SU1322984A3 - Способ определени пирувата в биологических объектах - Google Patents

Abstract

Изобретение относитс  к биохиъши: и биотехнологии и обеспечивает повышение стабильности и достоверности результатов определени  за счет предотвращени  образовани  осадков и помутнений . Способ заключаетс  в том, что в состав реактива дл  определени  целевого продукта входит пируватокси- даза, характеризующа с  оптимумом активности при рН 5,7, оптимумом стабильности при рН 5,6-5,8, константой Михаэлиса дл  пирувата при 25 С 0,4 ммоль/л, дл  фосфата 2,3 ммоль/л, мол.м 146000 дальтон при определении в центрифуге по , вьщеленна  из штаммов мелочно-кислых бактерий Са ctobacillus DSM 2671, Lbc. salivari- U8 DSM 2573, Leuconostoc mesentero- ideB DSM 2572 и/или Streptococcus creraoris DSM 2574. 4 табл.

Description

113

Изобретение относитс  к биохимии и биотехнологии и касаетс  получени  фермента, пригодного дл  количественного определени  пирувата и пируват- образуюших ферментов.

Цель иобретени  - повьт1ение стабильности и достоверности результатов определени  за счет предотвращени  образовани  осадков и помутнений.

Способ определени  пйрувата в биологических пробах заключаетс  в том, что в состав реактива дл  определени  пирувата входит фермент пируватокси- да, активный без добавлени  флавин- адепнндинуклеотида (FAD), тиамин-пи- рофосфата (ТРР) и двухвалентных ионов металлов. Пируватоксидаза оптимально активна при рН 5,7, оптимально стабильна при рН 5,6-5,8 и, что особенно важно, при применении фермента константа Михаэлиса равна 0,4 ммоль/л дл  пирувата и 2, 3 ммол ь/л дл  фосфата, мол.м. фермента 146000 дальтон, что мрньше известного фермента (190000).

Полученный фермент более специфичен к субстрату по сравнению с известным .

Характеристики специфичности представлены в табл.1.

Вли ние ингибиторов на активность предлагаемого фермента, используемог дл  определени  пирувата, показано в табл.2.

Ингибирующее действие ЕДТА на предлагаемую пируватоксидазу в 1000 раз слабее, чем в случае известного фермента, а после многодневного диализа фермента благодар  добавке ТРР FAD и Мп активность повышаетс  на 5-15Z, в то врем  как известный фермент без этих активаторов неактивен.

В качестве источника фермента используют штаммы молочно-кислых бактерий Lactobacillus plantarum DSM 2571, Lbc. Salivarius DSM 2573, Le- uconosboc mesenteroides DSM 2572 и/или Streptococcus cremoris DSM 2574, хран щиес  в Национальной коллекции микроорганизмов.

Обогащение и очистку фермента осуществл ют обычными биохимическими методами . Можно достигнуть 20-30-кратного обогащени  до достижени  удельной активности 6-9 ед/мг протеина. Полученна  пируватоксидаэа входит в состав реактива дл  определени  пирувата в анализируемых пробах.

42

Предпочтительный состав реактива: 1-50 ед/нл пируватоксидазы, 10 - 50 ммоль/л фосфата, буфер рН 6-8 (любое пригодное буферное вещество, буферирующее в указанных рН-област х, в которых фермент активен и стабилен ) . Хорошо пригоден фосфатный буфер и 0,22 ед/мл пероксидазы (РОД). Использование в составе реактива

предлагаемого фермента обеспечивает более высокую способность его к хранению .

Выделение пируватоксидазы (Py-OD) из Lactobacillusplantarum DSM 2571

осуществл етс  следующим образом.

1. Культивирование. Среда дл  культивировани  содержит, г/л воды: бакто-триптон-оксоид Ю;дрожжевой экстракт оксоида 4; х 3 2;

диаммоний-гидроцитрат 2; твин-80 (полиоксиэтиленсорбитанмоноолеат) 1 мл; MgSO X 7 Н,0 0,2; MnSO х X 0,2; сульфид молибдена 0,2; лактоза 10; пировиноградна  кислота

3,2; рН 7.

150 мл среды указанного состава или обычной дл  бактерий молочной кислоты MRS-среды засевают культурами путем укола и встр хивают при

28°С. После происшедшего роста

150 мл указанной среды засевают 15% вьфащенной культуры и встр хивают в колбе Эрленмейера емкостью 500 мл при 28 С вплоть до завершени  поздней

лаг-фазы.

MRS-среда составл етс  следующим образом, г/л: м сной экстракт (MERCK) 2; пептон из казеина 10; trypish дрожжевой экстракт 4; глюкоза 20; твин-80 1 мл; хЗ 2,5; Na-ацетат х 3 5; диаммоний- цитрат 2; MgSO х 7 200 мг; MnSO+ X 50 мг. I

2. Вьщеление. Из 50 л культураль- ной жидкости Lactobacillus DSM 2571 со 120 ед/л пируватоксидазы (Py-OD) собиают 300 г влажной массы путем центрифугировани . 100 г клеток помещают в стекл нную диномельницу,

после добавки 4% полиэтиленимина центрифугируют и надосадочную жидкость обрабатьшают фракционированием сульфатом аммони  (25-65%) при рН 6,3,

хроматографированием с помощью дек- странблау-сефарозы (фирма Farmacia), второго фракционировани  с помощью сульфата аммони  при 20-30% (насыщени ) и путем пропускани  через мопекул рное сито Сефадекс АСА (фирмы LKB

Данные обогащени  представлены в табл . 3,

Очищенный фермент имеет удельную активность 5,8 ед/мг и содержит менее чем 0,037, Аро-глутамат-пируват- трансаминазы об -кетоглутаратокси- дазы, а также менее 0,002% NADH-ок- сидазы.

Активность пируватоксидазы определ ют при следующие: услови х: + Р. - ILO

Oj Ру - OD ацетил-Р +

COj -t г 2

нина содержит.200 ммоль/л аланинсуль- финовой кислоты, в тех же услови х, как и в примере 1, добавл ют GOT-co- держащую пробу. Из измеаеии  экстинк- с ции В 1 мин рассчитывают содержание GOT.

П р и м е р 3. Тест-полосы дл  GPT.

Дл  приготовлени  тест-полос GPT 10 пропитывают две бумаги.

Ферментна  бумага: 0,5 моль/л мор- фолинзтансульфокислота (гидроксид кали , рН 6,5 (MORS-буфер); 800 ммоль/л аланина; 1 ммоль/л гидрофосфата ка- 15 ли ; 20 000 ед/л P0D; 200000 ед/л пируватоксидазы.

С помощью этого раствора пропитывают адсорбирующую бумагу толщиной 50 ммк, с поверхностной плотностью

HjO ч- 4-аминоантипирин (4-АА) + + 2 окси-3,5-дихлорбензол сульфокис- лота (HDBS) РОР хиноновый краситель (546 им) -ь 2 .

. потребл етс  эквимол рным ко-20 12 г/м, поглотительной способностью

50 г HjO/M , и высушивают в течение 5 мин при (например, ситчата  бумага дл  ча  Teebeutelpapier фирмы Scholler and Hosch). Бумагу затем 25 разрезают на полосы щириной 1 см.

Индикаторна  бумага: 10 ммоль/л 4,5-(4-диметиламино-фе нил)-2-(3,5- -диметокси-4-оксифе11Ил) имидазола и 18 ммоль/л « -кетоглутаровой кисло- ществл етс  путем добавки 0,05 мкмольЗО ты раствор ют в 100 ммоль/л НС1 (бу- пирувата, соответственно содержащей ферна  система), пируват-пробы, в кювету объемом 2 мл

при толщине сло  1 см и температуре помощью этого раствора также про- jj°(питывают соответствующую адсорбируюРеакци  спуст  15 мин прекращав -  35 бумагу, высушивают в течение Коэффициент экстинкции при 546 нм мин при 30 С и разрезают на полосы

Н,0, личеством красител .

1 ед. Py-OD 1 мкмоль превращени  пирувата в 1 мин при 25 С.

Определение пирувата: 72 ммоль калийсофатного буфера, рН 6,7; 8 ммоль 4-АА; 6,8 ммоль/л HDBS; 0,01 ммоль/л FAD; 2 ед. POD; 10 ед, Py-OD на 1 мл. Старт дл  последовательности до целевого значени  осушириной 1 см. Прозрачную поликарбонатную пленку толщиной 10 ммк вместе с индикаторной бумагой и фермент- Q ной бумагой нанос т с одной стороны на пластиковые полосы (ленты), укрепл ют так, что пленка прилегает снаружи , индикаторна  бумага в середине, ферментна  бумага внутри. Нар ду с

6 16,5 см (мкмоль измер етс  дл  чистого пирувата - мононатриева  соль).

Пример 1. Кинетическое определение пирувата (GPT).

К 2,5 мл раствора, содержащего, ммоль/л: КН,РО (рН 6,7) 80; аланин

шириной 1 см. Прозрачную поликарбонатную пленку толщиной 10 ммк вместе с индикаторной бумагой и фермент Q ной бумагой нанос т с одной стороны на пластиковые полосы (ленты), укреп л ют так, что пленка прилегает снару жи, индикаторна  бумага в середине, ферментна  бумага внутри. Нар ду с

t-ti-if j л tj г -j л «iVii-Аъ Л1 f / v.v/ njictnnn

800; N-(3 -сульфонил-4-окси-5 -хлор- 5 им нанос т шириной 15 мм прочес из фенил)-4-аминоантипирин 0,2; л -ке- стекловолокна, толщиной 1,5 мм, с тоглутарова  кислота 18, а также пируватоксидаза 0,2 ед/мл; перокси- даза 2 ед/мл, добавл ют 0,1 мл пробы. Спуст  3 мин определ ют изменение экстинкции в 1 мин. Температура измерени  составл ет 25 С, длина волны 546 нм, составл ет 19,6, обпщй объем 2,6 мл и объем пробы 0,1 мл. Из прироста экстинкции в 1 мин рассчи- тьшают активность на GPT.

П р и м е р 2. Кинетическое определение GOT. В исходную смесь, аналогичную примеру 1, котора  вместо алатолщиной волокон примерно 2 мкм, так что свободный конец пленки и пропитанна  бумага выступают еще на 6 мм

50 над прочесом (ваточным холстом). Затем все разрезают на тест-полосы шириной 6 мм. Если нанос т 15 мкл цельной крови на участок дл  нанесени  пробы, то в течение 45 с дол  плазмы

проникает через стекловолокнистый прочес под прозрачную пленку, в то врем  как эритроциты удерживаютс  на месте нанесени . После прижати  пленки ферментна  и индикаторна  бумаги

нина содержит.200 ммоль/л аланинсуль- финовой кислоты, в тех же услови х, как и в примере 1, добавл ют GOT-co- держащую пробу. Из измеаеии  экстинк- ции В 1 мин рассчитывают содержание GOT.

П р и м е р 3. Тест-полосы дл  GPT.

Дл  приготовлени  тест-полос GPT пропитывают две бумаги.

Ферментна  бумага: 0,5 моль/л мор- фолинзтансульфокислота (гидроксид кали , рН 6,5 (MORS-буфер); 800 ммоль/л аланина; 1 ммоль/л гидрофосфата ка- ли ; 20 000 ед/л P0D; 200000 ед/л пируватоксидазы.

С помощью этого раствора пропитывают адсорбирующую бумагу толщиной 50 ммк, с поверхностной плотностью

12 г/м, поглотительной способностью

бумагу, высушивают в течение мин при 30 С и разрезают на полосы

шириной 1 см. Прозрачную поликарбонатную пленку толщиной 10 ммк вместе с индикаторной бумагой и фермент- ной бумагой нанос т с одной стороны на пластиковые полосы (ленты), укрепл ют так, что пленка прилегает снаружи , индикаторна  бумага в середине, ферментна  бумага внутри. Нар ду с

им нанос т шириной 15 мм прочес из стекловолокна, толщиной 1,5 мм, с им нанос т шириной 15 мм прочес из стекловолокна, толщиной 1,5 мм, с толщиной волокон примерно 2 мкм, так что свободный конец пленки и пропитанна  бумага выступают еще на 6 мм

над прочесом (ваточным холстом). Затем все разрезают на тест-полосы шириной 6 мм. Если нанос т 15 мкл цель ной крови на участок дл  нанесени  пробы, то в течение 45 с дол  плазмы

проникает через стекловолокнистый прочес под прозрачную пленку, в то врем  как эритроциты удерживаютс  на месте нанесени . После прижати  пленки ферментна  и индикаторна  бумаги

соприкасаютс  с освободившейс  плазмой и равномерно увлажн ютс , Содерж пщйс  в плазме пируват (GPT) реагирует с синим окрашиванием, интенсивность которого пропорциональна количеству (измерению) GPT и при известных услови х может измер тьс  в ремис- сионном фотометре. Таким же оС5разом реагируют другие испытуемые материалы , такие, как сыворотка, плазма и т.д.

П р и м е р 4. Тест-полосы на GOT

Тест-полосы на СОТ готов тс  так же, как и полосы на ОРТ согласно примеру 3, только в ферментной бумаге вместо аланина содержатс  200 ммоль апанинсульфокислоты. Получающеес  после прижати  прозрачной пленки синее окрашивание  вл етс  мерой количества GOT в пробе,

П р и м е р 5. Сравнение результатов измерений при применении предлагаемого способа и известного после хранени  примененных реактивов.

Дл  сравнени  примен ют:

реактив по примеру 3;

реактив по примеру 3, но бумагу вместо 200 000 ед/л предлагаемой пи- руватоксидазы пропитывают 200000 ед/л известной пируватоксидазы, а также дополнительно 1 ммоль/л пиаминпифос- фатом (ТРР) и 0,5 ммоль/л №i -ионо

При помощи этих реактивов исследуют 3 пробы с пируватом до и после хранени , которые показывают различную активность ОРТ. Измерение провод т согласно примеру 3,

Результаты испытаний представлены в табл.4.

Из табл.4 следует, что по предлагаемому способу и после хранени  реактива дл  определени  пирувата величина измер емых значений существенно не отклон етс  от базового значени , в то врем  как согласно известному способу результаты измерени  после хранени  в течение 3 дней при 60 С отклон ютс  от базовых значений до 60%.

Аналогичные результаты получают и в том случае, если вместо реактива дл  определени  пирувата согласно примеру 3 используют реактив согласно примеру 1, который перед хранени- ем лиофилизируют.

29846

Таким образом, предлагаемый способ определени  пирувата в биологических объектах обеспечивает достоверность результатов. Способ пригоден

и дл  определени  субстратов и

ментов, который привод т к образованию пирувата,

10

Claims (1)

1. Формула изобретени 

   0

   Способ определени  пирувата в биологических объектах, предусматривающий взаимодействие исследуемой пробы с реактивом, содержащим пируватокси5 дазу, буфер, пероксидазу, 4-аминоантипиран , и сульфокислоту, последую- щий анализ его количества путем регистрации образующейс  перекиси водорода , отличающийс  тем,

   0 что, с целью повышени  стабильности и достоверности результатов определени  за счет предотвращени  образовани  осадков и помутнений, используют пи- руватоксидазу, вьщеленную из молочно-кислых бактерий штаммов Lactoba- cillua plantarum DSM 2571, или Lbc. saliyarius DSM 2573, или Leuconosboc nleeenteroides DSM 2572, или Streptococcus сгепюг18 DSM 2574, характеризующуюс  оптимумом активности при рН 5,7, оптимумом стабильности при рН 5,6-5,8, константой Михаэлиса дл  пирувата при 25°С 0,4 ммодь/л, дп  фосфата 2,3 ммоль/л, мол.м, 146000

   5 дальтон при определении в центрифуге

   дтее

   Таблиц

   по

   1

   40

   Специфичность к субстрату,%

   Ингибитор

   Без ингибитора

   KCN

   NaN, ЕДТА

   Растворение - надоса- дочна  жидкость

   Фракционирование с сульфатом аммони 

   декстранблау-сефароза

   Фракционирование с сульфатом аммони 

   АСА Э4-мол-сита

   Активность фермента, %

   предлагаемого

   О

   10

   100

   100

   ,01

   ,1

   1

   10

   100

   85

   О

   75

   78

   30

   7

   О

   100

   75

   5

   62

   100

   100

   98

   85

   Таблица 3

   67000,37100

   55400,4497

   25600,8991

   7531,030

   1025,823,5

   27 27,5 29 12

   60 62 59 28

   212 209 211 81

   Редактор Н.Тупица

   Составитель И.Привалова

   Техред М.Моргентал Корректор А.Т ско

   Заказ 2883/59 Тираж 499Подписное

   BH№fflH Государственного комитета СССР

   по делам изобретений н открытий 113035, Москва, Ж-35, Раушска  наб.,д.4/5

   - ---- - - - - .-i-. «. - -«.- -.«-..«.«... .ч.  «««...

   Производственно-полиграфическое предпри тие, г.Ужгород, ул.Проектна ,А