JPS59130195A - Ａｔｐの新規定量法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 存在スるＡ　’Ｉ”　Ｐ　（アデンンントリフオスフエ
ート）、寸だＨ：Ａ　Ｄ　Ｐ　（アデノ／フジホスフェ
ート）とキノ−−ゼ基質用リン化合物からキナーゼの反
応により遊離、生成したＡ　’Ｔ”　Ｐの定量またはＡ
　Ｔ　Ｉ）定量に基くキナーゼ、Ａ　Ｄ　Ｐおよびキナ
ーゼゝ基質用リン化合物のいずれか１つの成分の測定法
に関する。

従来より、遊離、生成したＡ　Ｔ　Ｌ）、例えばクレア
チンホスフェートとＡ　ＤＰからクレアチンキナーゼの
作用によりクレアチンおよびＡ　’１’　Ｉ）を遊離、
生成する反応系のＡ　’Ｉｆ’　Ｐやあらかじめ存在す
るＡ１゛Ｐの測定法と１〜では、例えばこのＪ〜１’　
Ｐにグルコースおよびへキノキナーゼを作用せしめてＡ
　Ｉ）Ｐおよびグルコース−６−リン酸を生成せしめ、
このグルコース−６−リン酸にＮＡＩ）Ｉ’にコチン・
アデニン・ジヌクレオチド・リン酸）およこグルコ−ス
ル６−リン酸テヒドロゲナーゼを作用せｌ、メ、グルコ
ノ−δ−ラクトンおよび還元型Ｎ　Ａ　Ｄ　Ｉ）を生成
せしめ、次いでこの還元型Ｎ　Ａ、　ＩＰの生成量を紫
外部領域の波長で吸光度測定し１なるものであった。−
１（Ｍｅｔｈｏｄｓ、ｉｎ　ＥｎｇｙｍａｔｉｃＡｎａ
ｌｙｓｉｓ第２巻第７８９頁）。

このように従来のＡ　ＴＰ測測定だｌ−１：　Ａ　Ｔ　
Ｐをμ離、生成する反応系におけるＡ　ＴＰ測測定関し
１は、１モル比のＡ、　Ｔ　Ｐから１モル比の定量二成
分Ａる還元型Ｎ　Ａ　Ｄ　Ｐｌ、か生成されず、定量性
感度」なお不充分なものであった８ 本発明者らは、微量のＡ　’］”　Ｐ量の場合であつ１
も良好な感度にて定量し得る方法について種々化究した
結果、 ■　少なくとも被検液中に存在するＡＴＰに、脂ル酸お
よびＣｏ　Ａ、　Ｓ　ｌ−１（コ・エンチーｌ、Ａｌを
ア７）ＣｏＡ−シンセターゼ（ＥＣ６，２，１，８）９
作用にてアンル〜ＣｏＡを生成せしめ、■　この生成し
たアンルＣｏＡをアシル−ＣＯＡ・オキシダーゼ（米国
特許第４３４６１７８号明細書ｊ　　　参照）の作用に
てデヒドロアンルーＣｏＡを生成せしめ、 ）　　■　さらにこのデヒドロアンル〜ＣｏＡをエノイ
ル−ＣｏＡ・ヒドラターゼ（ＥＣ４，２，１，１７）の
作用にてヒドロキシアシル−Ｃｏ　Ａ　全生成せしめ、 ｔ　■　コノヒドロキンアンルーＣｏ　Ａ　ヲＮ　Ａ　
Ｄ　（＝コテン・アテ二）・ジヌクレオチド）を用いて
３−ヒドロキシアシルーＣｏＡ・デヒドロゲナーゼ（Ｅ
Ｃ１１，１，３５）の作用にて還元型ＮＡＤの生成を伴
って３−ケトアンルーＣｏＡを生成せしめ、 Ｉ　■　さらにコノ３−ケ）　７ゾルーＣｏ　ＡをＣｏ
　Ａ　Ｓ　Ｈを用いて３−ケトアシル−ＣｏＡ・チオラ
ーゼ（ｊ　　　ＥＣ２，］、１．１６）の作用ニテ７−
Ｌ　チルＣｏＡ２−　の生成を伴ってアンルーＣｏＡを
生成せしめ、と）　　の生成したアンルーＣｏＡは、さ
らに」１記の■のアシル−ＣＯＡ・オキシダーゼの基質
上して作用を受け、この反応サイクル内に入り、■サイ
クル毎にアンルＣｏＡは炭素数２個の単位で減じたアゾ
ルーＣｏＡを生成し、その際反応系において検出できる
変化の成分、例えばＮ　Ａ、　Ｄから還元型Ｎ　Ａ　１
）の生成量はアシルＣｏＡの１サイクル毎に等モル比の
量を生成するもので、このようにして１モル比のＡ゛Ｉ
″Ｐによって形成されたアンルーＣ。

からヤイクル数に応じた高モル比の還元型ＮＡＤを生成
せしめて々るもので、高感度にてＡ　ＴＰを定量する方
法を完成した、 本発明は」１記の知見に基いて完成されたもので被検液
中δＡ　Ｔ　Ｐを定量するに当り、下記の反応」工程■
　、　■、　■、０．　　■。

■　キナーゼ、Ａ　Ｄ　ｐおよびキナーゼ基質用リン化
合物からＡ　’Ｉ’　Ｐを遊離させるか、ＡＴＰを含有
している被検液に脂肪酸を作用させてアンルーＣｏＡと
する反応工程、 ■　アンルーＣｏ−ＡをデヒドロアンルーＣｏ　Ａ　Ｋ
　ｆる反応工程、 ■　デヒドロアンル〜ＣｏＡをヒドロキシアシルーＣｏ
Ａにする反応工程、 ■　ヒドロキシアシルーＣｏＡをケトアンル〜ＣｏＡに
する反応工程、 ■　ケトアンルーＣｏＡをア／／ｌ／−ＣｏＡにする反
応工程、 および検出できる変化を測定する工程を有するとＡ　　
とを特徴とする定量法、お上ひ少なくとも、下記の組成 ・キナーゼ、ＡＤＰおよびキナーゼ基質用ｊ）ン化合物
のいずれかの２つの成分 ・脂肪酸 ・ＣｏＡＳＨｌ ・Ｎ　Ａ、　Ｄ、 ・アンルーＣｏＡ・シンセターゼ活性の成分、・アンル
ーＣｏＡ・オキシダーゼ活性の成分、・エノイル−Ｃｏ
Ａ・ヒドラターゼ活性の成分、・３−ヒドロキシアシル
ーＣｏＡ・デヒドロゲナーゼ活性の成分、 ・３−ケＩ・アシル−ＣｏＡ・チオラーゼ活性の成分、 を含有してなる組成物を用いてＡ　’１’　Ｐを定量す
る方法である。

１ず本発明の被検液としては少なくともＡＴＰヶ含イ□
−Ｊ−、ｂ４ｏアあゎ、１よ３．４７□・ヶあ、ヵ１．
　■め含有してなる被検液やＡ　’Ｉ”　Ｉ）を遊離せ
しめてなるＡ　Ｔ　Ｉ）含有被検液が挙られる。Ａ　’
Ｊ”　Ｐを遊離せ（７めてなるＡ　’Ｉ”　Ｊ）含有被
検液としてｄ、・用常キナ　■−セ、ノ＼Ｉ）　Ｊ）お
よびキナーゼ基質用リン化合物による酵素反応にてその
Ａ１つＰがリン酸化さｆｌて挙られる。さらに詳しくは
、１記の酵素反応系が例示される′が、これ〜らは例示
であって何んら不発■クレアチンホスフェ−１−＋Ａ、
　、１）　Ｐクレアチン−４Ａ　’Ｊ”　Ｐ （Ｅに２．７．１．４０） ピルビン酸＋ＡＴＰ Ｍ　ｇ　２＋またはＭｎ”” アセチルホスフェート−１−Ａ　Ｉ）　Ｐ酢酸＋ＡＴＰ ＮＨ３→−ＣＯｒｌ−ＡＴＰ １．３−ジホスホーＤ−グリセレイト→−Ａ　Ｄ　ＰＮ
１ｇ２＋４たはＭ　ｎ　２ヤ ３−ホスホ−Ｄ−グリセレイト＋ＡＴＰＬ−アルギニン
＋ＡＴＰ （ＥＣ２゜７，４・、３） Ａ　Ｍ　Ｊ’　＋　Ａ　Ｔ　　Ｐ Ｘ　Ｍ　Ｊ）　−４−Ａ　Ｔ　Ｐ （ただしｘ−ｕ、■、’Ｏ，ｃ捷たはＡを示す）これら
の酵素反応系におけるキナーゼとしては、例えば前記の
タレアチンホスフエー＋−、ホスホエノールピルビン酸
、アセチルホスフェート、カルバモイルホスフェート、
４−ホスホアメパルディ１−，１．３−ジホスホ−１）
−グリセレイト、アルギニノポスフェート、、ＡＤＰ、
ＸＪ）Ｊ］などのキナーゼ基質用リン化合物とＡ　Ｄ　
Ｐとからキナーゼ基質用リン化合物のリン酸基をＡ　Ｄ
　、１）に転位せしめてＡ　’Ｊ’　Ｐを生成ＭＰ＃す
る作用を有する酵素であればよい。例えばタレアチンホ
スフエートヲキナーセ基質用リン化合物とするクレアチ
ンキナーゼ、ホスホエノールピルビン酸をキナーゼ基質
用リン化合物とするピルベートキナーゼ、アセチルホス
フェートをキナーゼ基質用リン化合物とするアセテート
キナーゼなどやその他カルバメイトキナーゼ、アスパル
テイトキナーゼ、ホスホグリセレイトキナーゼ、アルギ
ニンキナーゼ、ミオキナーゼ、ヌクレオザイドモノホス
フエートキナーゼなどが挙られる。寸だこれらの酵素反
応系におけるＡＴＰの定量の目的は、酵素反応系におけ
るキナーゼ活性測定、Ａ、　Ｊ）　Ｐの定量およびキナ
ーゼ基質用リン化合物の定量のいずれか１つの成分の定
量のために行なわれるものであって、寸だ他の２つの成
分は試楽吉して用いればよい。′またこれらのＡ　’Ｔ
”　Ｐを遊離せしめる酵素反応糸において、用いられる
被検液や試薬の量は測定すべき目的や選択する条件によ
って適宜変更設泪すればよく、特に限定されるものでは
なく、反応によって遊離されるＡＴＰＱ量が定量するに
充分量生成遊離される条件であれはよい。寸だＡ　’Ｊ
’　Ｐを遊離せしめるに当っては、通常３７°Ｃ近辺の
温度条件にて行なえばよく、また反応時間はＡ　’Ｉ”
　］）が充分量生成遊離されるに要する時間以上であれ
ばよく、通常１分以上行なわれる。

才だ本発明に用いられる脂肪酸としては、飽和まだは不
飽和の炭素数１０以上の高級脂肪酸が好寸しい。例えば
炭素数１０のカプリン酸、炭素数１２のラウリン酸、炭
素数１３のトリデ７レン酸、炭素数１４のミリスチン酸
、炭素数１５のベンタデ７レン酸、炭素数１６のパルミ
チン酸、パルミトオレイン酸、炭素数１７のマーガリン
酸、炭素数１８のステアリン酸、オレイン酸、バクセノ
酸、１２−オクタデセン酸、リノール酸、リルン酸、炭
素数１９のノナデ・／レン酸、炭素数２０のアラキシン
酸、９−アイコセン［，１，１−アイコセン酸、１１，
１４−アイコザジエン酸、８，１．１゜１４〜−′アイ
コザトリエン酸、アラキドン酸、炭素数２１のベヘニン
酸、炭素数２２のりグツセリン酸、１１−トコセン酸、
エルカ酸などが挙られる。

寸だ炭素数８のカプリル酸も使用できるものの、高感度
にて４１１ｊ定するに当っては」−記の高級脂肪酸を用
いることが好ましい。さらに本発明においてばＣｏＡＳ
Ｈが用いられる。

次いで本発明の被検液中のＡＴＰを測定するための■に
おけるＡＴＰに脂肪ｉｔを作用させてアンルーＣｏＡと
する反応工程、■、■、■および■の各反応工程を例示
す力、げ、次のクロ＜である。

（の　反応工程；　ＡＴＰに脂肪−酸を作用させてアン
ルー　ＣｏＡ１／ｉｃする反応工程である。例えばＡＴ
Ｐを脂肪ｔｌおよびＣ０ＡＳＨの共存下にてアンルーＣ
ｏＡ　。

ＡＭＰおよびピロリン酸（ＰＰＤ　となす反応を触媒す
る酵素活性を有するアシル−ＣｏＡ・ンンセターゼ活性
、脂肪酸およびＣｏＡＳＨＫ基く反応工程が挙ら］する
。

アンル〜ＣＯＡ＆ ／ンセターゼ活性 ■　反応工程；アンルーＣｏＡをデヒドロアンルーＣｏ
Ａにする反応工程である。例えばアンルーＣｏＡを酸素
の存在下にデヒドロアシル−ＣｏＡおよび過酸化水素と
なす反応を触媒する酵素活性を有するアンルーＣｏＡ・
オキンダーゼ活性および酸素に基く反応工程が挙ら第１
．る。０ １ （の　反応下杵；デヒドロア／ルーＣｏＡをヒｊ・ロギ
／ア／ルーＣｏＡ　Ｋする反応工程である。例乏−はデ
ヒドロアンルーＣｏＡを水の存在下にヒトロキ／ア／ル
ーＣｏＡと外す反応を触媒する酵素活性を何するエノイ
ル−ＣｏＡ・ヒドラターゼ活性および水に基く反応Ｊ１
４♀が挙ら力、る。

１ Ｒ−ＣＨ：・−ＣＨ−Ｃ−８ＣｏＡ　十ＨＯ〔デヒドロ
アンルーＣｏＡ） エノイル−ＣｏＡや　〔ヒトロキ／アンルーＣｏＡｊヒ
ドラタ〜ゼｌ占性 ■　反応工程；ヒドロキシアンルーＣｏＡをケトアンル
ーＣｏＡ　Ｋする反応下・程である。例え１ばヒドロキ
ノアンルーＣｏＡをＮ　Ａ　Ｄの存在下にケトアンルー
ＣｏＡおよび婿元７＋１’　Ｎ　Ａ　Ｄとなす反応を触
媒する酵素活性を有する３−ヒドロキ／ア／−ルーＣｏ
Ａ・デヒドロゲナーセ活性およびＮ　Ａ　Ｉ）に基く反
応工程が挙られる。

ＯＨ０ １］１ Ｒ−ＣＩ（−ＣＨ２−Ｃ−８ＣｏＡ　十　ＮＡＤ〔ヒド
ロキ／アンルーＣｏＡ：］ テヒトロゲナーゼ活性 ■　反応工程：ケトアンルーＣｏＡをアンルーＣｏＡ　
Ｋする反応工程である。例えばケトアンルーＣｏＡをＣ
０ＡＳＨの存ｒ［下にアンルーＣｏＡおよびアセチル−
ＣｏＡとなす反応を触媒する３−ケトアンルーＣｏＡ・
チオラーセ活性およびＣｏＡＳ＋−１に基く反応］二・
序が挙らノ′しる。

０、　　　　　　　０ １１ ＯＯ １ Ｒ−Ｃ−８ＣｏＡ＋ＣＨ３Ｃ−８ＣｏＡ３〜ケトア／ノ
ー、−ＣＯＡ・　　〔アンルーＣｏＡ〕チオラーゼ活朋 これらの各反応エイ♀を遂行せしめるために、各反応に
要する試薬および酵素活性を奏する各酵素を用い１−Ｌ
ばよく、また用いら力、る酵素としでは、動吻山来のも
のでも、微生物由来のものでも使用でき、またと力、ら
は市販の酵素を用いてもよく、寸／こ酵素含有組織から
単離したものでもよい１、アシル−ＣｏＡ・シンセタ〜
セ活性を奏する酵素（ＥＣ６，２，１，３）としては、
例えばモルモッ］・肝１藏由来のもの［：　Ｊ、Ｂｉｏ
ｌ、Ｃｈｅｍ、　、２０４．３２９　（１９５３）　〕
、ラット、マウス、ラン、ブタなどの肝臓由来のもの（
特開昭５５−７７１７９１号公報）、エンエリピア０コ
リー（Ｆ：５ｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　）由来の
もの［：　Ｅｕｒ、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、、１２．５７
６　（１９７０）　”’Ｊ、バチルス・メガテリウム（
Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ　）由来のも
の（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　４　　（１）、８５　
　（１９６５）　］、その］活アエロバククー（Ａｅｒ
ｏｂａｃｔｏｒ　）属に属する生産菌（Ａ、ａｅｒｏｇ
ｅｎｅｓ　ＩＦＯ３３１８）　、セラチア（Ｓｅｒａｔ
ｉａ　）属に属する生産菌（５ｅｒａｔｉａ　ｒｎａｒ
ｃｅｓｃｅｎｓＩＦＯ３０５４）、プロテウス（Ｐｒｏ
ｔｅｕｓ　）属に属する生産Ｗ４　（Ｐｒｏｔｅｕｓｍ
ｉｒａｂｉｌｉｓ　ＩＦ’０３８４９）　、スタフイｏ
＝＋ツカス（５ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　）属に属
する生産Ｍ　（５ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒ
ｅｕｓ　Ｉ　ＦＯ３０６０）、／ニードモナス（Ｐｓｅ
ｕｄｏｍｏｎａｓ　）属に属する生産ｍ　（Ｐｓｅｕｄ
ｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ　Ｉ　１ｉ’０３
９１９）　、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ　）属に属
する生産菌（Ｆｕｓａｒｉｕｍｏｘｙｓｐｏｒｕｍ　Ｉ
　Ｆ”０５９４２）　、キベレラ（Ｇｉｂｂｅｒｅ　Ｉ
　Ｉａ　）属に属する生産菌（Ｇｉｂｂｅｒｅ］Ｉａ　
ｆｕｊｉｋｕｒｏｉ　Ｉ　ＦＯ６６０４）、キャンシタ
（Ｃａｎｄ　１ｄａ）属に属する生産菌（Ｃａｎｄｉｄ
ａ　ｌ１ｐｏｌｙｔｉｃａ　ＩＦＯ０７１７）などの微
生物由来のもの［：　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｊ、、１
０５　（３）１２１６　（１９７１）　、Ｊ、７３ａｃ
ｔｅｒｉｏ１．．１１４　（、Ｌ）２４９　（１９７３
）、特開昭５５−７４．７９０号公報、特開昭５５−９
９１８７号公報〕号公報系られる。またアンルーＣｏＡ
・オキシダーゼ活性を奏する酵素としては、例えばラッ
ト肝臓由来のもの（Ｂ：ｏｃｈｅｍ、Ｂｌｏｐｈｙ、Ｒ
ｅｓ、ｃｏｍｐｎｌ］ｎ、、８３　（２）　４７９（１
９７８））、キャンシダ属に属する生産菌（Ｃａｎｄｉ
ｄａ　ｕｔｉｌｉｓ　、Ｃａｎｄｉｄａ　１ｉｐｏｌｙ
ｔｉｃａ　ＩＦＯｌ　５４８、Ｃａｎｄｉｄａ　　ｔｒ
ｏｐｉｃａｌｉｓ　　ＴＦＯ０５８９）　　、ザノカＤ
フイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　）属に属する
生産菌Ｃ５ａｃｃｈａｒｏｒｎｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｊ
ｓｉａｅ　ＩＦＯ０２１３、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅ
ｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　Ｙ　ＯＯ３６：　ＤＳＭ２
１３８、ＦＥＲＭ−ＰＮｏ、　５１７４　〕オイベニン
リウム（Ｅｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）　Ｊｊ％に属す
る生産菌（Ｅｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍｊａｖａｎｉｃ
ｕｍ　Ｉ　ＦＯ７９９２）　、モナスカス（Ｍｏｎａｓ
ｃｕｓ）属に属する生産菌ＣＭｏｎａｓｃｕｓ　ｓｐ、
　Ｍ　−４８００：ＤＳＭ２１３６、ＰＥＲＭ−ＰＮｂ
、５２２５］、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕ
ｓ　）属に属する生産菌〔Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｃ
ａｎｄｉｄｕｓ　Ｍ　−４８］　５　：　ＤＳＭ　２］
、３５、ＦＥＲＭ−ＰＮｏ、５２２６　〕〕アースロバ
フタ−Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ　）　ｇに属する生産
菌（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒｓｐ、Ｂ−０７２０：　
Ｉ）８Ｍ２１３７、ＦＥＲＭ−ＰＮｂ：５２２４、　）
、マクロフオミナ（Ｍａｃｒｏｐｈｏｍｌｎａ　）属に
属する生産菌（Ｍａｃｒｏｐｈｏｍｉｎａ　ｐｈａｓｅ
ｏｌｊ　Ａ　Ｔ　Ｃ属に属する生産菌（Ｃｌａｄｏｓｐ
ｏｒｉｕｍ　ｒｅｓｉｎａｅ　ＩＦＯ６３６７）などの
微生物由来のもの（Ａｒｃｈ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、、１７６−１５９
１　（１９７６）、特開昭５５−１１８３９１号公報、
特開昭５６−８６８３号公報、特開昭５６−６１．９９
１号公報、米国特許εＨ４３４６１７３号明細」、西ド
イツ国出１ψＩＪ第９３２２３８７４．６号明此書〕な
どが挙られる。寸だこのアンルーＣｏＡ・オキ／ダーゼ
活性の代りにアンルーＣｏＡ・デヒドロゲナーゼＣＡｃ
ｙｌ　−ＣｏＡｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ　ＸＥ　Ｃ
１，３、９９、３、Ａｃｙｌ　−ＣｏＡ：　　（ａｃｃ
ｅｐｔｏｒ　）　ｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ　］活
性を奏する酵Ｉ、例えばブタ、つ／やヒツジの肝臓由来
のものＣＪ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　、２±８．７
１７　（］　９５６）　、Ｊ、Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ、　、２１８．７０１　（１９５６）、Ｊ、Ａ
ｍ−Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ　、　）７５．２７８７　（１９
５３）　、Ｂｉｏｃｈｉｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ
、　。

２２．４．７５　（１９５６）　、Ｉｌｌを用いて、ア
ンルーＣＯＡをテヒドロア／ルーＣｏＡとなしてもよい
。この際、電子受容体、例えば２，６−シクロロフエノ
ールインドフエノ〜ル、３−（ｐ−ヨードフェニル）−
−テトラシリラム・クロライド（ＩＮＴ）、３−（４，
５−ジメチル−２−チアゾリル）　−２，５−ジフェニ
ル−２Ｈ−テトラゾリウムΦブロマイド（Ｍ’ｌ”Ｔ）
　、３．３’　−（４，４’−ビフエニリレン）−ビス
（２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウム・クロラ
イド）　　（Ｎｅｏ　−ＴＢ）、３．３’　−（３，３
’−ジフトキン−４，４１−ビフエニリレノ）−ビスＣ
２−（ｐ−＝トｏフェニル）−５−フェニル−２［（−
テトラシリラム・クロライド〕　にトロテトラゾリウム
ブルー：　ＮＴ　Ｂ）　、３．３’　−（３，３’−ジ
ノトキ／ロライド）　　（’ｆ’ＮＴＢ）、３．３−　
（３，３“１−ジフトキン−４，４−ビフエニレン）−
ビス（２，５−ジフェニル−２１１−テトラシリラム・
クロライド）（ＴＢ）などを、好捷しくにフェナジンメ
トザルフェトとともに用いて反応を行なわ＋：！：ｈげ
よい。さらにエノイル−ＣｏＡ化ドラターゼ活性を奏す
る酵素（ＥＣ４，２ｉ、、１７）　、３−ヒドロキノア
ル／−〇〇Ａ・テヒドロゲナーゼ活性を奏する酵素（Ｅ
Ｃｉ　、　ｌ。１３５）や３−ケトアノルーＣｏＡ・チ
オラーゼ活性を奏する酵素（ＥＣ２，３，１，１６）と
しては適宜それらの酵素活性含有糾１峨から晰離しても
よ込ＣＪ、　Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ、　、　２１８．９７１　（１９５６）　、Ａ
ｎｇｅｗ、　Ｃｈｅｍ、　、６４゜６８７　（１９５２
）　、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、　２０７．６３
１（］　９５４　）　、Ｂｉｏｃｈｉｒｎ、　Ｂｉｏｐ
ｈｙｓ、Ａｃｔａ、、２６．４４８（１９５７）　、Ｊ
、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、２０８．３４．５　（１
９５４）：）。

またこれらのエノイル−ＣｏＡ・ヒドラターセ活性、３
−ヒドロキンアンルーＣｏＡ・テヒドロゲナーゼ活性お
よび３−ケトアノルーＣｏＡ・チオラーゼ活性におりで
、各酵素活性を同−蛋白上に有してなる腹合活性酵素の
酵素活性を用いることが好ましい。この彷合活性酵累生
産菌としては、例えば工／エリヒア属に属する生産Ｍ　
ＣＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ；Ｐｒｏｃ、Ｎａ
ｔｌ、Ａｃｏｄ、Ｓｃｉ、、７４　（２）　４９２　（
１９７７）　〕、ンユードモナス属に属する生産菌ＣＰ
ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓＦｒａｇｉ　Ｂ　−０７７１（Ｆ
ＥＲＭ−ＰＡ５７０１）　；特願昭５６〜９９３１４号
明細書、米国特願第３９２０１０号明！、！ＩＩ書〕が
挙られる。特にこの７ユードモナス篇に属する生産菌Ｂ
−０７７１およびこの生産菌から得られた複合活性酵素
について述べ力、げ、次の通りである。ます本菌Ｂ−０
７７１は山梨県北巨摩郡須玉町の梨畑の土壌より分離し
たもので、その肉眼的および顕微鏡的観察などに基く各
錘培地上における培養の所見は以下にＩｊｌｓべろ通り
である。

（５）肉眼的特徴 （１）普通寒天平板培地 丘状、円形で、周囲（はなめらかな電溶を形成し、半光
沢で、灰白色〜淡黄色を呈する。可溶性色素は産生しな
い。

（２）普’）Ｈｈ寒天斜面培地 線状に良好に生育する。半光沢で、灰白色〜淡黄色を呈
する。可溶性色素（ｄ産生じなり０（３）液体培地 −＋＝、、ｆｆｌに混濁し、沈澱も生ずる。菌膜は形成
しない。

（１３）顕微鏡的特徴 まっすぐ、ま／こはやや曲った十早蘭で、単独寸たは二
連で、を捷に長連鎖になる。大きさは０．４〜０．６　
Ｘ　０．５〜３．０ｐｍで、極上で運動する。芽胞は形
成しなり０ （Ｃ）生理的・牛化学的％敗 ダラム染色　　　　　　　　　　　　　　　−〇＠Ｆテ
スト　　　　　　　　　　　　　　　　　　　Ｏカタラ
ーゼ　　　　　　　　　　　　　　　＋オキソダーセ　
　　　　　　　　　　　　　→−レ／チナーセ゛　　　
　　　　　　　　　　　　−ウレアーゼ ＳＳＲ培地　　　　　　　　　　　　　　−クリステン
ゼン培地　　　　　　　　（ト）ゲラヂンの力１１水分
解　　　　　　　　　　　　−−テンアンの加水分解　
　　　　　　　　　　−カゼインの加水分解　　　　　
　　　　　　−ニスクリ／の加水分角イ　　　　　　　
　　　−□−アルギニンの加水分解　　　　　　　　　
　十ポリーβ−ハイドロキシブチレイト（ＰＩ（Ｂ）の
蓄積　　−インドールの産生　　　　　　　　　　　　
−４１ｉｊｆｉ化水素の１看生　　　　　　　　　　　
　　−アセトインの産生　　　　　　　　　　　　−Ｍ
　Ｒテスト− 硝酸塩の還元　　　　　　　　　　　　　　−クエン酸
の利用　　　　　　　　　　　　　　十糖よ、！７酸の
産生性 酸産生、ガス非産生：Ｉ、（−１−）アラビノース、セ
ロビオース、ンラクトース、フコース、ガラクトース、
グルコース、！３１セリン、ラクトース、マルトース、
マンノース、ノリビオース、ラムノース、ンユクロース
、トレハロース、キン０−ス、峻非産生、ガス非産生：
アドニト−ル、プル７トール、メソ−エリスリトール、
イノ７トールイヌリノ、マンニト−ル、メレシトース、
ラフィノース、サリ／ン、ノルボース、ノリビオース、
スターチ、 上記の通り、水閘Ｂ〜０７７１は、ダラム陰性で、極上
で運動し、カタラーゼ、オキンダーゼ陽１生であり、さ
らにグルコースを酸化的に分１！ｌ！Ｉ！する静閑性の
細菌である特徴を有していることから、シュードモナス
属に属する菌株と認められた。

さらに、ザ・ジャーナル・オブ・ジェネラル・ミクロバ
イオロジー（Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｇｅｎｅ
ｒａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）　２５．３７９−４
０８　（１９６１）に記載の７ユードモナス拳フラギ（
Ｐｓｅｕｄｏ＋ｎｏｎａｓさらに水閘Ｂ−０７７１を、
標準法であるンユードモナス・フラギ・ＡＴＣＣ４９７
３と比較実験を行なった８その結果、第１表に示す通シ
であった。

第　　　　１　　　　表 以上の通り、水閘Ｂ−０７７１は、標準株であるンユー
ドモナス・７ラギ・Ａ　ＴＣＣ４９７３とよく一致した
。よって水閘をシュードモナス・フライＢ−０７７１と
命名した（微生物受託番号通知１、微生物受託番号［微
工研菌寄第５７０１号、ＦＥＲＭ−ＰＮｏ、５７０１ｊ
）。さらに、水閘を培養して単離、精製された複合活性
酵素の活性測定法、その理化学的性質について述べる。

（１）活性測定法 （ａ）エノイル−ＣｏＡ・ヒドラターゼ活性測定法０．
２Ｍ−トリス−塩酸緩衝液（＋）　Ｊ−１９，０）　　
　０．４　ｍｌＩＭ−Ｋ（Ｊ’　　　　　　　　　　　
　　　　　　Ｏ，１ｍ１４０ｍＭ−ＮＡＤ　　　　　　
　　　　　　　　　Ｏ，Ｉ　ｍ１１５ｍＭ　・パルミト
Ｘ／イ／ｌ／−ＣＯＡ　　　　　　　　　　０．１　ｍ
８１飴牛血清アルブミン　　　　　　　　０．（１５ｍ
ｆｆＯ８２５％ＮＴＢ　　　　　　　　　　　　　Ｏ，
１ｍ１３０　Ｕ　／ｍｌ−シフ＊７−ビ（東洋醸造社製
）　　　　　０．１ｍｌ！１２５ＬＪ／ｍｅ−３−ヒド
ロキソアシル−ＣＯＡ。

テヒドロゲナーゼ（ベーリンガー社製）　　　　　　　
　０．０１ｍｅ刷　　１．、００ｍｅ 上記の組成を有する反応液を３７℃、２分間予備加温し
、これに、酵素液５０μｌを加えて３７’（，１０分間
反応せしめる。反応後これに、０．５係ドデシル硫酸ナ
トリウム２．０ｍｌを加えて反応を停止せしめ、次いで
波長５５０ｎｍにて吸光度（ΔΔ５５０）を測定する。

測定において、１分間に１μｍｏｌｅの還元型ＮＡＤを
生成する酵素量を１単位（ＩＵ）とする。才だ酵素活性
は、次式に従う。

％式％ ０．２Ｍ−）リス−塩酸緩衝液（ｐＨ８，５）　　　　
　　０．５　　ｍｌＩＭ−ＫＣｌ　　　　　　　　　　
　　　　Ｏ，０５ｍｅ４０ｍＭ−ＮＡＪ）　　　　　　
　　　　　　　０．１　　ｍｅ１５ｍへイ・３−ヒドロ
キ／バルミトイル−１％牛血清アルブミン　　　　　　
　　０．０５ｍ／ＴＢ ０、２５％　　　−　　−”　　　　　　　０．１　　
ｍｌｌ＋．’３０ＴＪ／ｍｅーシフ　ホラーセ０．１　
　ｍｌ言＋　　　　　１．００　　ｍ６ 」二記の組成を有する反応′ＫＩｊ．を３７°Ｃ，　　
２分間予備加温し、これに、酵素液５　０　ｐ　ｌを加
えて３７０Ｃ，１０分間反応せしめる。反応後これに、
０．５チドデ／ル硫酸す）　ＩＪウム２。０ｍ７′を加
えて反応を停止せしめ、次いで波長５５０ｎｍにて吸光
度（△Ａ５５０）を測定する。測定において、１分間に
１μｍｏｌｅの還元型ＮＡＤを生成する酵素ｆ４．を１
単位（ＩＵ）とする。また酵素活性は、次式に従う。

（Ｃ）３−ゲトアシルーＣｏＡーチオラーゼ活性測定法
Ｑ．２Ｍ・トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）　　　　　
０．２　　ｍｅｌ　０ｍＭ　　ＣｏＡ　Ｓ．　Ｈ　　　
　　　　　　　　　Ｏ．０５　ｍ１０、２ｍＭ・３−ケ
トバルミトイル−ＣｏＡ　　　　　Ｏ．１　　ｍ１１０
０ｍＭ−ＭｇＣ１２　　　　　　　　　　ｏ．ｌ　ｍｌ
１ｍｈ４−ジチオスライド−”　　　　　　　　　０．
１−　　ｍｅ蒸留水　　　　　　　　　　　　　　０．
４５ｍｌ計　　１．００　ｍ 上記の組成を有する反応液を１．０ｍｌ容石英セルに加
えて３７°Ｃとし、これに酵素液２０μｌを加えて３７
°Ｃにて反応せしめ、反応によって消費される３−ケト
バルミトイル−ＣｏＡの減少を波長３０３ｎｍにて経時
的に吸光度（ＯＤ，。３）測定する。測定において、１
分間に１μｍ　ｏ　ｌ　ｅの３−ケトパルミトイルーＣ
ｏＡを消費する酵素量を１単位（ＩＵ）表する。また酵
素活性は、次式に従う。

１　１００ 酵素活性（Ｕ／ｍｌ）　＝　（１分間当りＯＤ３ｏ、、
　）　ｘ−ｘ　−１８，５２０ （２）酵素作用 １モルのデヒドロアンルーＣｏＡおよび１モルス水から
１モルのヒドロキノアンルーＣｏＡを生成する反応を触
媒するエノイル−ＣｏＡ・ヒドラター七活性、１モルの
ヒドロキノアンル〜ＣｏＡおよヒ１モルのＮ　Ａ、　Ｄ
から１モルのケトアシル−ＣｏＡおよび１モルの還元型
ＮＡＤを生成する反応を触媒Ｊる３〜ヒトロキ７アンル
ーＣｏＡ・デヒドロゲナーゼ活性、１モルのケトアノル
ーＣｏＡおよび１モルのＣｏΔＳＨから１モルのアンル
ＣｏＡおよびｌモ／Ｌのアセチル−ＣｏＡを生成する反
応を触媒する３−ケトアシル−ＣｏＡ・チオラーゼ活性
の各酵素活性を示す。

（３）三種の酵素活性が同−蛋白上にあることの証明シ
ュードモブス・フライ・Ｂ−０７７１の培養物からの菌
体より得られた粗酵素から、数段の精製工程にて精製酵
素を得るもので（後述の複合活性酵素の製造側参照）、
この工程において三鍾類の３　　　酵素活性を前記の活
性測定表に基いて測定した。

その結果第２表に示す通りであった。

第２表 （なお、酵素活性測定値は、その酵素含有液中の蛋白量
を求めて換算した値である） その結果、各酵素活性は、その粗酵素からの各精製工程
での活性の比率にてよく一致しているもので、かつ精製
された酵素もその三種の酵素活性を有していると七から
、この三種の酵素活性は同−蛋白上にあるものと認めら
れる。

さらに後述の製造例の１〜ヨバールＩ（Ｗ−６０カラム
クロマトグラフイーにて得らね、だ精製酵素２．０ｍｇ
を、キャリア・アンホライトを用いる等電点電気泳動に
かけた後三種の酵素活性を、その活性測定法に基いて測
定した結果、ｐＨ４゜９のフラクションに三種の酵素活
性とも単一ピーク上に検出された。

（４）基質特異性 下記の種々の炭素数を有する３−ヒドロギ／アシル−Ｃ
ｏＡを基質として用い、３−ヒドロギアアノルーＣｏＡ
・デヒドロゲナーセ活性ｆｆ１１１定法に従ってその活
性を測定した。

基　質　　　　　　　　　　　　相対活性（チ）３−ヒ
ドロキンカプロイル−ＣｏＡ　　　　　　　　　　　　
５６．５３−ヒドロキシカブリルルーＣｏＡ　　　　　
　　　　　　　　８８゜】３−ヒドロキシカブリルーＣ
ｏＡ　　　　　　　　　　　　　９９．０３−ヒドロキ
シラウリル〜ＣｏＡ　　　　　　　　　　　　１００゜
０３−ヒドロギシミリストイルーＣｏＡ　　　　　　　
　　　　９８゜０３−ヒドロキシバルミトイル−ＣｏＡ
　　　　　　　　　７５．５３−ヒドロキンステアリル
−ＣｏＡ　　　　　　　　　　３０．５３−ヒドロキシ
ラウリルーＣｏＡ　　　　　　　　　　９゜５３−ヒド
ロキシオレイル−ＣｏＡ’　　　　　　　　　　５７．
５３−ヒドロキノリ人レニル−ＣｏＡ　　　　　　　　
　　９９．０さらに本複合活性酵素は、少なくともパ／
Ｌミドエノイル−ＣｏＡ、３−りドパルミトイルー基質
特異性を有する。

（５）至適ｐ）（ 基質として３−ヒドロキンバルミトイル−ＣｏＡヲ用い
、３−ヒドロキノアンルーＣｏＡ・デヒドロゲナーゼ活
性測定法におけるｐ　Ｉ−Ｔをトリス−塩酸緩衝液ｐｌ
−１７．５〜９．５にて変化せしめて活性を求めた。そ
の結果、第１図に示す通り、その至適ｐＨはｐ．Ｈ９付
近であった。

（６）　ｐ　Ｈ安定性 １、　０　ｍ　Ｍの各種緩衝液（　ｐ　Ｉ−１　４〜７
：ジメチルグルタル酸−水酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７
．５〜９ニドリス塩酸緩衝液）に溶解した酵素液（１５
Ｕ　／　ｍｌ　）を３７℃、６０分間放置し７た後その
残存活性を、３−ヒドロキンアンルーＣｏＡ・デヒドロ
ゲナーゼ活性測定法に基いて測定した。

その結果、第２図に示す通りで、ｐＩ（５〜８の範囲で
安定であった。

（７）熱安定性 １０ｍＭジメチルグルタル酸−水酸化ナトリウム緩衝液
（ｐＩ（７，０）に溶解した酵素液（１５Ｕ／ｍｌ）を
各温度で１０分間処理した後その残存活性を３−ヒドロ
キンアンルーＣｏＡ・テヒトロゲナーヒ活性測定法に基
いて測定した。

その結果、第３図に示す通りで、はぼ５０’（、ｉでの
温度に対して安定であった。

（８）等電点 キャリア・アンポライドを用いた焦点電気原動法により
測定した結果、等電点け、ｐＨ４，，９にあった。

（９）金属イオンの影響 ３−ヒドロキンアンルーＣｏＡ・デヒドロゲナーゼ活性
についてその影響を測定した。

０１０）界面活性剤の影響 ３−ヒドロキンアンルーＣｏＡ・デヒドロゲナーゼ活性
についてその影響を測定した。

以上の通り、この複合活性酵素はエノイル−ＣｏＡ・ヒ
ドラタービ活性、３−ヒドロキンアンルー　ＣｏＡ・デ
ヒドロゲナーゼ活性および３−ケトアンルーＣｏＡ・チ
オラーゼ活性を同−蛋白上に有するものである。

さらにとれらの各酵素活性において、用いられる酵素の
活性測定法については、以下の通りである。

・アンル−ＣｏＡ・ンンセタービ活性測定法０．２Ｍ　
リン酸緩衝液（ｐ　Ｈ７゜５）　　　　　　　　　　　
０．２ｍｅ１０ｍＭ　　ＡＴＰ　　　　　　　　　　　
　　　　Ｏｏｌ　ｍ１１０ｍＭ　　ＭｇＣｌ２　　　　
　　　　　　　　　０．１ｍ１１０　ｍ　Ｍ　　ＣｏＡ
ＳＨ０，０５ｍ１５係トリトンＸ　　１００含有１ｍＭ
パルミチン酸溶液　０．２ｍｌ！蒸留水　　　　　　　
　　　　　　　　　　０．３５ｍ１言１　　　１．００
ｍ／’ 上記の組成を有する第１反応液を調整する。

寸だ第２反応液として、下記組成の反応液を調整する。

０．２Ｍ　リン酸緩衝液（ｐＨ７，５）　　　　　　　
　　０．５ｍｅ２０ｍＭＮ−エチル・マレイミド　　　
　　　　　Ｏｌｌ　　ｍ１１５ｍＭ　　４−アミノアン
チピリン　　　　　　　　０．３　　ｍ１０．３％　３
−メチル−Ｎ−エチル−Ｎ−（β−ヒト′ロキ／エチル
）アニリン　　　　　　　　　　　　　　　　０．２５
ｍＡベルオキンダービ（１００ＰＰＵ／ｍ６）　　　　
　　　　０．１　　ｍｌ！０．５係　ナトリウムアジド
　　　　　　　　　　　　０゜１ｍｌアンルーＣＯＡ・
オキ７ダービ（１２０Ｕ／ｍｇ）　　　　０．１　　ｍ
ｌ蒸留水　　　　　　　　　　　　　　　０．５５ｍ６
計　　　２．００ｍｆｆ 上記組成を有する第１反応液に酵素液５０μｌを加えて
３７°Ｃ１１０分間反応せしめる。反応後これを第２反
応液に加えて３７°（，５分間反応せしめ、次いで波長
５５０　ｍｍにて吸光度（△Ａｓ５ｏ）を測定する。寸
だ酵素活性は、次式に従う。

％式％ （ただし、Ｃは酵素液中のアシル−ＣｏＡ・シンセター
ゼの濃度（ｍり／　ｍｌ　）を示す。）・アンルーＣｏ
Ａ・オキンダーセ゛活性測定法０．２Ｍ　　ｈリス塩酸
緩衝液（ｐＩ−１８，０）　　　　　　　　　０．１　
　ｍ１５ｍＭ　　４−７ミ／７’／チピリ／　　　　　
　　　　　　０゜０５ｍｅ３ｍＭ　　ジエチルメタトル
イジン　　　　　　　　　　　０．０５ｍ１！０．５ｍ
ｑ／ｍｌベルオキシダーセ０．０５ｍｇ２５ｍＭ　　バ
ルミトイル−ＣｏＡ、０６０２ｍ１蒸留水　　　　　　
　　　　　　　　　　０．２３ｍｇ計　　０．５０ｍｅ 上記組成を有する反応液に、酵素液１０　ｔｈ　ＩＪを
加えて、３７°Ｃ１１０分間反応させた後０．５ｍ１−
の４Ｍ尿素を加えて反応を停止せしめ、次いでこれに１
係トリトンＸ　−１００の２　ｍｌを加え、波長５４５
朋にて比色し、生成した過酸化水素の量を求める。

酵素活性は、１分間に１７ｚｍｏｌｅの過酸化水素を生
成する酵素量を１単位（］Ｕ）とする。

捷だエノイル−ＣｏＡ・ヒドラターゼ活性測定法３−ヒ
ドロキンアンルーＣｎＡ・デヒドロケナ−セ活性測定法
、３−ケトアンルーＣ０Ａ−チオラーゼ活性測定法は、
前記複合活性酵素における各活性測定法にて述べた方法
と同一方法によるものである。

さらに各反応工程を遂行せしめるに当って　使用される
各酵素活性の量としては反応せ［７めるに充分な酵素活
性を有していればよく、被検液中のＡＴＰの量や反応条
件などに応じて適宜変更すればよく、特に限定されるも
のではない。例えば０．００５〜Ｏ００５ｚｚｍｏｌｅ
のＡＴＰを含有するか、寸たは生成、遊離する被検液に
ついて３７°Ｃ１３０秒〜１０分間反応せしめるに当っ
て、アノルーＣｏＡ・／ンセターゼ活性は通常０．１Ｕ
以上、好寸しくけ０．５〜ＩＵ程度の酵素活性を奏する
酵素の量を用いればよく、才たアシル−ＣｏＡ・オキシ
ダーゼ活性は通常ＩＵ以上、好１しくは５〜１５　Ｕ程
度の酵素活性を奏する酵素の量を用いればよい。

さらに、エノイル−ＣｏＡ・ヒドラターゼ活性、３−ヒ
ドロキンアンルーＣｏＡ・デヒドロゲナービ活性、３−
ケトアシル−ＣｏＡ・チオラーゼ活性、寸たはそれらの
各酵素活性を同一蛋白上に有する複合活性酵素の酵素活
性は通常０．１Ｕ以上、好ましくは１〜２５Ｕ程度の酵
素活性を奏する酵素の量を用いればよい。さらに反応に
要する試薬、例えば■反応工程に要する脂肪酸およびＣ
ｏ　Ａ、　Ｓ　Ｈ、■反応工程に要するＮＡＤ、■反応
工程に要するＣ　ｏ　Ａ　Ｓ　Ｊ（の各試薬の量として
は、被検液中に存在するＡＴＰｏ量と用いる脂肪酸の炭
素数に基いて行なわれるβ−酸化ザイクル数との積に値
する量以上の充分な量にて用いればよく、例えばＡＴＰ
ｏ、０１　μｍｏ　ｌ　ｅの場合には脂肪酸は通常０．
Ｌｚｚｍｏｌｅ程度以上、好ましくは０．５μｍｏｌｅ
程度以上、ＣｏＡＳＨは０．１７＋ｍｏ　ｌ　ｃ程度以
上、好ましくは０．５／４ｍｏｌｅ程度以上、ＮＡＤは
０．１　μｍｏ　ｌ　ｅ程度以上、好寸しくに０．５μ
ｍｏ　ｌ　ｅ以上を用いればよい。

さらに■反応工程において、アシル−ＣｏＡ・オキシダ
ーゼ活性に基づく反応を行なわせしめるに当っては、反
応系に存在する酸素、即ち溶存酸素を利用すればよく、
またＯ反応工程に要する水としても反応系に存在する水
を利用すればよい。さらにアシル−ＣｏＡ・シンセター
ビ活性を良好にせしめるために、マグネ７ウムイオンを
放出できる水溶性マグネ７ウム塩、好捷しくけ塩化マグ
ネシウムを用いればよい。また■反応工程において、ア
ノルーＣｏＡ・オキシダーゼ活性に基いて生成される過
酸化水素を消去することが好捷しく、通常カタラーゼを
用いて過酸化水素を分解、消去せしめればよい。このよ
うにして、少なくとも、脂肪酸、ＣｏＡＳＨＸＮＡＤ、
アシル−ＣｏＡ・シンセターゼ活性、アシル−ＣｏＡ・
オキシダーゼ活性、エノイル−ＣｏＡ・ヒドラターゼ活
性、３−ヒドロキンアンルーＣｏＡ・デヒドロゲナービ
活性、３−ケトアシル−ＣｏＡ・チオラーゼ活性の各活
性を含有するＡ、　Ｔ　Ｐの測定用組成物を調製すれば
よく、捷たは少なくとも、キナーゼ、ＡＤＰお二びキナ
ービ基質用リン化合物のいずれかの２成分、脂肪酸、Ｃ
０ＡＳ　Ｉ−（、ＮＡＤ、アシル−ＣｏＡ・／ンセター
ゼ活性、アシル−ＣＯＡ春オキンター−ビ活性、エノイ
ル−ＣｏＡ・ヒドラターゼ活性、３−ヒドロキシアシル
ＣｏＡ・デヒドロゲナービ活性、３−ケトアンルＣｏＡ
・チオラーゼ活性の各活性を含有する酵素反応系におけ
るキナーゼ活性、ＡＤＰおよびキナービ基質用リン化合
物のいずれか１成分の定量測定用組成物を調製すればよ
い。またこれらの測定用組成物において前記複合活性酵
素を、エノイル−ＣｏＡ・ヒドラターゼ活性、３−ヒド
ロキシアシル−ＣｏＡ・デヒドロゲナーゼ活性、および
３−ケトアシル−ＣｏＡ・チオラーゼ活性の代りに用い
るととが好塘しく、さらに水溶性マグネシウム塩を含有
せしめることが好ましい。さらにこの測定用組成物にカ
タラーゼやＦＡＤ　（フラビンアデニンジヌクレオチド
）を含有せしめることが好ましく、となしてもよく、壕
だ一般に中性ないし弱アルカリ性の水捷たは緩衝液を用
いて溶液となしてもよい。

次いでこのようにして得られた測定用組成物を用いて、
種々の被検液中のＡ　’Ｉ’　Ｐを測定するのであるが
、まず用いられる被検液の量としては通常５μｅ以上を
用いて、測定用組成物の通常１ｍ１以上の溶液に加えれ
ばよく、またその際の反応条件としては、例えば反応温
度は通常３７°Ｃ近辺にて行なえばよい。また反応時間
としては特に限定されるものでなく、反応時間は長時間
とする方がより高感度に変化を生ずるもので、通常２０
秒以上であればよく、好捷しくけ３０秒〜１０分間稈度
である。さらに反応媒体としては用いる各酵素活性の安
定ｐ　Ｉ−１域の媒体であればよく、通常弱酸性ないし
弱アルカリ性、例えばｐＨ６，５〜８．５のリン酸緩衝
液、トリス−Ｈ（Ｊ緩衝液、イミダゾール−Ｈｃｌ緩衝
液、ジメチルゲルタール酸−ＮａＯＨ緩衝液、ピペス（
ＰＩＦＥＳ　）−ＮａＯＨ緩衝液が用いられる。

このようにして反応せしめた後反応において検出できる
変化を測定するのであるが、この検出できる変化とは、
１回のβ−酸化サイクルにて少なくとも１分子の成分を
消費するか、または生成する成分の変化である。簡便に
は反応に用いられるＮＡＤから反応工程によって生成さ
れる還元型ＮＡＤＯ量の変化を検出し、定量測定するこ
とが簡便である。この還元型ＮＡＤの測定子一段として
は、例えば用いるＮＡＤに特異的吸収波長でなく、還−
元型ＮＡＤＫ特異的吸収波長である吸収波長域の波長に
基いて吸光度測定すればよい。ＮＡＤは２６０ｎｍ近辺
に特異的極太吸収波長を有し、還元型ＮＡ、Ｄは２６０
ｎｍ近辺および３４０ｎｍ近辺に特異的極大吸収波長を
有するもので、それ敏速元型ＮＡＤの測定のだめの特異
的吸収波長である吸収波長域としては３２０ｎｍ〜３６
０　ｎ　ｍ近辺であり、好捷しくは３４０ｎｍ近辺の波
長である。との波長により、生成される還元型ＮＡＤの
量を検出できる変化として測定す・る。さらに還元型Ｎ
ＡＤの測定手段としては、還元型Ｎ　Ａ、　Ｄの水素原
子の受容能を有する水素原子伝達系色原体の発色による
方法も挙られる。この還元型ＮＡＤの水素原子の受容能
を有する水素原子伝達系色原体としてはＩＮＴ　％ＭＴ
Ｔ、Ｎｅｏ　−ＴＢＸＮ’ｌ”Ｂ、ＴＮＴＢやＴ　Ｂな
どの水溶性テトラゾリウム塩などの電子受容体が用いら
れ好捷しくけ水溶性テトラゾリウム塩とともにジアホラ
ービを用いて子の電子伝達を良好にせしめたものを用い
ればよい。このこの水素伝達系色原体をあらかじめ前記
の測定用組成物に添加して用いてもよく、捷たは反応後
に添加してもよく、反応後に生成する還元型ＮＡＤはこ
の水素原子伝達系色原体と反応して色の変化を生ぜしめ
、この色調の変化をその吸光波長により吸光度を測定す
ればよい。さらに生成する還元型Ｎ　Ａ　Ｄについて詳
しく述べれば、本発明における０、■、の、■反応工程
にて形成されるβ−酸化サイクルにおいては触媒する酵
素の脂肪酸の炭素鎖長に対する基質特異性から炭素数２
で正寸る。従って炭素数１６個１たは１８個の飽和脂肪
酸であるパルミチン酸やステアリン酸の場合には７サイ
クル捷たは８ザイクルの反応を生じるもので、１モルの
パルミチン酸やステアリン酸から７モルまたは８モルの
還元型Ｎ　Ａ、　Ｄを生成する。さらに炭素数１８の１
つの不飽和結合を有するオレイン酸の場合も８モル比の
還元型ＮＡＤを生成する。このように飽和脂肪酸捷たは
１つの不飽和結合を有する脂肪酸におけるザイクル反応
数は、その脂肪酸の炭素鎖長から反応の正寸る炭素数２
の差を求め、さらにその値をβ−酸化サイクルにおける
炭素数２の〆肖失による２での商を求めた値となるもの
である。

さらに炭素数１８の２つの不飽和結合を有する脂肪酸で
あるリノール酸の場合には、３−ヒドロキンアフルーＣ
ｏＡ・デヒドロゲナーゼ活性の作用における立体異性体
に対する基質特異性のために５モル比の還元型Ｎ　Ａ、
　Ｄを生成して反応が終了する。

寸だ２す、上の不飽和結合を有する脂肪酸を用いる場合
にはエノイル−ＣｏＡ・イソメラーゼや３−ヒドロキン
アンルーＣｏＡエピメラーゼの存在下においてはその立
体異性体に基く基質特異性の影響をうけんいために、前
記と同様に脂肪酸の炭素鎖長による還元型ＮＡＤを生成
するものである。し力・し、２以上の不飽和結合を有す
る脂肪酸を用いる場合にはそのβ−酸化サイクルが２０
秒以内と極めて短時間に終了するために、Ａ　Ｔ　Ｐ定
量に当っては特に好適である。このようにＡ、ＴＰ１モ
ルに対して５モル以上の還元型Ｎ　Ａ　Ｄを生成するも
のであることから高感度にてＡＴＰｉたばＡ″Ｊ″ｐ　
全遊離する酵素反応系の１つの成分を測定できるもので
ある。さらに寸たこの還元型ＮＡＤの別の測定手段とし
て、例えばこの還元型ＮＡＤにレザズリンなどの螢光用
試薬の共存下ジアホラーゼを作用せしめて反応によって
生成する螢光成分の量を定量してもよく、さらにこの還
元型ＮＡＤを基質とする酵素、例えば還元型ＮＡＤ・オ
キシターゼを用いてこの酵素反応に基いて変化する成分
を測定すればよく、好ましくは公知の固定化手段により
固定化酵素として加工せしめ、この固定化酵素を酸素電
極などに具備せしめた還元５１４　Ｎ　Ａ　Ｄ・オキ／
タービ酵素電極を用いることにより１反応系に生成した
還元型ＮＡＤに作用して消費される酸素の量を電気的に
測定することによる還元型ＮＡＤの測定方法も利用でき
るもので、公知の種々の還元型ＮＡＤの定量手段が用い
られる。さらにこの測定された還元型ＮＡＤの量に基い
て、ＡＴＰ含有量が算出され、さらにこのＡ　Ｔ　Ｐ含
有量から被検液中の酵素反応系におけるキナーヒ活性、
ＡＤＰおよびキプービ基質′用リン化合物の定量値が算
出される。さらに前記の還元型ＮＡＤを測定する代りに
反応において消費される酸素の量寸たは生成される過酸
化水素の量を検出できる変化として、例えば酸素電極捷
たは過酸化水素電極による電気的変化にて測定ｌ〜でも
よい。

このようにして、本発明の測定法および測定法に基〈組
成分は、簡便かつ極めて高感度にてＡ、　ＴＰを測定し
得るもので、さらにＡ、　Ｔ　Ｐを遊離せしめる種々の
被検液中の成分の測定のために利用できる良好なもので
、例えばクレアチンホスフェ１、ピルベートキナーゼや
アセテートキナーセなどのｍ　素活性やクレアチンホス
フェ−１１エノ−ノンホスホピルベート、アセチルホス
フェ−１・やＡＤＰの定量において、簡便かつ高感度に
て正確に測定し得るものである。

次いで本発明の実施例および酵素の製造例を挙げて具体
的に述へるか、本発明はこれらによって何んら限定され
るものではない。

実施例　１ 〔脂肪酸の選択〕 ０、５　Ｍ−イミダゾ−／Ｌ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＩ（７
，０）　　　０．１．　ｍ１４０ｍＭ　−ＮＡＤ　　　
　　　　　　　　　　　０．０５ｍ１゜４０ｍＭ　−Ｃ
ｏＡ　ＳＨＯ，０５ｍ１５０ｍＭ−ＭｇＣ１２０，０８
ｍ１ １０ｍＭ−ＡＴＰ　　　　　　　　　　　　　　０．１
ｍｅ］、　ｍＭ−Ｆ　ＡＤ　　　　　　　　　　　　　
　　Ｏ，０１ｍｅアシル−ＣｏＡ・／ンセターヒ活性含
有液（東洋醸造社製、６０　Ｕ　／ｍｌ　）　　　　　
　　　　　　　０．０２ｍｌ！アンルアンＯＡ・オキシ
ダーセ活性含有液（東洋醸造社製、１５０　Ｕ／Ｉ＋Ｉ
ｌ）　　　　　　　　　　　０．１　ｍｅ複合活性酵素
活性含有液（エノイル−ＣＯＡ・ヒドラタービ活性４０
０　ＴＪ／ｍｌ、　３−ヒト０キシ７’／、／１ｚ−Ｃ
ｏＡ−デヒドロゲナーゼ活性２００Ｕ／ｍｌ、３−ケト
７７）１７−ＣｏＡ　。

チオラーゼ活性１６８Ｕ／ｍｌ；東洋醸造社製；後述の
複合活性酵素の製造側参照）　　　　　　　　　　　　
　　Ｏ，’Ｌｍｌカタラーゼ（ベーリンガー社製、　２
６００００Ｕ／ｍｆｆ）　　　０．０２ｍｆｆ精製水　
　　　　　　　　　　　　　　　　０．４２ｍｇ合　言
」　　　　　１．、Ｑ　　ｍｌ 上記組成を有する反応液１’：Ｏｍｉに、０．５ｍＭパ
ルミチン酸、オレイン酸、リノール酸の各種脂肪酸含有
液２０μｌを各々添加して３７℃にて反応せしめ、添加
後反応液における生成する還元型ＮＡＤＯ量を３４０　
ｎ　ｍの吸光度の増加の経時変化として測定した。その
結果は第４図に示す通りで、第４図中実線（−）はりノ
ー７−酸の場合、点線（−−−）　ｆｄパルミチン酸の
場合、一点鎖線←−−−）はオレイン酸の場合を示すも
のである。その結果、パルミチン酸、オレイン酸の場合
には、約６０〜７０ヂの増加せてＵ、速く反応が進行す
るが、終点に達する捷てに３〜４分を必要とした。才だ
、リノール酸の場合は約２０秒以内の極めて短時間に終
点に達したものであり、この結果からＡＴＰ含有被検液
による還元型ＮＡＤに変換するにはリノール酸を用いる
ことが特に短時間で効率よくなし得るために好捷しいと
判断され、かつ３０秒程度の反応時間にて充分測定でき
るものと判断された。

〔リノール酸を用いるＡＴＰの定量〕

前記の反応液におけるＡＴＰの代りにリノール酸を用い
てＡ　１１’　Ｐ測定用組成物を調製した。即ち下記の
組成を有する反応液を調製した。

０．５Ｍ−イミダゾール−ＨＣｌ緩衝液（ｐｉ−１７，
０）　　　０．１ｍ１４０ｍＭ　−ＮＡＤ　　　　　　
　　　　　　　　０．０５ｍ１４０ｍＭ　−ＣｏＡ　５
Ｉ−１０，０５ｍｇ５０ｍＭ−ＭｇＣ１２０，０３ｍ１ １０ｍＭ−リノ−・・１．酸（２％　Ｔｒ　ｉ　ｔｏｎ
　Ｘ−１００に溶解）０．１ｍ１ １ｍＭ−ＦＡＤ　　　　　　　　　　　　　　　０．０
１ｍ／！アシルーＣｏＡ・シンセダーゼ活性含有液（６
０Ｕ／ｍＪ）０．０２ｍ１ アシル−ＣｏＡ・オキシダーゼ活性含有液（１５００７
ｍｌ）０．１ｍ／ 複合活性酵素含有′ｇＩｊ（エノイル−ＣｏＡ・ヒドラ
ターゼ活性４００Ｕ／ｍ／’！、３−ヒドロキシアンル
ーＣｏＡ・デヒドロゲナーゼ活性２００　Ｕ／ｍｌ、　
　３−ケトアンルーＣｏＡ・チオラーゼ活性１６３Ｕ／
ｍｌ）　　　　　　　　　　　　Ｏｏｌ　ｍｅカタラ−
セ（２６００００Ｕ／ｍＡ　）　　　　　　　　　　　
　０．０２．ｍｌ精製水　　　　　　　　　　　　　　
　　　０．４２ｍ１合計　　１゜Ｏｍｌ この反応液１．Ｏｍｌに、ＡＴＰ含量０〜０．４ｍＭの
秤々の濃度のＡＴＰ溶液２０μｌを加えて、３７０Ｃ１
１分間反応せしめ、次いで反応終了後反応によって生成
された還元型ＮＡＤＯ量を波長３４．０ｎｍでの吸光度
として測定した。その結果、第５図に示す通りで、良好
なＡＴＰの検量曲線が得られた。寸だその結果に基いて
還元型ＮＡＤのミリ吸光係数から計算するとＡ　Ｔ　Ｐ
に対して５モル比の還元型ＮＡＤが生成さ力、たもので
あった。

実施例　２〔クレアチンキナービ活性測定〕０．５Ｍ−
イミダゾール−ＨＣＩＪ緩衝液（ｐｌ（７，０）　　　
０．１　ｍｅ４０ｍＭ　−ＮＡＤ　　　　　　　　　　
　　　　０．０５＋ｙ＋６４　０　　＋ｎＭ　　−Ｃｏ
　Ａ　５Ｉ−１０，０５ｍｇ５０ｍＭ−Ｍ　ｇ　Ｃ１２
０，０３ｍ１１０ｍＭ−リノール酸（２％Ｔｒ　１ｔｏ
ｎ　Ｘ−１００に溶Ｗｒ）０Ｉｍ１ １　ｒｎＭ−Ｆ　Ａ　Ｄ　　　　　　　　　　　　　　
　Ｏ，０１ｍｅアアンーＣＯＡ・ンンセダーゼ活性１１
ｔＩ　（６０ｖ　７ｍ１）０．０２ｍ１ アンルーＣｏＡ・オキシダーゼ活性含有液（１５０Ｕ／
ｍｌ）　　　０．１　ｍｌ複合活性酵素含有液（エノイ
ル−ＣｏＡ・ヒドラターゼ活性４００　Ｕ／ｍｅ！、　
　８−ヒドロキシアンル〜ＣＯＡ・デヒドロゲナーゼ活
性２００　Ｕ／ｒｎｆ　３−ケトアンルーＣｏＡ・チオ
ラーゼ活性１６３Ｕ／ｍ／？）　　　　　　　　　　　
　　　０．１　ｍｅカタラーゼ　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　０．０２ｍ１帆５Ｍ　β−メ
ルカプトエタノール　　　　　　　　　　０．０１ｍ／
！］、　ＯｍＭ　　ＡＤＰ　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　０．１　ｍ１ｉ０．２Ｍ　クレアチンポ
スフェート　　　　　　　　　　　０．２ｍ１合　言」
　　　　　１．０　ｍｌ 上記の組成を有する反応液１．０ｍ１ｉに、クレアチン
キナービ（ベーリンガー社製；表示活性３８０Ｕ　／　
ｒａｇ）の１　／Ｚ　ｆｌ　／ｍｌの溶液５μ４を添加
し、３７℃にて反応せしめた。反応後反応によって生成
する還元型ＮＡＤの量を波長３４０ｎｍの吸光度にて経
時的に測定した。

その結果を第６図に示す。寸たこの結果から１分間あた
りの吸ゲＣ度増加は０．０８４であり、この値からクレ
アチンキナーセ活性を求めると２２２．ＯＵ　／　ｍ９
であった。なお算出式は以下の通りである。

また上記のクレアチンキナーヒ含有被検液の代りにＡ、
　Ｄ　Ｐ含有被検ａを用い、かつその反応液におけるＡ
ＤＰの代りにクレアチンキナーゼを用いることにより、
簡便にＡＤＰ定量用反応液が得られる。またクレアチン
ホスフェートを被検液として上記のクレアチンキナーゼ
被検液の代りに用いかつその反応液におけるクレアチン
ホスフェートの代すにクレアチンキナーゼ゛を用いるこ
とにより、簡便にクレアチンホスフェート定量用反応液
が得られる。

実施例　３〔ピルベートキナーゼ活性測定〕下記組成を
有する反応液１．Ｏｍｌに７クマ社ピルベートキナーゼ
（タイプＩｆｆ）Ｏｏｌ、　Ｕ　／　ｍ、ｌの溶液を５
〜２０　ｔｔ　ｌ添加して反応を開始し、３７℃で３４
０ｎｍにおける吸光度の増加を経時的に測定した。３分
間から４分間寸での１分間あたりの吸光度の増加と、ピ
ルベートキナーゼ量との関係を第７図に示した一０第７
図から明らかな通シ酵素量と吸光度の増加とは良好な直
線関係が得られた。

０．２Ｍ　　）リエタノー）Ｌ−７ミン緩衝液（ｐＨ７
，５）　　　０．１５ｍ／！］、ＯｍＭ　　ホスホエノ
ールピルビン酸　　　　　　　　０．０５　ｍｅ２５ｍ
Ｍ　　ＭｇＣｄ２　　　　　　　　　　　　　　　０．
１　ｍ１１００ｍＭ　　ＭＣ１０，１ｍ１ ５０ｍＭ　　Ａ、ＤＰ　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　Ｏ６１ｍ１１０ｍＭ　　ＣｏＡＳＨＯ，０ＦＩ
Ｉ／！１０ｍＭ　　リノール酸（２％ＴｒｉｌｎｎＸ−
１００に溶Ｍ）Ｑ、１ｍ／？ ４０ｍＭ　　ＮＡＤ　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　０．０５ｍ、ｅ］、　ｍＭ　　Ｆ　ＡＤ　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　０．０１ｍ６７シル
ーＣｏＡ　−シンセタービ活性含有液（６０Ｕ／ｍｅン
　　０，０２ｍｇ７　／ルー　ＣｏＡ　・オキ／ダーゼ
活性含有液（１５０Ｕ／ｍ１）０．１　ｍｌ複合活性酵
素含有液（エノイル−ＣｏＡ・ヒドラターゼ活性４００
　ＴＪ／ｍｅ、　　３−ヒドロキシアシル　ＣｏＡ・デ
ヒドロゲナーゼ活性２００　Ｕ／ｍ１３．　３〜ケトア
ンルーＣＯＡ・チオラーゼ活性１６３［Ｊ／ｍ／ｌ’）
　　　　　　　Ｑ、１　ｍｌ！合計　１，０ｍ１３ 実施例　４〔アセチルホスフェートの定量〕下記組成を
有する反応液１．□ｍｌに０〜０．３　ｍ　Ｍの種々の
濃度のアセチルホスフェ−１溶液２０μｇを加えて、３
７°Ｃ１０分間反応を行なった後、反応によって生成さ
れた還元型ＮＡ、Ｄ量を波長３４．０ｎｍでの吸光度と
して測定し７た。その結果を第８図に示した。

０．２Ｍ　　）　Ｉ）エタ、ｙ−ル７ミ７緩衝液（ｒ）
Ｈ７，４）　　　０．２　ｍ１１０ｍＭ　　ＡＤＰ　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．１　ｍ１１
０ｍＭ　　リノール酸（２％ＴｒｉｌｏｎＸ−１００に
溶解）０．１０ｍｇ １ｍＭ　　ＦＡ、Ｄ　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　Ｏ，０１ｍＪ７シルーＣｏＡ　・’／：ｙセ
ターＨ活性含有液（６０Ｕ／ｍｇ）　　　０．０２ｍ４
ア／ルーＣＯＡ・オキシダーゼ活性含有液（１５０Ｕ／
ｍｅ）　　０．１　ｒｎｌ複合活性酵素含有液（エノイ
ル−ＣｏＡ・ヒドラターゼ活性４００　Ｕ　／ｍｌ！、
　　３−ヒドロキ／アシル−ＣｏＡ・デヒドロゲナービ
活性２００　Ｕ　／ｍｌ、−３−ケトアシル−ＣｏＡ　
”チオラーゼ活性１６３　Ｕ／ｍｌ）　　　　　　　　
　　　　　０．１．　ｍｅアセテートキナーゼ（シグマ
社２３０　Ｕ／ｍｌ　）　　　　　　０．０５ｍｅ精製
水　　　　　　　　　　　　　　　　０．１９ｍｇ合　
言１　　　　１．Ｏｍｌ 実施例　５［ＡＤＰの定量］ 下記組成を有する反応液１．０ｍｅに０〜０．５ｍ’Ｍ
の種々の濃度のＡＤＰ溶液２０　ＩＩ　ｌを加えて、３
７℃５分間反応を行なった後、反応によって生成された
還元型ＮＡＤ量を波長３４０　ｎ　ｎ］での吸光度と１
〜で測定した。その結果、第９図に示す通りの良好なＡ
ＤＰの検量線が得られた。

０．２Ｍ　ピペス−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７，２）　　
　　０．２　ｍ１４、０ｍＭ　　ＮＡＤ　　　　　　　
　　　　　　　０．０５ｍ１４０ｍＭ　　ＣｏＡ、ＳＨ
Ｏ，０５ｄ ５０ｍＭ　ＭｇＣｌ２０．０３ｍ１ １０ｍＭ　　リノ−１１ｚ酸（２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１
００に溶解）０．１ｍｅ １ｍＭ　　ＦＡＤ　　　　　　　　　　　　　　　Ｏ，
０１罰１、ＯｍＭホスホエノ〜、・Ｌ・ピルビン酸　　
　　　　　　　　０−１ｍｅアシル〜ＣＯＡ・シンセタ
ービ活性含有液（６０Ｕ／ｍｅ）　　　０．０２ｍｇア
シ／ｌ／−ＣｏＡ・オキ／ダーゼ活性含有液（１５０Ｕ
／ｍｇ）　　０．１　ｍｌ！複合活性酵素含有液（エノ
イル−ＣｏＡ・ヒドラターゼ活性。

４００ＴＪ／ｍｌ、　８−ヒドロキシアンルー〇〇Ａ・
デヒドロゲナーゼ活性２００　Ｕ　７ｍ、ｌ、　　３−
ケトアンルーＣｏＡ・チオラービ１６３　Ｕ／ｍｇ）　
　　　　　　　　　　　　　　０，１−　ｍｌピルベー
トキナーゼ　　（４５Ｕ／ｍ／）　　　　　　　　　　
０．１　ｒｄ精製水　　　　　　　　　　　　　　　　
　ｏ、１４　ｍｅ合計　１．、Ｏｍ／ 〔複合活性酵素の製造例〕 ５００ｍｅ容三角フラスコに１００ｍｔ′の培地（培地
組成：ペプトン１．５　％、粉末酵旬エキス０．５　％
　、Ｉ＜ｃｌｏ、２　　％　、　　　Ｎ　　ａ　Ｃｌ　
０．１％　　、　　Ｋ、、　　Ｉ−Ｉ　　ＰＯ４０，１
％　　、　　Ｍｇ　　８０４０．０５％、オレイン酸０
．７５％、ｐＨ７，０；　１５本分）を入れ、１２０°
Ｃで加圧滅菌した後３０〜にて、シュードモナス・フラ
イ・Ｂ−０７７１（ＦＥＲＭ−Ｐ　Ｎｏ、　５７０１　
）を接種し、ロータリーンニーカーにて２０時間培養し
た。次いでこの培養物を併合し、５０００ｒｐｍ、２０
分間遠心分離して培養菌体を得た。さらに得られた菌体
を１．５０＋ｙリゾチ一ム含有１０＋ｎＭリン酸緩衝＠
　（ｐ　Ｈ７，０）　３６０＋＋＋Ｊに加えて可溶性の
和製の複合活性酵素含有液（３−ヒドロキシアンル−Ｃ
ｏＡ・デヒドロゲナーゼ活性にて、その比活性は３．０
Ｕ／ｍりであった。）３４０ｍ／１１を得た。

得られた和製の複合活性酵素２９０ｍｅを氷槽中で冷却
後、予め一２０°Ｃに冷却したアセトン２９０ｍｆｆを
添加し、生じた沈澱物を回収し、これを］　Ｍｌ＜Ｃ１
含有１０ｍＭ）リス−塩酸緩衝液（−ｐ　Ｈ７，５）に
溶解し、さらに１．２０００　ｒ　ｐ　ｍ、１０分間遠
心分離して不溶物を除去した。得られた上清液の４５ｍ
ｅを分取し、これに２２．５ｍｇの飽和硫安溶液（ｐｌ
−Ｔ７．０）を添加し、生じた沈澱物を１２０００ｒｐ
ｒｎ。

１０分間遠心分離にて除去した。次いで得られた上清液
５７ｍ１に、さらに飽和硫安溶液２８ｍ１を加えて沈澱
せしめた。この沈澱物を回収１−だ後、ＩＭＫＣＩ含有
１．０　ｍ　Ｍ　）リス−塩酸緩衝液（ｐｌ（７，５）
の１．　Ｏｍｅに溶解し、１０　ｍ　Ｍ　）　’）スー
塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）　２．０　ｄＫ対して４℃で
２０時間セルロースチューブにて透析脱塩し、次いでこ
れを凍結乾燥して、複合活性酵素粉末（３−ヒドロキ／
アシル−ＣｏＡ・デヒドロゲナーゼ活性にて、その比活
性は］、８．２　Ｕ　／　ｍｇ　テあった）７’１ｍｇ
を得た。

さらに得られた複合活性酵素粉末（３−ヒドロキンアシ
ル−ＣｏＡ・デヒドロゲナービ活性にて、この比活性は
１８，２　Ｕ　／　ｍｇ　テあった。）７７ｍ２を２０
ｍ１の水に溶解し、これを、１０ｍＭトリス−塩酸緩衝
液（ｐＨ７，５）で平衝化したＤＥＡＥ−セファロース
ＣＬ−６Ｂ（ファルマシア社製）のカラム（３ｘ　１１
　ｃｍ、　）にチャージして吸着せしめ、同上緩衝液に
てカラムを洗浄した。次いで５００ｍｅの同上緩衝液と
０．４ＭＩ＜ＣＩを含んだ同上緩衝液５００′ｍｅにて
作製した直線濃度勾配法による溶出を行なった。’５２
ｍｅ／時間の流速で、ｅｍｅづつ分取し、各分画の酵素
活性を測定し、その活性画分（Ｎｏ、７１〜８０）９０
ｍ／４を得た（３−ヒドロキンアンルーＣｏＡ・デヒド
ロゲナーゼ活性にて、その比活性は３０、ＯＵ／ｍ２で
あった）。さらにこの活性画分を、１０ｍＭリン酸緩衝
液（ｐｌ−１７，５）２ｄに対して透析した後、ハイド
ロキノアパタイトゲルを充填したカラム（２Ｘ１０ｃｍ
）にチャージして吸着せしめた。３００ｍｅ（０１０ｍ
　Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，５）と３００　ｍ、ｌの０
．５Ｍリン酸緩衝液（ｐ　Ｉ−１７，５）とにて作製し
た直線濃度勾配法により溶出を行なった。

３３ｍ１／時間の流速で５　ｍｅづつ分取し、各分画の
酵素活性を測定し、活性画分（Ｎｎ４６〜６２）８５ｍ
ｌを得た（エノイルアンルーＣＯＡ・ヒドラターセ活性
の比活性は２１０．３Ｕ／ｍ２．３−ヒドロキシアンル
ーＣｏＡ・デヒドロゲナービ活性の比活性は１０５Ｕ／
ｍ９．３−ケトアフルーＣＯＡ・チオラーセ活性の比活
性は８５．６Ｕ／ｍ９であった）。次いでこの活性画分
を、限外濾過膜（アミコン社製ＸＭ−５０）を用いて濃
縮後、これを、トヨパール［ＩＷ−６０（東洋曹達社製
）を充填したカラム（１，１ｘ９０ｃｍ）にチャージし
てゲルｐ過した（溶媒：１０１１１　Ｍ　トリス−塩酸
緩衝液ｐＨ７，５，０，５ＭＩ（Ｃｌ）。

３．５ｍ、ｌづつ分取し、活性画分（Ｎｏ、　２８〜２
７　）１７．５ｍｌを得、これを凍結乾燥して精製され
た複合活性酵素を得た（３−ヒドロキシアンルーＣｏＡ
・デヒドロゲナーゼ活性にて、その比活性はｘ１ｏＴＪ
／ｍｙであった。収量２０ｍｇ）。

【図面の簡単な説明】

第１図はシュードモナス・フライ・Ｂ−０７７１（ＦＥ
ＲＭ−ＰＮロ５７０１）から得られた複合活性酵素の３
−ヒドロキシアシル−ＣＯＡ・デヒドロゲナーゼ活性の
至適ｐ　Ｉ−１を示す曲線を示し、第２図は該複合活性
酵素の３−ヒドロキシアシルー〇ｏＡ・デヒドロゲナー
ゼ活性のｐＨ安定性を示す曲線を示し、第３図は該複合
活性酵素の３−ヒドロキシアシルーＣｏＡ・デヒドロゲ
ナーゼ活性の熱安定性　　へ娘 を示す曲線を示し、第４図は各種脂肪酸による還　　−
元型Ｎ　Ａ　ＤＯ量の増加の経時変化を示し、第５図　
　駅Ｕ　Ａ、　Ｔ　Ｐの検量曲線を示し、第６図はクレ
アチン　　切キナーヒによる還元型Ｎ　Ａ、　Ｄの量の
増加の経時質　　ｐ化を示し、第７図はビルベートキナ
ーヒ活性に対　　年する還元型Ｎ　Ａ、　Ｄの量の増加
によるビルベ−トキナ−ヒ活性測定としての検量線を示
し、第８図は、アセチルホスフェートの検量線を示し、
第９図はＡＤＰの検量線を示す。 特許出願人　東洋醸造株式会社 代表者　伊東富士馬 第１図 ７．５　　　　８　　　　　　８，５　　　　９　　　
　　　９．５ｐＨ 第２図 ４　　　　５　　　　６　　　　７　　　　８　　　　
９第　　、　　図 （６Ｃ） 第　　４　図 ０　　　］−２３４ 反応時間（分） 第５図 ０　　　　　　２　　　　　　４　　　　　　６８ＡＴ
Ｐ　　（ｎ　ｍｏｌｅｓ） 第。図 ０　　　　　　　］、　　　　　　　２　　　　　　３
　　　　　４　　　　　　５反応時間（分） 第７図 ０　　　　　　　　　　　　１０　　　　　　　　　　
　２０ビルベートキ址ゼ（Ｓ） 第８　図 ０　　　　２　　　　４　　　　６ ７　セチル；Ｉ−、ス７工１゛（ｎ　ｍｏｌｅｓ）第９
図 ０　　　　２　　　４　　　　６　　　　８　　　　１
．０ＡＤＰ　（ｎ　ｍｏｌｅｓ） 手続補正１ 昭和５９年２月２２日 昭第１１５７年特許願第２／９乙３乙号、１．　　発明
の名称 ＡＴＰの新規定量法 ３　補正をする者 事件との関係　特許出願人 ｔ　補正命令の日セ］ 自　　　発 夕　補正の対象 訂正する・

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）被検液中のＡ　Ｔ　Ｐを定量するに当り、下記の
   反応工程■、■、■、■、■ ■　キナーゼ、Ａ、ＤＰおよびキナーゼ基質用リン化合
   物からＡ　’Ｉ’　Ｐを遊離させるか、Ａ　ＴＪ−’を
   含有している被検液に脂肪酸を作用させてアブルーＣｏ
   Ａとする反応工程、 ■　アブルーＣｏＡをデヒドロアンルーＣｏＡにする反
   応工程、 ■　デヒドロアンルーＣｏ　Ａ　ヲヒドロキシアンル−
   ＣｏＡにする反応工程、 ■　ヒドロキシアブルーＣｏ　Ａ　ｆ　’ｙ　）アブル
   ーＣｏＡにする反応工程、 ■　ケトアンルーＣｏＡをアシル−ＣｏＡにする反応工
   程、 および検出できる変化を測定する工程を有することを特
   徴とする定量法。　　　　　　　（３２）反応工程にお
   いて、 ■反応工程が、キナーゼ、Ａ　Ｉ）　Ｐおよびキナーゼ
   基質用リン化合物からＡＴＰを遊離させるか、含有して
   いる被検液のＡＴＰと、脂肪酸とＣ０ＡＳＨおヨヒアシ
   ルーＣｏＡ・シンセターゼ活性に基〈反応工程、 ■反応工程が、アシル−ＣｏＡ、酸素およびアブルーＣ
   ｏＡ・オキノダーゼ活性に基く反応工程、 ■反応工程が、デヒドロアンルーＣ”　ｏ　Ａ、　、水
   およびエノイル−ＣｏＡ・ヒドラターゼ活性に基く反応
   工程、 ■反応工程が、ヒドロキシアブルーＣｏＡＸＮＡＤおよ
   び３−ヒドロキ／アシル−ＣｏＡ・デヒドロゲナーゼ活
   性に基く反応工程、 ■反応工程が、ケトアシル−Ｃｏ　Ａ、　Ｃｏ　Ａ　Ｓ
   　Ｈおよび３−ケトアシル−ＣｏＡ・チオラーゼ活性に
   基く反応工程である特許請求の範囲第１項記載の定量法
   − １）　■、■および■反応工程が、エノイル−ＣｏＡ・
   ヒドラターゼ活性、３−ヒトロキ゛／アンルーＣｏＡ・
   デヒドロゲナーゼ活性および３−り−トア／ルーＧ）Ａ
   チオラーゼ活性の各酵素活性を同一蛋白」二に有してな
   る複合活性酵素の酵素活性に基く反応工程である特許請
   求の範囲第１項才だけ第２項記載の定量法。 （４）　　複合活性酵素が、７ユードモナス・フライに
   属する複合活性酵素生産菌から得られた酵素である特許
   請求の範囲第３項記載の定量法。 （５）　　ソニー）・モナス・フライに属する複合活性
   酵素生産菌が、ンユードモナス・フライ・Ｈ−０７７１
   菌である特許請求の範囲第４項記載の定量法。 （６）検出てきる変化を６１り定する工程か、反応工程
   によって生成する還元型Ｎ　Ａ、　ＪＪＱ量を別事する
   工程である特許請求の範囲第１項、第２項斗たは第３項
   記載の定量法。 （７）　　生成する還元型Ｎ　Ａ、　Ｊ）の量の定量が
   、Ｎ　Ａ、　Ｄに特異的吸収波長でなく、還元型Ｎ　Ａ
   　Ｊ）に特異的吸収波長である吸Ｉヌ波長域の波長によ
   る定量である時π１請求の範囲第６項記載の定量法。 （８）吸収波長域の波長が、３２０　ｎ　ｍ〜３６０　
   ｎ　＋ｎ近辺である特許請求の範囲第７項記載の定量法
   。 （９）　　吸収波−長域の波長が、３４・Ｏｎｍ近辺で
   ある特許請求の範囲第８墳記載の定量法。 （１０）　　生成する還元型Ｎ　Ａ　Ｉ）の量の定量が
   、還元型Ｎ　Ａ、　］）の水水素子の受容能をイ１する
   水素原子伝達系色原体の発色による定量である特許請求
   の範囲第７　ｇｉ記載の定量法。 （Ｊｌ）還元型Ｎ　Ａ　Ｄの水素原子の受容能を有する
   水素原子伝達系が、ジアホラーゼおよび水溶性テトラゾ
   リウｌ、塩を含有する水素原子伝達系である特許請求の
   範囲第１０項記載の定量法。 （１２）被検液中の成分が、Ａ　’Ｊ”　Ｐである特許
   請求の範囲第１項ないし第１１項のいずれかの項にｂ記
   載の定量法。 （１３）被検液中の成分が、キナーゼ、ＡＩＪＰおよび
   キナーゼ基質用リン化合物から遊離されるＡＴＶである
   特許請求の範囲第１項ないし第１．１項のいずれかの項
   に記載の定量法。 （１４）キナーゼｐ測定、ＡＩＪＰの測定およびキナー
   ゼ基質用リン化合物の測定のいずれかの１つの成分の６
   １］］定である特許請求の範囲第１３項記載の定量法っ （１５）キナーゼの測定が、クレアチ／ギナーセ、ビル
   ベートキナーセ、アセテートキプーーゼの乙用定である
   特許請求の範囲第１４項記載の定量法。 （１６）キナーゼ基質用リン化合物が、クレアチンホス
   フェート、ホスホエノールピルベ−１・、アセデルホス
   フェートの測定である特許請求の範囲第１４項記載の定
   量法。 （１７）少なくとも、下記組成 ・キナーゼ、Ａ　Ｉ）　Ｐおよびキナーゼ基質用リン化
   合物のいずれか２つの成分、 ・脂肪酸、 ・ＣｏＡＳｌ（、 ・Ｎ　Ａ　］）、 ・アノルーＣｏＡ・／ンセターセ活性、・ア／ルーＣＯ
   Ａ中オキノダーゼ活性、・エノイル−ＣｏＡ・ヒドラタ
   ーゼ活性、・３−　ヒト「１キンア／ルーＣＯＡ・デヒ
   ドロゲナーゼ活性、 中３−ケトア／ルーＣｏＡ・チオラーゼ活性、を含有す
   る特許請求の範囲第１項ないし第１６項のいずれかの項
   記載の定量法。