JPS59162877A - ピルベ−トオキシダ−ゼ、その製法並びにピルベ−トの測定法及びそのための試薬 - Google Patents
ピルベ−トオキシダ−ゼ、その製法並びにピルベ−トの測定法及びそのための試薬Info
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- JPS59162877A JPS59162877A JP59032729A JP3272984A JPS59162877A JP S59162877 A JPS59162877 A JP S59162877A JP 59032729 A JP59032729 A JP 59032729A JP 3272984 A JP3272984 A JP 3272984A JP S59162877 A JPS59162877 A JP S59162877A
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- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、新規ピルベートオキシダーゼ、その製法及び
その用途に関する。
その用途に関する。
ピルベートオキシダーゼＥ、０．１．２．３．３は、ビ
ルペートヲホスフエートイオン及び酸素の存在において
Ｈ２Ｏ２の形成下に脱炭酸する酵素である［ ” Ｆｅ
ｄｅｒａｔｉｏｎ Ｐｒｏｃｓｅｄｉｎｇｓ ’、１３
巻、７６４〜７６８頁（１９５４年）〕。尺応性成物ア
セチルホスフェート、００２及びＨ２Ｏ２のうち、特に
Ｈ２０□を分析的に良好に検出することができ、それ故
この酵素はピルベート及びキクベートを形成する酵素も
しくはその基質を定量的に測定するのに好適である。
ルペートヲホスフエートイオン及び酸素の存在において
Ｈ２Ｏ２の形成下に脱炭酸する酵素である［ ” Ｆｅ
ｄｅｒａｔｉｏｎ Ｐｒｏｃｓｅｄｉｎｇｓ ’、１３
巻、７６４〜７６８頁（１９５４年）〕。尺応性成物ア
セチルホスフェート、００２及びＨ２Ｏ２のうち、特に
Ｈ２０□を分析的に良好に検出することができ、それ故
この酵素はピルベート及びキクベートを形成する酵素も
しくはその基質を定量的に測定するのに好適である。
公知のぎルベートオキシダーゼの性質は、その活性化［
ＦＡＤ （フラビン−アデニン−ジヌクレオチド）、Ｔ
ＰＰ（チアミンピロホスフェート）及び二価′め金属イ
オンの添加を必要とするという麿にある。しかしこの性
質はピルベート又はピルベートを形成する反応を測定す
る方法もしくは試薬の範囲において妨害的である。特に
、ＴＰＰは涌渭及びマグネシウムイオンの存在において
不溶の沈ｓＣヲ形成する傾向を有し、これは混濁の押固
となり、それ故光学的測定性を損なう。切に、ＴＰＰの
貯蔵性は組合せた試薬中で、特に二価の金属イオンの存
在において低下し、それは貯蔵する際に徐々に分解する
。特に、この性質は動力学的な湿式試験の範囲で妨害的
なものである。それ故、ピルベートを測定しかつこれに
好適な試薬のために、前記の物質、特にＴＰＰ及び二価
の金属イオンに左右されず、即ちこれらを添加しなくて
も十分に筒い活性度を有するピルベートオキシダーゼを
開示することが切望されていた。
ＦＡＤ （フラビン−アデニン−ジヌクレオチド）、Ｔ
ＰＰ（チアミンピロホスフェート）及び二価′め金属イ
オンの添加を必要とするという麿にある。しかしこの性
質はピルベート又はピルベートを形成する反応を測定す
る方法もしくは試薬の範囲において妨害的である。特に
、ＴＰＰは涌渭及びマグネシウムイオンの存在において
不溶の沈ｓＣヲ形成する傾向を有し、これは混濁の押固
となり、それ故光学的測定性を損なう。切に、ＴＰＰの
貯蔵性は組合せた試薬中で、特に二価の金属イオンの存
在において低下し、それは貯蔵する際に徐々に分解する
。特に、この性質は動力学的な湿式試験の範囲で妨害的
なものである。それ故、ピルベートを測定しかつこれに
好適な試薬のために、前記の物質、特にＴＰＰ及び二価
の金属イオンに左右されず、即ちこれらを添加しなくて
も十分に筒い活性度を有するピルベートオキシダーゼを
開示することが切望されていた。
ところで、ＦＡＤ、 ＴＰＰ及び二価の金属イオンを添
加しなくとも活性であるピルベートオキシダーゼが存在
することが判明し驚異的であり、本発明はこのことをベ
ースとする。
加しなくとも活性であるピルベートオキシダーゼが存在
することが判明し驚異的であり、本発明はこのことをベ
ースとする。
それ故、本発明の目的はＦＡＤＸＴＰＰ及び二価の金属
イオンｙｅｆＩＪｓ加しなくとも活性であるピルベート
オキシダーゼである。
イオンｙｅｆＩＪｓ加しなくとも活性であるピルベート
オキシダーゼである。
本発明によるぎルベートオキシダーゼは七の他の性質に
よっても例えば西ドイツ国特許公開第２９１１４８１号
明細誉に記載されている公知のピルベートオキシダーゼ
とは部分的には著しく異なっている。特に、本発明によ
る酵素では活性に関する至適ＰＨ範囲（ｐＨ５−０〜６
．５、最適ｐＨ５，７）は公知の酵素（ｐＨ６，５〜７
．５）よりも低く、分子量は本発明による酵素では超遠
心で測定して１４６０００であり、公知の酵素ではセフ
ァデックスＧ２００のゲル濾過によ’ｌ ｆｆ１ｌＪ定
して１９００００であり、それ数本発明によるｒｓＡが
但く、かつピルベート側足に使用する際に特に重要であ
るピルベートに対するミバエリス定数ＫＭはｌ／１０よ
りも更に低い。次に、本発明による酵素の性質を公知の
酵素の性質と比較する。
よっても例えば西ドイツ国特許公開第２９１１４８１号
明細誉に記載されている公知のピルベートオキシダーゼ
とは部分的には著しく異なっている。特に、本発明によ
る酵素では活性に関する至適ＰＨ範囲（ｐＨ５−０〜６
．５、最適ｐＨ５，７）は公知の酵素（ｐＨ６，５〜７
．５）よりも低く、分子量は本発明による酵素では超遠
心で測定して１４６０００であり、公知の酵素ではセフ
ァデックスＧ２００のゲル濾過によ’ｌ ｆｆ１ｌＪ定
して１９００００であり、それ数本発明によるｒｓＡが
但く、かつピルベート側足に使用する際に特に重要であ
るピルベートに対するミバエリス定数ＫＭはｌ／１０よ
りも更に低い。次に、本発明による酵素の性質を公知の
酵素の性質と比較する。
の弱さであり、かつ本発明による酵素を数日間透析した
後で、ＴＰＰ、 ＰＡＤ及びＭ言“の添加により活性度
ヲ価かではあるが５〜１５チ高めることができる。しか
し一方公知の＊ｉはこれらの活性剤なしには活性ではな
い。
後で、ＴＰＰ、 ＰＡＤ及びＭ言“の添加により活性度
ヲ価かではあるが５〜１５チ高めることができる。しか
し一方公知の＊ｉはこれらの活性剤なしには活性ではな
い。
アウチタロニ−（０ｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ ）試験（家
兎）で本発明による酸素と公知酵素との間には免疫学的
交叉反応は生じない。
兎）で本発明による酸素と公知酵素との間には免疫学的
交叉反応は生じない。
本発明による酵素は、後処理に十分な量を含有する微生
物から常用の生化学的方法の趣１用下に取得し、その際
に各々の富化工程に関しては酵素の性質、即ちＰＡＤ
、 ＴＰＰ及び二価の金属イオンの不存在においてピル
ベートからのＨ３Ｏ２形成に基いて、どの両分中に所望
の酵素が存在するかを容易に！出することができる。殊
に、水性微生物砕解物に直接または不溶成分の分離後に
ポリエチレンイミンを加え、その際に形成した不溶物を
分離除去する。
物から常用の生化学的方法の趣１用下に取得し、その際
に各々の富化工程に関しては酵素の性質、即ちＰＡＤ
、 ＴＰＰ及び二価の金属イオンの不存在においてピル
ベートからのＨ３Ｏ２形成に基いて、どの両分中に所望
の酵素が存在するかを容易に！出することができる。殊
に、水性微生物砕解物に直接または不溶成分の分離後に
ポリエチレンイミンを加え、その際に形成した不溶物を
分離除去する。
本発明による酵素の供給源として乳酸菌を使用すると有
利である。所望の酵素の含ｆについでは、ラクトバチル
スプランクルｗ、 （Ｌａｃｔｏｂａ−ｃｉｌｌｕｓ
Ｐｌａｎｔａｒｕｍ ） ＤＳＭ ２５７ ｊ 、ラク
トバチルスサリバリウス（Ｌａｃｔｏｂａｃｌｌｌｕａ
８ａｌｉｖａｒ−１ｕａ ） ＤＳＭ ２５７５、ロ
イ・コノストクメセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔ
ｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ ） ＤＳＭ２５７
２及び／又はストレプトコックスクレモリス（５ｔｒｅ
ｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｃｒｅｍｏｒｉｓ ） ＤＳＭ
２５７４が特に好適な給源として明らかとなった。試験
した数百様の異なる乳ｅ菌のうち本発明による酵素は試
＃！菌株の約ｌ／４で検出することができた。そのこと
により、酵素が広く分布していると結論することができ
る。更に、乳酸菌に含まれない微生物中でも見出し得る
ことの手がかりが存在する。
利である。所望の酵素の含ｆについでは、ラクトバチル
スプランクルｗ、 （Ｌａｃｔｏｂａ−ｃｉｌｌｕｓ
Ｐｌａｎｔａｒｕｍ ） ＤＳＭ ２５７ ｊ 、ラク
トバチルスサリバリウス（Ｌａｃｔｏｂａｃｌｌｌｕａ
８ａｌｉｖａｒ−１ｕａ ） ＤＳＭ ２５７５、ロ
イ・コノストクメセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔ
ｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ ） ＤＳＭ２５７
２及び／又はストレプトコックスクレモリス（５ｔｒｅ
ｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｃｒｅｍｏｒｉｓ ） ＤＳＭ
２５７４が特に好適な給源として明らかとなった。試験
した数百様の異なる乳ｅ菌のうち本発明による酵素は試
＃！菌株の約ｌ／４で検出することができた。そのこと
により、酵素が広く分布していると結論することができ
る。更に、乳酸菌に含まれない微生物中でも見出し得る
ことの手がかりが存在する。
微生物から酵素を取得する１７ｉ：肖り微生物を常法で
砕解する。良好な結果は、超音波を用いて及びダイノミ
ル（’Ｄ７ｎＯＩｌｌ（ｌｈｌｅ ） （ガラスピー
ス）中で達成された。高圧分散液中の砕解によっても良
好な結果が得られた。しかし一般には、例えは西ドイツ
国特許公開第２９１１４８１号明細書に記載されている
ように他の砕解法も適用することができる。
砕解する。良好な結果は、超音波を用いて及びダイノミ
ル（’Ｄ７ｎＯＩｌｌ（ｌｈｌｅ ） （ガラスピー
ス）中で達成された。高圧分散液中の砕解によっても良
好な結果が得られた。しかし一般には、例えは西ドイツ
国特許公開第２９１１４８１号明細書に記載されている
ように他の砕解法も適用することができる。
既に記載したように、本発明による酵素の富化及び精製
は常用の生化学的方法により達成することができる。試
験済みの作業法で、砕解後に不溶物を遠心分離し、上澄
みを２５％と６５％の硫酸アンモニウムの間でｐＨ６，
３で分画し、活性な両分はデキストランブルーセファロ
ース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社、スウェーデン、Ｕｐｓａ
’ｌａ在）を介してクロマトグラフィ処理し、活性画分
を褥び飽和度２０％及び６０％の硫酸アンモニウムの間
で分画し、最後に分子篩（５ｅｐｈａｄθｘ ＡＣ！Ａ
６４、ＬＫＢ社）を通して精製する。
は常用の生化学的方法により達成することができる。試
験済みの作業法で、砕解後に不溶物を遠心分離し、上澄
みを２５％と６５％の硫酸アンモニウムの間でｐＨ６，
３で分画し、活性な両分はデキストランブルーセファロ
ース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社、スウェーデン、Ｕｐｓａ
’ｌａ在）を介してクロマトグラフィ処理し、活性画分
を褥び飽和度２０％及び６０％の硫酸アンモニウムの間
で分画し、最後に分子篩（５ｅｐｈａｄθｘ ＡＣ！Ａ
６４、ＬＫＢ社）を通して精製する。
別法では、砕解物液体にポリエチレンイミン４チを加え
、沈殿を除去しかつ上澄み中で硫酸アンモニウム沈殿を
飽和度６５％で行なう。沈殿を採取しかつ透析後サッカ
ロース傾斜工程にもたらす。凋び硫酸アンモニウム沈殿
’に６５％までで行ないかつゲル濾過した後で、デキス
トランブルーセファロースを介して精製する。
、沈殿を除去しかつ上澄み中で硫酸アンモニウム沈殿を
飽和度６５％で行なう。沈殿を採取しかつ透析後サッカ
ロース傾斜工程にもたらす。凋び硫酸アンモニウム沈殿
’に６５％までで行ないかつゲル濾過した後で、デキス
トランブルーセファロースを介して精製する。
記載の方法により約２０〜３０倍の富化によって比活性
約６〜９Ｕ／〜（蛋白質）までを達成することができる
。
約６〜９Ｕ／〜（蛋白質）までを達成することができる
。
本発明の他の目的により、新規ｍ、素を形成Ｈ２Ｏ２の
測定によりピルベートの測定に使用する。これについて
は多数の好適な方法が知られており、傷に記載する必要
はない。０２消＊量を例えば酸素電極により測定するご
とも好適である。
測定によりピルベートの測定に使用する。これについて
は多数の好適な方法が知られており、傷に記載する必要
はない。０２消＊量を例えば酸素電極により測定するご
とも好適である。
本発明による酵素はピルベートの測定ばかりでなく、竹
に基質及びビルベルト形成に案内する酵素の測定にも使
用することができる。
に基質及びビルベルト形成に案内する酵素の測定にも使
用することができる。
本発明による酵素な用いて実施することのできる測定の
代表例は次の通りである： グルタメート−ピルベート−トランスアミナーゼ又はα
−ケトグルタレート； グルタメート−オキサルア七テートートランスアミナー
ゼ； ピルベートキナーゼ又はＡＤＰ ｉ ラクテートデヒドロゲナーゼ又は乳酸；グリセリン又は
グリセロホス７エートキナーゼ： トリグリセリド； クレアチンホスホキナーゼ又はクレアチン；ミオキナー
ゼ、チオキナーセ゛又は脂肪酸。
代表例は次の通りである： グルタメート−ピルベート−トランスアミナーゼ又はα
−ケトグルタレート； グルタメート−オキサルア七テートートランスアミナー
ゼ； ピルベートキナーゼ又はＡＤＰ ｉ ラクテートデヒドロゲナーゼ又は乳酸；グリセリン又は
グリセロホス７エートキナーゼ： トリグリセリド； クレアチンホスホキナーゼ又はクレアチン；ミオキナー
ゼ、チオキナーセ゛又は脂肪酸。
本発明の他の目的はピルベートを測定するための試薬で
あり、これは本発明によるピルベートオキシダーゼ、ホ
スフェート、緩衝剤、Ｈ２ｏ２測定糸及び場合によりピ
ルベートを形成する糸を含有することを特徴とする。
あり、これは本発明によるピルベートオキシダーゼ、ホ
スフェート、緩衝剤、Ｈ２ｏ２測定糸及び場合によりピ
ルベートを形成する糸を含有することを特徴とする。
緩衝剤としては、酵素が活性でありかつ安定である前記
のＰＨ範囲に緩衝するそれぞれの好適なに衝物質を使用
することかできる。ホスフェート緩衝剤も好適であるの
で、反応に必要なホスフェートと共に特別な緩衝剤の添
加はもはや必要ではない。しかし一般に、緩衝剤の選択
では、Ｈ２Ｏ２ｖ形成する系中に又はピルベートを形成
する系中に補酵素に関してどの両値が含まれているかも
配慮すべきである。しかしこれらの酵素に関する公知の
データに基いて当業者は容易に好適な緩衝剤の選択を行
なうことができる。
のＰＨ範囲に緩衝するそれぞれの好適なに衝物質を使用
することかできる。ホスフェート緩衝剤も好適であるの
で、反応に必要なホスフェートと共に特別な緩衝剤の添
加はもはや必要ではない。しかし一般に、緩衝剤の選択
では、Ｈ２Ｏ２ｖ形成する系中に又はピルベートを形成
する系中に補酵素に関してどの両値が含まれているかも
配慮すべきである。しかしこれらの酵素に関する公知の
データに基いて当業者は容易に好適な緩衝剤の選択を行
なうことができる。
本発明による試薬は、試験片用の組、テラスチックシー
ト等のような基材の含浸に十分に好適である。
ト等のような基材の含浸に十分に好適である。
殊に、本発明による試薬はピルベートオキシダーゼ１〜
５ Ｑ Ｕ／ ｒｉｇ、ホスフェート１ｏ〜５００ミリ
モル／ −１％ 緩衝前（１ｐＨ６〜８、（場合によ
り基質１〜５０ミリモル／〕、例えばＧＰＴ測定に関し
て、それぞれα−ケトグルタレート及び１−アラニン）
並びにＨ２Ｏ２Ｍ足糸として４−アミノアンチピリン０
．５〜４０ミリモル／ノ、２−ヒドロキシ−３，５−ジ
クロルベンゼン−スルホン酸（ＨＤＢＳ） １〜５ｏミ
リモル／ノ及びペルオキシダーゼ０．２〜２０Ｕ／ｄｆ
含有する。
５ Ｑ Ｕ／ ｒｉｇ、ホスフェート１ｏ〜５００ミリ
モル／ −１％ 緩衝前（１ｐＨ６〜８、（場合によ
り基質１〜５０ミリモル／〕、例えばＧＰＴ測定に関し
て、それぞれα−ケトグルタレート及び１−アラニン）
並びにＨ２Ｏ２Ｍ足糸として４−アミノアンチピリン０
．５〜４０ミリモル／ノ、２−ヒドロキシ−３，５−ジ
クロルベンゼン−スルホン酸（ＨＤＢＳ） １〜５ｏミ
リモル／ノ及びペルオキシダーゼ０．２〜２０Ｕ／ｄｆ
含有する。
本発明により、公知のＰ素の欠点は除かれかつ優れた貯
蔵性を有する試薬を製造する可能性が得られる。
蔵性を有する試薬を製造する可能性が得られる。
次に、本発Ｅ！Ａを昇施例により詳説する。
例 １
ラクトパチルスプランタルムＤＳＭ ２５ ’７１から
ピルベートオキシダーゼ（ｐｙ−ｏｎ ）の単離１、培
養 培地（ｐＨ７）１１尚り トリプト７１０１Ｆ、酵母エキス４ ｆ 、 Ｋ２ＷＯ
４−３）（２０２５４，クエン酸水素ジアンモニウム２
？、ツイーン５Ｑ（ｙｊｅリオキシエチレンソルピタン
モノオレエート） Ｉ’、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２００、２
ｆ 、 ＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ０−２Ｐ、硫化モリブデン
０．０２ｆ、ラクトーヌ１０５’＼、無性ブＰつ酸３．
２？、（±）寒天２％ ラクトパチルスブランクルムＤｓｍ ２５７１を前記の
組成の培地（＋寒天）１５０−又は乳酸菌に常用のＭＢ
２培ぜ中で穿刺培養物として２８℃で培養する。成長後
、新たに培地（前記の寒天培地）１５０−にこの穿刺培
養物から接種しかつ５００−一三角フラスコ中２８℃で
後の対数期が終結するまで振盪する。
ピルベートオキシダーゼ（ｐｙ−ｏｎ ）の単離１、培
養 培地（ｐＨ７）１１尚り トリプト７１０１Ｆ、酵母エキス４ ｆ 、 Ｋ２ＷＯ
４−３）（２０２５４，クエン酸水素ジアンモニウム２
？、ツイーン５Ｑ（ｙｊｅリオキシエチレンソルピタン
モノオレエート） Ｉ’、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２００、２
ｆ 、 ＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ０−２Ｐ、硫化モリブデン
０．０２ｆ、ラクトーヌ１０５’＼、無性ブＰつ酸３．
２？、（±）寒天２％ ラクトパチルスブランクルムＤｓｍ ２５７１を前記の
組成の培地（＋寒天）１５０−又は乳酸菌に常用のＭＢ
２培ぜ中で穿刺培養物として２８℃で培養する。成長後
、新たに培地（前記の寒天培地）１５０−にこの穿刺培
養物から接種しかつ５００−一三角フラスコ中２８℃で
後の対数期が終結するまで振盪する。
”ＭＲ８培地の組成は次の通シである（１）当シ）：肉
エキス（ＭＥＲＣＫ社）２Ｐ、カゼインからのベノトン
ＩＯｆ？）リゾシンで（ｔｒｙｐｉｓａｈ）。
エキス（ＭＥＲＣＫ社）２Ｐ、カゼインからのベノトン
ＩＯｆ？）リゾシンで（ｔｒｙｐｉｓａｈ）。
酵母エキス４Ｆ、グルコース２０ムツイー：／ ８０
１１１１ｔ％ Ｋ２ＨＰＯ４φ３ Ｈ２Ｏ２−５９ＸＮ
ａ−アセ７ ） −３Ｈ２Ｏ５１％ クエン酸シアン
モニ’） Ａ ２ Ｆ ＸＭｇ５Ｏ，ｅ ７ Ｈ２Ｏ２
００”ｌ、ＭｎＥＩ０４＠Ｈ２０５，０■ ２、単離 Ｐ７−ＯＤ １２０ Ｕ／ノを含有する５０ノ一培養ラ
クトバチルスゾランタルムＤＳＭ ２５７１力λら湿潤
物質６００ｙを遠心分離により採取する。
１１１１ｔ％ Ｋ２ＨＰＯ４φ３ Ｈ２Ｏ２−５９ＸＮ
ａ−アセ７ ） −３Ｈ２Ｏ５１％ クエン酸シアン
モニ’） Ａ ２ Ｆ ＸＭｇ５Ｏ，ｅ ７ Ｈ２Ｏ２
００”ｌ、ＭｎＥＩ０４＠Ｈ２０５，０■ ２、単離 Ｐ７−ＯＤ １２０ Ｕ／ノを含有する５０ノ一培養ラ
クトバチルスゾランタルムＤＳＭ ２５７１力λら湿潤
物質６００ｙを遠心分離により採取する。
細胞１ｏｏｙａ’ガラスダイノミル中で砕解し、ポリエ
チレンイミン４％の添加後遠心分１ｉｆｔ Ｌ力・つ上
澄みＹＰ８６．３で硫酸アンモニウム（２５チλび６５
チ）−分画し、デキストランブルーセファロースクロマ
トグラフィ処理しくＰｈａｒｍａｃｉａ社Ｌ ２０％
及び３０％の間で２回目の硫酸アンモニウム分画乞し、
かつ、セファデックスＡＣＡ３４ （ＬＫＢ社）を介し
て分子篩を通して後処理する。
チレンイミン４％の添加後遠心分１ｉｆｔ Ｌ力・つ上
澄みＹＰ８６．３で硫酸アンモニウム（２５チλび６５
チ）−分画し、デキストランブルーセファロースクロマ
トグラフィ処理しくＰｈａｒｍａｃｉａ社Ｌ ２０％
及び３０％の間で２回目の硫酸アンモニウム分画乞し、
かつ、セファデックスＡＣＡ３４ （ＬＫＢ社）を介し
て分子篩を通して後処理する。
富化に関するデータは次の表に掲載する。
ｙｎＩ製した酵素は比活性５．８Ｕ／ｌＩｖを有し、０
．０３ ’％より少ないアボーグルタメートーールベー
トートランスアミナーゼ＋α−ケトグルタレートオキシ
ダーゼ並びに０．００２％より少ないＮＡＤＨオキシダ
ーゼを含有する。
．０３ ’％より少ないアボーグルタメートーールベー
トートランスアミナーゼ＋α−ケトグルタレートオキシ
ダーゼ並びに０．００２％より少ないＮＡＤＨオキシダ
ーゼを含有する。
ぎルペートオキシダーゼの活性は次の条件下に確定した
： ｙ−ＯＤ （１１ピルペー”） ＋ Ｐｉ ＋ ０２−〉アセチル
−Ｐ＋００２十Ｈ２Ｏ２ （２１Ｈ２Ｏ２＋ ４−アミンアンチピリン（４−ＡＡ
）＋２−ヒドロキシ−５，５−ジクロルベンゼンスルホ
ン＃ （ＨＤＢＳ ） −一ユキノン着色物質（５４６
隅） ＋ ２ Ｈ２Ｏ Ｈ２Ｏ２は着色物質等モル量で使われる。
： ｙ−ＯＤ （１１ピルペー”） ＋ Ｐｉ ＋ ０２−〉アセチル
−Ｐ＋００２十Ｈ２Ｏ２ （２１Ｈ２Ｏ２＋ ４−アミンアンチピリン（４−ＡＡ
）＋２−ヒドロキシ−５，５−ジクロルベンゼンスルホ
ン＃ （ＨＤＢＳ ） −一ユキノン着色物質（５４６
隅） ＋ ２ Ｈ２Ｏ Ｈ２Ｏ２は着色物質等モル量で使われる。
Ｐ７−ＯＤ １単位−２ルペート変換１μモル／分（２
５℃で）ピルベートの測定ニ リン酸カリウム緩衝剤７２ミリモル、ＰＨ６，７；４−
ＡＡ８ミリモル； ）ＩＤＥ８６．８ミリモル／ノ；
ＦＡＤ ０．０１ミリモル／ノｔ ＰＯＤ ２ Ｕ ；
ｐ７−ＯＤ １０ Ｕ ／ ｍｌｏ最終値を得るため
にぎルペート０．０５μモルもしくはぎルベート乞含有
する試料を容量２ｄのキュベツト中に層厚１ｃｔＩ＆及
び６７℃で添加することにより開始する。
５℃で）ピルベートの測定ニ リン酸カリウム緩衝剤７２ミリモル、ＰＨ６，７；４−
ＡＡ８ミリモル； ）ＩＤＥ８６．８ミリモル／ノ；
ＦＡＤ ０．０１ミリモル／ノｔ ＰＯＤ ２ Ｕ ；
ｐ７−ＯＤ １０ Ｕ ／ ｍｌｏ最終値を得るため
にぎルペート０．０５μモルもしくはぎルベート乞含有
する試料を容量２ｄのキュベツト中に層厚１ｃｔＩ＆及
び６７℃で添加することにより開始する。
反応は１５分後に停止する。吸光度係数ε−１６，５ｅ
−”／μモル（５４，６ｎｍで）が極めて純粋なぎルペ
ート（モノナトリウム塩）に関して測定された。
−”／μモル（５４，６ｎｍで）が極めて純粋なぎルペ
ート（モノナトリウム塩）に関して測定された。
例 ２
ＧＰＴの動力学的測定
ｘｍ２ｐｏ、 ８０ミリモ
ル／ノ、ＰＨ６，７アラニン ８
００ミリモル／ノＮ −（３’−スルホニル−４′〜 α−ケトグルタル＃Ｒ１８ミリモル／ノビルペートオキ
シダーゼ Ｑ、２Ｕ／ｎｔｌｐ ＯＤ
２ Ｕ／ｄを含有する溶液２．５ ａ
ｔに試料０．１ｄＹ力Ｐえる。
ル／ノ、ＰＨ６，７アラニン ８
００ミリモル／ノＮ −（３’−スルホニル−４′〜 α−ケトグルタル＃Ｒ１８ミリモル／ノビルペートオキ
シダーゼ Ｑ、２Ｕ／ｎｔｌｐ ＯＤ
２ Ｕ／ｄを含有する溶液２．５ ａ
ｔに試料０．１ｄＹ力Ｐえる。
３分後に１分間当りの吸光度変化？測定する。
測定温度は２５℃であり、波長は５４６ ｎｍである。
εは１９．６であり、全容量は２．６−及び試料容量は
０．１４である。吸光度上昇７分からＧＰＴの活性が計
算される。− 例 ３ ＧＯＴの動力学的測定 アラニンの代りにアラニンスルフィン＃ ２００ミリモ
ル／ノを含有する例２と同様のバッチ中で例２と同じ条
件下にＧＯＴ含有試料な添加丁゛る。
０．１４である。吸光度上昇７分からＧＰＴの活性が計
算される。− 例 ３ ＧＯＴの動力学的測定 アラニンの代りにアラニンスルフィン＃ ２００ミリモ
ル／ノを含有する例２と同様のバッチ中で例２と同じ条
件下にＧＯＴ含有試料な添加丁゛る。
吸介度変化／分から直接ＧＯＴ含量が計算される。
例 ４
ＧＰＴ用試験片
ＧＰＴ試験片の製造に当り２枚の紙を含浸する：Ａ）酢
素紙 アラニン ８００ミリモル／ノリ
ン酸水素カリウム １きリモル／ノーＰＯＤ
２００００Ｕ／ノビルペートオ
キシダーゼ ２０００００ Ｕ／ノ吸収性の紙
（厚さ５０μｍ１面積重ｆ１２Ｐ／ｍ２、吸収性Ｈ２Ｏ
５０Ｐ／ｍ” ）Ｙこの溶液で含浸しかつ３０℃で５分
間乾燥させる（例えば５ｃｈ８１１ｅｒ ＆ Ｈ６ａｃ
ｈ社のティーバッグの紙）。次いで、この紙Ｙ幅１ｃｌ
Ｉ＆に切断する。
素紙 アラニン ８００ミリモル／ノリ
ン酸水素カリウム １きリモル／ノーＰＯＤ
２００００Ｕ／ノビルペートオ
キシダーゼ ２０００００ Ｕ／ノ吸収性の紙
（厚さ５０μｍ１面積重ｆ１２Ｐ／ｍ２、吸収性Ｈ２Ｏ
５０Ｐ／ｍ” ）Ｙこの溶液で含浸しかつ３０℃で５分
間乾燥させる（例えば５ｃｈ８１１ｅｒ ＆ Ｈ６ａｃ
ｈ社のティーバッグの紙）。次いで、この紙Ｙ幅１ｃｌ
Ｉ＆に切断する。
Ｂ）指示薬用紙
ＨＣＪ、（＆側糸） １００ミリモル乙ノ中に溶
解したα−ケトグルタル酸 １８ミリモ
ル／ノこの溶液で同様に相応して吸収性の紙を含浸し、
３０℃で５分間乾燥させかつ幅１礪に切断する。幅１眞
、暦さ１００μｍの透明なポリカーボネートシートを指
示薬用紙及び酵素用紙と一緒にプラスチック片の片側に
、シートは外仙１に、指示薬用紙は中央に、酵素用紙は
内１１１＋に配置するように固定する。それと共に幅１
５ｍ。
解したα−ケトグルタル酸 １８ミリモ
ル／ノこの溶液で同様に相応して吸収性の紙を含浸し、
３０℃で５分間乾燥させかつ幅１礪に切断する。幅１眞
、暦さ１００μｍの透明なポリカーボネートシートを指
示薬用紙及び酵素用紙と一緒にプラスチック片の片側に
、シートは外仙１に、指示薬用紙は中央に、酵素用紙は
内１１１＋に配置するように固定する。それと共に幅１
５ｍ。
岸さ１．５藤、緑維の太さ約２μｍ、のがラス緻、維フ
リースを設ける。その際にシートと含浸紙の自由端がフ
リースより６襲突き出すように設ける。その後、幅６ｊ
ＩＢの試験片に切断する。血液１５μノを試料区域上に
施す場合、血しよう分は３０〜６０秒間で全ガラス細紐
フリースに透明なシート下にも浸透し、一方赤血球は試
料区域に固定される。シートを圧Ｎすることにより酵素
用紙及び指示薬用紙は展開した血しようと接触しかつ均
一に湿潤する。抑しよう中に含まれるＧＰＴは呈色反応
して青色になり、その濃さはＧＰＴ ｔに比例し、場合
により拡散反射光度計で測定することができる。同様に
血清等のような佃の試料も反応する。
リースを設ける。その際にシートと含浸紙の自由端がフ
リースより６襲突き出すように設ける。その後、幅６ｊ
ＩＢの試験片に切断する。血液１５μノを試料区域上に
施す場合、血しよう分は３０〜６０秒間で全ガラス細紐
フリースに透明なシート下にも浸透し、一方赤血球は試
料区域に固定される。シートを圧Ｎすることにより酵素
用紙及び指示薬用紙は展開した血しようと接触しかつ均
一に湿潤する。抑しよう中に含まれるＧＰＴは呈色反応
して青色になり、その濃さはＧＰＴ ｔに比例し、場合
により拡散反射光度計で測定することができる。同様に
血清等のような佃の試料も反応する。
例 ５
ＧＯＴ用試験片
ＧＯＴ用試験は例４によるＧＰＴ用試験片と全く同様に
調製するが、但し酵素用紙はアラニンの代りにアラニン
スルフイン酸２００ミリモルを含有する、透明なシート
の圧着後に生じる青色は試料中のＧＯＴ量の尺度である
。
調製するが、但し酵素用紙はアラニンの代りにアラニン
スルフイン酸２００ミリモルを含有する、透明なシート
の圧着後に生じる青色は試料中のＧＯＴ量の尺度である
。
ドイツ連邦共和国ミュンヘン４０
テユルケンシュトラーセ８２
＠ｌ！ 明者 アルベルト・レーダードイツ連邦共
和国ゼースハウプ ト・テイーフエンタールヴ工− り８ ０発 明 者 ハンス・メレリング ドイツ連邦共和国トウツイング ・ヘレシュトラーセ１０ ０発 明 者 ハンス・ザイデル ドイツ連邦共和国トウライング ・ヴアクセンシュタインシュト ラーセ６
和国ゼースハウプ ト・テイーフエンタールヴ工− り８ ０発 明 者 ハンス・メレリング ドイツ連邦共和国トウツイング ・ヘレシュトラーセ１０ ０発 明 者 ハンス・ザイデル ドイツ連邦共和国トウライング ・ヴアクセンシュタインシュト ラーセ６
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、ピルベートをＨ２Ｏ２の形成下に脱炭＃１ｊるピル
ベートオキシダーゼにおいて、それがＦＡＤ ＸＴＰＰ
及び二価の金属イオン％ｆ添加しなくとも活性であるこ
とを％徴とするピルベートオキシダーゼ。 ２、活性至適ｐＨ５，７、安定性至適ｐＨ５，６〜５．
８．２５℃でピルベートのＫＭＯ，４ミリモル／ノ、２
５℃でホスフェートのＫＭ２．３ミリモル／ノ及びアメ
スの超遠心機で測定して分子量１４６０００ダルトンで
ある特許請求の範囲第１項記載のピルベートオキシダー
ゼ。 ５、 ＦＡＤ、 ＴＰＰ及び二価の金属イオンを添
加しなくとも活性であり、ビルベー） ）ｉ Ｈ２Ｏ２
１７）形成下に脱炭酸するピルベートオキシダーゼな製
造する方法において、所望の酵素な後処理に十分な量で
含有する微生物な砕解し、この水性砕解物処ポリエチレ
ンイミンを加え、不溶成分を分能しかつ得られた溶液か
ら酵素を常用の生化学的方法により取得しかつ鞘製する
ことを特徴とするピルベートオキシダーゼの製法。 ４、微生物として乳酸菌を使用する特許請求の範囲第６
項記載の方法。 ５、 乳酸菌としてラクトバチルスプランタルムＤＳＭ
２５７１ 、ラクトバチルスサリバリウスＤＳＭ ２
５７３ 、ロイコノストクメセンテロイデスＤＳＭ ２
５７２及び／又はストレゾトコックスクレモリスＤＡＭ
２５７４を使用する特許請求の範囲第４項記載の方法
。 ６、形成したＨ２Ｏ２又は消費した０２を、ＦＡＤ 。 ＴＰＰ及び二価の金属イオンを添加しなくとも活性であ
り、ぎルペートナＨ２Ｏ２の形成下に脱炭酸するピルベ
ートオキシダーゼを用いて測定することを特徴とするピ
ルベートの測定法。 ７、 ＦＡＤ、 ＴＰＰ及び二価の金属イオンを添加
しなくとも活性であり、ビルベー） Ｙ ＨａＯ２の形
成下に脱炭酸するピルベートオキシダーゼ、ホスフェー
ト、緩衝剤及びＨ２Ｏ２の測定系を含有するピルベート
測定試薬。 ８、 薄層状の支持材上に調製して施されている特許請
求の範囲第７項記載の試薬。 ９Ｈ２０２ｋ ’６４１Ｊ 定する糸がペルオキシダー
ゼと指示薬としてａ）４−アミノアンチピリン及び２−
ヒドロキシ−６，５−ジクロルベンゼン−スルホン酸又
はｂ） ４ 、５− （４−ジメチルアミノフェニル）
−２−（３，５−ジメトキシ−４−ヒト日キシフェニル
）−イミダゾールとより成る特許請求の範囲第８項記載
の試薬。 １０、積層支持材から成りかつ一つの指示ｌ−が指示薬
を含有しかつ他の指示層が他の成分を含有する特許請求
の範囲第８項又は第９項記載の試薬。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE3306719.8 | 1983-02-25 | ||
| DE19833306719 DE3306719A1 (de) | 1983-02-25 | 1983-02-25 | Pyruvatoxidase |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS59162877A true JPS59162877A (ja) | 1984-09-13 |
| JPS6114794B2 JPS6114794B2 (ja) | 1986-04-21 |
Family
ID=6191871
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59032729A Granted JPS59162877A (ja) | 1983-02-25 | 1984-02-24 | ピルベ−トオキシダ−ゼ、その製法並びにピルベ−トの測定法及びそのための試薬 |
Country Status (15)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4666832A (ja) |
| EP (1) | EP0117550B1 (ja) |
| JP (1) | JPS59162877A (ja) |
| AT (1) | ATE63334T1 (ja) |
| AU (1) | AU573570B2 (ja) |
| CA (1) | CA1213843A (ja) |
| CZ (1) | CZ280350B6 (ja) |
| DD (1) | DD220777A5 (ja) |
| DE (2) | DE3306719A1 (ja) |
| DK (1) | DK100184A (ja) |
| ES (1) | ES530001A0 (ja) |
| IE (1) | IE56922B1 (ja) |
| SU (1) | SU1322984A3 (ja) |
| YU (1) | YU33984A (ja) |
| ZA (1) | ZA841363B (ja) |
Families Citing this family (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3614470A1 (de) * | 1985-05-02 | 1986-11-20 | Gary D. Flushing N.Y. Steinman | Verfahren zum messen der kaliumgehalte in biologischen fluessigkeiten |
| EP0274425B1 (en) * | 1987-01-06 | 1993-12-15 | Asahi Kasei Kogyo Kabushiki Kaisha | Pyruvate oxidase, its preparation and use |
| DE3821077A1 (de) * | 1988-02-12 | 1989-08-24 | David Diagnostics Inc | Verfahren zur bestimmung des sauerstoffgehaltes in biologischen fluessigsubstraten und vorrichtung zur durchfuehrung des verfahrens |
| US5153138A (en) * | 1988-10-03 | 1992-10-06 | Boehringer Mannheim Gmbh | Pyruvate oxidase mutants, DNA expressing pyruvate oxidase and methods of use thereof |
| DE3833601A1 (de) * | 1988-10-03 | 1990-04-05 | Boehringer Mannheim Gmbh | Pyruvatoxidase-mutanten |
| IT1241154B (it) * | 1990-05-18 | 1993-12-29 | Slavo | Metodo e composizione reagente per la determinazione dell'alanina amminotrasferasi e dell'antigene hbsag in uno stesso campione biologico |
| US5834226A (en) * | 1991-01-31 | 1998-11-10 | Xytronyx, Inc. | One-step test for aspartate aminotransferase |
| JP3034969B2 (ja) * | 1991-03-01 | 2000-04-17 | 旭化成工業株式会社 | アンモニア、α−アミノ酸類またはα−ケト酸の高感度定量法および高感度定量用組成物 |
| CA2365668C (en) | 1999-03-17 | 2014-05-20 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | In vitro macromolecule biosynthesis methods using exogenous amino acids and a novel atp regeneration system |
| FR2814947B1 (fr) * | 2000-10-09 | 2003-01-31 | Oreal | Composition tinctoriale favorisant la pigmentation naturelle procede d'obtention et utilisation pour la coloration de la peau et/ou des fibres keratiniques |
| EP3864167A4 (en) * | 2018-10-12 | 2022-11-23 | Polymer Technology Systems, Inc. | POTASSIUM DETECTION SYSTEMS AND METHODS AT THE SUPPLY POINT |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| DE2911481A1 (de) * | 1978-03-25 | 1979-10-04 | Toyo Jozo Kk | Verfahren zur gewinnung von pyruvatoxidase und deren verwendung fuer analytische zwecke und als reagenz |
| JPS5840465A (ja) * | 1981-09-03 | 1983-03-09 | 松下精工株式会社 | 空冷式冷凍機 |
| JPS5915637A (ja) * | 1982-07-19 | 1984-01-26 | Nissan Motor Co Ltd | ガスタ−ビンエンジンの始動方法および装置 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0236227B2 (ja) * | 1983-03-03 | 1990-08-16 | Kyowa Hakko Kogyo Kk | Pirubinsanokishidaazenoseizoho |
-
1983
- 1983-02-25 DE DE19833306719 patent/DE3306719A1/de not_active Ceased
-
1984
- 1984-02-22 IE IE421/84A patent/IE56922B1/en not_active IP Right Cessation
- 1984-02-22 CA CA000448010A patent/CA1213843A/en not_active Expired
- 1984-02-22 AU AU24824/84A patent/AU573570B2/en not_active Ceased
- 1984-02-23 DD DD84260292A patent/DD220777A5/de not_active IP Right Cessation
- 1984-02-23 YU YU00339/84A patent/YU33984A/xx unknown
- 1984-02-24 JP JP59032729A patent/JPS59162877A/ja active Granted
- 1984-02-24 ES ES530001A patent/ES530001A0/es active Granted
- 1984-02-24 AT AT84101954T patent/ATE63334T1/de not_active IP Right Cessation
- 1984-02-24 DE DE8484101954T patent/DE3484541D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1984-02-24 CZ CS841296A patent/CZ280350B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1984-02-24 ZA ZA841363A patent/ZA841363B/xx unknown
- 1984-02-24 EP EP84101954A patent/EP0117550B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1984-02-24 SU SU843706215A patent/SU1322984A3/ru active
- 1984-02-24 DK DK100184A patent/DK100184A/da not_active Application Discontinuation
- 1984-02-27 US US06/583,728 patent/US4666832A/en not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (4)
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|---|---|---|---|---|
| JPS4939836A (ja) * | 1972-08-25 | 1974-04-13 | ||
| DE2911481A1 (de) * | 1978-03-25 | 1979-10-04 | Toyo Jozo Kk | Verfahren zur gewinnung von pyruvatoxidase und deren verwendung fuer analytische zwecke und als reagenz |
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Also Published As
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