CZ280350B6 - Způsob výroby pyruvátoxidázy - Google Patents
Způsob výroby pyruvátoxidázy Download PDFInfo
- Publication number
- CZ280350B6 CZ280350B6 CS841296A CS129684A CZ280350B6 CZ 280350 B6 CZ280350 B6 CZ 280350B6 CS 841296 A CS841296 A CS 841296A CS 129684 A CS129684 A CS 129684A CZ 280350 B6 CZ280350 B6 CZ 280350B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- pyruvate
- liter
- enzyme
- mmol
- dsm
- Prior art date
Links
- 108010042687 Pyruvate Oxidase Proteins 0.000 title claims abstract description 27
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title abstract description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 43
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 43
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M Pyruvate Chemical compound CC(=O)C([O-])=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims abstract description 27
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 22
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 claims abstract description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 15
- YXVCLPJQTZXJLH-UHFFFAOYSA-N thiamine(1+) diphosphate chloride Chemical compound [Cl-].CC1=C(CCOP(O)(=O)OP(O)(O)=O)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N YXVCLPJQTZXJLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- VWWQXMAJTJZDQX-UYBVJOGSSA-N flavin adenine dinucleotide Chemical compound C1=NC2=C(N)N=CN=C2N1[C@@H]([C@H](O)[C@@H]1O)O[C@@H]1CO[P@](O)(=O)O[P@@](O)(=O)OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)CN1C2=NC(=O)NC(=O)C2=NC2=C1C=C(C)C(C)=C2 VWWQXMAJTJZDQX-UYBVJOGSSA-N 0.000 claims description 10
- 235000019162 flavin adenine dinucleotide Nutrition 0.000 claims description 10
- 239000011714 flavin adenine dinucleotide Substances 0.000 claims description 10
- 229940093632 flavin-adenine dinucleotide Drugs 0.000 claims description 10
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 10
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 7
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 claims description 6
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 claims description 6
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 claims description 6
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 5
- 229920002873 Polyethylenimine Polymers 0.000 claims description 5
- 240000006024 Lactobacillus plantarum Species 0.000 claims description 3
- 235000013965 Lactobacillus plantarum Nutrition 0.000 claims description 3
- 229940072205 lactobacillus plantarum Drugs 0.000 claims description 3
- 241000186869 Lactobacillus salivarius Species 0.000 claims description 2
- 241000194034 Lactococcus lactis subsp. cremoris Species 0.000 claims description 2
- 241000192130 Leuconostoc mesenteroides Species 0.000 claims description 2
- 235000014962 Streptococcus cremoris Nutrition 0.000 claims description 2
- 230000000911 decarboxylating effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000002002 slurry Substances 0.000 claims description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 abstract description 7
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 abstract description 4
- AYEKOFBPNLCAJY-UHFFFAOYSA-O thiamine pyrophosphate Chemical compound CC1=C(CCOP(O)(=O)OP(O)(O)=O)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N AYEKOFBPNLCAJY-UHFFFAOYSA-O 0.000 abstract 1
- 229940076788 pyruvate Drugs 0.000 description 24
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 11
- RLFWWDJHLFCNIJ-UHFFFAOYSA-N 4-aminoantipyrine Chemical compound CN1C(C)=C(N)C(=O)N1C1=CC=CC=C1 RLFWWDJHLFCNIJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 8
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 8
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 8
- 102000003929 Transaminases Human genes 0.000 description 7
- 108090000340 Transaminases Proteins 0.000 description 7
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 6
- MUBZPKHOEPUJKR-UHFFFAOYSA-N Oxalic acid Chemical compound OC(=O)C(O)=O MUBZPKHOEPUJKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229930195712 glutamate Natural products 0.000 description 6
- KPGXRSRHYNQIFN-UHFFFAOYSA-N 2-oxoglutaric acid Chemical compound OC(=O)CCC(=O)C(O)=O KPGXRSRHYNQIFN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 5
- LWKJNIMGNUTZOO-UHFFFAOYSA-N 3,5-dichloro-2-hydroxybenzenesulfonic acid Chemical compound OC1=C(Cl)C=C(Cl)C=C1S(O)(=O)=O LWKJNIMGNUTZOO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 4
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 4
- 239000003463 adsorbent Substances 0.000 description 4
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 4
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 4
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 4
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M Potassium hydroxide Chemical compound [OH-].[K+] KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 3
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 3
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 3
- 239000011888 foil Substances 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 3
- AZQWKYJCGOJGHM-UHFFFAOYSA-N 1,4-benzoquinone Chemical compound O=C1C=CC(=O)C=C1 AZQWKYJCGOJGHM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IKHGUXGNUITLKF-UHFFFAOYSA-N Acetaldehyde Chemical compound CC=O IKHGUXGNUITLKF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- AIJULSRZWUXGPQ-UHFFFAOYSA-N Methylglyoxal Chemical compound CC(=O)C=O AIJULSRZWUXGPQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-N Pyruvic acid Chemical compound CC(=O)C(O)=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002250 absorbent Substances 0.000 description 2
- 230000002745 absorbent Effects 0.000 description 2
- LIPOUNRJVLNBCD-UHFFFAOYSA-N acetyl dihydrogen phosphate Chemical compound CC(=O)OP(O)(O)=O LIPOUNRJVLNBCD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HWXBTNAVRSUOJR-UHFFFAOYSA-N alpha-hydroxyglutaric acid Natural products OC(=O)C(O)CCC(O)=O HWXBTNAVRSUOJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940009533 alpha-ketoglutaric acid Drugs 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 2
- 238000002306 biochemical method Methods 0.000 description 2
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- CVSVTCORWBXHQV-UHFFFAOYSA-N creatine Chemical compound NC(=[NH2+])N(C)CC([O-])=O CVSVTCORWBXHQV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 239000002808 molecular sieve Substances 0.000 description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 2
- 239000000244 polyoxyethylene sorbitan monooleate Substances 0.000 description 2
- 238000003825 pressing Methods 0.000 description 2
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N sodium aluminosilicate Chemical compound [Na+].[Al+3].[O-][Si]([O-])=O.[O-][Si]([O-])=O URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 2
- UPLLQJUZZIYKHI-DFWYDOINSA-N (2s)-2-aminopentanedioic acid;2-oxobutanedioic acid Chemical compound OC(=O)CC(=O)C(O)=O.OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O UPLLQJUZZIYKHI-DFWYDOINSA-N 0.000 description 1
- SXGZJKUKBWWHRA-UHFFFAOYSA-N 2-(N-morpholiniumyl)ethanesulfonate Chemical compound [O-]S(=O)(=O)CC[NH+]1CCOCC1 SXGZJKUKBWWHRA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ADVPTQAUNPRNPO-UHFFFAOYSA-N 2-azaniumyl-3-sulfinopropanoate Chemical compound OC(=O)C(N)CS(O)=O ADVPTQAUNPRNPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- TYEYBOSBBBHJIV-UHFFFAOYSA-N 2-oxobutanoic acid Chemical compound CCC(=O)C(O)=O TYEYBOSBBBHJIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CUARLQDWYSRQDF-UHFFFAOYSA-N 5-Nitroacenaphthene Chemical compound C1CC2=CC=CC3=C2C1=CC=C3[N+](=O)[O-] CUARLQDWYSRQDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000002281 Adenylate kinase Human genes 0.000 description 1
- 108020000543 Adenylate kinase Proteins 0.000 description 1
- 102000004420 Creatine Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108010042126 Creatine kinase Proteins 0.000 description 1
- PIICEJLVQHRZGT-UHFFFAOYSA-N Ethylenediamine Chemical compound NCCN PIICEJLVQHRZGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 101000621371 Homo sapiens WD and tetratricopeptide repeats protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000892274 Human adenovirus C serotype 2 Adenovirus death protein Proteins 0.000 description 1
- 102000003855 L-lactate dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 108700023483 L-lactate dehydrogenases Proteins 0.000 description 1
- 241000186660 Lactobacillus Species 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 239000007993 MOPS buffer Substances 0.000 description 1
- JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N Magnesium ion Chemical compound [Mg+2] JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010007843 NADH oxidase Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 1
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- 101710098398 Probable alanine aminotransferase, mitochondrial Proteins 0.000 description 1
- 102000001253 Protein Kinase Human genes 0.000 description 1
- 102000013009 Pyruvate Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108020005115 Pyruvate Kinase Proteins 0.000 description 1
- 101000820656 Rattus norvegicus Seminal vesicle secretory protein 4 Proteins 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 102100023038 WD and tetratricopeptide repeats protein 1 Human genes 0.000 description 1
- AWUCVROLDVIAJX-UHFFFAOYSA-N alpha-glycerophosphate Natural products OCC(O)COP(O)(O)=O AWUCVROLDVIAJX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001166 ammonium sulphate Substances 0.000 description 1
- 239000007900 aqueous suspension Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- KLOIYEQEVSIOOO-UHFFFAOYSA-N carbocromen Chemical compound CC1=C(CCN(CC)CC)C(=O)OC2=CC(OCC(=O)OCC)=CC=C21 KLOIYEQEVSIOOO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012876 carrier material Substances 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 229960003624 creatine Drugs 0.000 description 1
- 239000006046 creatine Substances 0.000 description 1
- 230000037029 cross reaction Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- YXVFQADLFFNVDS-UHFFFAOYSA-N diammonium citrate Chemical compound [NH4+].[NH4+].[O-]C(=O)CC(O)(C(=O)O)CC([O-])=O YXVFQADLFFNVDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000396 dipotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019797 dipotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 239000011152 fibreglass Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 239000003365 glass fiber Substances 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000009413 insulation Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 229940039696 lactobacillus Drugs 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 229910001425 magnesium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- -1 mononatrium salt Chemical class 0.000 description 1
- 239000006872 mrs medium Substances 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 230000036284 oxygen consumption Effects 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 239000002985 plastic film Substances 0.000 description 1
- 229920006255 plastic film Polymers 0.000 description 1
- 229920000515 polycarbonate Polymers 0.000 description 1
- 239000004417 polycarbonate Substances 0.000 description 1
- 239000008057 potassium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 108060006633 protein kinase Proteins 0.000 description 1
- 238000010298 pulverizing process Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 229940107700 pyruvic acid Drugs 0.000 description 1
- 238000001226 reprecipitation Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000007873 sieving Methods 0.000 description 1
- AWUCVROLDVIAJX-GSVOUGTGSA-N sn-glycerol 3-phosphate Chemical compound OC[C@@H](O)COP(O)(O)=O AWUCVROLDVIAJX-GSVOUGTGSA-N 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 229960002363 thiamine pyrophosphate Drugs 0.000 description 1
- 235000008170 thiamine pyrophosphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000011678 thiamine pyrophosphate Substances 0.000 description 1
- UFTFJSFQGQCHQW-UHFFFAOYSA-N triformin Chemical compound O=COCC(OC=O)COC=O UFTFJSFQGQCHQW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0008—Oxidoreductases (1.) acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y102/00—Oxidoreductases acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2)
- C12Y102/03—Oxidoreductases acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2) with oxygen as acceptor (1.2.3)
- C12Y102/03003—Pyruvate oxidase (1.2.3.3)
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
- Y10S435/853—Lactobacillus
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
- Y10S435/885—Streptococcus
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Amplifiers (AREA)
- Financial Or Insurance-Related Operations Such As Payment And Settlement (AREA)
- Cash Registers Or Receiving Machines (AREA)
- Vibration Dampers (AREA)
- Diaphragms For Electromechanical Transducers (AREA)
- Prostheses (AREA)
- Table Devices Or Equipment (AREA)
- Eye Examination Apparatus (AREA)
- Dairy Products (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
Abstract
Je popsán způsob výroby pyruvátoxidázy, dekarboxylující pyruvát za vzniku peroxidu vodíku, aktivní bez přídavku flavin-adeninindinukleotidu, thiaminpyrofosfátu a dvojmocných kovových iontů, s optimem aktivity při pH 5,7; optimem stability při pH 5,6 až 5,8, konstantou K.sub.M.n. pro pyruvát při 25 .degree. C 2,3mnol/litr a molekulovou hmotností 146.000 Dalton při stanovení v ultraodstředivce podle Amese, který spočívá v tom, že se rozdrtí bakterie mléčného kvašení, k vodné supsenzi hmoty vzniklé rozdrcením se přidají 4 % hmot. polyethyleniminu, nerozpustné podíly se oddělí a ze získaného roztoku se enzym izoluje a přečistí.
ŕ
Description
Oblast techniky
Vynález se týká způsobu výroby nové pyruvátoxidázy.
Dosavadní stav techniky
Pyruvátoxidáza E. C. 1.2.3.3 je enzym, který dekarboxyluje pyruvát v přítomnosti fosfátových iontů a kyslíku za vzniku peroxidu vodíku (Federation Proceedings 13., (1954), str. 734 až 738). Z reakčních produktů, tvořených acetylfosfátem, oxidem uhličitým a peroxidem vodíku lze analyticky dobře stanovit zejména peroxid vodíku, a proto je tento enzym vhodný pro kvantitativní stanovení pyruvátu a pyruvát tvořících enzymů, popřípadě jejich substrátů.
Charakteristickou vlastností známé pyruvátoxidázy je, že ke své aktivitě potřebuje přídavek FAD (flavin-adenin-dinukleotidu), TPP (thiaminpyrofosfátu) a dvojmocných kovových iontů. Tato vlastnost však působí při způsobu, popřípadě v rámci činidla ke stanovení pyruvátu nebo pyruvát tvořících enzymů rušivě. Zejména TPP má totiž v přítomnosti séra a hořčíkových iontů sklon k tvorbě nerozpustných sraženin, které způsobují zákaly a proto ovlivňují optickou měřitelnost. Také skladovatelnost TPP v kombinovaném činidle, zejména v přítomnosti dvojmocných kovových iontů, je snížena, takže se TPP při skladováni poznenáhlu rozkládá. Tato vlastnost působí obzvláště rušivě při kinetickém mokrém testu. Bylo by proto velmi žádoucí mít pro stanovení pyruvátu a pro činidlo, vhodné k tomuto účelu, k dispozici pyruvátoxidázu, která není závislá na uvedených látkách, zejména na TPP a dvojmocných kovových iontech, tj. má i bez přídavku těchto látek dostatečně vysokou aktivitu.
Překvapivě bylo nyní zjištěno a na tomto zjištění spočívá tento vynález, že existuje pyruvátoxidáza, která je aktivní bez přídavku FAD, TPP a dvojmocných kovových iontů.
Podstata vynálezu
Uvedené nevýhody odstraňuje způsob výroby pyruvátoxidázy, dekarboxylující pyruvát za vzniku peroxidu vodíku, aktivní bez přídavku flavin-adenindinukleotidu, thiaminpyrofosfátu a dvojmocných kovových iontů, s optimem aktivity při pH 5,7, optimem stability při pH 5,6 až 5,8, konstantou KM pro pyruvát při 25 ’C 0,4 mmol/litr, konstantou KM pro fosfát při 25 °C 2,3 mmol/litr a molekulovou hmotností 146.000 při stanovení v ultraodstředivce podle Amese podle vynálezu, jehož podstata spočívá v tom, že se rozdrtí bakterie mléčného kvašení, k vodné suspenzi hmoty vzniklé rozdrcením se přidají 4 % hmot, polyethyleniminu, nerozpustné podíly se oddělí a ze získaného roztoku se enzym izoluje a přečistí.
Pyruvátoxidáza vyrobená způsobem podle vynálezu se však liší i svými ostatními vlastnostmi z části značné od známé pyruvátoxidázy, jak je popsáno například v německém zveřejňovacim spisu DE-OS č. 29 11 481. Zejména rozsah pH, optimální pro aktivitu,
-1CZ 280350 B6 leží u enzymu, vyrobeného způsobem podle vynálezu, níže (pH 5,0 až 6,5, optimální 5,7), než u známého enzymu (pH 6,5 až 7,5), molekulová hmotnost, stanovená v ultraodstředivce, je u enzymu podle vynálezu nižší (146.000), než u známého enzymu (190.000, stanoveno pomocí filtrace přes gel Sephadex G 200), a - což je pro použití ke stanovení pyruvátu obzvláště důležité - Michaelisova konstanta KM pro pyruvát je o více, než jeden desítkový řád nižší. V následujícím sestavení jsou porovnávány vlastnosti enzymu vyrobeného způsobem podle vynálezu s vlastnostmi známého enzymu:
| vlastnost | pyruvátoxidáza podle vynálezu | pyruvátoxidáza podle německého zveřej ňovacího spisu 29 11 481 |
| KM pyruvát (25 °C) | 0,4 mmol/litr | 10,2 mmol/litr |
| KM fosfát (25 ’C) | 2,3 mmol/litr | 0,96 mmol/litr |
| optimum stability | pH 5,6 až 5,8 | pH 6,5 až 7,5 |
| Substrátová specificita: | ||
| pyruvátoxidáza | pyruvátoxidáza | |
| podle vynálezu | podle německého zveřej ňovacího spisu 29 11 481 | |
| pyruvát | 100 % | 100 % |
| a-ketobutyrát | 0 % | 3 % |
| acetaldehyd | 15 % | 0 % |
| methylglyoxal | 20% | 0 % |
Vliv inhibitorů ve srovnání se známým enzymem ukazuje tabulka 1:
Tabulka 1
| inhibitor | koncentrace v mmol/litr | pyruvátoxidáza podle | |
| zveřej ňovacího spisu 29 11 481 aktivita | vynálezu v % | ||
| bez | 0 | 100 | 100 |
| KCN | 10 | 85 | 75 |
| 100 | 0 | 5 | |
| NaN3 | 100 | 75 | 62 |
| kyselina | 0,01 | 78 | 100 |
| ethylendiamin | 0,1 | 30 | 100 |
| tetraoctová | 1 | 7 | 98 |
| (EDTA) | 10 | 0 | 85 |
-2CZ 280350 B6
Vliv aktivátorů ve srovnání se známým enzymem ukazuje tabulka 2:
Tabulka 2
| aktivátor | koncentrace v mmol/litr | pyruvátoxidáza podle | |
| zveřejnovacího spisu 29 11 481 aktivita | vynálezu v % | ||
| thiamin-PP + | 0,2 | 100 | 100 |
| mnso4 | 1 | ||
| 0 | 0 | 0,2 | 84 |
| CoCl2 | 1 | 0 | 97 |
| MgSO4 | 0,1 | 0,2 | 97 |
| MnSO4 | 0,1 | 13 | 97 |
| thiamin-PP | 0,2 | 46 | 97 |
| FAD | 0,1 | 0 | 93 |
| FAD + TPP | 0,4 + 0,2 | 61 | 93 |
| MgSO4 + TPP | 0,4 + 0,2 | 55 | 100 |
Ze shora uvedených hodnot vyplývá, že inhibiční účinek kyseliny ethylendiamintetraoctové (EDTA) na enzym podle vynálezu je přibližně tisíckrát menší, než u známého enzymu a že po několikadenní dialýze enzymu podle vynálezu lze přísadou TPP, FAD a Mn2+ zvýšit aktivitu jen o 5 až 15 %, zatímco známý enzym není aktivní bez těchto aktivátorů.
Mezi enzymem podle vynálezu a známým enzymem nedochází při Ouchterlonyho testu (na králíku) k žádné imunologické křížové reakci.
Enzym podle vynálezu se získává z mikroorganismů, které jej obsahují v rentabilním množství, použitím obvyklých biochemických metod, přičemž v každém obohacovacím stupni lze využitím charakteristických vlastností enzymu, tj. tvorby peroxidu vodíku z pyruvátu v nepřítomnosti FAD, TPP a dvojmocných kovových iontů, snadno dokázat, v které frakci se vyráběný enzym nachází. S výhodou se k vodné suspenzi, vzniklé rozdrcením mikroorganismů, přidá přímo nebo po oddělení nerozpustných podílů polyethylenimin a přitom vzniklé nerozpustné látky se oddělí.
Jako zdroje pro enzym podle vynálezu se výhodné použije bakterií mléčného kvašení. Se zřetelem ke svému obsahu vyráběného enzymu se ukázaly jako obzvláště výhodné zdroje Lactobacillus plantarum DSM 2571, Lactobacillus salivarius DSN 2573, Leuconostoc mesenteroides DSM 2572 nebo/a Streptococcus cremoris DSM 2574. Při zkoumání několika stovek různých bakterií mléčného kvašení byl enzym podle vynálezu prokázán asi ve čtvrtině zkoumaných kmenů. Z toho lze usuzovat, že výskyt tohoto enzymu je značné rozšířen. Kromě toho existují i náznaky, že jej lze nalézt i v mikroorganismech, které nepatří k bakteriím mléčného kvašení.
-3CZ 280350 B6
K získání tohoto enzymu z mikroorganismů se tyto rozdrtí obvyklými metodami. Dobrých výsledků bylo dosaženo ultrazvukem a použitím mlecího zařízení Dyno (skleněné perličky). I rozdrcení ve vysokotlaké disperzi poskytlo dobré výsledky. Obecné však jsou použitelné i ostatní metody pro rozmělnění, jak jsou například uvedeny v německém zveřejňovacím spise č. 29 11 481.
Obohacení a vyčištění enzymu podle vynálezu je možno, jak již bylo uvedeno, dosáhnout různým způsobem obvyklými biochemickými metodami. Podle vyzkoušeného postupu se po rozdrcení získaná suspenze zbaví odstředěním nerozpustných podílů, zbylá kapalina se frakcionuje při pH 6,3 za použití roztoků síranu amonného o plynule stoupající koncentraci od 25 do 65 %, aktivní frakce se chromátografuje na adsorbentu, sestávajícím z komplexu Sepharosy s dextranovou modří (výrobce firma Pharmacia, Upsala, Švédsko), aktivní frakce se znovu frakcionuje za použiti roztoků síranu amonného o plynule stoupající koncentraci od 20 do 30 % a konečně se přečistí průchodem molekulárním sítem (Sephadex ACA 34 firmy LKB).
Podle alternativní metody se ke kapalině získané rozdrcením přidají 4 % hmot, polyethyleniminu, sraženina se odstraní a ve zbylé kapalině se provede srážení síranem amonným v roztoku o koncentraci 65 %. Sraženina se vyjme a po dialýze podrobí frakcionaci za použití roztoků sacharózy se stoupajícím gradientem. Po opětovném srážení roztoky síranu amonného o koncentraci až 65 % a po odfiltrování gelu se provede dočištění na adsorbentu, sestávajícím z komplexu Sepharosy s dextranovou modří.
Popsanými postupy lze dosáhnout asi dvaceti- až třicetinásobného obohacení až na specifickou aktivitu přibližné 6 až 9 j./mg proteinu.
Podle dalšího aspektu vynálezu se nového enzymu používá ke stanovení pyruvátu měřením množství vzniklého peroxidu vodíku. K tomu účelu jsou známy četné vhodné metody, které zde není třeba zvlášť popisovat. Také dobře vhodné je měření spotřeby kyslíku, například pomocí kyslíkové elektrody.
Enzymu podle vynálezu je možno použít nejen ke stanovení pyruvátu jako takového, ale zejména i v rámci substrátů a enzymů, které vedou k tvorbě pyruvátu.
Typickými příklady látek, jež je možno enzymem podle vynálezu stanovit, jsou:
glutamát-pyruvát-transamináza, pyruvátkináza nebo ADP, glutamát-oxalacetát-transamináza, laktátdehydrogenáza nebo kyselina mléčná, glycerin nebo glycerofosfátkináza, triglycerid kreatinfosfokináza nebo kreatin, myokináza, thiokináza nebo mastná kyselina.
Dalším předmětem vynálezu je reakční činidlo ke stanovení pyruvátu, které se vyznačuje tím, že obsahuje pyruvátoxidázu,
-4CZ 280350 B6 fosfát, pufr, soustavu pro stanovení peroxidu vodíku a popřípadě soustavu pro tvorbu pyruvátu.
Jako pufru je možno použít kteréhokoliv vhodného pufru, který pufruje ve shora uvedených rozsazích pH, v nichž je uvedený enzym aktivní a stabilní. Dobře se hodí i fosfátový pufr, takže zvláštní přídavek pufru, kromě fosfátu potřebného pro reakci, již není nutný. Při volbě pufru je však zpravidla třeba také brát zřetel na to, které hodnoty pH pro pomocné enzymy jsou v soustavě pro stanovení peroxidu vodíku nebo v soustavě pro tvorbu pyruvátu obsaženy. Se znalostí známých údajů o těchto enzymech je však možno bez dalších obtíží pufr správně zvolit.
Činidlo podle vynálezu se dobře hodí k napuštění nosičových materiálů, jako je papír, fólie z plastické hmoty a podobně, pro zkušební proužky.
Výhodné obsahuje reakční činidlo podle vynálezu 1 až 50 j./ml pyruvátoxidázy, 10 až 500 mmol/litr fosfátu, pufr pro pH 6 až 8 (popřípadě 1 až 50 mmol/litr substrátu, například pro stanovení GPT α-ketoglutarát a 1-alanin) a jako soustavu ke stanovení peroxidu vodíku 0,5 až 40 mmol/litr 4-aminoantipyrinu, 1 až 50 mmol/litr kyseliny 2-hydroxy-3,5-dichlorbenzensulfonové (HDBS) a 0,2 až 20 j./ml peroxidázy.
Vynález nemá nevýhody známého enzymu a je jím dána možnost přípravy činidla, jehož skladovatelnost předčí skladovatelnost dosavadních činidel.
Dále uvedené příklady vynález blíže objasňují.
Příklad 1
Izolace pyruvátoxidázy (Py-OD) z Lactobacillus planetarum DSM 2571
1. Kultivace
Kultivační prostředí na 1 litr: 10 g bacto-trypton/oxoidu - 4 g oxoidu kvasničného extraktu - 2 g K2HPO4 x 3 H20 - 2 g diamoniumhydrogencitrátu - 1 ml Tweenu 80 (polyoxyethylensorbitanmonooleátu) - 0,2 g MgSO4 x 7 H2O - 0,2 g MnS04 x H2O - 0,02 g molybdansulfidu - 10 g laktózy - 3,2 g kyseliny pyrohroznové, pH 7.
150 ml média se naočkuje vpichovými kulturami shora uvedeného složení nebo médiem MRS+) obvyklým pro mléčné kvašení a třepe při teplotě 28 ’C. Po provedené kultivaci se znovu 150 ml média (viz shora) naočkuje použitím 15 % narostlé kultury a třepe v Ehrlenmayerové baňce o objemu 500 ml při teplotě 28 ’C až do skončení pozdní log fáze.
-5CZ 280350 B6 +) MRS médium má toto složení:
na 1 litr: 2 g masového výtažku MERCK - 10 g peptonu z natráveného kaseinu - 4 g kvasnicového výtažku - 20 g glukózy
- 1 ml Tweenu 80 (polyoxyethylensorbitanmonooleát)
- 2,5 g K2HPO4 x 3 H2O - 5 g natriumacetátu x 3 H20
- 2 g diamoniumcitrátu - 200 mg MgSO4 x 7 H2O - 50 mg MnSO4 x H20.
2. Izolace
Z 50 litrové kultury Lactobacillus plantarum DSM 2571 se 120 j./litr pyruvátoxidázy se odstředěním získá 300 g vlhké hmoty. 100 g buněk se rozdrtí v mlecím zařízení Dyno se skleněnými perličkami, rozmělněná hmota se po přidání 4 % polyethyleniminu odstředí a kapalná fáze se dále zpracuje při pH 6,3 frakcionací za použití roztoků síranu amonného o koncentracích od 25 do 65 %, chromatografií za použití adsorbentu tvořeného komplexem Sepharosy s dextranovou modří (firma Pharmacia), druhou frakcionací za použití roztoků síranu amonného o koncentracích od 20 do 30 % a průchodem molekulárním sítem Sephadex ACA 34 (firmy LKB).
Údaje o obohacení jsou sestaveny v dále uvedené tabulce:
| jednotlivé operace | objem (ml) | jednotky | protein (mg) | specifická aktivita | výtěžek (M |
| kapalina zbývající po odstředění rozdrcené hmoty mikroorganismů | 480 | 2 516 | 6700 | 0,37 | 100 |
| 1. frakcionace za použití síranu amonného | 98 | 2 436 | 5540 | 0,44 | 97 |
| chramatografování na adsorbentu tvořeném komplexem Sepharosy s dextranovou modří | 54 | 2 284 | 2560 | 0,89 | 91 |
| 2. frakcionace za použití síranu amonného | 13 | 748 | 753 | 1,0 | 30 |
| průchod molekulárním sítem | 30 | 590 | 102 | 5,8 | 23,5 |
ACA 34
Přečištěný enzym má specifickou aktivitu 5,8 j./litr a obsahuje méně, než 0,03 % apo-glutamát-pyruvát-transaminázy + a-ketoglutarát-oxidázy, jakož i méně, než 0,002 % NADH-oxidázy.
Aktivita pyruvátoxidázy se stanoví za těchto podmínek:
pyruvátoxidáza
1) pyruvát + P^ + 02 ---------------> acetyl-P + CO2 + H2O2
-6CZ 280350 B6
2) H2O2 + 4-aminoantipyrin (4-AA) + kyselina 2-hydroxy-3,5POD
-dichlorbenzensulfonová (HDBS) ----> chinonové barvivo (546 nm) + 2 H20
H2O2 se spotřebuje v ekvimolárním množství barviva.
jednotka pyruvátoxidázy = 1 μπιοί zreagovaného množství pyruvátu za 1 minutu při teplotě 25 ’C.
Stanovení pyruvátu:
mM kaliumfosfátového pufru, pH 6,7; 8 mM 4-aminoantipyrinu; 6,8 mmol/litr kyseliny 2-hydroxy-3,5-dichlorbenzensulfonové; 0,01 mmol/litr flavin-adenin-dinukleotidu; 2 j. POD; 10 j. pyruvátoxidázy na 1 ml. Zahájení průběhu k dosažení konečné hodnoty se provádí přidáním 0,05 μπιοί pyruvátu, popřípadě vzorku obsahujícího pyruvát do kyvetového objemu 2 ml při tloušťce vrstvy 1 cm a při teplotě 37 ’C.
Reakce ustane po uplynutí 15 minut. Extinkční koeficient při 546 nm e =16,5 cm2/μπιοί se naměří pro nejčistší pyruvát (mononatriová sůl).
Příklad 2
Kinetické stanovení GPT
Ke 2,5 ml roztoku obsahujícího
KH2PO4 ..................................... 80 mmol/litr pH 6,7 alanin ..................................... 800 mmol/litr
N-(3'-sulfonyl-4'-hydroxy-5'-chlorfenyl)-4-aminoantipyrin .............. 0,2 mmol/litr kyselina a-ketoglutarová ....... 18 mmol/litr pyruvátoxidáza ..... 0,2 j ./ml
POD .............. 2 j./litr se přidá 0,1 ml vzorku. Po 3 minutách se stanoví změna extinkce za 1 minutu. Teplota při měření je 25 °C, vlnová délka je 546 nm. Hodnota je 19,6, celkový objem 2,6 ml a objem vzorku 0,1 ml. Z přírůstku extinkce za 1 minutu se vypočte aktivita GPT.
Příklad 3
Kinetické stanovení glutamát-oxalát-transaminázy (GOT)
Do násady, analogické násadě z příkladu 2, která místo alaninu obsahuje 200 mmol/litr kyseliny alaninsulfinové, se za stejných podmínek jako v příkladu 2 přidá vzorek obsahující glutamátoxalát-transaminázu (GOT). Ze změny extinkce za 1 minutu se přímo vypočte obsah glutamát-oxalát-transaminázy.
-7CZ 280350 B6
Příklad 4
Zkušební proužek pro GTP
K výrobě zkušebních proužků pro GPT se napustí dva papíry takto:
A) enzymový papír
0,5 mol/litr kyseliny morfolinethansulfonové/hydroxid draselný, pH 6,5 (pufr MOPS)
800 mmol/litr alaninu mmol/litr kaliumhydrogenfosfátu
000 j./litr POD
200 000 j./litr pyruvátoxidázy
Tímto roztokem se napustí savý papír o tloušťce 50 μπι, plošné hmotnosti 12 g/m2 a savosti 50 g H2O/m2, který se potom suší při teplotě 30 ‘C 5 minut (například papír na čajové sáčky od firmy Schóller a Hósch). Z takto zpracovaného papíru se potom nastříhají proužky o šířce 1 cm.
B) indikátorový papír mmol/litr 4,5-(4-dimethylaminofenyl)-2-(3,5-dimethoxy-4-hydroxyf enyl)-imida zolu mmol/litr kyseliny α-ketoglutarové rozpuštěné ve
100 mmol/litr HC1 (pufrová soustava).
Tímto roztokem se také napustí savý papír, který se potom suší 5 minut při teplotě 30 “C, potom se z něho nastříhají proužky o šířce 1 cm. Materiál se potom zpracuje, jak dále uvedeno:
Na jednu stranu plastikového pruhu se společně se shora zmíněným indikátorovým papírem a enzymovým papírem upevní průhledná polykarbonátová fólie o šířce 1 cm a tloušťce 100 μπι tak, že fólie bude ležet směrem ven, indikátorový papír bude uprostřed a enzymový papír vespod. Dále se nanese rouno ze skelných vláken o šířce 15 mm, tloušťce 1,5 mm a tloušťce vláken asi 2 μπι tak, že volné konce fólie a napuštěných papírů přesahují rouno ještě o 6 mm. Potom se vše rozstříhá na zkušební proužky o šířce 6 mm. Jestliže se potom 15 μΐ krve nanese do oblasti pro nanášení vzorku, pronikne plazmový podíl během 30 až 60 sekund celým rounem ze skelných vláken i pod průhlednou fólii, zatímco erythrocyty zůstanou v oblasti pro nanášení vzorku. Po přitlačení fólie přijdou nyní enzymový a indikátorový papír do styku s vyvinutou plazmou a rovnoměrně se zvlhčí. GPT obsažená v plazmě reaguje za vzniku modrého zbarvení, jehož intenzita je úměrná množství GPT a popřípadě může být změřena remisním fotometrem. Stejným způsobem reagují i ostatní složky vzorku, jako je sérum, plazma atd.
Příklad 5
Zkušební proužky na glutamát-oxalát-transaminázu (GOT)
Zkušební proužky na glutamát-oxalát-transaminázu se připraví zcela stejným způsobem, jako proužky na GPT podle příkladu 4,
-8CZ 280350 B6 pouze s tím rozdílem, že v enzymovém papíře je místo alaninu obsaženo 200 mmol kyseliny alaninsulfinové. Zde je modrá barva, vzniklá po přitlačení průhledné fólie, měřítkem množství glutamát-oxalát-transaminázy ve vzorku.
Claims (2)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Způsob výroby pyruvátoxidázy, dekarboxylující pyruvát za vzniku peroxidu vodíku, aktivní bez přídavku flavinadenindinukleotidu, thiaminpyrofosfátu a dvojmocných kovových iontů, s optimem aktivity při pH 5,7, optimem stability při pH 5,6 až 5,8, konstantou KM pro pyruvát při 25 °C 0,4 mmol/litr, konstantou KM pro fosfát při 25 ’C 2,3 mmol/litr a molekulovou hmotností 146 000 při stanovení v ultraodstředivce podle Amese, vyznačující se tím, že se rozdrtí bakterie mléčného kvašení, k vodné suspenzi hmoty vzniklé rozdrcením se přidají 4 % hmot, polyethyleniminu, nerozpustné podíly se oddělí a ze získaného roztoku se enzym izoluje a přečistí.
- 2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že jako bakterií mléčného kvašení se použije Lactobacillus plantarum DSM 2571, Lactobacillus salivarius DSM 2573, Leuconostoc mesenteroides DSM 2572 a/nebo Streptococcus cremoris DMS 2574.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19833306719 DE3306719A1 (de) | 1983-02-25 | 1983-02-25 | Pyruvatoxidase |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ129684A3 CZ129684A3 (en) | 1995-07-12 |
| CZ280350B6 true CZ280350B6 (cs) | 1995-12-13 |
Family
ID=6191871
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CS841296A CZ280350B6 (cs) | 1983-02-25 | 1984-02-24 | Způsob výroby pyruvátoxidázy |
Country Status (15)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4666832A (cs) |
| EP (1) | EP0117550B1 (cs) |
| JP (1) | JPS59162877A (cs) |
| AT (1) | ATE63334T1 (cs) |
| AU (1) | AU573570B2 (cs) |
| CA (1) | CA1213843A (cs) |
| CZ (1) | CZ280350B6 (cs) |
| DD (1) | DD220777A5 (cs) |
| DE (2) | DE3306719A1 (cs) |
| DK (1) | DK100184A (cs) |
| ES (1) | ES530001A0 (cs) |
| IE (1) | IE56922B1 (cs) |
| SU (1) | SU1322984A3 (cs) |
| YU (1) | YU33984A (cs) |
| ZA (1) | ZA841363B (cs) |
Families Citing this family (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3614470A1 (de) * | 1985-05-02 | 1986-11-20 | Gary D. Flushing N.Y. Steinman | Verfahren zum messen der kaliumgehalte in biologischen fluessigkeiten |
| DE3886225T2 (de) * | 1987-01-06 | 1994-03-31 | Asahi Chemical Ind | Pyruvat-Oxidase, ihre Herstellung und Verwendung. |
| DE3821077A1 (de) * | 1988-02-12 | 1989-08-24 | David Diagnostics Inc | Verfahren zur bestimmung des sauerstoffgehaltes in biologischen fluessigsubstraten und vorrichtung zur durchfuehrung des verfahrens |
| US5153138A (en) * | 1988-10-03 | 1992-10-06 | Boehringer Mannheim Gmbh | Pyruvate oxidase mutants, DNA expressing pyruvate oxidase and methods of use thereof |
| DE3833601A1 (de) * | 1988-10-03 | 1990-04-05 | Boehringer Mannheim Gmbh | Pyruvatoxidase-mutanten |
| IT1241154B (it) * | 1990-05-18 | 1993-12-29 | Slavo | Metodo e composizione reagente per la determinazione dell'alanina amminotrasferasi e dell'antigene hbsag in uno stesso campione biologico |
| US5834226A (en) * | 1991-01-31 | 1998-11-10 | Xytronyx, Inc. | One-step test for aspartate aminotransferase |
| JP3034969B2 (ja) * | 1991-03-01 | 2000-04-17 | 旭化成工業株式会社 | アンモニア、α−アミノ酸類またはα−ケト酸の高感度定量法および高感度定量用組成物 |
| JP4707237B2 (ja) | 1999-03-17 | 2011-06-22 | ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ リーランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティ | 外因性アミノ酸および新規ａｔｐ再生システムを用いたインビトロ高分子生合成の方法 |
| FR2814947B1 (fr) * | 2000-10-09 | 2003-01-31 | Oreal | Composition tinctoriale favorisant la pigmentation naturelle procede d'obtention et utilisation pour la coloration de la peau et/ou des fibres keratiniques |
| US20200300836A1 (en) * | 2018-10-12 | 2020-09-24 | Polymer Technology Systems, Inc. | Systems and methods for point-of-care detection of potassium |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS4939836A (cs) * | 1972-08-25 | 1974-04-13 | ||
| US4246342A (en) * | 1978-03-25 | 1981-01-20 | Toyo Jozo Kabushiki Kaisha | Process for the manufacture of pyruvate oxidase, and analytical method and kit for the use of the same |
| JPS5840465A (ja) * | 1981-09-03 | 1983-03-09 | 松下精工株式会社 | 空冷式冷凍機 |
| JPS5915637A (ja) * | 1982-07-19 | 1984-01-26 | Nissan Motor Co Ltd | ガスタ−ビンエンジンの始動方法および装置 |
-
1983
- 1983-02-25 DE DE19833306719 patent/DE3306719A1/de not_active Ceased
-
1984
- 1984-02-22 CA CA000448010A patent/CA1213843A/en not_active Expired
- 1984-02-22 AU AU24824/84A patent/AU573570B2/en not_active Ceased
- 1984-02-22 IE IE421/84A patent/IE56922B1/en not_active IP Right Cessation
- 1984-02-23 YU YU00339/84A patent/YU33984A/xx unknown
- 1984-02-23 DD DD84260292A patent/DD220777A5/de not_active IP Right Cessation
- 1984-02-24 SU SU843706215A patent/SU1322984A3/ru active
- 1984-02-24 ZA ZA841363A patent/ZA841363B/xx unknown
- 1984-02-24 JP JP59032729A patent/JPS59162877A/ja active Granted
- 1984-02-24 EP EP84101954A patent/EP0117550B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1984-02-24 ES ES530001A patent/ES530001A0/es active Granted
- 1984-02-24 AT AT84101954T patent/ATE63334T1/de not_active IP Right Cessation
- 1984-02-24 CZ CS841296A patent/CZ280350B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1984-02-24 DE DE8484101954T patent/DE3484541D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1984-02-24 DK DK100184A patent/DK100184A/da not_active Application Discontinuation
- 1984-02-27 US US06/583,728 patent/US4666832A/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0117550A3 (en) | 1986-07-02 |
| US4666832A (en) | 1987-05-19 |
| YU33984A (en) | 1986-10-31 |
| AU573570B2 (en) | 1988-06-16 |
| ATE63334T1 (de) | 1991-05-15 |
| CZ129684A3 (en) | 1995-07-12 |
| IE840421L (en) | 1984-08-25 |
| DE3306719A1 (de) | 1984-08-30 |
| SU1322984A3 (ru) | 1987-07-07 |
| DD220777A5 (de) | 1985-04-10 |
| JPS59162877A (ja) | 1984-09-13 |
| DK100184D0 (da) | 1984-02-24 |
| AU2482484A (en) | 1984-08-30 |
| DK100184A (da) | 1984-08-26 |
| ES8500451A1 (es) | 1984-11-01 |
| EP0117550B1 (de) | 1991-05-08 |
| DE3484541D1 (en) | 1991-06-13 |
| CA1213843A (en) | 1986-11-12 |
| ZA841363B (en) | 1984-10-31 |
| JPS6114794B2 (cs) | 1986-04-21 |
| ES530001A0 (es) | 1984-11-01 |
| IE56922B1 (en) | 1992-01-29 |
| EP0117550A2 (de) | 1984-09-05 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Verduyn et al. | Colorimetric alcohol assays with alcohol oxidase | |
| Groen et al. | Quinohaemoprotein alcohol dehydrogenase apoenzyme from Pseudomonas testosteroni | |
| US4350762A (en) | Aminopyrine improved Trinder's reagent and dosing process for hydrogen peroxide from enzymatic oxidation of metabolic substrata with the same | |
| Tani et al. | The Microbial Metabolism of Methanol: Part I. Formation and Crystallization of Methanol-oxidizing Enzyme in a Methanol-utilizing Yeast, Kloeckera sp. No. 2201 Part II. Properties of Crystalline Alcohol Oxidase from Kloeckera sp. No. 2201 | |
| Shinmen et al. | Crystallization and characterization of an extracellular fungal peroxidase | |
| EP0012446B1 (en) | Acidic uricase, its production and its use for the determination of uric acid | |
| US4614714A (en) | Use of novel L-glutamic acid oxidase | |
| Dijken et al. | Growth of Hansenula polymorpha in a methanol-limited chemostat | |
| CZ280350B6 (cs) | Způsob výroby pyruvátoxidázy | |
| US4416983A (en) | Determination of NAD(P)H or salicylate | |
| Baich | The biosynthesis of proline in Escherichia coli phosphate-dependent glutamate γ-semialdehyde dehydrogenase (NADP), the second enzyme in the pathway | |
| Forlani et al. | Biochemical evidence for multiple acetoin-forming enzymes in cultured plant cells | |
| FI56845C (fi) | Foerfarande foer framstaellning av nadh-peroxidas | |
| JPH03155780A (ja) | フルクトシルアミン・オキシダーゼ、その製造法、該酵素を用いたアマドリ化合物の定量法及びその試薬 | |
| US4657856A (en) | Glutathione peroxidase, process for production thereof, method and composition for the quantitative determination of lipid peroxide | |
| US4677062A (en) | Process for producing bilirubin oxidase | |
| Tassin et al. | Purification and properties of a membrane-bound alcohol dehydrogenase involved in oxidation of long-chain hydrocarbons by Pseudomonas aeruginosa | |
| Au et al. | Role of quinones in the branch of the Escherichia coli respiratory chain that terminates in cytochrome o | |
| Pritchard | An NAD+-independent L-lactate dehydrogenase from Rhizopus oryzae | |
| FI82071C (fi) | Av nukleosiditrifosfat beroende 1-metylhydantoinas och dess anvaendning. | |
| Rytka et al. | Haemoprotein formation in yeast: III. The role of carbon catabolite repression in the regulation of catalase A and T formation | |
| CA1066211A (en) | Creatinine desimidase, its method of production and use thereof for the quantitative determination of creatinine | |
| JP2763551B2 (ja) | ピラノースオキシダーゼおよびその製造法 | |
| EP0097949B1 (en) | L-glutamic acid oxidase, its production, and its use | |
| Tani et al. | Separation and Characterization of Glyeolaldehyde Dehydrogenase Isozymes in Escherichia coli B |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| IF00 | In force as of 2000-06-30 in czech republic | ||
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20020224 |