JPS5950320B2 - サイクリツク−３′，５′−グアニル酸の製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は微生物を用いるサイクリック−３７、５，１−
グアニル醗以丁、ｃＧＭＰと略称する）の製造法に関す
る。

ｃＧＭＰは生体内に極微量存在する生理活性物であり、
最近生化学の分野においてその） 重要性が認められ、試案としても極めて高価なものであ
る。

また制ガン剤の中間体としても重要な物質である。

そして現在ｃＧＭＰを製造する方法としては、化学的に
合成する方法、発酵法、発酵法及び合成法を組み合わせ
た方法が知られているが、これらは何段階もの複雑な工
程が必要であったり、収量が極度に低い等の欠点があり
へそこで本発明者はＣＧＭＰを簡単な工程で製造する方
法について種々研究した結果、アスペルギルスに属する
微生物を２−アミノ−アデノシン−３′、グー環状り４
玖以下、２−アミノ−ＣＧＭＰと略称する）の存在下に
培養した場合、２−アミノ−ＣＡＭＰを脱アミノしてＣ
ＧＭＰを生成し、かつホスホジェステラーゼの副生が極
めて少ないか又は実質的に副生じないことを見出し、２
−アミノ−ｃＡＭＰかもほとんど副産物を生成すること
な（ｃＧＭＰを効率よく製造することに成功し、本発明
を完成するに到った。

すなわち、本発明はアスペルギルスに属し、２−アミノ
−ｃＡＭＰを脱アミノしてｃＧＭＰを生成する能力を有
する微生物を２−アミノ−ｃ ＡＭＰの存在下に培養し
、培養物中にｃＧＭＰを生成、蓄積せしめ、これを採取
することを特徴とするｃＧＭＰの製造方法である。

以下本発明について詳細に説明する。

先ず本発明方法で使用する微生物としては、２−アミノ
−ｃＡＭＰからｃＧＭＰを生産する能力を有し、ｃＧＭ
Ｐを生成するに不都合を生じない程度にホスホジェステ
ラーゼ活性が弱いか若しくは実質的にホスホジェステラ
ーゼ活性物質を生産しない菌が用いられ、特に好適な菌
の具体例としては、アスペルギルス・ニガー（Ａａ ｐ
ｅ ｒ ｇ ｌ −１ｕｓ−ｎｉｇｅｒＯ） ＩＡＭ２５３３、アスペルギルス・ニガーＩＡＭ２５３
４、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇ−ｉ １１
ｕｓ ｏｒｙｚａｅ ） Ｉ ＡＭ２７４７、ア
スペルギルス・オリゼＩＡＭ２７４２、アスペルギルス
・ソーヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ５ｏｊａｅ）Ｉ
’＆７７（２）」所菌寄第６０１６号）等が挙げられる
。

アスペルギルス・ンーヤ嵐１１は本発明者が空気中より
分離した菌株で、菌糸に柄足細胞が形成され、それより
分生胞子柄ができ、その先端に頂のうができる。

頂の５には第１梗子ができ、３０〜５０個の分生胞子が
着生する。

そして分生胞子の表面は小突起で橿われている。

このためアスペルギルス・ソーヤと認められる（Ｈｉｄ
ｅｙａ Ｍｕ−ｒａｋａｍｉ 、Ｊ、Ｇｅｎ 、Ａｐｐ
ｌ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｄｌ。

１７．２８１〜３０１，１９７１゜） しかし本発明者が分離したアスペルギルス・ソーヤ％７
７は２．２−アミノ−ｃＡＭＰを脱アミノしてｃＧＭＰ
を生成する能力を有し、ホスホジェステラーゼ活性物質
を実質的に生産しないことから、従来のアスペルギス・
ソーヤとは異なる。

そしてアスペルギルス・ソーヤＮ［Ｌ７７は微工研菌寄
第６０１６号（ＦＥＢＭ Ｐ−６０１６と）して寄託
されている。

本発明における培養とは、発酵、微生物工業における普
通の培養法を意味、シ、アスペルギルス属に属する微生
物をあらかじめ別に培養して得た固体培養物または液体
培養物そのままを、２−アスノーｃＡＭＰ溶液に添加接
触作用させる特殊な場合は除かれる。

これらの菌株の培養は、糸状菌の培養に用いられる培地
を用いて常法に従って固体培養又は液体培養することに
より行われる。

培地の栄養源としては、微生物の培養に通常用いられる
ものが広く使用される。

すなわち炭素源としては、資化可能な炭素化合物又はこ
れを含有するものであればよく、例えば小麦、稲、グル
コース、シュクロース、スターチ、マルトース、テキス
トリン、グリセリン、等が用いられる。

窒素源としては利用可能な窒素化合物又はこれを含有す
るものであればよく、例えば大豆粉、脱脂大豆粉、グル
テン、ペプトン、肉エキス、カゼイン、大豆ミール、コ
ーンステイープリカー、硫安、塩安等が使用される。

またリン酸、カリウム、マグネシウム、カルシラλ等の
適当な無機塩類を適宜使用することができ、更に必要に
応じて菌の生育に必要な各種の有機物、無機物等を培地
に添加使用することができる。

先ず固体培養の場合には、適当な固体培地原料、例えば
皺に散水し、１２０℃、２０分間殺菌した後、種菌を接
種し、３〜５日間培養を行う。

次に液体培養を行う場合には、上記炭素源、窒素源及び
無機塩を適宜組み合わせた栄養培地、例えばグルコース
、ペプトン、硫安、酵母エキス、ＫＨ２ＰＯ４等からな
る培地をｐＨ５〜７に調整し、常法により加熱殺菌した
培地に種菌を接種し、培養する。

この場合、静置培養、振盪培養、攪拌培養、通気培養、
などの適宜の培養法を用いて実施することができるが大
量に培養する場合には、振盪又は通気攪拌培養を行うの
が好適である。

培養温度は該菌株が生育する範囲内で変更することがで
きるが、通常１０〜５５℃、特に好ましくは１５〜４５
℃である。

ＰＨは２〜７が適当である。

培養期間は使用菌及び培養形態によっても異なるが、通
常１〜６日程度である。

培地に添加する２−アミノ−ｃＡＭＰは、０．１〜２０
％（ｗ／ ｖ ）程度が好ましく、添加時期は培養開始
時の培地又は培養期間の中頃、若しくは培養終了の１日
前位迄が適当である。

また、２−アミノ−ｃＡＭＰは、例えば微生物による大
量生産法が確立されている。

ｃＡＭＰより容易に合成することができ〔ヌクレイツク
、アシシトリサーチ、スペシャルパブリケーション１ｔ
２．５５９（１９７８、Ｊ）精製標品だけでなく、２−
アミノ−ｃＡＭＰ含有物も用いることができる。

本発明方法において使用する菌を、２−アミノ−ｃＡＭ
Ｐ又は２−アミノ−ｃＡＭＰ以外の核酸関連物質の存在
乍に液体培養した時の培養液中の生成物を実験例で示す
。

実験例 アスペルギルス、オリゼＩＡＭ２７４７を米麹用寒天斜
面［相］度：ｌＯ°ボーメ）に３０℃、５日間培養して
得た胞子を、グルコース８％、（ＮＨ４）４ＳＯ，０，
５％、ＫＨ２ＰＯ４１％、ポリペプトン、１％、酵母エ
キス０．５％、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２００，０５％、Ｆ
ｅ ８０． ・７ Ｈ２Ｏ０，０１％、ｚｎＳ０４・７
Ｈ２００，０１％、及び第１表に記載の化合物１ ％％
ｐ Ｈ７，５（３Ｎ ＯＨで調整辺組成をもつ培養地
１１当りを５１容ひだつき三角フラスコに分注して、１
１５℃、１０分間殺菌したものに接種し、３０℃、３日
間、１８０ ｒ、Ｐ、ｍで振盪した。

ここのようにして得た各培養液を東洋Ｎｔｘ５Ｃの濾紙
で濾過し、得られた透明な濾液を東洋Ｎｃｉ５１Ａ５０
Ｘ５０ｃｍの濾紙に１０μｌ宛スポツトし、風乾後、溶
妨Ｃツブロバノール：飽和硫安液＝ＩＭ酢酸ソーダ＝２
： ８０ ： ２０（Ｖｏ １ ｔＶｏｌ）’ｌで室
温下、一夜展開した。

展開後、風乾して紫外線ランプ照射下に濾紙上に紫外吸
収スポットを検出し、その結果を第１表に示す。

そして本発明方法において使用する菌の培養物の性質は
給源により多少異なるがｐＨ２〜７の範囲で２−アミノ
−ｃＡＭＰデアミナーゼ活性を有し、その作用温度は１
０〜７０℃である。

培養物よりｃＧＭＰを分離し精製するには例えば活性炭
による処理、陰イオン交換樹脂または陽イオン交換樹脂
による処理１．ｃＧＭＰ不溶性溶媒の添加などの手段が
適当に組合わされて用いられる。

例えば液体培養の場合には菌体を除去した培養液中のｃ
ＧＭＰを活性炭に吸着させ、これをアンモニア性アルコ
ール水又はアンモニア性アセトン水などで溶出する。

この溶出液はさらに減圧濃縮その他により過剰のアンモ
ニアを除いた後、陰イオン交換樹脂（例えばダウエック
スｌクロル型、ダウエックス１蟻酸型など）に吸着させ
、つぎは適当な溶液（ｆ暖ばダウ千ツクス１クロル型の
場合には希塩酸又は塩化カルシウム＋希微酸系の溶媒で
、ダウエックス１．蟻酸型の場合には希蟻酸又は希蟻酸
＋蟻酸ソーダ系の溶媒）で浴出する。

この溶出液はさらに活性炭に吸着し、アンモニア性アル
コール水又はアンモニア性アセトン水などで溶出し、さ
らにこの溶出液は減圧濃縮その他により過剰のアンモニ
アを除いた後、陽イオン交換樹脂（Ｗばダウエックス５
０水素型など）に吸着させ、希塩酸で溶出する。

このようにして得た溶出液を減圧濃縮したのち、冷室に
放置するか又はこれにアルコール、アセトンなどのｃＧ
ＭＰ不溶性溶媒を添加することによりｃＧＭＰの結晶が
得られる。

また他の方法としては、菌体を除去した培養液中のｃＧ
ＭＰを活性炭に吸着させ、これをアンモニア性アルコー
ル水又はアンモニア性アセトン水なト−ｍ出し、溶出液
より減圧濃縮その他により過剰のアンモニアを除いた後
、これに塩酸性でアルコール、アセトン等の有機溶媒を
添加して例えば冷室に放置することによりｃＧＭＰの粗
結楯を得ることができる。

この粗結晶は、上記したような陰イオン交換樹脂又は陽
イオン交換樹脂により精製することができる。

またこの粗結晶は、水に浴かして塩酸酸性又は硫酸酸性
で脱色樹脂〔例えばデュオライト（Ｄｕｏｌｉｔｅ）Ｓ
−３０など〕で脱色し、さらにアルコール、アセトン等
のｃＧＭＰ不溶性溶媒を添加して例えば冷室に放置する
ことにより、ｃＧＭＰの結晶を得ることができる。

あるいは又菌体を除去した培養液中のｃＧＭＰを直接陰
イオン交換樹脂又は陽イオン交換樹脂に吸着させ、その
溶出液について活性炭による処理、脱色樹脂による精製
を行なった後、ｃＧＭＰ不溶性溶媒を添加して例えば冷
室に放置することにより、分離、精製を行なってｃＧＭ
Ｐの結晶を得ることもできる。

また、固体培養の場合には、適宜培養物に適量の水又は
緩衝液を加え、必要に、よ１す２攪拌した後、固形物を
除去した溶液を液体培養時の菌体除去培養液と同様に処
理することによりｃＧＭＰを得ることができる。

なお、培養物中に２−アミノニｅＡＭＰが含有されてい
る場合には、精製の過程において例えばイオン交換樹脂
による吸着処理を施したのち、溶出剤の種類、塩濃度、
酸濃度などを適当に選択して溶出操作を行うことにより
２−アミノ−ｃＡＭＰとｃＧ’ＭＰとを分離することが
できる。

そしてＮａ塩として分離するのが最も安易である。

このようにして本発明方法で製造された物質は、元素分
析、リボースの定量、燐の定量、さらに紫外線吸収スペ
クトル、赤外線スペクトルを測定した結果、純品のｃＧ
ＭＰと一致した。

実施例 １ 第２表に記載の各菌株を、グルコース５％、尿素０．５
％、ＫＨ２ＰＯ４１％、ポリペプトン１％、酵母エキス
０．５％、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２００，０５％、ＦｅＳＯ
４４Ｈ２００，０１％、ｚｎＳ０４・７Ｈ２００，１％
、２−ＮＨ２−ｃＡＭＰ２％、ｐＨ７，５（３Ｎ−ＫＯ
Ｈで調整ｐ組成をもつ培養地１１当りを５１容ひたつき
三角フラスコに入れ、１２０℃で１０分間殺菌した培地
に接種し、３０℃で２日間、１８０ ｒ、ｐ、ｍ、で振
盪培養しｔもこの各各の菌の培養液を１０００Ｏｒ、ｐ
ｏｍ、、１０分間遠心分離し、その上澄液について残存
２−ＮＨ２−ｃＡＭＰ及び生成ｃＧＭＰを次の如く定量
した。

上澄液１０７ＩＬｌを東洋ｒｈｓｔＡ瀘紙にスポットし
、風乾後、溶媒イソプロパツール：濃アンモー＝７水：
水＝ ７ ： １ ： ２（ＶＯ１／ＶＯυで一夜展
開し、展開後、風乾して紫外線ランプ照射下に濾紙上の
紫外線スポラ）（Ｒｆ値： ｃ ＧＭＰｏ、１）を検出
し、該部分を切り抜き、水５１１Ｌｌを加え１００℃で
抽出し、２６０ｎｍで測定し、標準直線よりｃＧＭＰ量
を測定し、その結果を第２表に示す。

なお、各培養液中には２−アミノ−ｃＡＭＰは残存しな
かつｔも次に各画の培養上澄液５００１ｒｌｊｌを活性
炭カラム（５Ｘ２０ａｎ）に通液し、ｃＧＭＰを活性炭
に吸着させ蒸留水２１で水洗後、１％アンモニア含有５
０％エタノール１１で溶出させた。

この溶出液を減圧下に５０７ｄＫ濃縮した後、アンバー
ライトＩＲＣ５ＯＮａカラム（５Ｘ ３０ ｃｍ）に通
液し、更に水１００７ｎｌで水洗した。

通過液及び水洗液を合わせ、これをアルミナ（中性）カ
ラム５×１５印に通液し、水５０・麻で水洗後、この通
過液及び水洗液を減圧下に２０ＷＬｌに濃縮した。

該濃縮物にイソプロパツール３倍量を除徐に添加した後
、３℃に一夜放置してｃＧＭＰ塩の結晶を晶出させ、濾
過により該結晶を集め、五酸化燐上で真空乾燥し九各画
の培養液よりｃＧＭＰのＮａ塩の結晶を第２表のどと（
得ｔも 実施例 ２ 麹６００ｇ水３００属を添加し、１２０℃、１５分間殺
菌し、同条件で殺菌した麹ぶた上にのせ、別に水２００
１１Ｌｌに２ ＮＨ２ｃ ＡＭＰ １００９をｌＮ−
ＮａＯＨで中和しながら溶解し、ｐＨ６０に調整したも
のを１２０°Ｃ１１０分間殺菌し、該麹ぶたの麹に添加
しよく混合した。

このものにアスペルギルス・ソーヤＮＮ１１７７（ＦＥ
Ｂ Ｐ−６０１６）の胞子を接種し、３０℃、５日間
培養し？Ｑ）この培養物に水３１を加え、室温下でよく
攪拌した後、９０００ ｒ、ｐ、ｍ、、３０分間遠心分
離し、上澄液２１！を得薗この上澄液を実施例１と同様
に処理してｃＧＭＰのＮａ塩の結晶２７ｇを得た。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ アスペルギルス属に属し、２−アミノ−アデノシン
   −３’ｔ５’−環状リン酸を脱アミノしてサイクリック
   ３’、５’−グアニル酸を生成する能力を有すする微生
   物を３−アミノ−アデノシン−３７、５／−環状リン酸
   の存在下に培養し、培養物中にサイクリック−３’、５
   ’−グアニル酸を生成、蓄積せしめ、これを採取するこ
   とを特徴とするサイクリック−３’、５’−グアニル酸
   の製造法。