activité de L.P.L., on a abouti à plusieurs conclusions : 1) L’activité lipasémique de plusieurs préparations pharmaceutiques disponibles dans le commerce est due à l'utilisation de substances actives qui sont soit l'héparine, soit des dérivés naturels plus ou moins désulfatés. Ces substances exercent une activité anticoagulante intrinsèque qui est 1 >„. u jours t rcs · 1 λ > c dcns le '.'ut de η ι m.*:· î.ser 1 «?s rAsqtvs dus à une hypocoagulabiT.it-é suite à un -traitement· prolongé c ; . : c’est. le cas lors de la thérapie de la dyslipidémie.

2) L1étude de nouveaux dérivés de glycosaminoglycanes , qui ont été modifiés vis-à-vis des produits naturels, mais qui sont toujours spécifiquement du type de l’héparine en ce sens qu’ils sont toujours des dérivés d’héparine, doit être basée sur une modification atteignant un degré tel que le produit final conserve toujours un important degré d’anio-nicité.

3) La matière de départ utilisée pour obtenir ces dérivés ne peut être que 1*héparine elle-même ayant subi une désulfatation à un degré différent et dans laquelle le caractère anionique a été rétabli avec introduction de groupes anioniques contenant de l1azote, ces groupes étant moins ionisés que le groupe sulfate, par exemple, des groupes carboxyliques. Ces dérivés exercent une activité lipoprotéino-lipasique qui est toujours importante, avec une activité anticoagulante réduite, si bien que ces dérivés réduisent les risques dihypocoaguiabilité en thérapie humaine. Toutefois, pour les raisons déjà invoquées, la N-désulfatation, de même que la régénération ultérieure du groupe anionique contenant de 1*azote ne doivent jamais dépasser 33—35% des groupes N-sulfate initialement présents. En effet, on ne désire pas obtenir un produit final ”reconstitué” qui possède un caractère extrêmement lipophile, qui est trop peu anionique et qui ne convient pas pour former- un complexe avec L.P.L. Bon nombre de travaux de recherches ont été entrepris sur la base de ces observations, spécifiquement sur les dérivés K-succiny-liques de l’héparine, plus ou moins hydrolyses, comme décrit par I.B. Cushing dans le brevet des Etats-Unis d’Amérique n° / /\ * !. . t' I .· 1 . - J .\ / ; » , .

. ; 3.118.816 accordé le 21 janvier 1964 à la firme "Abbott Labs" et ayant pour titre : "N-Succinyl heparin and Process" (= X—succi— nyl—héparine et son procédé de préparation), ainsi que dans les revendications du même brevet. La revendication la plus importante de ce brevet est celle basée sur la substitution (à un degré ne dépassant pas 35% des groupes K-sulfate de l'héparine constituant la matière de départ) par les groupes N-succinyle en conformité avec les travaux de Levy. Cette revendication est également basée sur l'hypothèse selon h laquelle on a réduit excessivement l'activité lipasémique des dérivés N-désulfatés qui ont été ensuite soumis â une succinylation avec un degré de N-désulfatation supérieur à 35%· En effet, ces composés ont un caractère anionique trop faible, si bien qu'ils ne sont pas en mesure de former le complexe activateur "L.P.L./héparine modifiée.' Les mêmes conditions d'hydrolyse acide avec HCl 0,086X au cours d’une période maximale de 3 heures permettent d’obtenir un dérivé qui est exclusivement N-désulfaté dans les intervalles décrits ci-dessus et ce, sans aucune O-désulfatation ou X-désacét3rlation. Ce produit de base que l'on pense être un produit optimum lorsqu'il a subi une succinylation avec du chlorure de succi-nyle dans du benzène et du bicarbonate de sodium, forme un complexe de N-succinyl-héparine qui est suffisamment ionique pour formier le complexe avec L.P.L.,si bien qu’il est rendu soluble dans le plasma et exerce une activité clarifiante correspondante. Toutefois, cette activité n'est pas suffisante pour permettre l'interaction avec l’antithrombine III, si bien que l'activité inhibitrice exercée par l’héparine dans les phénomènes de coagulation, est perdue. En d'autres mots, le brevet des Etats-Unis d’amérique n° 3»HS.8lô a eu pour objet de préparer un produit exerçant une activité clarifiante com-

; A

Tir-sble a l’activité de 1 Ma'paii ne, ni s sans .bercer la haut·»* activité ccagu! at ri ce de cette d<-r.mere» La revend:» cation 5 de ce brevet est basée sur 1*utilisation d’un acide dilué et les exemples décrivent 1*utilisation d’un acide minéral en une concentration ne dépassant pas 0,086>i.

La haute activité lipasémique du produit obtenu démontre que la méthode adoptée par ces chercheurs est correcte* Toutefois, même si elle est réduite vis—à—vis de l’héparine constituant la matière de départ, l’activité anticoagulante résiduelle (8—10 unités U.S*P*/mg) est toujours trop élevée pour que l’on puisse envisager une utilisation sans risque d’hypocoagulation en thérapie humaine au cours d'une période prolongée. Dans une publication récente (j. Biochem, 8l_, 9&9 > 1979)* K. Nagasawa et al* maintiennent que les héparines N-désulfatées à des degrés différents et même à des degrés élevés conservent 62 à 79a de l’activité anticoagulante initiale, ce qui est manifestement en contradiction avec les résultats obtenus au cours des recherches précitées de Levy et Stivala, ainsi qu’avec les résultats obtenus par la Demanderesse.

Toutefois, il doit être tenu compte du fait que Nagasawa a effectué la désulfatation avec du diméthylsulfoxyde et du méthanol à la température ambiante, c’est-à-dire dans des conditions très différentes de celles adoptées pour obtenir le produit de la présente invention (acides minéraux de différentes concentrations et à des uempéi-atures qui sont toujours supérieures à la température ambiante).

L’exposé ci-dessus résume l’état de la technique antérieur à la présente invention. De façon étonnante, la Demanderesse a trouvé que,dans des conditions d’une hydrolyse beaucoup plus intensive (c’est-à-dire avec HCl 0,33-' à une .selon les travaux de J_evy, le produit d*hydrolyse de 1*héparine était biologiquement inact if et qu * après succinylation corap] etc avec de 1*anhydride succinique et du N a OH , on obtenait un dérivé pratiquement exempt de toute activité anticoagulante (soit moins de 0,05 unité U.S.P./mg), tandis que l1activité clarifiante était toujours thérapeutiquement importante.

Les conditions dlhydrolyse concernant la concentration de l1acide et le temps de la réaction, sont calculées de façon à provoquer une N-désulfatation totale et une O-désulfatation réduite. La succinyiation intensive effectuée ultérieurement aboutit à la formation d!un produit qui est toujours reproductible en ce qui concerne son activité biologique et ses propriétés phvsicochimiques. Dans le produit obtenu, 1*unité disaccharide est à base d1 héparine, laquelle est- constituée du 2-G-sulfate décide y-L-iduronique et du 6-0-sulfate d*a;-D-glucosamino—2-N—sulfate avec une liaison 1,4 ou qui est constituée du 6-0-sulfate d*acide t-D-glucuronique et du 6-0-sulfate d * ce—D—glucosamine·—2—K—acétyle avec la liaison 1,4 comme décrit par R.W. Jeanloz I!Heparin. Structure, Function and Clinical Implications”, Edition R.A. Bradshav; et S. Wessler · Adv. Expi. Med. Biol. 52_} 3, 1974·

Dans ce produit, on a introduit des unités hémi-succiniques jusqu1à ce quIon atteigne 1,2 unité disaccharide.

En contraste direct, dans les produits mentionnés par Cushing, cette valeur est, tout au plus, de 0,6 lorsque 1*héparine initiale subit une hydrolyse au cours dtune période de 3 heures avec une R-désulfatation à 35a correspondant a la limite maximale.

Tous les produits obtenus sous forme du dérivé succinyle suivant la présente invention présentent une perte totale d1activité anticoagulante qui est inférieure à 0,05 unité ü.S.P./mg et cette caractéristique a été vérifiée avec tous les types d’heparines qui ont été utilisés comme matière de départ·· En fait, cette car a et- erist ique a été conrirmee au cours d1expériences effectuées avec de 1 *héparine ayant une activité anticoagulante se situant entre 150 et i80 unités U.S.P./mg· En outre, on a observé les propriétés suivantes : 1) Le produit a une composition qui est d'une nature constante lors de 1*isoélectrofocalisation en utilisant différents types d’hépar-ines comme matière de départ· De plus, ce produit possède un degré moyen d’anionicité qui est sensiblement inférieur aux valeurs obtenues suivant le brevet précité des Etats-Unis d*Amérique, ces valeurs variant en fonction de la durée d’hydrolyse et, partant, en fonction du degré de N-succinylation. De même, les produits obtenus suivant Cushing varient entre eux suivant la période d’hydrolyse et aucun de ces produits ne manifeste, lors de l’isoélectrofocalisation, un comportement semblable à celui du dérivé de la présente invention (voir figure l).

La figure 1 montre qu’en plus d’une variation survenant dans le profil des bandes, l’intensité de la coloration est, avec un dépôt égal, plus faible dans le cas du produit de la présente invention, ce qui démontre une différence structurale, c’est-à-dire une plus faible affinité vis—à—vis des agents colorants· 2) Le produit préparé suivant la présente invention a un comportement constant lors de l’électrophorèse, conjointement avec les propriétés mentionnées ci—après. En outre, il possède un plus faible degré d’acidité totale non seulement vis-à-vis de l’héparine utilisée comme matière de départ, mais également vis-à-vis des dérivés obtenus par Cushing. En outre, les dérivés obtenus par Cushing sont sensiblement différents l’un de l’autre suivant la période d’hydrolyse et cette différence est· plus évidente enuore lorsque le degré dHydrolyse est· faible.

3) Lorsqu1on analyse les propriétés du dérivé suivant- la présente invention par spectrométrie de résonance magnétique nucléaire protonique, ainsi qu’avec C^a ainsi qu’on le décrira ci-après, on observe un haut degré de succi-nyiation sur l’atome d’azote et, en partie également, sur l'atome d'oxygène. Ce degré de succinylation est de l’ordre de 1,2 unité hémi-suecinique /unité disaccharide, ainsi qu'on l'a mentionné ci-dessus. En contraste direct, lorsqu'on examine les mêmes types de spectres obtenus avec les produits de Cushing dont le degré d'hydrolyse initiale est variable, on observe tin degré maximum de succinylation de l'ordre de 0,6 unité hémi-succinique/unité disaccharide.

4) Activité antilipémique constante ; lorsque, comme matière de départ pour l'hydrolyse, on utilise plusieurs types d'héparines d'origines différentes, on obtient toujours une substance exerçant une activité lipasémique constante égale à environ 50% de l'activité de l'héparine constituant la matière de départ (valeur qui est acceptable comme mo3renne pour différents échantillons).

Cette activité correspond également- à 50%e de celle obtenue avec le dérivé de Cushing, c'est-à-dire le produit d’hydrolyse après une période comprise entre 2,5 et 3 heures. Toutefois, ce produit exerce toujours une activité anticoagulante se situant entre S et 10 unités U.S.P./mg. Il est à noter que l’activité lipasémique de l'héparine est beaucoup plus prolongée à la fois dans le cas du dérivé préparé suivant-la présente invention et dans le cas du dérivé prépare suivant Cushing.

/' ar- i'' 5) La toxicité aiguë est· plus faible que celle de 1*héparine constituant, la matière de départ, ainsi que celle du produit de Cushing qui est obtenu par hydrolyse pendant une période de 2,5 à 3 heures et qui exerce une activité anticoagulante se situant entre S et 10 unités U.S.P./mg.

En effet, chez les rats, la valeur- DL^q (= dose létale à 50%) par administration intraveineuse est de 3*4 g/kg* tandis que la toxicité aiguë du sel de sodium de 1'héparine de départ est d'environ 0,9-1 g/kg, la toxicité aiguë du dérivé de Cushing étant de 2,3 g/kg»

On donnera ci-après un exemple de préparation et de détermination des propriétés du produit suivant la présente invention.

Préparation

Dans un ballon de 3 litres muni d'un réfrigérant, d1 un agitateur mécanique et d'une admission d’azote en vue de travailler sous une atmosphère inerte, on dépose 2 livres d'eau distillée et 200 g du sel de sodium dfhéparine. Tout en agitant, on dissout le produit à la température ambiante, puis on ajoute 400 cm3 de HCl 2N. On élimine llair de la solution claire au moyen d'azote et, tout en maintenant une atmosphère d'azote, on dépose la solution dans un bain-marie bouillant et on la maintient dans ces conditions pendant une période de 6 heures* On refroidit ensuite la solution à la température ambiante et, tout en refroidissant à la glace, on porte le pH à S,5 par addition d'une solution saturée froide de NaOH. Tout en maintenant la température dans l’intervalle initial de 5 s 10°C et le pH, à une valeur d'environ 5 par-addition d'une solution de KaOK, on ajoute, par- portions, 400 g d'anhydride succinique. L'addition finale porte le pH à une valeur d'environ 7,4 à 7*5. On maintient 1ε solution froide sous agitation pendant 30 minutes* puis on ajoute trois volumes d’éthanol à 95°· On essore à la trompe le précipité formé qui est initialement huileux,mais qui devient solide lorsqu’on le laisse reposer, après quoi on le sèche à l’air.

On redissout le précipité dans 3 litres d’eau distillée et on le soumet à une dialyse dans un appareil d’une élimination nominale de 600 daltons vis-à-vis de l’eau distillée et jusqu’à élimination du succinat-e de sodium. On soumet ensuite la solution finale à une lyophilisation. On obtient 200 g d’un produit sous forme d’aiguilles,

Isoélectrofocalis ation

On effectue la détermination suivant la méthode de P,G, Righetti et E, Gianazza, B,B«A, 532, 137 (1978)· On utilise 7/o de gel de polyacrylamide T contenant 1% L.R.B.

2,5-4/0 j 1% L.K.B. 3-5 * 0)1% L.K,B. 3*5-10 ampholine. On dissout les échantillons dans de l’urée 8M en une concentration de 20 mg/ml, puis on les applique sur du papier- "vfhatmann” (3MM) en quantités égales pour tous les échantillons (-50 pg J.

/

On effectue les essais dans les conditions suivantes : l/2 heure + 3 heures ; 12 W et 100 V maximum ; T = 9°C* Coloration : bleu de toluidine dans de l’acide acétique à 2,1.

Les résultats sont repris en figure 1 dans laquelle les parties 1 et 2 se rapportent au dérivé de glycosaminoglycane, 250 (on a utilisé deux préparations provenant de charges différentes du sel de sodium d’héparine, préparation commerciale, exerçant une activité anticoagulante de 105 et I7S unités U.S,P,/jtç.’·

Dans les figures annexées, les parties 3 et 4 ont été obtenues avec des dérivés provenant d’une charge du sel de sodium d’héparine ayant une activité anticoagulante de 165 unités U,S.P./mg, préparée suivant le procédé de Cushing avec des durées d’hydrolyse de 30 minutes et de ISO minutes respective- î.-‘-nt , «_·.η une cu^t ent rai i ...»ri de* -50 jig» La partie 5 co; a-espo; ici au sel de sodium d’héparine ayant· une activité anticoagulante / de 105 unités U,S*P*/mg et à partir de laquelle on obtient les dérivés correspondant aux parties 2, 3 et 4 en une concentration de 250 ^ig*

Electrophorèse

Les résultats d’électrophorèse reproduits en figure 2 ont été obtenus dans les conditions suivantes : acétate de baryum 0,1M, pH : 5*8 j pellicule d’acétate de cellulose (Sepraphore III—Gelman) de 5*5 x 11 cm \ tension : 40 V ; essai effectué pendant une période de 4 heures à la température ambiante ; dépôt de 3 ^ig* Coloration : bleu Alcian sous 5 forme d’une solution de 150 mg dans 100 ml d1éthanol à 95e* dilué à 1:1 avec de l’acétate de sodium 0,5M, pH = 5*8·

On détermine la décoloration dans de 1*acide acétique à 5%· On effectue la diaphanisation avec une solution d’acide acétique à 15%9 du méthanoi à 84.Î* du toluène à 0,5£ et de l’acétone à 0,5% pendant une minute*

En figure 2, les taches a, b et d ont été formées avec des dérivés obtenus suivant la présente invention en utilisant, comme matière de départ, trois charges différentes d’héparine commerciale* La tache c a été obtenue avec le dérivé préparé suivant la méthode de Cushing après hydrolyse pendant 2,5 heures, l’échantillon ayant une activité anticoagulante résiduelle de lû unités ü*S.P*/mg,

Les résultats repris en figure 3 ont été obtenus dans les conditions suivantes : solution d’acide trichlor— acétique 0,05M réglée à un pK de. 3 avec du KaOH ; pellicule d’acétate de cellulose (Sepraphore XXX—Gelman) de 5*5 x 11 en. ; tension : 45 V : essai effectué pendant une période de 3 heures à la température ambiante : dépôt· de 3 ug* La coloration a été / ~ di'l-<*j jiii.née comme décrit ci-dessus· On a c galt-ment dct-«-rîi.liié la diapbanisation comme décrit ci—dessus.

En figure 3, la partie a a été obtenue avec l e .··' : vé préparé suivant la présente invention en utilisant, cor.r-c-matière de départ, de 1*héparine ayant· formé la partie h , c'est-à-dire de l'héparine à 1:0 unités t'.S.P,/mg, La p: i x i e c a été obtenue avec un produit préparé suivant la méthode de Cushing après hydrolyse acide de la même héparine pendant 30 minutes, tandis que la partie d a été obtenue avec un autre produit préparé suivant la méthode de Cushing après hydrolyse acide pendant l8o minutes, toujours en utilisant la même héparine comme matière de départ*

Spectre de résonance magnétique nucléaire_ C du dérivé de glycosaminoglycane

Les résultats ont été obtenus à 25,2 MHz dans du dioxanne—Do0 ; étalon interne : dioxanne (67,4 parties par-million) : les résultats sont exprimés en parties par million. Le procédé adopté a été décrit par G* Gatti, E« Casu, G,K,

Hamer et A,S, Perlin, !!Macromolecules!I 12, 1001 (1979)·

Le spectre comparé à celui du sel de sodium de 1'héparine (ces spectres étant déterminés dans les memes conditions), donne les différences et signaux suivants : 1) On observe un nouveau signal à l8l,8, attribuable au C00 du radical succinique $ 2) un nouveau signal à 177,attribuable au -C0NH du radical succinique : 3) un signal à 176,7, attribuable au C00H du radical iduronique,analogue à celui de l'héparine \ 4) un petit- signal à 102, attribuable au C^ des petites quantités du radical d'acide glucuronioue,analogue-à celui de 1*héparine 5 5) un signal à 100, attribuable au du radical d 1 acide i dur oni que ? an a 1 o gue à celui de l‘héparine ; 6) un nouveau signal à 95?3? attribuable au de 1‘unité de N-succinyl—glucosamine, D*une manière analogue, on observe la disparition du signal à 97? 7? ce signal étant attribuable au du radical de X-sulfate de glucosamine oui , est caractéristique à 1‘héparine constituant la matière de départ ; 7) une nouvelle série de signaux entre 72 et J6, attribuables aux CL et C. du radical X-suceinylglucosaminique, “ 4 ainsi qu*au C0 du radical iduronique ·, ces signaux du spectre de 1‘héparine sont rassemblés en un seul signal intense h /6 : 8) une paire de signaux à 70 et 71? attribuables aüxCA et C_ du radical N-succinylglucosaminique, ainsi qu’aux o d

Ch et- Ch du radical iduronique, ces signaux étant analogues d b a ceux des mêmes atomes de l’héparine ; 9) un signal à 67? attribuable au du radical X-succinylglucosaminique. ce signal étant analogue au signal du Cg du radical X-sulfonyle de 1‘héparine ; 10) un nouveau signal à 54?5? attribuable au C0 du radical N—succinylglucosaminique. En même temps, on observe la disparition du signal à 5B?S? attribuable au Ch du radical N—suifonylglucosaminique dans le spectre de l’héparine 5 11) deux nouveaux signaux a 33 et 33?5? attribuables aux — CHr.COQ- et —CH,-,—CO—NR- du radical succinique de 1ε X-succinyl—héparine.

Spectre de résonance magnétique nucléaire-_du dérive obtenu suivant la méthode de Cushing après hydrolyse acide-pendant ISO minutes 1 O ,

Le spectre °C du produit donne les signaux décrits dans les paragraphes 1-5; 9 ex 11 ci-dessus pour le compose Γη ·: f- .T.«i c.->nç*.-rj»e le -·1 y:.al du :--u du J '· d ' a I glucosaminique, qui est. décrit dans le paragraphe 6 cx-dessus, on observe 1* apparition du pic dû à la X-succxny 1 glucos?xi;>o . tandis que l'on observe toujours le pic dû au du radical N-s ul f o ny 1 gl ucos amini qu e f ce qui démontre que, dans cet échantillon, la X-désulfatation est incomplète et qu'zl y a toujours un mélange de groupes X—sulfate et X-succmyle.

Les signaux dus aux C„, C. et C_ du radical X—

O H· O

sulronyle ou du radical X—succinyl—glucosammique, ainsi qu'aux C9, C9, C. et C- du radical iduronique, apparaissent sous forme d'une série de pics qui peuvent être groupés en deux groupes principaux aux alentours de 70 et· 7^· En consc-- quence, l'état de choses se situe à un stade intermédiaire entre le cas de l'héparine et celui du dérivé préparé conformément à la présente invention (paragraphes 7 et 8 décrits ci-dessus)·

On note l'apparition d'un nouveau pic à 54*5* correspondant au pic décrit dans le paragraphe 10 du dérivé faisant l'objet de la présente invention* Toutefois, le signal apparaissant à 5S,S et indiquant la présence du carbone C9 du radical X—sulfonyigiucosaminïque de l'héparine est toujours présent.

Spectre de résonance magnétique nucléaire °C du dérivé obienu suivant Cushing après hydrolyse acide pendant une période de „ 30 minutes

Le spectre est analogue à celui de l'échantillon obtenu après hydrolyse acide pendant ISO minutes et il indique un faible degré de succinylation. En effet, tous les pics décrits pour le produit obtenu après hydrolyse pendant 1*0 minutes, sont toujours présents. En particulier, les pics décrits dans les paragraphes 1 et 2 sont beaucoup moins intenses que- le pic décrit dans le paragraphe 3 à propos des spectres du. composé de glycosaminoglycanes ex du composé obtenu «près hydrolyse pendant ISO minutes, ce qui indique un plus faible degré de succinylation.

Les pics décrits dans les paragraphes 3> 4* 5S 9 et 11 sont les mêmes pour le produit de glyccsaminoglycane et pour le produit obtenu après hydrolyse pendant ISO minutes. Le signal de du radical de (X-sulfcnyl-glucosamine) à 97*7 est présent, mais plus intense près du signal de de la X-suceinyl-héparine à 95j3, ce qui démontre à nouveau un faible degré de succinylation (paragraphe 6 ci-dessus). Les signaux dus aux C„, C, et C_ du radical X-sulfonyl- ou X-succi-nyl-glucosaminique, ainsi que ceux dus aux C23 C0, et du radical iduronique (paragraphes 7 et b ci-dessus) apparaissent sous une forme intermédiaire se situant, entre les signaux du produit obtenu après hydrolyse pendant 180 minutes et les signaux obtenus avec 1*héparine comme matière de départ.

Le pic accentué à 54*5 du C0 du radical X—succinyl-glucosaminique est proche du pic à 58*S dû au radical X—sulfo-nyl-glucosaminique, le premier· étant plus intense que le second (paragraphe 10 ci-dessus).

Spectre de résonance magnétique nucléaire 1H enregistré avec ; "Varian XL-10011 à 100 MHz

On utilise les spectres de résonance magnétique nucléaire 1H afin de déterminer- le degré de succinylation en établissant mie relation entre le signai c5hydrogène dans Cl, deux atomes d1hydrogène/unité de disaccharide, à savoir un pour l1 unité iduronique et un pour· 1*unit é glucosaminique . ainsi que le signal des atomes d!hydrogène de l*acide succi-nique, soit un total de 4 atomes d*hydrogène/radical d*acide succinique. On obtient les résultats suivants : 1} ik-j-ivé préparé suivant 3 a prsii-nte invi*nt j on : 1,2 unité d’acide suctinique/unit-é de disaccharide $ 2) dérivé obtenu suivant Cushing après hydrolyse acide pendant 30 minutes : 0,2 unité d’acide succinique/ unité de disaccharide ; 3) dérivé obtenu suivant Cushing après hydrolyse acide pendant l80 minutes : 0,6 unité d’acide succinique/ unité de disaccharide.

En conclusion, ces essais démontrent que le dérivé obtenu suivant la présente invention est le résultat d’un plus haut degré de désuifatation et de suceinylat-ion comparativement au dérivé obtenu suivant Cushing, tandis que le produit obtenu suivant la présente invention a subi une hydrolys acide dans des conditions plus rigoureuses que celles adoptées par Cushing, c’est-à-dire une hydrolyse pendant une période de l80 minutes.

Toxicité

La toxicité du dérivé de glycosaminoglycane, qui sera démontrée dans les exemples ci-après, lesquels illustrent l’activité lipasémique et l’activité clarifiante, a fait l’objet d’essais sur deux espèces d’animaux, c’est-à-dire sur des souris par voie intraveineuse, ainsi que sur des rats par-voie intraveineuse, et également par- voie intrapéritonéale et par voie orale. Le support utilisé est une solution physiologique. Les valeurs DI._r exprimées en mg/kg sont les suivantes :

Espèce ; souris males albinos "Svriss" d’un poads moyen de 22+ 1 g.

Administration intraveineuse : DL_r. — 3»414 Œg/kg (2.027,6-3.826,2).

• _t) -

Espèce : rats albinos reales "Wistar” d'un poids moyen de lSOtlO s.

Administration intraveineuse : DL_q * 2.400,2 mg/kg (2.100,2-2.782,6) : administration intrapéritonéale : DLj.q : > 3»500 mg/kg administration orale : DL_~ : > 5·000 mg/kg.

oO

La valeur DL.r obtenue chez la souris par administra- i0 tion intraveineuse du dérivé préparé suivant Cushing est d'environ 2.300 mg/kg.

Activité sur 1'hypercholestérolémie et 1'hypertriglyeéridemie provoquées par- "Triton” L'activité hypocholestérolémiante et l'activité hypotriglycéridique ont été déterminées par l'essai d'hypocholestérolémie et d'hypertriglycéridémxe au moyen de "Triton” (WR-I339) comme indiqué par* Garattini S., Morpurgo P., Paoletti R. : Arzn. Forsch, £, 20ό (1959ί î E, Marmo, E. Lampa et al. : Arehivo per le Scienze Mediche 132, (3), &3 (1975).

On a effectué les expériences avec des rats albinos mâles adultes de la famille "Wistar" pesant entr*e 1Q0 et 210 g et préalablement choisis au hasard.

On divise les animaux en groupes de 10 : un groupe reçoit uniquement le support du produit à examiner, c'est-à-dire la solution physiologique, tandis que l'on traite les autres groupes avec : l î "Triton" et 2J "Triton." conjointement avec la substance à examiner suivant le mode d'administration et les dosages indiqués dans le tableau 1. Dans chaque cas, le "Triton" est administré en une dose de 200 mg/kg par voie intraveineuse à des rats maintenus à jeun pendant une période de 12 heures en les laissant simplement boire librement de 1'eau.

- i -

Les substances devant être utilisées comme antagoniste sont administrées par voie intrapéritonéale ou par voie orale deux heures avant et deux heures après 1‘administration du "Triton”. Entre 1Tadministration du "Triton" et la deuxième administration du produit faisant 1*objet de Cessai, on donne à nouveau de la nourriture aux animaux et, après avoir supprimé la nourriture, on leur laisse simplement le libre accès s l’eau. Au terme d’une période de 12 heures après l’administration eu "Triton", on prélève un échantillon de sang par ponction cardiaque et l’on effectue la détermination des triglycérides suivant la combinaison d’essai de "Bioehemia Boehringer".

Il s’agit en l’occurrence d’une détermination enzymatique des triglycérides après saponification avec de 1’hydroxyde de potassium éthanolique (.KGH) suivant Eggst ein Μ. : "Klin. Wschz, ’’ 44, lp66, 262« L’échantillon de sang fait également l’objet d’un essai de détermination de la teneur en cholestérol suivant la combinaison d’essai de Roschlav P., et al. : "Z. Klin. Chem. Klin. Biochem." 12» 1974a 403a par le procédé de catalyse, c’est-à-dire l’essai enzymatique colorimétrique. Les résultats sont repris dans le tableau 1.

Les tableaux 2 et 3 reprennent les résultats expérimentaux obtenus après provocation de 11hyperlipémie au moyen du "Triton", ces résultats étant obtenus par administration orale à des rats et suivant les méthodes décrites ci—dessus, de la substance active de giycosairinoalycane dans deux supports différents, cette substance étant d’une nature lipophile.

TABLEAU 1

Dosage des triglycérides et du cholestérol chez des rats "Wistar pesant + 200 g et soumis à un traitement après provocation de l'hyperlipémie au moyen de ,!TritonI! en une quantité de 200 mg/kg par voie intraveineuse.

Composé S Dose Mode ; Triglycé-i Choies- ί (mg/kg) d'admi— rides | térol nistra- (mg/ί) (n?g>) ; [ tion i < ’ î jTémoins = Solution i- Intra- 111 ,62+3; 71*8li2 !: physiolo- : périto- i gique né. a le et : ’ 2 ml/kg orale !! "Triton" 200 Intra- 479*78+7î19S,1 2+5 !: veineuse , ! : i ; i ' - Glycosaminoglvcane 20 Int ra- 100,18+6 ? 151 *00+0 + "Triton" péri — • ( 200 mg/kg.) tonésle j, , i: Glycosaminoglyeane 40 Intra- 13?. 64+6:116 ,50+5 + "Triton" pér-i- ?(200 mg/kgj tonéaie

i Glycosaminoglyeane 100 Orale 320,70+8 ; 171 *SO^T

?+ "Triton" ‘ (200 mg/kg) ?Glycosaminoglyeane 20G Orale 2b0,75+7162,47+6 + "Triton" s(200 mg/kg) ? i . .· .t - \ ! · 2 I.*· des triglycérides et· du cholestérol chez des rats "Vtistar" pesant 200+10 g et- soumis à un traitement après provocation de 11 hyperlipémie au moyen de ''Triton” en une dose de 200 mg/kg par voie intraveineuse. Le produit à examiner est administré dans un support à base de "Tween".

i-“ΠΓ-~~~T—” Γ” ” |Composé t Dose Mode Triglyce- Choles- !(mg/kg) d'admi— rides térol \ ! nistra- (mg£) (mg^) tion I Témoins ! Solution Orale 111,62+3 71*81+2 j physiolo gique = (2 ml/kg) "Triton" 200 Intra- 479,78+7 198,12+5 veineuse

Glveosamino- 50 Orale 355,-2+10 179,31+7 glycane + "Triton" ·(200 mg/kg}

Glveosamino- 100 Orale 210,37+9 130,92^9 glyeane + "Triton" (200 mg/kg} -•*v_

V

j; j ;>_·>3.

Dosage des triglycérides et du cholestérol chez des rats "Wistar11 pesant 200+10 g et soumis à un traitement après provocation de 11 hyperlipémie au moyen de "Triton" en une quantité de 200 mg/kg par voie intraveineuse. Le produit à examiner est administré dans un support à base de triglycérides · _____ - — — _

Composé Dose Mode Triglycé- Choies- j (mg/kg) d^dmi- rides térol ‘ j nistra- {mg%) (mg£) ! tion ! i î !

I i I

H" — ; ; 1 ; τ' iTémoins j Solution Orale 111,62+3 » 7^,81+2 : = physiolo— * i gique ; | '· (2 mg/kg) ? «Triton« 200 Intra- 179,7&±7 ;193,75+7 veineuse

Glycosamino- 50 Orale ‘ 347,82+0 172,36+0 glvcane + . "I rit. or" (200 mg/kg) - Glvcosaminc- 100 Orale 202,2 3+6 116,75^9 glvcane + "Triton” * (.200 mg/kg)

Activité lipoprotéinolipasique (essai dtEdiol)

Les effets clarifïcateurs du produit suivant la présente invention ont été étudiés sur des rats albinos males "Wistar" d’un poids moyen de 190+10 g suivant Bianchini (P, Bianchini, G, Guidi, B, Gsima : "Blood Levels of the Clearing Factor After Administrât ion of a Natural Glueurono-glucosaminoglycsn" - Biochem. Expl, Biol, X, (n, 3), 197*.)·

Les animaux sont choisis au hasard et- ils sont divisés en groupes de six que 1 * on nourrit de la manière habituelle.

(a* Réponse à u?,'.· >i3 c„- dose _>.*« * ':·.··· x de ' -"urec

On injecte les préparations pharmacentiques (c’est-à-dire le dérivé suivant la présente invention et le dérivé suivant· Cushing ayant une activité anticoagulante résiduelle de 10 unités U.S.P./mg) par voie intraveineuse en une dose de 10 mg/kg et en un voluine de 5 ml/kg dans une solution phys io lo gi qu e .

Après des périodes prédéterminées de 5S 10, 20, 40, 60 et 90 minutes, on soumet les animaux à une anesthesie à l’éther, puis on prélève un échantillon de 5 ml de sang par-ponction cardiaque en utilisant une seringue sèche que l’on a préalablement traitée aux silicones. On verse rapidement le sang dans des éprouvettes graduées centrifugées contenant 0,25 ml de citrate de sodium à 20%, On soumet la matière à une centrifugation à une vitesse de 4*000 tours pendant 15 minutes, puis on sépare le plasma clair.

On prépare des éprouvettes contenant 1 ml d’une solution à G,lS% d’une émulsion lipidique qui a été stabilisée ( "lipostrate", "Ediol-Calbiocheir" .> , cette émulsion ayant ét é préalablement filtrée. Dans chaque éprouvette, on dépose un échantillon du plasma à examiner en une quantité de 2 ml.

On veille à laisser s’écouler une période d’une minute lors »» de la préparation de tous les échantillons de telle sorte - que l’on puisse effectuer une lecture appropriée exactement après 30 secondes dans chaque cas, ainsi que des lectures ultérieures 15 minutes après incubation du plasma rEdioln à 25°C.

On effectue les lectures spectrophotométriques de la densité optique du mélange à 600 nm. roux- la détermination de l’activité clarifiante, on règle la lecture de la densité optique à 100, la lecture de la densité optique étant effectuée .-s Λ 30 Si'*,': .-1 f··· · ^ î . ?>; ! · - i V · V· ·. ' ’ - ? · ' ; ; ! - , . . · ’ Λ .

L’activité clarifiant e ι-st exprimée par un pour ..‘„î de cette dernière lecture, tandis que les lectures ni tî H.« tir,-s sont exprimées en (~ Δ %).

Les résultats démontrent que, dans la dose de 10 mg/h·.;, la valeur Δ % atteint un maximum de -27£ cinq minutes après 1 Administration, tandis que le dérivé préparé suivant Cushing et ayant une activité anticoagulante r-ésiduelle de 10 unités U.S.P./mg atteint une valeur maximale de —50/c 10 minutes après l’administration« Dans les deux cas, l’activité clarifiante disparaît 40 minutes après l’administration, (b) Réponse dose/effet

On effectue une autre sér-ie d’expériences conformément au procédé décrit, ci-dessus selon lequel on administre toujours à des raus et par- voie intraveineuse, des doses croissantes de glycosaminoglycanes, soit plus exactement 0,2, 0,3, 0,6, 0,6, 1, 2, 3 et 5 mg/rat-. Cinq minutes après l’administration, on vue les animaux et, conformément aux procédés décrits ci-dessus, on trace la courbe dose/effet.

Cette courbe aboutit à une détermination d’une valeur DE_,t (= dose efficace à 5Qa>) égale à 2,3 mg/rat, soit 11,5 mg/kg.

La dose efficace minimale est de 0,75 mg/rat, soit 3/75 mg/kg * avec une réduction linéaire allant jusqu’à 2,5 mg/rat.

Sur la base des essais décrits ci—dessus, on peut conclure que l’indice thérapeutique du produit de la présente invention se situe entre 550 et 1.700, soit manifestement une valeur moins favorable que l’indice thérapeutique du dérivé préparé suivant Cushing, lequel est de 700-2300.

Lorsqu’on compare l’activité clarifiante du glyco-sairunoglycane et du produit de Cushing, on aboutit à la conclusion selon laquelle l’activité clarifiante du produit de la y—> pi·'-·te invention est egale à la moitié de col le du pi («.fuit de Cushing, En réalité, Cushing stipule que la dose thérapeutique se situe dans X*intervalle de 0,5 à 5 mg/kg et que la dose optimale est comprise entre 1 et 3 mg/kg^soit un intervalle de 70 à 210 mg du poids du corps.

En vue d’exercer une activité clarifiante lors dsune thérapie pratiquée par voie parentérale, dans le cas du glyco-saminoglycane, la dose optimale se situe entre 2 et 10 mg/kg, soit entre 140 et 700 mg du poids du corps. Cette conclusion est également basée sur les résultats obtenus au cours des expériences de dyslipidémie provoquée par Triton" chez les rats ,

Lorsqu’on compare les deux préparations concernant la dose optimale vis-à-vis du poids du corps et en considérant que 11 activité anticoagulante du dérivé de Cushing est de 10 unités U,S,P,/ms, tandis que l’activité anticoagulante du glvcosaminoglycane est de 0,05 unité l',S,P,/mg, on aboutit à la conclusion qu’un traitement effectue avec ce dernier produit donne une activité anticoagulante se situant entre 7 et 35 "imités U,S,P,/poids du corps/administration, tandis que la thérapie pratiquée avec le dérivé de Cushing donne une activité anticoagulante se situant entre 7 00 et 2,100 unités ü,S,P,/poids du corps/adn-inist ration.

Les résultats ci-dessus font ressortir de toute évidence l’avantage résultant du plus faible risque d’hypo-coagulabilîté, en particulier, si l’on considère que le prolongement de la thérapie peux provoquer une bypocoagulabilix t et que ce risque est moindre avec le produit suivant la présente invention.

Cet avantage s’accentue du fait que 1’absorption par voie orale du giycosaminoglycane est telle que les teneurs ^ en triglycérides et en cholestérol du sang sont sensiblement i-eduit-es , cette caractéristique rendant- une thérapie par voie orale intéressante* Résultats de phar-maeologie clinique

On a administré le glycosaminoglycane par voie intraveineuse et à jeun dans les doses indiquées ci—après, en solution dans 6 ml d'eau distillée exempte de pyrogènes, à des sujets volontaires sains de quatre groupes :

Groupe 1:6 sujets (3 masculins, 3 féminins) âgés de 25 à 35 ans» Dose : 90 nig, soit 1 -,3—1 ^6 mg/kg du poids du corps *

Groupe XI: 6 suiets masculins âgés de 35 à 50 ans. Dose : 100 mg, soit 1,3-1j5 mg/kg ;

Groupe III : les 6 sujets du groupe II, 3 semaines après le premier traitement* Dose : 300 mg, soit 3,9-4,5 mg/kg*

Groupe IV : 6 sujets (4 masculins, 2 féminins) âgés de 50 à 60 ans. Dose : 150 mg, soit 1,9-2,b mg/kg.

Au moment 0, on prélève le sang pour pratiquer les déterminations de base et, immédiatement après, on administre le glycosaminoglycane. On procède à des prélèvements ultérieurs de sang aux moments suivants : 5 minutes/10 minutes/30 minutes/ v 60 minutes.

On effectue les déterminations en partie sur du plasma traité au citrate et, en partie, sur du sang !! completr . Centrifugation à 3.000 tours/minute pendant 15 minutes. Déterminations : activité Xipasémique (LPL, exprimée en Δ %) suivant l'essai précité d'Ediol : glycérine libre (exprimée en xnM/litre de plasma), acides gras non estérifiés (exprimés en meq/litre de plasma';, durée de thrombine partielle (en secondes) suivant les méthodes cliniques normales.

RESULTATS

GROUPE X

Moments Activité j Glycérine Acides gras non | lipasémique j libre estérifiés j (moyenne) | (moyenne) (moyenne) l

f I

: j j ; O minute | 92,53 j 0,062 ! 0,462 I ! ! ; 5 minutes j 61,39 0,193 0,6δ3 t i

i j I

30 minutes j 76,99 0,119 0,583 \ t · 60 minutes J 88,59 : 0,081 0,474 J 1 _I_i_:

Remarques : 1) Ll activité lipasémique maximale apparaît déjà 5 minutes après 11administration du glycosaminoglycane avec une « réduction de 33,05¾ du trouble d'Ediol à 600 nm.

2) Toujours à 5 minutes, on observe un accroissement de plus de 200% de la teneur en glycérine libre j à 60 minutes, cet accroissement est nettement plus faible, mais toujours présent.

3) A nouveau à 5 minutes, les teneurs en acides gras non estérifiés sont accrues d'environ 100% comparativement au moment 0.

GROUPE XI

Moments Activité Glycérine Acides gras Throm— lipasémique libre non estéri- bine (moyenne) (moyenne) ! fiés partielle |(moyenne) (secondes)

- I

0 minute 92,82 0,084 1 0,408 24 ! 1.0 minutes 70,82 j 0,206 S 0,899 25 30 minutes 78,50 ! 0,114 0,550 25 60 minutes 84,49 0,084 0,521 24 ! Λ λ.Α : / · * * ·

Remarques : 1) 10 minutes après 11 administration, on observe les accrois sements les plus élevés de 1* act ivité lipasémique (24;' i, de la teneur en glycérine libre (^150^) et. de la ton euren acides gras non estérifiés 1207;).

2) La valeur de thrombine partielle reste pratiquement é; !c à la valeur de base pour tous les sujets.

GROUPE III

--y--“-“·— 1 ~~ · — - '.......

Moments I Activité {Glycérine Acides gras Thrombine I lipasémique libre non estérifiés partielle I (moyenne) (moyenne) (moyenne) (secondes) î. ; 0 minute 99*49 0,104 0,159 26 ïlO minutes 50,07 0*440 0,921 26 130 minutes 50,65 0,405 0,681 25 i60 minutes 68,59 0,202 0,617 26 t

Remarques : 1) A la dose de 300 mg (toujours après 10 minutes), on observe les activités maximales qui sont nettement supérieures aux précédentes : 49% pour 1* activité lipasémique ; environ 300% pour la teneur en glycérine libre et environ 450.£ _ pour- la teneur- en acides gras non estérifiés. Les valeurs restent remarquablement significatives également après 60 minutes· 2) Les valeurs de thrombine partielle sont pratiquement constantes et égales à la valeur- de base.

' 1

iHîiîi'L- S Y

IMoments r Activité I Glycérine J Acide gras ! Tïn·'.r: !> j m ; lipasémique I libre j non estéri-j p-rrirlh | 1 (moyenne) j (moyenne) ; fiés ! i ,,:κΡ·- 1 j : (moyenne) \ , ; i : ; i------- ; 0 minute 99*4 i 0,0599 ; 0,410 | 24 10 minutes 72,78 0,1084 0,Sl4 25 30 minutes 74*6$ 0,0740 ! 0,7S0 24 60 minutes 81,44 0,0494 0,656 24

Les résultats sont analogues à ceux des groupes précédents «

De plus, pour les groupes II, III et IV, on a déterminé le lipidogramme (8—lipoprotéines, pré-S-lipoprotéines, kilomicrons) par néphélémétrie ; les valeurs sont exprimées en mg/lOO ml de sérum. On a relevé les observations suivantes a) chez les sujets du groupe II, la valeur des 8—lipoprotéines au moment 0 (425-450) a diminué à ~ 250 après 10 minutes et, par conséquent, elle se situait entre 250 et 300 après 60 minutes, tandis que les valeurs en pré-:;-lipoprotéines et· en kilomicrons sont restées pratiquement constantes (270-2S0 et respectivement 11,7-12,2), b) Groupe III : dans ce cas, la valeur de base des 8—lipoprotéines a diminué à environ 120 après 10 minutes et elle était de 150-220 après 00 minutes. On nra observé aucune variation importante pour les valeurs en pré-S—lipoprotéine et en kilomicrons, c) Groupe IV : la valeur des -lipoprotéines a diminué de I90—220 (moment 0,i à 120-130° après 10 minutes et elle est restée à ce niveau egalement après 60 minutes. Les valeurs en pré—3—lipoprotéines sont restées pratiquement inchangées ^ avec une légère diminution des valeurs en kilomicrons.

Claims (10)

1. 2, Dérivé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que le radical succinyle est présent en une quantité d'environ 1,2 par radical de disaccharide#
2. 3. Dérivé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que l'activité anticoagulante est inférieure à 0,5 unité internationale/mg* 4# Procédé de préparation d'un dérivé succinylique d'héparine désulfatée, dérivé dans lequel la teneur en groupes y-sulfate est inférieure à 10% comparativement à l'héparine constituant la matière de départ, tandis que le radical succinyle est présent en une quantité supérieure à 0,6 par unité de disaccharide, caractérisé en ce qu'il consiste à hydrolyse:· de l'héparine avec un acide fort au moins 0,1K à une tempérât ur supérieure à la température ambiante, puis faire réagir le produit de cette hydrolyse avec de l'anhydride succinique à un * pH supérieur- à 7# 5# Frocédé suivant la revendication 4-, caractérisé en ce que la température se situe entre "JG et 100°C, tandis que l'on effectue l’hydrolyse pendant une période de plus de 3 heures.
3. 6. Procédé suivant la revendication 4, caractérisé en ce qu'on utilise un acide fort au moins 0,5-»·
4. 7· Procédé suivant la revendication 4, caractérisé en ce que le rapport pondéral entre l'anhydride succinique et le produit d'hydrolyse se situe entre 1:1 et 5:1« * - 33 -
5. 8, Procédé en vue de réduire la teneur en lipides du sang ”in vivo” chez un sujet vivant dont le sang a une forte teneur en lipides, caractérisé en ce qu*il consiste à administrer, a ce sujet, un composé suivant la revendication 1, 9· Procédé suivant la revendication 8, caractérisé en ce que le sujet vivant est un être humain atteint de dyslipidémie*
6. 10, Composition pharmaceutique pour la thérapie d’états de dyslipidémie, caractérisée en ce que, comme ingrédient actif, elle comprend le dérivé succinylique d’héparine >1 suivant la revendication 1*
7. 11, Composition suivant la revendication 10, sou? une forme de dosage unitaire approprié pour une administration par voie parentérale,
8. 12, Composâtion suivant la revendication 11, caractérisée en ce que la forme de dosage unitaire se situe entre 0,5 et 40 mg/kg du poids du corps,
9. 13, Composition suivant la revendication 10 sous une forme de dosage unitaire appropriée pour une administration ' par voie orale,
10. 14, Composition suivant la revendication 13s caractérisée en ce que la dose unitaire se situe entre 30 et 300 mg/ kg du poids du corps, \ t ) f, p- p r K Λ \ V H