JPS59175895A - サイクリツク−３′，５′−イノシン酸の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は微生物を用い′るサイクリック−３’　、　５
’−イノシン酸（以下、ｃＩＭＰと略称する）の製造法
に関する。

ｃｌＭＰは生体内に極微量存在する生理活性物質であり
、最近生化学の分野においてその重要性が認められ、試
薬としても極めて高価なものである。

また製ガン剤の中間体としても重要な物質である。

（１） そして現在ｃ　Ｉ　Ｍ　Ｐを製造する方法としては、化
学的に合成する方法、発酵法、発酵法及び合成法を組み
合わせた方法等が知られているが、これらは何段階もの
複雑な工程が必要であったり、収量が極度に低い等の欠
点を有していた。

そこで本発明者はｃ　Ｉ　Ｍ　Ｐを簡単な工程で製造す
る方法について種々研究を重ねた結果、アスペルギルス
属に属する微生物をアデノシン−３’、５’−環状リン
酸（以下、ｃ　Ａ　Ｍ　Ｐと略称する）の存在下に培養
した場合、該微生物がｃＡＭＰを脱アミノしてｃＩＭＰ
’ｉ生成し、かつホスホジェステラーゼの副生が極めて
少ないか又は実質的に副生しないことを見出し、ｃＡＭ
Ｐから殆んど副産物を生成することな（ｃ　Ｉ　Ｍ　Ｐ
を効率良く製造することに成功し、本発明を完成するに
到った。

すなわち、本発明はアスペルギルス域に滅し、ｃ　Ａ　
Ｍ　Ｐ　’ｆ脱アミノしてｃ　Ｉ　Ｍ　Ｐを生成する能
力を有する微生物をｃ　Ａ　Ｍ　Ｐの存在下に培養し、
培養物中にｃＩＭＰを生成、蓄積せしめ、これを採取す
ることを特徴とするｃ　Ｉ　Ｍ　Ｐの製造法である。

／Ｑ＼ 以下本発明について詳細に説明する。

先ず本発明方法で使用する微生物としては、アスペルギ
ルス属に属しｃ　Ａ　Ｍ　ＰからｃＩＭＰを生産する能
力を有する菌が挙けられるが、このうち特に、ホスホジ
ェステラーゼ活性が弱いか若しくは実質的にホスホジェ
ステラーゼ活性物質を生産しない菌が好適に用いられる
。その好適なｌの具体例としては、アスペルギルス・ニ
カ−（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ）　Ｉ　Ａ
　Ｍ　　２５３３、アスペルギ、ＩＩ／　スーニガーＩ
ＡＭ　　２５３４、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅ
ｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅ　）　Ｉ　’Ａ　Ｍ　　
２７４７　、アスペルギルス・オリゼＩＡＭ　　２７４
２．アスペルギルス・ソーヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ
　５ｏｊａｏ　）　Ｎｏ、　７７　（微工研菌寄第６０
１６号）等が挙げられる。

つ′スペルギルス・ソーヤＮｏ、７７は本発明者が空気
中より分離した菌株で、菌糸に補足細胞が形成され、そ
れより分生胞子柄ができ、その先端に頂のうができる。

頂のうには第１梗子ができ、３０〜５０個の分生胞子が
着生する。そして分生胞子の表面は小突起で覆われてい
る。このためアスペ（３） ルギルス・ソーヤと認められる（　Ｈｉｄｅｙａ　Ｍｕ
ｒａＫａｍｉ　、　Ｊ、　Ｇｅｎ　、　Ａｐｐｌ、　Ｍ
ｉｃｒｏｂｉｌ　、、　１７　、２８１〜３０１．１９
７］　）。

しかし本発明者が分離したアスペルギルス・ソーヤＮｏ
、７．７はｃ　Ａ　Ｍ　Ｐを脱アミノしてｃＩＭＰを生
成する能力を有し、ホスホジェステラーゼ活性物質を実
質的に生産しないことから、従来のアスペルギルス・ソ
ーヤとは異する。

そしてアスペルギルス・ソーヤＮｏ、７７は微工研菌寄
第６０１６号（Ｆ　ＥＢ　Ｍ　Ｐ　−６０１６）と１〜
て寄託されている。

これらの閑株の培養は、糸状閑の培養に用いられる培地
を用いて常法に従って固体培養又は液体培養することに
より行なわれる。

培地の栄養源としては、微生物の培養に】円常用いられ
るものが広く使用される。すなわち炭素源とし、ては、
資化可能な炭素化合物又はこれを含有するものであれば
よく、例えば７ノー麦、鈑、グルコース、シュークロー
ス、スターチ、マルトース、デキストリン、グリセリン
等が用いられる。窒素（４） 源としては、利用可能な窒素化合物又はこれを含有する
ものであればよく、例えば大豆粉、脱脂大豆粉、グルテ
ン、ペプトン、肉エキス、カゼイン、大豆ミール、コー
ンステイープリカー、硫安、塩安等が使用される。１だ
リン酸、カリウム、マグネシウム、カルシウム等の適当
な無機塩類を適宜使用することができ、更に必要に応じ
て菌の生育に必要な各種の有機物、無機物等を培地に添
加使用することができる。

先ず固体培養の場合には、適当な固体培地原料、例えば
鈑に散水し、１２０℃、２０分間殺菌した後、種菌を接
種し、３〜５日間培養を行う。次に液体培養を行う場合
には、上記炭素源、窒素源及び無機塩を適宜組み合わせ
た栄養培地、例えばグルコース、ペプトン、ｆｉｆｂ安
、ｓｅ工”ｒス、ＫＨ２ＰＯ４等からなる培地’１ＰＨ
５〜７に調整し、常法により加熱殺菌した培地に種菌を
接種し、培養する。この場合、静置培養、振盪培養、攪
拌培養、通気培養などの適宜の培養法を用いて実施する
ことができるが大量に培養する場合には、振盪又は（５
） ］山気攪拌培養を行うのが好適である。

培養温度は核附株が生育する範囲内で変更することがで
きるが、通常１０〜５５℃、特に好ましくは１５〜４５
℃である。ＰＨは２〜７が適当である。

培養期間は使用菌及び培養形態によっても異なるが、通
常１〜６日＠朋である。

培地に添加する（！　ＡＭＩ−ｔｏ、１〜２．０　％　
（Ｗ／１程度が好筐しく、添加時期は培養開始時の培地
又は培養期間の中頃、若しくは培養終了の１日前位迄が
適当である。またｃ　Ａ　Ｍ　Ｐは微生物による犬、４
゜量生並法が確立されているので、精製標品だけでなく
、ｃ　Ａ　Ｍ　Ｐ生並園の培養液、培養濾液等ｃＡＭＰ
含有物も用いることができる。

こうして培地に添加されだｃ　Ａ　Ｍ　Ｐは上記微生物
により特異的に脱アミノ化されて１００　％、目的物で
あるｃＩＭＰに転換することができる。

以下、実験例を示して本発明の効果を具体的に説明する
。

（６） 実　　　験　　　例 アスペルギルス・オリゼ　ＩＡＭ　　２７４７を米麹抽
出寒天斜面（糖度；１０°ボーメ）に３０℃、５日間培
養して得た胞子を、グルコース３％、（Ｎ　Ｈ４）２８
０４０．５％、Ｋ　Ｈ２Ｐ　０４１％、ポリペプトン　
１％、酵母エキス０．５％、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２００，
０５％、ＦｅＳＯ４・７　ＨｇＯＯ，０１％、ｚｎＳＯ
４・７Ｈ２００，０１’％及び第１表記載のアデニン化
合物１％、ＰＨ７，５（３Ｎ−ＫＯＨで調製）の組成を
もつ培地１を当りを５ノ容ひだつき三角フラスコに分注
して、１１５℃、１０分間殺回したものに接佃し、３０
℃、３日間、１８０　ｒ、ｐ、ｍ、で振盪培養した。

このようにして得た谷培養液を東洋Ｎｏ、５ｃの濾紙で
濾過し、得られた透明な濾液を東洋Ｎｏ、５１Ａ　（５
０Ｘ　５０　ｃｍ　）の濾紙に１０ｕノ宛ポツトし、風
乾後、溶媒〔イソプロパノ−）Ｌ−：飽和硫案液：ＩＭ
−酢１ｇソー１−＝２　＋　８０　：　２０　（Ｖ／ｖ
）　）で室温下、−夜展開した。

展開後、風乾して紫外線ランプ照射下に濾紙上（７） に紫外吸収スポラトラ検出し、培養液中の生成物（主産
物及び副産物）Ｋついて調べた。甘だそのうち主産物に
ついては、その転換率について調べた。その結果を第１
表に示す。

第１表の結果から、アスペルギルス・オリゼエＡＭ２７
４７菌は第１表に記載のアデニン化合物のうち５’−Ａ
　Ｍ　Ｐ及びアデノシンに対しては脱アミン作用を有さ
す、ｉたアデニンに対しては脱アアミノ作用を有し、そ
の１００％ｋｃＩＭＰＫ転換し、しかも培養液中に副産
＊を生じないことが判る。

第　　１　　表 （８） 次に培養物よりｃＩＭＰを分離し精製するには例えば活
性炭による処理、陰イオン交換樹脂または陽イオン交換
樹脂による処理、ｃ　Ｉ　ＭＰ不溶性溶媒の添加などの
手段が適当に組み合わされて用いられる。

例えば液体培養の場合には菌体を除去した培養液中のｃ
　Ｉ　Ｍ　Ｐを活性炭に吸着させ、これをアンモニア性
アルコール水又はアンモニア性アセトン水などで溶出す
る。この溶出液はさらに減圧濃縮その他により過剰のア
ンモニアを除いた後、陰イオン交換樹脂（例えばダウエ
ックス１クロル型、ダウエックス１＠ｌｆ型など）に吸
着させ、つぎに適当な溶媒（例えばダウエックス１クロ
ル型の場合には希塩酸又は塩化カルシウム＋精微酸系の
溶媒で、ダウエックス１蟻酸型の場合には希蟻酸又は希
蟻酸十蟻酸ソーダ系の溶媒）で溶出する。この溶出液は
さらに活性炭に吸着し、アンモニア性アルコール水又は
アンモニア性アセトン水などで溶出し、さらにこの溶出
液は減圧濃縮その他により過剰のアンモニアを除いた後
、陽イオン交換樹（９） 脂（例えばダウエックス５０水素型など）に吸着させ、
希塩酸で溶出する。このようにして得た溶出液を減圧濃
縮したのち、冷室に放置するか又はこれにアルコール、
アセトンなどのｃＩＭＰ不溶性溶媒を添加することによ
りｃＩＭＰの結晶が得られる。

また他の方法としては、菌体を除去した培養液中のｃ　
Ｉ　Ｍ　Ｐを活性炭に吸着させ、これをアンモニア性ア
ルコール水又はアンモニア性アセトン水などで溶出し、
溶出液より減圧濃縮その他により過剰のアンモニアを除
いた後、これに塩酸酸性でアルコール、アセトン等の有
機溶媒を添加して例えば冷室に放置することによりｃＩ
ＭＰの粗結晶を得ることができる。

この粗結晶は、上記したような陰イオン交換樹脂又は陽
イオン交換樹脂により精製することができる。またこの
粗結晶は水に溶かして塩酸酸性又は硫酸酸性で脱色樹脂
〔例えばデーオライ）（Ｄｕｏｌｉｔｅ　）　Ｓ−３０
など〕で脱色し、さらにアルコール、アセトン等のｃ　
Ｉ　Ｍ　Ｐ不溶性溶媒を添加し【１０） てたとえば冷室に放置することにより、ｃ　Ｉ　Ｍ　Ｐ
の結晶を得ることができる。

あるいは又菌体を除去した培養液中のｃＩＭＰを直接陰
イオン交換樹脂又は陽イオン交換樹脂に吸着させ、その
溶出液について活性炭による処理、脱色樹脂による精製
を行った後、ｃ　Ｉ　Ｍ　Ｐ不溶性溶媒を旅刀ｑして例
えば冷室に放置することにより分離、精製を行ってｃ　
Ｉ　Ｍ　Ｐの結晶を得ることもできる。

また、固体培養の場合には、適宜培養物に適量℃水又は
緩衝液を加え、必要により攪拌した後、固形物を除去し
た溶液を液体培養時の菌体除去培養液と同様に処理する
ことによりｃＩＭＰを得ることができる。

なお、培養物中にｃ　Ａ　Ｍ　Ｐが含有されている場合
には、精製の過程において例えばイオン交換樹脂による
吸着処理を施した後、溶出剤のＳ類、塩濃［貌、酸濃度
などを適当に選択して溶出操作を行うことによりｃ　Ａ
ＭＰとｃ　Ｉ　Ｍ　Ｐとを分離することができる。面上
記の場合予め、ｃ　Ｉ　Ｍ　Ｐ　ｉＮａ塩とした後分離
操作を行うと、分離が容易となるので好ましい。

このようにして本発明方法で製造された物質は元素分析
、リポースの定量、燐の定量、さらに紫外線吸収スペク
トル、赤外線吸収スペクトルを測定した結果、純品のｃ
ＩＭＰと一致した。

以下実施例を示して本発明を更に詳細に説明する。

実　　施　　例　　１ 第２表に記載の各菌株を、グルコース５％、尿素０．５
チ、Ｋ　Ｈｚ　Ｐ　０４１％、ポリペプトン１％、酵母
エキス０．５％、ＮｇＳＯ４・７ＨｇＯＯ，０５％Ｆｅ
ＳＯ４”　７ＨｇＯＯ，０１％、Ｚｎ５Ｏ＜壷７ＨｚＯ
Ｏ１１％ｃＡＭＰ２％、ＰＨ７゜５（３Ｎ−ＫＯＨで調
製）の組成をもつ培地１ノ当りを５ノ容ひつき三角フラ
スコに入れ、１２０℃で１０分間殺菌した培地に接種し
、３０℃で２日間、１８０ｒ−ｐ・ｍ・で振盪培養した
。

この各々の菌の培養液を１０．００　Ｏｒ、ｐ、ｍ、、
１０分間遠心分離し、その上澄液について残存ｃ　Ａ　
Ｍ　Ｐ及び生成ｃ　Ｉ　Ｍ　Ｐを次の如く定量した。

上澄液１０ｄを東洋Ｎｏ、５１Ａ濾紙にスポットし、風
乾後溶媒〔イングロパノール：濃アンモニア水：水＝７
：１：２（ｖ／ｖ）〕で−夜展開し、展開後、風乾して
紫外線ランプ照射下に濾紙上の紫外線吸収スポット（Ｒ
ｆ値：ｃＩＭＰｌ、７５）を検出し、該部分を切り抜き
、水５ｄを加え１００℃で抽出し、２６０　ｎｍで測定
し、標準直線よりＣＩＭＰ−ｊｊｉを測定した。

その結果を第２表に示す。

なお、各培養液中にはｃ　ＡＭＰは残存しなかった。

次に各間の培養土漬液５００ｄを活性炭カラム（５Ｘ　
２０　ｃｍ　）に通液し、ｃ　Ｉ　Ｍ　Ｐを活性炭に吸
着させ蒸溜水２ノで水洗後、１％アンモニア含有５０％
エタノール１ノで溶出させた。この溶出液を減圧下に５
０　ｍｌに濃縮した後、アンバーライトＩＲｃ５ＯＮａ
カラム（５ｘ　３０　ｃｍ　）に嘲液し、更に水１００
　ｍｌで水洗した。通過液及び水洗液を合わせ、これを
アルミナ（中性）カラム（５Ｘ１５（１３） 釧）に通液し、水５０　ｍｌで水洗後、この通過液及び
水洗液を減圧下に２０　ｍｌに両組した。該濃縮液にイ
ソプロパツール３倍量を徐々に添加した後、３℃に一夜
放置してｃ　Ｉ　Ｍ　ＰのＮａ塩の結晶を晶出させ、濾
過により該結晶を集め、五酸化燐上で真空乾燥した。

そして各国の培養液よりｃＩＭＰのＮａ塩の結晶を第２
表の如く得た。

第　　　２　　　表 実施例２ １１１１ｉ６００ｆに水３００　ｍｌを添加し、１２０
℃１５分間殺菌し、同命件で殺菌した麹ぶた上にのせ、
別に水２００ｍ１ＶＣｃ　ＡＭＰ　１００　ｆをｌＮ−
Ｎａ　ＯＨで中和しながら溶解し、Ｐ　Ｈ６，０に調整
したものを１２０℃、１０分間殺菌し、該麹ぶた上の岐
に添加しよく混合した。

このものにアスペルギルス・ソーヤＮｏ、７７（ＦＥＲ
Ｍ　　Ｐ−６０１６）の胞子を接拙し、３０℃、５日間
培養した。

この培養物に水３ノを加え、室温下でよく攪拌した後、
９０００　ｒ、ｐ、ｍ、、３０分間遠心分離し、上澄液
２ノを得た。この上澄ｇ、を実施例１と同様に処理して
ｃＩＭＰのＮａ塩の結晶２９．６Ｓ’を得た。

特許出願人　キッコーマン株式会社 （１５） 手続補正書 昭和ケ２年４月ｆ日 特許庁長官殿 ■、事件の表示 昭和よ♂年特許願第夕ｏｚｌＩ−を号 ２、発明の名称 ザイクリック−３；　ｓ　／−イノシン酸の製造法３、
補正をする者 ４、補正命令の日付 「自　　発」 ６、補正の内容 （１）明細書第７頁第１６行の「１ｏｕ＝ｔ」とあるを
「１０μｔ」と補正する。

（２）明細書第７頁第１７行の「飽和硫案液」とあるを
「飽和硫安液」と補正する。

（３）明細書第１２頁第１２行ノ「Ｎｇｓｏ４」トアル
を「ＭｇＳＯ４」と補正する。

（４）明細書第１２頁第１５行の「夕を容ひっ」とある
を１ｔｔ容ひたつ」と補正する。

（５）明細書第１３頁第１８行の「工ＲｃＪとあるを「
■ＲＣ」と補正する。

特許出願人　　キッコーマン株式会社 ”　−一５１

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）　　アスペルギルス域に属し、アデノシン−３＋
   。 ５′−環状リン酸を脱アミノしてサイクリック−３’、
   ５’−イノシン酸を生成する能力を有する微生物をアデ
   ノシン−３’　、　５’−環状リン酸の存在下に培養し
   、培養物中にサイクリック−３’　、　５’−イノシン
   酸を生成、＃槓せしめ、これを採取することを特徴とす
   るサイクリック−３’　、　５’−イノシン酸の製造法
   。