JPS5851896A - ジペプチドエステルとアミノ酸エステルとの付加化合物の回収法 - Google Patents
ジペプチドエステルとアミノ酸エステルとの付加化合物の回収法Info
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- JPS5851896A JPS5851896A JP14875481A JP14875481A JPS5851896A JP S5851896 A JPS5851896 A JP S5851896A JP 14875481 A JP14875481 A JP 14875481A JP 14875481 A JP14875481 A JP 14875481A JP S5851896 A JPS5851896 A JP S5851896A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
に詳しくはこの付加化合物及び蛋白分解酵素を含む水性
懸濁液からこの付刀日化合物却媛牛件スウキー．？よび
酵素を回収する方法に関 するものである。
懸濁液からこの付刀日化合物却媛牛件スウキー．？よび
酵素を回収する方法に関 するものである。
ジペプチドエステル、例えばＮ−ペンジルオキルアラニ
ン低級アルキルエステルとの付加化合物は例えば甘味剤
であるα一ＬーアスバルテルーＬ一フェニルアラニン低
級アルキルエステルへの中間体などとして有用な化合物
でめる。
ン低級アルキルエステルとの付加化合物は例えば甘味剤
であるα一ＬーアスバルテルーＬ一フェニルアラニン低
級アルキルエステルへの中間体などとして有用な化合物
でめる。
この様な付，叩化合物は、例えばアミノ酸エステルとＮ
−保護アミノジカルボン酸を水性媒体中蛋白分ｙｌ１ｌ
！＃累の存在ドでノ又尾、きせることによって得られる
（ ｌ＋！｝開１１８ ５ ３− ９ ２ ７ ２ ９
、特開昭５４−９ ２ ２ ６） ｕこの反応でほ何カ
［１化合物は水性媒体中へ同相となって析出する。そ［
〜で水性媒体中には使用した酵素がなおそのほとんどの
活性を維持した寸゜ま温存する。従ってこの様な水性混
合液から付加化合物及び酵素をいかに効率よく回収する
かは極めて重要な昧題である。
−保護アミノジカルボン酸を水性媒体中蛋白分ｙｌ１ｌ
！＃累の存在ドでノ又尾、きせることによって得られる
（ ｌ＋！｝開１１８ ５ ３− ９ ２ ７ ２ ９
、特開昭５４−９ ２ ２ ６） ｕこの反応でほ何カ
［１化合物は水性媒体中へ同相となって析出する。そ［
〜で水性媒体中には使用した酵素がなおそのほとんどの
活性を維持した寸゜ま温存する。従ってこの様な水性混
合液から付加化合物及び酵素をいかに効率よく回収する
かは極めて重要な昧題である。
上述した方法では何列１化合物を１過によって回収して
いるが酵素の回収は行っていない。
いるが酵素の回収は行っていない。
−万水と二Ａ成することのできる有機溶媒を反応終了液
に加えて付加化合物ケ鹸解抽出し、これを／ＰＴ機浴媒
申の均一液として分離し、水相から酵素？回収すること
は知られている＜ｖｊ開昭５４− １． １ ２ ９
５ ）。しかしながら抽出を効率よく行′）ためにＣ・
ゴ水と二相を形成することができるとｆａｉｌ時に付方
ｌ化合物に対する溶解力の大きい有機溶媒全便ｙ＋１す
る必要があるが、この様な有機溶媒としては、酢酸エチ
ル号のエステル類やクロロホルム、二鳩化エタン等のハ
ロゲン化アルキル類寺比較的限られている。ところがエ
ステル類については、加水分解の問題があり、またハロ
ゲン化アルキル類については近年発ガン性が問題になっ
ている折から食品等の原料となる付加化合物の処理工程
においては、極力その使用を避けることが望ましい。
に加えて付加化合物ケ鹸解抽出し、これを／ＰＴ機浴媒
申の均一液として分離し、水相から酵素？回収すること
は知られている＜ｖｊ開昭５４− １． １ ２ ９
５ ）。しかしながら抽出を効率よく行′）ためにＣ・
ゴ水と二相を形成することができるとｆａｉｌ時に付方
ｌ化合物に対する溶解力の大きい有機溶媒全便ｙ＋１す
る必要があるが、この様な有機溶媒としては、酢酸エチ
ル号のエステル類やクロロホルム、二鳩化エタン等のハ
ロゲン化アルキル類寺比較的限られている。ところがエ
ステル類については、加水分解の問題があり、またハロ
ゲン化アルキル類については近年発ガン性が問題になっ
ている折から食品等の原料となる付加化合物の処理工程
においては、極力その使用を避けることが望ましい。
−万句加化合′吻に対する溶解力が小さい有機溶媒の場
合には、人情に使用することが必要で経済」二問題があ
る。
合には、人情に使用することが必要で経済」二問題があ
る。
本発明者らはこの様な問題点を解決するため、酵素の回
収を同時に行う伺刀０化合物の分離法について工業的に
更に有利な方法を、鋭意検討した結果、慧外にも水相と
有機溶媒相との二液相系においでイ」刀日化合物の結晶
が同相状態で有機溶媒相中に取り込謙れ、未反し′シ基
質や＃、素を含む水和から即ち本発明は一般式 で六ねされるジペプチドエステルとアミノ酸エステルと
の何ノ用化合物（式中ＲＪま低級アルキル基、Ｉ６はア
ミノ酸の側鎖基、Ｘは置換基金４Ｊすることのあるペン
ジルオキンノＪルボニル基でめり、ｎけ１又番り、２で
ある）全固相で含み、かつ蛋白分解酵素を含む水性混合
液に水と二ｉｔｌを形成することのでさる有機溶媒を加
えて混合し、この付加化金砂ノの実質的部分を同相で甘
む何機溶媒相と酵素を甘む水相のニア夜相を形成δせ、
有機溶媒相と水相全分離し、この付加化合物を有機溶媒
のスラリーとして回収し、水２１１から酵素を回収フる
こと全特徴とするジペプチドエステルとアミノ酸エステ
ルとの付ツノ１化合物の回１区法を提供するものである
１゜一般式（１）中１＜ｒ胸伏典はメナル基、エナル基
の４ポな低級アルキル基、Ｒ２及カー−はイソプｒコビ
ル羞、ベンジル基の様なアミノ酸の側鎖基、Ｘはベンジ
ルオキシカルボニル基、ｐ〜メトキシベンジルオキ７カ
ルボニル基の様な置換基を有することのあるベンジルオ
キシカルボニル基、ｎｕｉ又は２である。
収を同時に行う伺刀０化合物の分離法について工業的に
更に有利な方法を、鋭意検討した結果、慧外にも水相と
有機溶媒相との二液相系においでイ」刀日化合物の結晶
が同相状態で有機溶媒相中に取り込謙れ、未反し′シ基
質や＃、素を含む水和から即ち本発明は一般式 で六ねされるジペプチドエステルとアミノ酸エステルと
の何ノ用化合物（式中ＲＪま低級アルキル基、Ｉ６はア
ミノ酸の側鎖基、Ｘは置換基金４Ｊすることのあるペン
ジルオキンノＪルボニル基でめり、ｎけ１又番り、２で
ある）全固相で含み、かつ蛋白分解酵素を含む水性混合
液に水と二ｉｔｌを形成することのでさる有機溶媒を加
えて混合し、この付加化金砂ノの実質的部分を同相で甘
む何機溶媒相と酵素を甘む水相のニア夜相を形成δせ、
有機溶媒相と水相全分離し、この付加化合物を有機溶媒
のスラリーとして回収し、水２１１から酵素を回収フる
こと全特徴とするジペプチドエステルとアミノ酸エステ
ルとの付ツノ１化合物の回１区法を提供するものである
１゜一般式（１）中１＜ｒ胸伏典はメナル基、エナル基
の４ポな低級アルキル基、Ｒ２及カー−はイソプｒコビ
ル羞、ベンジル基の様なアミノ酸の側鎖基、Ｘはベンジ
ルオキシカルボニル基、ｐ〜メトキシベンジルオキ７カ
ルボニル基の様な置換基を有することのあるベンジルオ
キシカルボニル基、ｎｕｉ又は２である。
一般式（１）で表わされる付加化合物を固相で含み。
かつ蛋白分解酵素を含む水性混合液は一般式％式％（）
で表わされるアミノ酸エステルと一般式ＯＮ）ＩＸＯ
ＩＩ
ＨＯ−Ｃ−（ＣＨｆｆｉ）ｎ−ＣＨ−Ｃ−ＯＨ・＝＝曲
（１）で表わされるＮ−保護アミノジカルボン酸全水性
媒体中、蛋白分解酵素の存在下で反応させて、水性媒体
中に一般式（１）で表わされる付加化合物を析出式せる
ことにより調製することができる。一般式（■）及び（
１）中、Ｒ１，Ｒ２１Ｘ及びｎは一般式（１）中におけ
ると同じ意味全表わす。なお以下一般式（Ｉ）で表わさ
れる付加化合物、同（Ｉｔ）で表ゎされるアミノ酸エス
テル及び同（組で表ゎきれるＮ−採機アミノジカルボン
酸はそれぞれ付加化合物、アミノ酸エステル及びＮ−保
護アミノジカルボン酸と云う。
（１）で表わされるＮ−保護アミノジカルボン酸全水性
媒体中、蛋白分解酵素の存在下で反応させて、水性媒体
中に一般式（１）で表わされる付加化合物を析出式せる
ことにより調製することができる。一般式（■）及び（
１）中、Ｒ１，Ｒ２１Ｘ及びｎは一般式（１）中におけ
ると同じ意味全表わす。なお以下一般式（Ｉ）で表わさ
れる付加化合物、同（Ｉｔ）で表ゎされるアミノ酸エス
テル及び同（組で表ゎきれるＮ−採機アミノジカルボン
酸はそれぞれ付加化合物、アミノ酸エステル及びＮ−保
護アミノジカルボン酸と云う。
上述の方法による水性混合液の調製は特開昭５３−９２
７２９号公報等に記載されている公知の条件に従ってよ
い。これらの条件を例示すると以下の様である。
７２９号公報等に記載されている公知の条件に従ってよ
い。これらの条件を例示すると以下の様である。
アミノ酸エステル及び
Ｎ−保護アミノジカル 約０１ないし約５Ｍ、ボン酸の
水性媒体中で 好ましくは約０２ないの濃度
し約２Ｍ アミノ酸エステルとＮ 約５：１ないし約１＝−保穫ア
ミノジ力ルボ ５、好捷しくは約２：ン酸との量比（モ
ル比）１ないし約１：４使用酵素 酸性グ
ロテアーゼ、チオールプロテアーゼ。
水性媒体中で 好ましくは約０２ないの濃度
し約２Ｍ アミノ酸エステルとＮ 約５：１ないし約１＝−保穫ア
ミノジ力ルボ ５、好捷しくは約２：ン酸との量比（モ
ル比）１ないし約１：４使用酵素 酸性グ
ロテアーゼ、チオールプロテアーゼ。
金属グロテアーゼ、セ
リンプロテアーゼ等の
蛋白分解酵素；
好ましくはプロリシン。
サーモライシン、タシ
ナーゼＮ、ＰＳ−グロ
テアーゼ等の全域プロ
テアーゼ。サモアーゼな
どの粗製酵素も使用可。
酵素濃度 通常基質１モルに対して約２な
いし約４００ ｍｒ＜約５Ｘ１０”ない し約ｌＸｌ０ ”ミリモ ル）程度、好ましくは 約５ないし約１００ｍｙ （約１×１０ ないし ３Ｘ１０−３ミリモル） 反応の際の液性 使用する酵素が酵素活性を示す
範囲内、通常 ＰＨ約４ないし約９、 好ましくは４ないし８゜ 反応温度 使用する酵素が酵素活性を維持
し得る温度範 囲、好ましくは約２０ ないし約５０℃。
いし約４００ ｍｒ＜約５Ｘ１０”ない し約ｌＸｌ０ ”ミリモ ル）程度、好ましくは 約５ないし約１００ｍｙ （約１×１０ ないし ３Ｘ１０−３ミリモル） 反応の際の液性 使用する酵素が酵素活性を示す
範囲内、通常 ＰＨ約４ないし約９、 好ましくは４ないし８゜ 反応温度 使用する酵素が酵素活性を維持
し得る温度範 囲、好ましくは約２０ ないし約５０℃。
アミノ酸エステルとＮ−保穫アミノジカルボン酸はそれ
ぞれＬ一体又はＬ一体とＤ一体との混合物を用いる。ア
ミノ酸エステルとしてＬ一体を用いるとＬＬ−型ジペプ
チドエステルとＬ−４Ｖアミノ酸エステルとの付加化合
物が、またＬ一体とＤ一体との混合物を用いるとＬＬ−
型ジペプチドエステルとＤ一体又はＤ一体とＬ一体の混
合のアミノ酸エステルとの付〃１比合物が生成する。
ぞれＬ一体又はＬ一体とＤ一体との混合物を用いる。ア
ミノ酸エステルとしてＬ一体を用いるとＬＬ−型ジペプ
チドエステルとＬ−４Ｖアミノ酸エステルとの付加化合
物が、またＬ一体とＤ一体との混合物を用いるとＬＬ−
型ジペプチドエステルとＤ一体又はＤ一体とＬ一体の混
合のアミノ酸エステルとの付〃１比合物が生成する。
こうして得られた水性混合液に水と二相を形成すること
のできる有機溶媒を加えると付加化合物の結晶は同相の
まま有機酊媒相に移行しスラリー状となる。＃素は水相
に残る。水と二相を形成することのできる有機溶媒とし
ては、ベンゼン、トルエン等の芳香族炭化水素、メチル
イソブチルケトン、ジイソブテルクトン等のケトン類、
ジイソプロピルエーテル等のエーテル類又は、これらの
混合液を好適なものとして例示することができる。
のできる有機溶媒を加えると付加化合物の結晶は同相の
まま有機酊媒相に移行しスラリー状となる。＃素は水相
に残る。水と二相を形成することのできる有機溶媒とし
ては、ベンゼン、トルエン等の芳香族炭化水素、メチル
イソブチルケトン、ジイソブテルクトン等のケトン類、
ジイソプロピルエーテル等のエーテル類又は、これらの
混合液を好適なものとして例示することができる。
本発明は付加化合物を有機溶媒のスラリーとして分離す
るものであるから、付加化合物金光全に溶解する程多量
の有機溶媒全使用するものでない。
るものであるから、付加化合物金光全に溶解する程多量
の有機溶媒全使用するものでない。
その串は通常イ・１フル化合物１重綾部に対して約１な
いし約２０重量部、好捷しくは約３ないし約１５で付〃
口化舎物を懸濁させたとき、ぞの浴解度の軸回で打力１
］化合物を溶解させて合むが、その実質的部分全同相で
、スラリーの形で含むものである。
いし約２０重量部、好捷しくは約３ないし約１５で付〃
口化舎物を懸濁させたとき、ぞの浴解度の軸回で打力１
］化合物を溶解させて合むが、その実質的部分全同相で
、スラリーの形で含むものである。
本発明の方法において伺刀［１化合物を含む水性混合液
と有機溶媒を接触させるときの温度は、通常約０ないし
約８０℃である。しかしながら、形成した二相を分離し
、水相から残存酵素を回収づ−る目的の場合には、約５
ないし約５０℃で混合を行うことが望ましい。混合時１
１１１および二相の分離時間に特に限″Ｊ１的でないが
、通常５分ないし３時間の範囲内で行われる。
と有機溶媒を接触させるときの温度は、通常約０ないし
約８０℃である。しかしながら、形成した二相を分離し
、水相から残存酵素を回収づ−る目的の場合には、約５
ないし約５０℃で混合を行うことが望ましい。混合時１
１１１および二相の分離時間に特に限″Ｊ１的でないが
、通常５分ないし３時間の範囲内で行われる。
られるよつな慣用の手段により分離することができる。
前述した様な付加化合物の生成反歇、で、未成［Ｓで残
ったアミノ酸エステル、Ｎ−保強アミノジカルボン酸、
酵素等の大部分は水相に残るので、これによって付加化
合物をこれらから分離することができる。分離された壱
磯和からは、慣用の手段、例えば何磯酌媒を蒸発により
除去するとか、ろ退部の方法により個別１に合物を単離
することができる。あるいは１分離された有機相全酸性
水ｍ液と接触させることにより、付〃［１化合物の一方
の成分であるアミノ酸エステルを水相側に移動させ、こ
れよりアミノ酸エステルを、有機相からは他方の成分で
るるジペゾテドエステルを分離することができる。
ったアミノ酸エステル、Ｎ−保強アミノジカルボン酸、
酵素等の大部分は水相に残るので、これによって付加化
合物をこれらから分離することができる。分離された壱
磯和からは、慣用の手段、例えば何磯酌媒を蒸発により
除去するとか、ろ退部の方法により個別１に合物を単離
することができる。あるいは１分離された有機相全酸性
水ｍ液と接触させることにより、付〃［１化合物の一方
の成分であるアミノ酸エステルを水相側に移動させ、こ
れよりアミノ酸エステルを、有機相からは他方の成分で
るるジペゾテドエステルを分離することができる。
４た付加化合物倉吉む有機溶媒相を直ちに付加化合物の
アミノ基の保獲基（一般式（１）中のＸ）の脱離の工程
に供することもできる。
アミノ基の保獲基（一般式（１）中のＸ）の脱離の工程
に供することもできる。
付加化合物の実質的部分をスラリーとして含む有機ｍ媒
相全分離した水相中にはなお活性を有する反応に使用し
た酵素の大部分が含捷れており、この水相は限外１過膜
等により酵素を濃縮回収し再び使用することができる。
相全分離した水相中にはなお活性を有する反応に使用し
た酵素の大部分が含捷れており、この水相は限外１過膜
等により酵素を濃縮回収し再び使用することができる。
またその他の慣用の手段、例えば塩析等の操作により酵
素を水相と分離した抜用いることもできる。、これらの
うちＩ恨外１過膜による方法は工業的に最も有利である
。１退外ｆ過膜の膜材質としては特に限定はなくポリア
クリロニトリル、ポリアミド、ポリイミド、ポリスルホ
ン、酢酸セルロース等を使用することができる。しかし
ながら使用する酵素の分子前に応じた分画性をもちかつ
酵素に対する吸着性の少ない膜を選択し使用することが
望ましい。膜モジュールとしては特に１恨定はなく、中
空糸型、スパイラル型、円管型、平板型等いずれでも使
用することができる。
素を水相と分離した抜用いることもできる。、これらの
うちＩ恨外１過膜による方法は工業的に最も有利である
。１退外ｆ過膜の膜材質としては特に限定はなくポリア
クリロニトリル、ポリアミド、ポリイミド、ポリスルホ
ン、酢酸セルロース等を使用することができる。しかし
ながら使用する酵素の分子前に応じた分画性をもちかつ
酵素に対する吸着性の少ない膜を選択し使用することが
望ましい。膜モジュールとしては特に１恨定はなく、中
空糸型、スパイラル型、円管型、平板型等いずれでも使
用することができる。
こうして濃縮された酵素溶液は未反応で残ったアミノ酸
エステル及びＮ−保護アミノジカルボン酸とともに次回
の付加化合物生成反応の原料として用いることができる
。
エステル及びＮ−保護アミノジカルボン酸とともに次回
の付加化合物生成反応の原料として用いることができる
。
寸だ単に限外υ１過によって酵素を濃縮するだけで々く
、濃縮液に更に塩類水溶液を加えて沢過を継続し、実質
上酵素のみを含む環部水溶液の形で酵素全回収すること
ができる。
、濃縮液に更に塩類水溶液を加えて沢過を継続し、実質
上酵素のみを含む環部水溶液の形で酵素全回収すること
ができる。
こうして回収した酵素又はその水溶液は再度伺加化合物
の生成反応に朗用できる。また勿論蛋白分解酵素を用い
る他の反応にも使用できる。
の生成反応に朗用できる。また勿論蛋白分解酵素を用い
る他の反応にも使用できる。
以上の説明から明らかなように、本発明によれば水性混
合液中の付加化合物を他の成分から有機溶媒中への高濃
度のスラリーの形で効率的に分離できる。また付ノ用化
合物を全量溶解することなしに実質的部分を固形物とし
て有機溶媒相に抽出できるので、溶媒の使用量が少なく
てすみ工業的に有利である。しかも俗解による抽出の場
合に比べてより安定で、かつ生理学的によｐ問題の少な
い有機溶媒を用いることができる。更にまた水相の方か
らは、酵素を回収、再使用することがでべろので経済的
にも有利である。以下本発明を実施例により更に詳しく
説明する。
合液中の付加化合物を他の成分から有機溶媒中への高濃
度のスラリーの形で効率的に分離できる。また付ノ用化
合物を全量溶解することなしに実質的部分を固形物とし
て有機溶媒相に抽出できるので、溶媒の使用量が少なく
てすみ工業的に有利である。しかも俗解による抽出の場
合に比べてより安定で、かつ生理学的によｐ問題の少な
い有機溶媒を用いることができる。更にまた水相の方か
らは、酵素を回収、再使用することがでべろので経済的
にも有利である。以下本発明を実施例により更に詳しく
説明する。
実施例Ｉ
Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−７スパラキン酸５
３．４５ＰとＩ） Ｌ−７エニルアラニンメテルエステ
ル」盆酸塩１０７．８４ｆ−ｆ２１のフラスコにとり、
蒸留水４００ｍｌ、５Ｎ−水酸化ナトｌ）ラム水溶液１
００ｍｌおよび粗製サーモライシン（サーモアーゼＰＳ
−１６０．商標、大和化成■製）４８２、酢酸カルシウ
ム−水塩０９７を加え、４０℃で攪拌しながら反応させ
た。１５時間後懸濁状の反応混合液を得た。この液にト
ルエン６００ｍ１を加え、４０℃で２０分間攪拌混合し
た。攪拌を止めると固形物を懸濁状に含むトルエン相と
均一透明な水相とに分離した。１０分後に固形物を含む
トルエン相を水相から分離し、トルエン相は２００ｙｙ
＋／の０．５チ酢酸カルシウム水溶液で２回洗浄を行っ
たのち固形物をガラスフィルターを用いて濾過により分
離した。乾燥後酢酸エテル−ｎ −ヘキザン混合溶媒か
ら再結晶を行いＮ−ベンジルか オキシカルボニル〜Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルア
ラニン７１ す／ｌｚ ｍステル（以下Ｚ−ＡＰＭと云
う）と主にＤ一体のフェニルアラニンメチルエステル（
以下Ｄ −Ｐ Ｍと云う）との１＝１０付〃ｌ化合物１
０１．１ｉｉ’（収率８３．２％）を得た。この結光度
が特開昭５３−９２７２９号に開示されているチーター
と同一であることにより確認した。一方二相分離を行っ
た水相と洗浄液全混合しく全層８４、０ｒｎｌ！ ）酵
素活性をカゼイン消化法により測定したところ仕込み＃
素の８８％の残存活性かめる径０．５ ｙｒｍ ）によ
り２００ ｍｅまで濃縮を行った。濃縮液の酵素活性は
仕込んだ酵素に対して８６チであった。
３．４５ＰとＩ） Ｌ−７エニルアラニンメテルエステ
ル」盆酸塩１０７．８４ｆ−ｆ２１のフラスコにとり、
蒸留水４００ｍｌ、５Ｎ−水酸化ナトｌ）ラム水溶液１
００ｍｌおよび粗製サーモライシン（サーモアーゼＰＳ
−１６０．商標、大和化成■製）４８２、酢酸カルシウ
ム−水塩０９７を加え、４０℃で攪拌しながら反応させ
た。１５時間後懸濁状の反応混合液を得た。この液にト
ルエン６００ｍ１を加え、４０℃で２０分間攪拌混合し
た。攪拌を止めると固形物を懸濁状に含むトルエン相と
均一透明な水相とに分離した。１０分後に固形物を含む
トルエン相を水相から分離し、トルエン相は２００ｙｙ
＋／の０．５チ酢酸カルシウム水溶液で２回洗浄を行っ
たのち固形物をガラスフィルターを用いて濾過により分
離した。乾燥後酢酸エテル−ｎ −ヘキザン混合溶媒か
ら再結晶を行いＮ−ベンジルか オキシカルボニル〜Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルア
ラニン７１ す／ｌｚ ｍステル（以下Ｚ−ＡＰＭと云
う）と主にＤ一体のフェニルアラニンメチルエステル（
以下Ｄ −Ｐ Ｍと云う）との１＝１０付〃ｌ化合物１
０１．１ｉｉ’（収率８３．２％）を得た。この結光度
が特開昭５３−９２７２９号に開示されているチーター
と同一であることにより確認した。一方二相分離を行っ
た水相と洗浄液全混合しく全層８４、０ｒｎｌ！ ）酵
素活性をカゼイン消化法により測定したところ仕込み＃
素の８８％の残存活性かめる径０．５ ｙｒｍ ）によ
り２００ ｍｅまで濃縮を行った。濃縮液の酵素活性は
仕込んだ酵素に対して８６チであった。
こうして得た酵素液を用いて付加化合物の生成反応をく
り返した（蒸溜水４００ｍ／のうち２００ｍ１に代えて
この酵素液ケ用い、粗製サーモライシンの添加楡は０６
２とした）、、Ｓ初の生成数ＬＬ、の場合とほとんど同
一の結果が得しれた。
り返した（蒸溜水４００ｍ／のうち２００ｍ１に代えて
この酵素液ケ用い、粗製サーモライシンの添加楡は０６
２とした）、、Ｓ初の生成数ＬＬ、の場合とほとんど同
一の結果が得しれた。
実施例２
実施例１において粗製サーモライシンを７２２、ｖｌｎ
酸カルシウム−水塩を１：３２反応時１川を８時間□に
した以外は実施例１と同様にしてペプチド生成および付
加化合物の形成反応を行った。反応路γ後トルエンのか
わりにメナルイソプテルケＩ・ンを１１！使用した以外
は実施例１と同様に処理を行った。固形物を懸濁状で含
有したメチルイソブチルケトン相は分離後ロータリーエ
バポレーターで溶媒全留去したのち、残渣全酢酸エテル
ーｎ−ヘキサン混合溶媒から再結晶し、Ｚ−ＡＰＭ、：
Ｄ−ＰＭの１：１付加化合物全１０２．２ｆ（収率８４
１％）（ｉｌ−得た。水相と洗浄液ケ合わせだ液（全量
８４０ｍｅ）は仕込み酵素に対して９０チの酵素活性全
保持していた。さらにこの面をポリアクリロニ） ｌ）
ル糸中窒糸ｉＭ限外ｔ４過膜装置（旭化成社製。
酸カルシウム−水塩を１：３２反応時１川を８時間□に
した以外は実施例１と同様にしてペプチド生成および付
加化合物の形成反応を行った。反応路γ後トルエンのか
わりにメナルイソプテルケＩ・ンを１１！使用した以外
は実施例１と同様に処理を行った。固形物を懸濁状で含
有したメチルイソブチルケトン相は分離後ロータリーエ
バポレーターで溶媒全留去したのち、残渣全酢酸エテル
ーｎ−ヘキサン混合溶媒から再結晶し、Ｚ−ＡＰＭ、：
Ｄ−ＰＭの１：１付加化合物全１０２．２ｆ（収率８４
１％）（ｉｌ−得た。水相と洗浄液ケ合わせだ液（全量
８４０ｍｅ）は仕込み酵素に対して９０チの酵素活性全
保持していた。さらにこの面をポリアクリロニ） ｌ）
ル糸中窒糸ｉＭ限外ｔ４過膜装置（旭化成社製。
ＨＬ −１００型１分画分子量６，０００，１模面積（
１，２ｍ” 、中架糸内径０．８ ｍｍ ）を用いて２
００ｍｅ’Ｅで濃縮した。濃縮液の酵素活性は仕込んだ
酵素に比べて７５％であった。
１，２ｍ” 、中架糸内径０．８ ｍｍ ）を用いて２
００ｍｅ’Ｅで濃縮した。濃縮液の酵素活性は仕込んだ
酵素に比べて７５％であった。
実施例３
実施例２と同様にしてペプチド生成および付方目化合物
の形成反応を行った。反応終了後メチルイソブチルケト
ンのかわりにジイソプロピルエーテル５００−を使用し
た以外は実施例２と同様に処理を行った。固形物を懸濁
状に含有したジイソプロピルエーテル相は分１ｆ、Ｉ
？＆ロータリーエバポレータで溶媒を留去したのち、残
渣を酢酸エテル−ｎ−ヘキサンから再結晶し、Ｚ−ＡＰ
Ｍと主に１）−ＰＭの１＝１付加付加物９６．５ｆ（収
率７９．５チ）を得た。水相と洗浄液を合わせた欣（全
社６８０ｍ１）に−仕込み酵素にズ１して７２チの酵素
活性を保持［７ていた。さらにこの液をポリイミド型円
管状眠外ｆ過膜装置（日東電気工業社製、ＮＴＵ−４２
２０、膜面積０．０１４ ｍ”、分画分子−！：２０，
０００ ）分用いて２００ｍ７まで濃縮した。濃縮液の
酵素活性は仕込んだ酵素と比べて７０チであった。
の形成反応を行った。反応終了後メチルイソブチルケト
ンのかわりにジイソプロピルエーテル５００−を使用し
た以外は実施例２と同様に処理を行った。固形物を懸濁
状に含有したジイソプロピルエーテル相は分１ｆ、Ｉ
？＆ロータリーエバポレータで溶媒を留去したのち、残
渣を酢酸エテル−ｎ−ヘキサンから再結晶し、Ｚ−ＡＰ
Ｍと主に１）−ＰＭの１＝１付加付加物９６．５ｆ（収
率７９．５チ）を得た。水相と洗浄液を合わせた欣（全
社６８０ｍ１）に−仕込み酵素にズ１して７２チの酵素
活性を保持［７ていた。さらにこの液をポリイミド型円
管状眠外ｆ過膜装置（日東電気工業社製、ＮＴＵ−４２
２０、膜面積０．０１４ ｍ”、分画分子−！：２０，
０００ ）分用いて２００ｍ７まで濃縮した。濃縮液の
酵素活性は仕込んだ酵素と比べて７０チであった。
実施例４
実施例２においてＤＬ〜フェニルアラニンメチルエステ
ル塩酸塩のかわりにＬ−７エニルアラニンメナルエステ
ル塩酸塩を用いた以外は実施例２と同様にしてペプチド
生成および性力■化合物形成反１５ ｋ行った。反応終
了後メチルイソブチルケトンのかわりにメチルインブチ
ルケトン９００ ｍｅとトルエン１００ｍＩ！の混合溶
媒を用い実施例２と同様に後処理ケ行った。固形物を懸
濁状で含有する有機相は、水相から分離したのちロータ
リーエバポレータで溶媒全留去し、残渣を酢酸エテル−
ｎ−へキサンより再結晶し、Ｚ−ＡＰＭとＬ−フェニル
アラニンメチルエステル（以下Ｌ−ＰＭと云う〕の１＝
１付加付加物９８．６８ｆ（収率８１２チ〕をイ与た。
ル塩酸塩のかわりにＬ−７エニルアラニンメナルエステ
ル塩酸塩を用いた以外は実施例２と同様にしてペプチド
生成および性力■化合物形成反１５ ｋ行った。反応終
了後メチルイソブチルケトンのかわりにメチルインブチ
ルケトン９００ ｍｅとトルエン１００ｍＩ！の混合溶
媒を用い実施例２と同様に後処理ケ行った。固形物を懸
濁状で含有する有機相は、水相から分離したのちロータ
リーエバポレータで溶媒全留去し、残渣を酢酸エテル−
ｎ−へキサンより再結晶し、Ｚ−ＡＰＭとＬ−フェニル
アラニンメチルエステル（以下Ｌ−ＰＭと云う〕の１＝
１付加付加物９８．６８ｆ（収率８１２チ〕をイ与た。
Ｚ −Ａ Ｐ ＭとＬ−ＰＭの１：１付刀１いるデーク
ーと同一であることにより確認した。
ーと同一であることにより確認した。
水相と洗浄液を合わせた液（全量９２０ｍｅ）は仕込ん
だ酵素に対して９２％の酵素活性分有していた。この液
を実施例Ｉと同様の操作により２００ｍｅｔで譲縮した
。−縮液の酵素活性は仕込んだ酵素に対して８８％であ
った。
だ酵素に対して９２％の酵素活性分有していた。この液
を実施例Ｉと同様の操作により２００ｍｅｔで譲縮した
。−縮液の酵素活性は仕込んだ酵素に対して８８％であ
った。
更にこれに（）５係のＩｖＶ酸カルシウム水ｆ８液を、
ｉｆ″１過によって減少ターる址全補償する様絶えずカ
■えて２００ｍ／の定量ｆ過を行ない、粗製サーモライ
シンをほとんど他成分を含まない形で０５チ酢酸カルシ
ウム水浴液の溶液の形で回収した。得られた粗製サーモ
ライシン浴液の酵素活性げ仕込んだ酵素のそれの８５％
であった。
ｉｆ″１過によって減少ターる址全補償する様絶えずカ
■えて２００ｍ／の定量ｆ過を行ない、粗製サーモライ
シンをほとんど他成分を含まない形で０５チ酢酸カルシ
ウム水浴液の溶液の形で回収した。得られた粗製サーモ
ライシン浴液の酵素活性げ仕込んだ酵素のそれの８５％
であった。
実施例５
Ｎ −ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−７スパラギンｔ
ｖ！１５．３４５ｆとＤ Ｌ−フェニルアラニンメチル
エステル塩酸塩１０．７８４Ｆを２０ＯＦＦｌｅ（７）
７う溶液］、Ｏｍｅおよびサーモライシン２００ｍｙ、
酢酸カルシウム−水塩１３０ｍｇを加え４０℃で攪拌し
ながら反応させた。７時間後反応混合液にメチルイン７
’ ｆ ）レケト：ｙ ］ ＯＯｍｌ！ ｋ ／Ｊｌｌ
え、４０ ｔ４’２０分間攪拌、混合した。攪拌停止１
０分後置形物を含む４１磯相と均一な水Ａ目と全分離し
、／ｆｉ機相ｉｔ２０ｍｅの０５％ＨＩ°酸カルシウム
水溶液で２回洗浄を行ったのち、ロータリーエバボレー
ターテ溶媒全留去し残ｍｋ酢酸エチルーｎ−ヘキサンよ
り再結晶［７、Ｚ−ＡＰＭと主にｌ） −Ｐ Ｍの１：
１の付加化合物の結晶全１０．３４ｆ（収率８５．２％
）を得た。水相と洗浄液を合わせた液（全−計７０−）
に仕込み酵素に対して８２％の酵素活性を保持していた
。さらにこの液ヲポリアクリロニトリル系中を基型限外
濾過ｊ換装置（旭化成社製ミニモジュールＮＭ−３型、
ＨＩ 膜、 ｏＪ而面２５ｃＪ、中空系内径０．８
ｍｍ 、分画分子Ｍ６，０００ ） ｋ用い２０ｍ１ま
で濃縮した。濃縮液の酵素活性は仕込んだ酵素に比べて
７７優であった。
ｖ！１５．３４５ｆとＤ Ｌ−フェニルアラニンメチル
エステル塩酸塩１０．７８４Ｆを２０ＯＦＦｌｅ（７）
７う溶液］、Ｏｍｅおよびサーモライシン２００ｍｙ、
酢酸カルシウム−水塩１３０ｍｇを加え４０℃で攪拌し
ながら反応させた。７時間後反応混合液にメチルイン７
’ ｆ ）レケト：ｙ ］ ＯＯｍｌ！ ｋ ／Ｊｌｌ
え、４０ ｔ４’２０分間攪拌、混合した。攪拌停止１
０分後置形物を含む４１磯相と均一な水Ａ目と全分離し
、／ｆｉ機相ｉｔ２０ｍｅの０５％ＨＩ°酸カルシウム
水溶液で２回洗浄を行ったのち、ロータリーエバボレー
ターテ溶媒全留去し残ｍｋ酢酸エチルーｎ−ヘキサンよ
り再結晶［７、Ｚ−ＡＰＭと主にｌ） −Ｐ Ｍの１：
１の付加化合物の結晶全１０．３４ｆ（収率８５．２％
）を得た。水相と洗浄液を合わせた液（全−計７０−）
に仕込み酵素に対して８２％の酵素活性を保持していた
。さらにこの液ヲポリアクリロニトリル系中を基型限外
濾過ｊ換装置（旭化成社製ミニモジュールＮＭ−３型、
ＨＩ 膜、 ｏＪ而面２５ｃＪ、中空系内径０．８
ｍｍ 、分画分子Ｍ６，０００ ） ｋ用い２０ｍ１ま
で濃縮した。濃縮液の酵素活性は仕込んだ酵素に比べて
７７優であった。
実施例６
サーモライジンのかわりにＰＳ−グロテアーセ１Ｖ金用
いた以外は実施例５と同様の操作でペプチド生成、付方
呵ヒ金物の形成および反応後の処理を行った。再結晶後
、得られたＺ −Ａ Ｐ Ｍと王にＤ−ｐＭの１：を付
加化合物の収量は９．８７ｆ（収率８１２％）であり水
相から回収σれた酵素の活性は仕込酵素に対して膜磯縮
以前は８４チで特許出願人 東に曹達工業体式会社 代表者選定届 昭和５７年 ２月２２日 特許庁長官 島 １）春 樹殿 １事件の表示 昭オｌ」５６年特許願第１４８７５４号２発明の名称 ジペプチドエステルとアミノ酸エステルとの伺加化合物
の回収法 ６代表者 事件との関係 特許出願人 （連絡先） 郵便番号１０７ 東京都港区赤坂１丁目７番７号 東洋曹達工業株式会ン１ 特許情報部 電話番号 （５８５）３３Ｍ ４添付書類の目録 （１）代表者であることを証する書面 １通代表者選
定証 昭和５１年 ２月２２日 住 所 郵便番号 ７４６ 山ロ県新南ＩＩ市太字富田４５６０省地代表者 （３３
０） 束詳留達工業株式会ネ１代表者 森 嶋
束 三 殿 住 所 郵便番号 １００ 東京都千代１］１区丸の内１Ｊ泪４番５袖下記の発明に
関する手続についてに↓責殿を代表者に選定したことに
相違あり捷せん。
いた以外は実施例５と同様の操作でペプチド生成、付方
呵ヒ金物の形成および反応後の処理を行った。再結晶後
、得られたＺ −Ａ Ｐ Ｍと王にＤ−ｐＭの１：を付
加化合物の収量は９．８７ｆ（収率８１２％）であり水
相から回収σれた酵素の活性は仕込酵素に対して膜磯縮
以前は８４チで特許出願人 東に曹達工業体式会社 代表者選定届 昭和５７年 ２月２２日 特許庁長官 島 １）春 樹殿 １事件の表示 昭オｌ」５６年特許願第１４８７５４号２発明の名称 ジペプチドエステルとアミノ酸エステルとの伺加化合物
の回収法 ６代表者 事件との関係 特許出願人 （連絡先） 郵便番号１０７ 東京都港区赤坂１丁目７番７号 東洋曹達工業株式会ン１ 特許情報部 電話番号 （５８５）３３Ｍ ４添付書類の目録 （１）代表者であることを証する書面 １通代表者選
定証 昭和５１年 ２月２２日 住 所 郵便番号 ７４６ 山ロ県新南ＩＩ市太字富田４５６０省地代表者 （３３
０） 束詳留達工業株式会ネ１代表者 森 嶋
束 三 殿 住 所 郵便番号 １００ 東京都千代１］１区丸の内１Ｊ泪４番５袖下記の発明に
関する手続についてに↓責殿を代表者に選定したことに
相違あり捷せん。
記
１事件の表示
昭和５６年特許願第１４８７５４号
２発明の名称
ジペプチドエステルとアミノ酸エステルとの付カｎ化合
物の回収法
物の回収法
Claims (9)
- （１）一般式 で表わされるジペプチドエステルとアミノ酸エステルと
の付力目化合物（式中Ｒ厘は低級アルキル基、Ｒ２はア
ミノ酸の側鎖基、Ｘは置換基を有することのあるベンジ
ルオキシカルボニル基であり、ｎは１又は２である）を
同相で含み、かつ蛋白分解酵素を含む水性混合液に水と
二相を形成することのできる有機溶媒を力日えて混合し
、この付加化合物の実質的部分を固相で含む有機溶媒相
と酵素を含む水相の二液用を形成させ、有機溶媒相と水
相を分離（７、この付加化合物を有機溶媒のスラリーと
して回収し、水相から酵素全回収することケ特徴とする
ジペプチドエステルとアミノ敲エステルとの付加化合物
の回収法。 - （２）水性混合液が、一般式 ％式％ で表わされるアミノ酸エステル（式中Ｒ１，ｊ： 低級
アルキル基Ｒ２はアミノ酸の側鎖基である）と一般式 で表わされるＮ−保護アミノジカルボン酸（式中Ｘは置
換基を有することのあるベンジルオキシカルボニル基で
ｌ） ｔ） ｎは１又は２である）を水性媒体中、蛋白
分解酵素の存在下で反応させて、一般式 ｏ ＯＮＨＸＯＯ Ｉｌ、 ｉｔ Ｉｌｌ
ＩＩで表わされるジペプチドエステルと
アミノ酸エステルとの付加化合物（式中、Ｒ＋、 Ｒ（
Ｘ及びｎは前記同様である）全生成させた反応生成液で
ある特許請求の範囲第１項記載の回収法。 - （３）水と二相を形成することのできる有機溶媒が水と
二相を形成することのできるケトン類、脂肪族系もしく
は芳香族系の炭化水素類、エーテル類又はこれらの混合
物である特許請求の範囲第１項又は第２項記載の回収法
。 - （４）水と二相全形成することのできる有機隘媒を付加
化合物全完全に溶解できる量未満の量で用いる特許請求
の範囲第１項ないし第３項のいずれかの項記載の回収法
。 - （５）水と二相を形成することのできる有機溶媒全付加
化合物１重量部に対して約１ないし約２０重量部の量で
用いる特許請求の範囲第１項ないし第３項のいすねかの
項記載の回収法。 - （６） ｆ’ｌ加化金化合物ペプチド部分がＬＬ−型
である特許請求の範囲第１項ないし第５項のいずれかの
項記載の回収法。 - （７）付加化合物、アミノ酸エステル及ＵＮ−保穫アミ
ノジカルボン酸の一般式中のＲ＋がメチル基、Ｒ２がベ
ンジル基、ｎが１である特許請求の範囲第２項ないし第
６項のいずれかの項記載の回収ｏ：、。 - （８）用いるアミノ酸エステル及びＮ−保護アミノジカ
ルボン酸がそれぞれＬ−型又はＬｍと１）−型との混合
物である特ｉｆ′ｌ：請求の範囲第２項ないし第７項の
いずれかの項記載の回収を去。 - （９）蛋白分解酵素が金鶏プロテアーゼである特許請求
の範＋ｔ）Ｉ第１項ないし第８項のいずれかの項記載の
回収法。 （Ｉ（遣 水相を有機溶媒相から分離したのち、１恨
外濾過膜による限外１ｌ−ｉ過に付し、酵素を譲縮され
た酵素耐液の形で回収する特許請求の範囲第１項ないし
第９項のいずれかの項記載の回収法。 ａの 限外ｊ′１過膜上に残る酵素溶液に塩類浴液を加
えて更に限外σ１過を行う特許請求の範囲第９項またｌ
″ｌ：第１０項記載の回収法。 ０■ 塩類溶液がカルシウム塩の水溶液である特許請求
の範囲第１１項記載の回収法。
Priority Applications (9)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP14875481A JPS5851896A (ja) | 1981-09-22 | 1981-09-22 | ジペプチドエステルとアミノ酸エステルとの付加化合物の回収法 |
| EP82108116A EP0075160B1 (en) | 1981-09-21 | 1982-09-02 | Process for recovering a dipeptide derivative |
| DE8282108116T DE3274985D1 (en) | 1981-09-21 | 1982-09-02 | Process for recovering a dipeptide derivative |
| AU88018/82A AU554836B2 (en) | 1981-09-21 | 1982-09-03 | Process for recovering a dipeptide derivative |
| US06/415,912 US4487717A (en) | 1981-09-21 | 1982-09-08 | Process for recovering a dipeptide derivative |
| BR8205516A BR8205516A (pt) | 1981-09-21 | 1982-09-20 | Processo para recuperacao de um derivado de dipeptidio |
| CA000411792A CA1186648A (en) | 1981-09-21 | 1982-09-20 | Process for recovering a dipeptide derivative |
| DD82272585A DD232499A5 (de) | 1981-09-21 | 1982-09-21 | Verfahren zur gewinnung eines dipeptidderivats |
| DD24340782A DD216451A5 (de) | 1981-09-21 | 1982-09-21 | Verfahren zur gewinnung eines dipeptidderivats |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP14875481A JPS5851896A (ja) | 1981-09-22 | 1981-09-22 | ジペプチドエステルとアミノ酸エステルとの付加化合物の回収法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5851896A true JPS5851896A (ja) | 1983-03-26 |
| JPS6257318B2 JPS6257318B2 (ja) | 1987-11-30 |
Family
ID=15459881
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP14875481A Granted JPS5851896A (ja) | 1981-09-21 | 1981-09-22 | ジペプチドエステルとアミノ酸エステルとの付加化合物の回収法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS5851896A (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP3940669A4 (en) | 2019-03-15 | 2022-03-30 | Panasonic Intellectual Property Management Co., Ltd. | DISTRIBUTION PLAN GENERATION METHOD AND DISTRIBUTION PLAN GENERATION SYSTEM |
-
1981
- 1981-09-22 JP JP14875481A patent/JPS5851896A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS6257318B2 (ja) | 1987-11-30 |
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