CZ280350B6 - Způsob výroby pyruvátoxidázy - Google Patents

Způsob výroby pyruvátoxidázy Download PDF

Info

Publication number
CZ280350B6
CZ280350B6 CS841296A CS129684A CZ280350B6 CZ 280350 B6 CZ280350 B6 CZ 280350B6 CS 841296 A CS841296 A CS 841296A CS 129684 A CS129684 A CS 129684A CZ 280350 B6 CZ280350 B6 CZ 280350B6
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
pyruvate
liter
enzyme
mmol
dsm
Prior art date
Application number
CS841296A
Other languages
English (en)
Inventor
Erich Prof. Dr. Elstner
Karl-Heinz Prof. Dr. Schleifer
Friederich Dr. Götz
Barbara Sedewitz
Albert Dr. Röder
Hans Möllering
Hans Dr. Seidel
Original Assignee
Boehringer Mannheim Gmbh
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Boehringer Mannheim Gmbh filed Critical Boehringer Mannheim Gmbh
Publication of CZ129684A3 publication Critical patent/CZ129684A3/cs
Publication of CZ280350B6 publication Critical patent/CZ280350B6/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0008—Oxidoreductases (1.) acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y102/00—Oxidoreductases acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2)
    • C12Y102/03—Oxidoreductases acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2) with oxygen as acceptor (1.2.3)
    • C12Y102/03003—Pyruvate oxidase (1.2.3.3)
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
    • Y10S435/853—Lactobacillus
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
    • Y10S435/885—Streptococcus

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Financial Or Insurance-Related Operations Such As Payment And Settlement (AREA)
  • Amplifiers (AREA)
  • Cash Registers Or Receiving Machines (AREA)
  • Vibration Dampers (AREA)
  • Eye Examination Apparatus (AREA)
  • Table Devices Or Equipment (AREA)
  • Prostheses (AREA)
  • Diaphragms For Electromechanical Transducers (AREA)
  • Dairy Products (AREA)
  • Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)

Abstract

Je popsán způsob výroby pyruvátoxidázy, dekarboxylující pyruvát za vzniku peroxidu vodíku, aktivní bez přídavku flavin-adeninindinukleotidu, thiaminpyrofosfátu a dvojmocných kovových iontů, s optimem aktivity při pH 5,7; optimem stability při pH 5,6 až 5,8, konstantou K.sub.M.n. pro pyruvát při 25 .degree. C 2,3mnol/litr a molekulovou hmotností 146.000 Dalton při stanovení v ultraodstředivce podle Amese, který spočívá v tom, že se rozdrtí bakterie mléčného kvašení, k vodné supsenzi hmoty vzniklé rozdrcením se přidají 4 % hmot. polyethyleniminu, nerozpustné podíly se oddělí a ze získaného roztoku se enzym izoluje a přečistí. ŕ

Description

Oblast techniky
Vynález se týká způsobu výroby nové pyruvátoxidázy.
Dosavadní stav techniky
Pyruvátoxidáza E. C. 1.2.3.3 je enzym, který dekarboxyluje pyruvát v přítomnosti fosfátových iontů a kyslíku za vzniku peroxidu vodíku (Federation Proceedings 13., (1954), str. 734 až 738). Z reakčních produktů, tvořených acetylfosfátem, oxidem uhličitým a peroxidem vodíku lze analyticky dobře stanovit zejména peroxid vodíku, a proto je tento enzym vhodný pro kvantitativní stanovení pyruvátu a pyruvát tvořících enzymů, popřípadě jejich substrátů.
Charakteristickou vlastností známé pyruvátoxidázy je, že ke své aktivitě potřebuje přídavek FAD (flavin-adenin-dinukleotidu), TPP (thiaminpyrofosfátu) a dvojmocných kovových iontů. Tato vlastnost však působí při způsobu, popřípadě v rámci činidla ke stanovení pyruvátu nebo pyruvát tvořících enzymů rušivě. Zejména TPP má totiž v přítomnosti séra a hořčíkových iontů sklon k tvorbě nerozpustných sraženin, které způsobují zákaly a proto ovlivňují optickou měřitelnost. Také skladovatelnost TPP v kombinovaném činidle, zejména v přítomnosti dvojmocných kovových iontů, je snížena, takže se TPP při skladováni poznenáhlu rozkládá. Tato vlastnost působí obzvláště rušivě při kinetickém mokrém testu. Bylo by proto velmi žádoucí mít pro stanovení pyruvátu a pro činidlo, vhodné k tomuto účelu, k dispozici pyruvátoxidázu, která není závislá na uvedených látkách, zejména na TPP a dvojmocných kovových iontech, tj. má i bez přídavku těchto látek dostatečně vysokou aktivitu.
Překvapivě bylo nyní zjištěno a na tomto zjištění spočívá tento vynález, že existuje pyruvátoxidáza, která je aktivní bez přídavku FAD, TPP a dvojmocných kovových iontů.
Podstata vynálezu
Uvedené nevýhody odstraňuje způsob výroby pyruvátoxidázy, dekarboxylující pyruvát za vzniku peroxidu vodíku, aktivní bez přídavku flavin-adenindinukleotidu, thiaminpyrofosfátu a dvojmocných kovových iontů, s optimem aktivity při pH 5,7, optimem stability při pH 5,6 až 5,8, konstantou KM pro pyruvát při 25 ’C 0,4 mmol/litr, konstantou KM pro fosfát při 25 °C 2,3 mmol/litr a molekulovou hmotností 146.000 při stanovení v ultraodstředivce podle Amese podle vynálezu, jehož podstata spočívá v tom, že se rozdrtí bakterie mléčného kvašení, k vodné suspenzi hmoty vzniklé rozdrcením se přidají 4 % hmot, polyethyleniminu, nerozpustné podíly se oddělí a ze získaného roztoku se enzym izoluje a přečistí.
Pyruvátoxidáza vyrobená způsobem podle vynálezu se však liší i svými ostatními vlastnostmi z části značné od známé pyruvátoxidázy, jak je popsáno například v německém zveřejňovacim spisu DE-OS č. 29 11 481. Zejména rozsah pH, optimální pro aktivitu,
-1CZ 280350 B6 leží u enzymu, vyrobeného způsobem podle vynálezu, níže (pH 5,0 až 6,5, optimální 5,7), než u známého enzymu (pH 6,5 až 7,5), molekulová hmotnost, stanovená v ultraodstředivce, je u enzymu podle vynálezu nižší (146.000), než u známého enzymu (190.000, stanoveno pomocí filtrace přes gel Sephadex G 200), a - což je pro použití ke stanovení pyruvátu obzvláště důležité - Michaelisova konstanta KM pro pyruvát je o více, než jeden desítkový řád nižší. V následujícím sestavení jsou porovnávány vlastnosti enzymu vyrobeného způsobem podle vynálezu s vlastnostmi známého enzymu:
vlastnost pyruvátoxidáza podle vynálezu pyruvátoxidáza podle německého zveřej ňovacího spisu 29 11 481
KM pyruvát (25 °C) 0,4 mmol/litr 10,2 mmol/litr
KM fosfát (25 ’C) 2,3 mmol/litr 0,96 mmol/litr
optimum stability pH 5,6 až 5,8 pH 6,5 až 7,5
Substrátová specificita:
pyruvátoxidáza pyruvátoxidáza
podle vynálezu podle německého zveřej ňovacího spisu 29 11 481
pyruvát 100 % 100 %
a-ketobutyrát 0 % 3 %
acetaldehyd 15 % 0 %
methylglyoxal 20% 0 %
Vliv inhibitorů ve srovnání se známým enzymem ukazuje tabulka 1:
Tabulka 1
inhibitor koncentrace v mmol/litr pyruvátoxidáza podle
zveřej ňovacího spisu 29 11 481 aktivita vynálezu v %
bez 0 100 100
KCN 10 85 75
100 0 5
NaN3 100 75 62
kyselina 0,01 78 100
ethylendiamin 0,1 30 100
tetraoctová 1 7 98
(EDTA) 10 0 85
-2CZ 280350 B6
Vliv aktivátorů ve srovnání se známým enzymem ukazuje tabulka 2:
Tabulka 2
aktivátor koncentrace v mmol/litr pyruvátoxidáza podle
zveřejnovacího spisu 29 11 481 aktivita vynálezu v %
thiamin-PP + 0,2 100 100
mnso4 1
0 0 0,2 84
CoCl2 1 0 97
MgSO4 0,1 0,2 97
MnSO4 0,1 13 97
thiamin-PP 0,2 46 97
FAD 0,1 0 93
FAD + TPP 0,4 + 0,2 61 93
MgSO4 + TPP 0,4 + 0,2 55 100
Ze shora uvedených hodnot vyplývá, že inhibiční účinek kyseliny ethylendiamintetraoctové (EDTA) na enzym podle vynálezu je přibližně tisíckrát menší, než u známého enzymu a že po několikadenní dialýze enzymu podle vynálezu lze přísadou TPP, FAD a Mn2+ zvýšit aktivitu jen o 5 až 15 %, zatímco známý enzym není aktivní bez těchto aktivátorů.
Mezi enzymem podle vynálezu a známým enzymem nedochází při Ouchterlonyho testu (na králíku) k žádné imunologické křížové reakci.
Enzym podle vynálezu se získává z mikroorganismů, které jej obsahují v rentabilním množství, použitím obvyklých biochemických metod, přičemž v každém obohacovacím stupni lze využitím charakteristických vlastností enzymu, tj. tvorby peroxidu vodíku z pyruvátu v nepřítomnosti FAD, TPP a dvojmocných kovových iontů, snadno dokázat, v které frakci se vyráběný enzym nachází. S výhodou se k vodné suspenzi, vzniklé rozdrcením mikroorganismů, přidá přímo nebo po oddělení nerozpustných podílů polyethylenimin a přitom vzniklé nerozpustné látky se oddělí.
Jako zdroje pro enzym podle vynálezu se výhodné použije bakterií mléčného kvašení. Se zřetelem ke svému obsahu vyráběného enzymu se ukázaly jako obzvláště výhodné zdroje Lactobacillus plantarum DSM 2571, Lactobacillus salivarius DSN 2573, Leuconostoc mesenteroides DSM 2572 nebo/a Streptococcus cremoris DSM 2574. Při zkoumání několika stovek různých bakterií mléčného kvašení byl enzym podle vynálezu prokázán asi ve čtvrtině zkoumaných kmenů. Z toho lze usuzovat, že výskyt tohoto enzymu je značné rozšířen. Kromě toho existují i náznaky, že jej lze nalézt i v mikroorganismech, které nepatří k bakteriím mléčného kvašení.
-3CZ 280350 B6
K získání tohoto enzymu z mikroorganismů se tyto rozdrtí obvyklými metodami. Dobrých výsledků bylo dosaženo ultrazvukem a použitím mlecího zařízení Dyno (skleněné perličky). I rozdrcení ve vysokotlaké disperzi poskytlo dobré výsledky. Obecné však jsou použitelné i ostatní metody pro rozmělnění, jak jsou například uvedeny v německém zveřejňovacím spise č. 29 11 481.
Obohacení a vyčištění enzymu podle vynálezu je možno, jak již bylo uvedeno, dosáhnout různým způsobem obvyklými biochemickými metodami. Podle vyzkoušeného postupu se po rozdrcení získaná suspenze zbaví odstředěním nerozpustných podílů, zbylá kapalina se frakcionuje při pH 6,3 za použití roztoků síranu amonného o plynule stoupající koncentraci od 25 do 65 %, aktivní frakce se chromátografuje na adsorbentu, sestávajícím z komplexu Sepharosy s dextranovou modří (výrobce firma Pharmacia, Upsala, Švédsko), aktivní frakce se znovu frakcionuje za použiti roztoků síranu amonného o plynule stoupající koncentraci od 20 do 30 % a konečně se přečistí průchodem molekulárním sítem (Sephadex ACA 34 firmy LKB).
Podle alternativní metody se ke kapalině získané rozdrcením přidají 4 % hmot, polyethyleniminu, sraženina se odstraní a ve zbylé kapalině se provede srážení síranem amonným v roztoku o koncentraci 65 %. Sraženina se vyjme a po dialýze podrobí frakcionaci za použití roztoků sacharózy se stoupajícím gradientem. Po opětovném srážení roztoky síranu amonného o koncentraci až 65 % a po odfiltrování gelu se provede dočištění na adsorbentu, sestávajícím z komplexu Sepharosy s dextranovou modří.
Popsanými postupy lze dosáhnout asi dvaceti- až třicetinásobného obohacení až na specifickou aktivitu přibližné 6 až 9 j./mg proteinu.
Podle dalšího aspektu vynálezu se nového enzymu používá ke stanovení pyruvátu měřením množství vzniklého peroxidu vodíku. K tomu účelu jsou známy četné vhodné metody, které zde není třeba zvlášť popisovat. Také dobře vhodné je měření spotřeby kyslíku, například pomocí kyslíkové elektrody.
Enzymu podle vynálezu je možno použít nejen ke stanovení pyruvátu jako takového, ale zejména i v rámci substrátů a enzymů, které vedou k tvorbě pyruvátu.
Typickými příklady látek, jež je možno enzymem podle vynálezu stanovit, jsou:
glutamát-pyruvát-transamináza, pyruvátkináza nebo ADP, glutamát-oxalacetát-transamináza, laktátdehydrogenáza nebo kyselina mléčná, glycerin nebo glycerofosfátkináza, triglycerid kreatinfosfokináza nebo kreatin, myokináza, thiokináza nebo mastná kyselina.
Dalším předmětem vynálezu je reakční činidlo ke stanovení pyruvátu, které se vyznačuje tím, že obsahuje pyruvátoxidázu,
-4CZ 280350 B6 fosfát, pufr, soustavu pro stanovení peroxidu vodíku a popřípadě soustavu pro tvorbu pyruvátu.
Jako pufru je možno použít kteréhokoliv vhodného pufru, který pufruje ve shora uvedených rozsazích pH, v nichž je uvedený enzym aktivní a stabilní. Dobře se hodí i fosfátový pufr, takže zvláštní přídavek pufru, kromě fosfátu potřebného pro reakci, již není nutný. Při volbě pufru je však zpravidla třeba také brát zřetel na to, které hodnoty pH pro pomocné enzymy jsou v soustavě pro stanovení peroxidu vodíku nebo v soustavě pro tvorbu pyruvátu obsaženy. Se znalostí známých údajů o těchto enzymech je však možno bez dalších obtíží pufr správně zvolit.
Činidlo podle vynálezu se dobře hodí k napuštění nosičových materiálů, jako je papír, fólie z plastické hmoty a podobně, pro zkušební proužky.
Výhodné obsahuje reakční činidlo podle vynálezu 1 až 50 j./ml pyruvátoxidázy, 10 až 500 mmol/litr fosfátu, pufr pro pH 6 až 8 (popřípadě 1 až 50 mmol/litr substrátu, například pro stanovení GPT α-ketoglutarát a 1-alanin) a jako soustavu ke stanovení peroxidu vodíku 0,5 až 40 mmol/litr 4-aminoantipyrinu, 1 až 50 mmol/litr kyseliny 2-hydroxy-3,5-dichlorbenzensulfonové (HDBS) a 0,2 až 20 j./ml peroxidázy.
Vynález nemá nevýhody známého enzymu a je jím dána možnost přípravy činidla, jehož skladovatelnost předčí skladovatelnost dosavadních činidel.
Dále uvedené příklady vynález blíže objasňují.
Příklad 1
Izolace pyruvátoxidázy (Py-OD) z Lactobacillus planetarum DSM 2571
1. Kultivace
Kultivační prostředí na 1 litr: 10 g bacto-trypton/oxoidu - 4 g oxoidu kvasničného extraktu - 2 g K2HPO4 x 3 H20 - 2 g diamoniumhydrogencitrátu - 1 ml Tweenu 80 (polyoxyethylensorbitanmonooleátu) - 0,2 g MgSO4 x 7 H2O - 0,2 g MnS04 x H2O - 0,02 g molybdansulfidu - 10 g laktózy - 3,2 g kyseliny pyrohroznové, pH 7.
150 ml média se naočkuje vpichovými kulturami shora uvedeného složení nebo médiem MRS+) obvyklým pro mléčné kvašení a třepe při teplotě 28 ’C. Po provedené kultivaci se znovu 150 ml média (viz shora) naočkuje použitím 15 % narostlé kultury a třepe v Ehrlenmayerové baňce o objemu 500 ml při teplotě 28 ’C až do skončení pozdní log fáze.
-5CZ 280350 B6 +) MRS médium má toto složení:
na 1 litr: 2 g masového výtažku MERCK - 10 g peptonu z natráveného kaseinu - 4 g kvasnicového výtažku - 20 g glukózy
- 1 ml Tweenu 80 (polyoxyethylensorbitanmonooleát)
- 2,5 g K2HPO4 x 3 H2O - 5 g natriumacetátu x 3 H20
- 2 g diamoniumcitrátu - 200 mg MgSO4 x 7 H2O - 50 mg MnSO4 x H20.
2. Izolace
Z 50 litrové kultury Lactobacillus plantarum DSM 2571 se 120 j./litr pyruvátoxidázy se odstředěním získá 300 g vlhké hmoty. 100 g buněk se rozdrtí v mlecím zařízení Dyno se skleněnými perličkami, rozmělněná hmota se po přidání 4 % polyethyleniminu odstředí a kapalná fáze se dále zpracuje při pH 6,3 frakcionací za použití roztoků síranu amonného o koncentracích od 25 do 65 %, chromatografií za použití adsorbentu tvořeného komplexem Sepharosy s dextranovou modří (firma Pharmacia), druhou frakcionací za použití roztoků síranu amonného o koncentracích od 20 do 30 % a průchodem molekulárním sítem Sephadex ACA 34 (firmy LKB).
Údaje o obohacení jsou sestaveny v dále uvedené tabulce:
jednotlivé operace objem (ml) jednotky protein (mg) specifická aktivita výtěžek (M
kapalina zbývající po odstředění rozdrcené hmoty mikroorganismů 480 2 516 6700 0,37 100
1. frakcionace za použití síranu amonného 98 2 436 5540 0,44 97
chramatografování na adsorbentu tvořeném komplexem Sepharosy s dextranovou modří 54 2 284 2560 0,89 91
2. frakcionace za použití síranu amonného 13 748 753 1,0 30
průchod molekulárním sítem 30 590 102 5,8 23,5
ACA 34
Přečištěný enzym má specifickou aktivitu 5,8 j./litr a obsahuje méně, než 0,03 % apo-glutamát-pyruvát-transaminázy + a-ketoglutarát-oxidázy, jakož i méně, než 0,002 % NADH-oxidázy.
Aktivita pyruvátoxidázy se stanoví za těchto podmínek:
pyruvátoxidáza
1) pyruvát + P^ + 02 ---------------> acetyl-P + CO2 + H2O2
-6CZ 280350 B6
2) H2O2 + 4-aminoantipyrin (4-AA) + kyselina 2-hydroxy-3,5POD
-dichlorbenzensulfonová (HDBS) ----> chinonové barvivo (546 nm) + 2 H20
H2O2 se spotřebuje v ekvimolárním množství barviva.
jednotka pyruvátoxidázy = 1 μπιοί zreagovaného množství pyruvátu za 1 minutu při teplotě 25 ’C.
Stanovení pyruvátu:
mM kaliumfosfátového pufru, pH 6,7; 8 mM 4-aminoantipyrinu; 6,8 mmol/litr kyseliny 2-hydroxy-3,5-dichlorbenzensulfonové; 0,01 mmol/litr flavin-adenin-dinukleotidu; 2 j. POD; 10 j. pyruvátoxidázy na 1 ml. Zahájení průběhu k dosažení konečné hodnoty se provádí přidáním 0,05 μπιοί pyruvátu, popřípadě vzorku obsahujícího pyruvát do kyvetového objemu 2 ml při tloušťce vrstvy 1 cm a při teplotě 37 ’C.
Reakce ustane po uplynutí 15 minut. Extinkční koeficient při 546 nm e =16,5 cm2/μπιοί se naměří pro nejčistší pyruvát (mononatriová sůl).
Příklad 2
Kinetické stanovení GPT
Ke 2,5 ml roztoku obsahujícího
KH2PO4 ..................................... 80 mmol/litr pH 6,7 alanin ..................................... 800 mmol/litr
N-(3'-sulfonyl-4'-hydroxy-5'-chlorfenyl)-4-aminoantipyrin .............. 0,2 mmol/litr kyselina a-ketoglutarová ....... 18 mmol/litr pyruvátoxidáza ..... 0,2 j ./ml
POD .............. 2 j./litr se přidá 0,1 ml vzorku. Po 3 minutách se stanoví změna extinkce za 1 minutu. Teplota při měření je 25 °C, vlnová délka je 546 nm. Hodnota je 19,6, celkový objem 2,6 ml a objem vzorku 0,1 ml. Z přírůstku extinkce za 1 minutu se vypočte aktivita GPT.
Příklad 3
Kinetické stanovení glutamát-oxalát-transaminázy (GOT)
Do násady, analogické násadě z příkladu 2, která místo alaninu obsahuje 200 mmol/litr kyseliny alaninsulfinové, se za stejných podmínek jako v příkladu 2 přidá vzorek obsahující glutamátoxalát-transaminázu (GOT). Ze změny extinkce za 1 minutu se přímo vypočte obsah glutamát-oxalát-transaminázy.
-7CZ 280350 B6
Příklad 4
Zkušební proužek pro GTP
K výrobě zkušebních proužků pro GPT se napustí dva papíry takto:
A) enzymový papír
0,5 mol/litr kyseliny morfolinethansulfonové/hydroxid draselný, pH 6,5 (pufr MOPS)
800 mmol/litr alaninu mmol/litr kaliumhydrogenfosfátu
000 j./litr POD
200 000 j./litr pyruvátoxidázy
Tímto roztokem se napustí savý papír o tloušťce 50 μπι, plošné hmotnosti 12 g/m2 a savosti 50 g H2O/m2, který se potom suší při teplotě 30 ‘C 5 minut (například papír na čajové sáčky od firmy Schóller a Hósch). Z takto zpracovaného papíru se potom nastříhají proužky o šířce 1 cm.
B) indikátorový papír mmol/litr 4,5-(4-dimethylaminofenyl)-2-(3,5-dimethoxy-4-hydroxyf enyl)-imida zolu mmol/litr kyseliny α-ketoglutarové rozpuštěné ve
100 mmol/litr HC1 (pufrová soustava).
Tímto roztokem se také napustí savý papír, který se potom suší 5 minut při teplotě 30 “C, potom se z něho nastříhají proužky o šířce 1 cm. Materiál se potom zpracuje, jak dále uvedeno:
Na jednu stranu plastikového pruhu se společně se shora zmíněným indikátorovým papírem a enzymovým papírem upevní průhledná polykarbonátová fólie o šířce 1 cm a tloušťce 100 μπι tak, že fólie bude ležet směrem ven, indikátorový papír bude uprostřed a enzymový papír vespod. Dále se nanese rouno ze skelných vláken o šířce 15 mm, tloušťce 1,5 mm a tloušťce vláken asi 2 μπι tak, že volné konce fólie a napuštěných papírů přesahují rouno ještě o 6 mm. Potom se vše rozstříhá na zkušební proužky o šířce 6 mm. Jestliže se potom 15 μΐ krve nanese do oblasti pro nanášení vzorku, pronikne plazmový podíl během 30 až 60 sekund celým rounem ze skelných vláken i pod průhlednou fólii, zatímco erythrocyty zůstanou v oblasti pro nanášení vzorku. Po přitlačení fólie přijdou nyní enzymový a indikátorový papír do styku s vyvinutou plazmou a rovnoměrně se zvlhčí. GPT obsažená v plazmě reaguje za vzniku modrého zbarvení, jehož intenzita je úměrná množství GPT a popřípadě může být změřena remisním fotometrem. Stejným způsobem reagují i ostatní složky vzorku, jako je sérum, plazma atd.
Příklad 5
Zkušební proužky na glutamát-oxalát-transaminázu (GOT)
Zkušební proužky na glutamát-oxalát-transaminázu se připraví zcela stejným způsobem, jako proužky na GPT podle příkladu 4,
-8CZ 280350 B6 pouze s tím rozdílem, že v enzymovém papíře je místo alaninu obsaženo 200 mmol kyseliny alaninsulfinové. Zde je modrá barva, vzniklá po přitlačení průhledné fólie, měřítkem množství glutamát-oxalát-transaminázy ve vzorku.

Claims (2)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Způsob výroby pyruvátoxidázy, dekarboxylující pyruvát za vzniku peroxidu vodíku, aktivní bez přídavku flavinadenindinukleotidu, thiaminpyrofosfátu a dvojmocných kovových iontů, s optimem aktivity při pH 5,7, optimem stability při pH 5,6 až 5,8, konstantou KM pro pyruvát při 25 °C 0,4 mmol/litr, konstantou KM pro fosfát při 25 ’C 2,3 mmol/litr a molekulovou hmotností 146 000 při stanovení v ultraodstředivce podle Amese, vyznačující se tím, že se rozdrtí bakterie mléčného kvašení, k vodné suspenzi hmoty vzniklé rozdrcením se přidají 4 % hmot, polyethyleniminu, nerozpustné podíly se oddělí a ze získaného roztoku se enzym izoluje a přečistí.
  2. 2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že jako bakterií mléčného kvašení se použije Lactobacillus plantarum DSM 2571, Lactobacillus salivarius DSM 2573, Leuconostoc mesenteroides DSM 2572 a/nebo Streptococcus cremoris DMS 2574.
CS841296A 1983-02-25 1984-02-24 Způsob výroby pyruvátoxidázy CZ280350B6 (cs)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE19833306719 DE3306719A1 (de) 1983-02-25 1983-02-25 Pyruvatoxidase

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ129684A3 CZ129684A3 (en) 1995-07-12
CZ280350B6 true CZ280350B6 (cs) 1995-12-13

Family

ID=6191871

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CS841296A CZ280350B6 (cs) 1983-02-25 1984-02-24 Způsob výroby pyruvátoxidázy

Country Status (15)

Country Link
US (1) US4666832A (cs)
EP (1) EP0117550B1 (cs)
JP (1) JPS59162877A (cs)
AT (1) ATE63334T1 (cs)
AU (1) AU573570B2 (cs)
CA (1) CA1213843A (cs)
CZ (1) CZ280350B6 (cs)
DD (1) DD220777A5 (cs)
DE (2) DE3306719A1 (cs)
DK (1) DK100184A (cs)
ES (1) ES530001A0 (cs)
IE (1) IE56922B1 (cs)
SU (1) SU1322984A3 (cs)
YU (1) YU33984A (cs)
ZA (1) ZA841363B (cs)

Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3614470A1 (de) * 1985-05-02 1986-11-20 Gary D. Flushing N.Y. Steinman Verfahren zum messen der kaliumgehalte in biologischen fluessigkeiten
EP0274425B1 (en) * 1987-01-06 1993-12-15 Asahi Kasei Kogyo Kabushiki Kaisha Pyruvate oxidase, its preparation and use
DE3821077A1 (de) * 1988-02-12 1989-08-24 David Diagnostics Inc Verfahren zur bestimmung des sauerstoffgehaltes in biologischen fluessigsubstraten und vorrichtung zur durchfuehrung des verfahrens
US5153138A (en) * 1988-10-03 1992-10-06 Boehringer Mannheim Gmbh Pyruvate oxidase mutants, DNA expressing pyruvate oxidase and methods of use thereof
DE3833601A1 (de) * 1988-10-03 1990-04-05 Boehringer Mannheim Gmbh Pyruvatoxidase-mutanten
IT1241154B (it) * 1990-05-18 1993-12-29 Slavo Metodo e composizione reagente per la determinazione dell'alanina amminotrasferasi e dell'antigene hbsag in uno stesso campione biologico
US5834226A (en) * 1991-01-31 1998-11-10 Xytronyx, Inc. One-step test for aspartate aminotransferase
JP3034969B2 (ja) * 1991-03-01 2000-04-17 旭化成工業株式会社 アンモニア、α−アミノ酸類またはα−ケト酸の高感度定量法および高感度定量用組成物
CA2365668C (en) 1999-03-17 2014-05-20 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University In vitro macromolecule biosynthesis methods using exogenous amino acids and a novel atp regeneration system
FR2814947B1 (fr) * 2000-10-09 2003-01-31 Oreal Composition tinctoriale favorisant la pigmentation naturelle procede d'obtention et utilisation pour la coloration de la peau et/ou des fibres keratiniques
EP3864167A4 (en) * 2018-10-12 2022-11-23 Polymer Technology Systems, Inc. POTASSIUM DETECTION SYSTEMS AND METHODS AT THE SUPPLY POINT

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS4939836A (cs) * 1972-08-25 1974-04-13
US4246342A (en) * 1978-03-25 1981-01-20 Toyo Jozo Kabushiki Kaisha Process for the manufacture of pyruvate oxidase, and analytical method and kit for the use of the same
JPS5840465A (ja) * 1981-09-03 1983-03-09 松下精工株式会社 空冷式冷凍機
JPS5915637A (ja) * 1982-07-19 1984-01-26 Nissan Motor Co Ltd ガスタ−ビンエンジンの始動方法および装置
JPH0236227B2 (ja) * 1983-03-03 1990-08-16 Kyowa Hakko Kogyo Kk Pirubinsanokishidaazenoseizoho

Also Published As

Publication number Publication date
DE3484541D1 (en) 1991-06-13
ATE63334T1 (de) 1991-05-15
IE840421L (en) 1984-08-25
ES8500451A1 (es) 1984-11-01
DE3306719A1 (de) 1984-08-30
DK100184A (da) 1984-08-26
ES530001A0 (es) 1984-11-01
JPS59162877A (ja) 1984-09-13
IE56922B1 (en) 1992-01-29
AU2482484A (en) 1984-08-30
CZ129684A3 (en) 1995-07-12
DD220777A5 (de) 1985-04-10
JPS6114794B2 (cs) 1986-04-21
SU1322984A3 (ru) 1987-07-07
EP0117550A3 (en) 1986-07-02
US4666832A (en) 1987-05-19
YU33984A (en) 1986-10-31
DK100184D0 (da) 1984-02-24
ZA841363B (en) 1984-10-31
CA1213843A (en) 1986-11-12
AU573570B2 (en) 1988-06-16
EP0117550B1 (de) 1991-05-08
EP0117550A2 (de) 1984-09-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Van Dijken et al. Growth of Hansenula polymorpha in a methanol-limited chemostat: Physiological responses due to the involvement of methanol oxidase as a key enzyme in methanol metabolism
Verduyn et al. Colorimetric alcohol assays with alcohol oxidase
Groen et al. Quinohaemoprotein alcohol dehydrogenase apoenzyme from Pseudomonas testosteroni
US4350762A (en) Aminopyrine improved Trinder's reagent and dosing process for hydrogen peroxide from enzymatic oxidation of metabolic substrata with the same
Tani et al. The Microbial Metabolism of Methanol: Part I. Formation and Crystallization of Methanol-oxidizing Enzyme in a Methanol-utilizing Yeast, Kloeckera sp. No. 2201 Part II. Properties of Crystalline Alcohol Oxidase from Kloeckera sp. No. 2201
Shinmen et al. Crystallization and characterization of an extracellular fungal peroxidase
US4614714A (en) Use of novel L-glutamic acid oxidase
Dijken et al. Growth of Hansenula polymorpha in a methanol-limited chemostat
CZ280350B6 (cs) Způsob výroby pyruvátoxidázy
EP0012446B1 (en) Acidic uricase, its production and its use for the determination of uric acid
US4416983A (en) Determination of NAD(P)H or salicylate
Baich The biosynthesis of proline in Escherichia coli phosphate-dependent glutamate γ-semialdehyde dehydrogenase (NADP), the second enzyme in the pathway
FI56845C (fi) Foerfarande foer framstaellning av nadh-peroxidas
JPH03155780A (ja) フルクトシルアミン・オキシダーゼ、その製造法、該酵素を用いたアマドリ化合物の定量法及びその試薬
US4657856A (en) Glutathione peroxidase, process for production thereof, method and composition for the quantitative determination of lipid peroxide
US4677062A (en) Process for producing bilirubin oxidase
Tassin et al. Purification and properties of a membrane-bound alcohol dehydrogenase involved in oxidation of long-chain hydrocarbons by Pseudomonas aeruginosa
FI82071C (fi) Av nukleosiditrifosfat beroende 1-metylhydantoinas och dess anvaendning.
Au et al. Role of quinones in the branch of the Escherichia coli respiratory chain that terminates in cytochrome o
Pritchard An NAD+-independent L-lactate dehydrogenase from Rhizopus oryzae
Rytka et al. Haemoprotein formation in yeast: III. The role of carbon catabolite repression in the regulation of catalase A and T formation
CA1066211A (en) Creatinine desimidase, its method of production and use thereof for the quantitative determination of creatinine
EP0097949B1 (en) L-glutamic acid oxidase, its production, and its use
Wittliff et al. [42] Thiaminase II (thiamine hydrolase, EC 3.5. 99.2)
JPH0414957B2 (cs)

Legal Events

Date Code Title Description
IF00 In force as of 2000-06-30 in czech republic
MM4A Patent lapsed due to non-payment of fee

Effective date: 20020224