JPH0212238B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、ジペプチドエステルとアミノ酸エス
テルとの付加化合物の回収法に関するものであ
り、更に詳しくは、この化合物を含む水性懸濁液
からこの付加化合物を有機溶媒のスラリーとして
分離回収する方法に関するものである。 ジペプチドエステル、例えばＮ−ベンジルオキ
シカルボニル−α−Ｌ−アルパルチル−Ｌ−フエ
ニルアラニン低級アルキルエステルとアミノ酸エ
ステル、例えばフエニルアラニン低級アルキルエ
ステル、やバリン低級アルキルエステルなどとの
付加化合物は、甘味剤であるα−Ｌ−アルパルチ
ル−Ｌ−フエニルアラニン低級アルキルエステル
への中間体として、あるいはラセミ体アミノ酸エ
ステルの光学分割の中間体などとして有用な化合
物である。 この様な付加化合物は、Ｎ−保護アミノジカル
ボン酸とアミノ酸エステルを水性媒体中、蛋白分
解酵素の存在下で反応させることにより（特開昭
53−92729、特開昭54−9226）、あるいはジペプチ
ドエステルとアミノ酸エステルとを水などの溶媒
中で反応させること（特開昭55−19234、特開昭
55−73644）などにより得られる。これらの反応
では付加化合物は溶媒中へ固相の形で析出する。
従つてこの様な溶媒、特に水性媒体からこの付加
化合物をいかに効率よく回収するかは極めて重要
な課題である。 上述した公知の方法では、この回収を過で行
なつている。また、水と二相を形成することので
きる有機溶媒を反応終了液に加えて付加化合物を
溶解抽出し、有機溶媒中の均一液として分離する
ことも知られている（特開昭54−11295）。 しかしながら、抽出を効率よく行なうためには
水と二相形成ができると同時に、付加化合物に対
する溶解力の大きい有機溶媒を使用する必要があ
るが、この様な有機溶媒は、酢酸エチル等のエス
テル類やクロロホルム、二塩化エタン等のハロゲ
ン化アルキル類等比較的限られている。ところ
が、エステル類については、加水分解の問題があ
り、またハロゲン化アルキル類については、近年
発ガン性が問題になつている折から、食品等の原
料となる付加化合物の処理工程においては、極力
その使用を避けることが望ましい。 一方、付加化合物に対する溶解力が小さい有機
溶媒の場合には、大量に使用することが必要で経
済上も問題がある。 本発明者らは、この様な問題点を解決するため
付加化合物の分離法について工業的に更に有利な
方法を鋭意研討した結果、意外にも水相と有機溶
媒相の二相系において付加化合物の結晶が固相状
態で有機溶媒相中に取り込まれ、未反応原料、酵
素等を含む水相から効果的に分離できることを見
い出し本発明を完成した。 即ち本発明は、一般式 で表わされるジペプチドエステルとアミノ酸エス
テルとの付加化合物を固相で含む水性混合液に水
と二相を形成することのできる有機溶媒を加えて
混合し、この付加化合物の実質的部分を固相で含
む有機溶媒相と水相との二液相を形成させ、有機
溶媒相を水相から分離し、この付加化合物を有機
溶媒のスラリーとして回収することを特徴とする
付加化合物の回収法を提供するものである。 一般式()中R₁及びR₄はメチル基、エチル基の
様な低級アルキル基、R₂及びR₃はイソプロピル
基、ベンジル基の様なアミノ酸の側鎖基、Ｘはベ
ンジルオキシカルボニル基、ｐ−メトキシベンジ
ルオキシカルボニル基の様な置換基を有すること
のあるベンジルオキシカルボニル基、ｎは１又は
２である。 一般式（）で表わされる付加化合物を固相で
含む水性混合液は一般式 で表わされるアミノ酸エステルと一般式 で表わされるＮ−保護アミノジカルボン酸を水性
媒体中、蛋白分解酵素の存在下で反応させて、水
性媒体中に一般式（）で表わされる付加化合物
を析出させることにより調製することができる。 一般式（）及び（）中、R₁、R₂、R₃、
R₄、Ｘ及びｎは一般式（）中におけると同じ
意味を表わす。但し、この場合R₃はR₂と、R₄は
R₁と共通である。なお、以下一般式（）で表
わされる付加化合物、同（）で表わされるアミ
ノ酸エステル及び同（）で表わされるＮ−保護
アミノジカルボン酸は、それぞれ付加化合物、ア
ミノ酸エステル及びＮ−保護アミノジカルボン酸
と云う。 上述の方法による付加化合物の調製は、特開昭
53−92729号公報等に記載されている公知の条件
に従つてよい。これらの条件を例示すると以下の
様である。

【表】 この方法ではアミノ酸エステルとＮ−保護アミ
ノジカルボン酸は、それぞれＬ体又はＬ体とＤ体
との混合物を用いる。 アミノ酸エステルとしてＬ−体を用いるとLL
−型ジペプチドエステルとＬ−型アミノ酸エステ
ルとの付加化合物が、またＬ−体とＤ−体との混
合物を用いるとLL−型ジペプチドエステルとＤ
−体又はＤ−体とＬ−体の混合のアミノ酸エステ
ルとの付加化合物が生成する。 本発明の水性混合液は、またアミノ酸エステル
と一般式 で表わされるジペプチドエステルを水性媒体中で
反応させることによつて調製できる。 この様にして得られる付加化合物は、特開昭55
−19234号公報及び特開昭55−73644号公報に開示
されている様にDL−アミノ酸エステルの光学分
割のために利用できる。 こうして得られた水性混合液に水と二相を形成
することのできる有機溶媒を加えると、付加化合
物の結晶は固相のまま有機溶媒相に移行しスラリ
ー状となる。 水と二相を形成することのできる有機溶媒とし
ては、ベンゼン、トルエン等の芳香族炭化水素、
メチルイソブチルケトン、ジイソブチルケトン等
のケトン類、ジイソプロピルエーテル等のエーテ
ル類又はこれらの混合液を好適なものとして例示
することができる。 本発明は、付加化合物を有機溶媒のスラリーと
して分離するものであるから、付加化合物を完全
に溶解する程多量の有機溶媒を使用するものでな
い。その量は通常、付加化合物１重量部に対して
約１ないし約20重量部、好ましくは約３ないし約
15重量部である。 本発明で用いる有機溶媒は、水相と二相を形成
して付加化合物を懸濁させたとき、その溶解度の
範囲で付加化合物を溶解させて含むが、その実質
的部分を固相で、スラリーの形で含むものであ
る。 本発明で出発原料として用いる水性混合液中の
水の量は必ずしも限定的ではないが通常付加化合
物１重量部に対して約0.3ないし約20重量部、好
ましくは約0.5ないし約15重量部である。 本発明の方法において、付加化合物を含む水性
混合液と有機溶媒を接触させるときの温度は、通
常約０ないし約80℃である。しかしながら、形成
した二相を分離し、水相から残存酵素を回収する
目的の場合には、約５ないし約50℃で混合を行な
うことが望ましい。 混合時間及び二相の分離時間は、特に限定的で
ないが、通常５分ないし３時間の範囲内で行なわ
れる。 付加化合物の実質的部分をスラリーとして含む
有機溶媒相と水相は液々抽出の時に用いられるよ
うな慣用の手段により分離することができる。 前述した様な付加化合物の生成反応で未反応で
残つたアミノ酸エステル、Ｎ−保護アミノジカル
ボン酸、酵素等の大部分は水相に残るので、これ
によつて付加化合物をこれらから分離することが
できる。分離された有機相からは慣用の手段、例
えば有機溶媒を蒸発により除去するとか、ろ過等
の方法により付加化合物を単離することができ
る。あるいは、分離された有機相を酸性水溶液と
接触させることにより、付加化合物の一方の成分
であるアミノ酸エステルを水相側に移動させ、こ
れよりアミノ酸エステルを、有機相からは他方の
成分である一般式（）で表わされるジペプチド
エステルを分離することができる。 また付加化合物を含む有機溶媒相を直ちに付加
化合物のアミノ酸の保護基（一般式（）中の
Ｘ）の脱離の工程に供することもできる。 以上の説明から明らかな様に、本発明によれ
ば、水性混合液中の付加化合物を他の成分から有
機溶媒中への高濃度のスラリーの形で効率的に分
離できる。また付加化合物を全量溶解することな
しに、実質的部分と固形物として有機溶媒相に抽
出できるので、溶媒の使用量が少なくてすみ工業
的に有利である。しかも、溶解による抽出の場合
に比べてより安定で、かつ生理学的により問題の
少ない有機溶媒を用いることができる。 以下、本発明を実施例により更に詳しく説明す
る。 実施例 １ Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−α−Ｌ−アス
パラギン酸53.45gとDL−フエニルアラニンメチ
ルエステル塩酸塩107.84gを２のフラスコにと
り、蒸留水400ml、5N−水酸化ナトリウム水溶液
100ml及び粗製サーモライシン（サーモアーゼPS
−160、商標、大和化成(株)製）4.8g、酢酸カルシ
ウム−水塩0.9gを加え、40℃で撹拌しながら反応
させた。15時間後、懸濁状の反応混合液を得た。
この液にトルエン600mlを加え、40℃で20分間撹
拌混合した。撹拌を止めると固形物を懸濁状に含
むトルエン相と均一透明な水相とに分離した。10
分後に固形物を含むトルエン相を水相から分離
し、トルエン相は200mlの0.5％酢酸カルシウム水
溶液で２回洗浄を行なつたのち、固形物をガラス
フイルターを用いてろ過により分離した。乾燥
後、酢酸エチル−ｎ−ヘキサン混合溶媒から再結
晶を行ない、Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−α
−Ｌ−アルパルチル−Ｌ−フエニルアラニンメチ
ルエステル（以下、Ｚ−APMと云う）と主にＤ
−体のフエニルアラニンメチルエステル（以下、
Ｄ−PMと云う）との１：１の付加化合物101.1g
（収率83.2％）を得た。この結晶が、Ｚ−APMと
主にＤ−PMの１：１の付加化合物であること
は、NMR、IR、元素分析、旋光度が特開昭53−
92729号公報に開示されているデータと同一であ
ることにより確認した。 実施例 ２ 実施例１において粗製サーモライシンを7.2g、
酢酸カルシウム−水塩を1.3g、反応時間を８時間
にした以外は実施例１と同様にしてペプチド生成
及び付加化合物の形成反応を行なつた。 反応終了後、トルエンの代りにメチルイソブチ
ルケトンを１使用した以外は実施例１と同様に
処理を行なつた。固形物を懸濁液で含有したメチ
ルイソブチルケトン相は分離後、ロータリーエバ
ポレーターで溶媒を留去したのち、残渣を酢酸エ
チル−ｎ−ヘキサン混合溶媒から再結晶し、Ｚ−
APMとＤ−PMの１：１付加化合物102.2g（収率
84.1％）を得た。 実施例 ３ 実施例２と同様にしてペプチド生成及び付加化
合物の形成反応を行なつた。反応終了後、メチル
イソブチルケトンの代りにジイソプロピルエステ
ル500mlを使用した以外は実施例２と同様に処理
を行なつた。固形物を懸濁液に含有したジイソプ
ロピルエーテル相は分離後、ロータリーエバポレ
ーターで溶媒を留去したのち、残渣を酢酸エチル
−ｎ−ヘキサンから再結晶し、Ｚ−APMと主に
Ｄ−PMの１：１付加化合物96.5g（収率79.5％）
を得た。 実施例 ４ 実施例２において、DL−フエニルアラニンメ
チルエステル塩酸塩の代りにＬ−フエニルアラニ
ンメチルエステル塩酸塩を用いた以外は実施例２
と同様にしてペプチド生成及び付加化合物形成反
応を行なつた。反応終了後、メチルイソブチルケ
トンの代りにメチルイソブチルケトン900mlとト
ルエン100mlの混合溶媒を用い、実施例２と同様
に後処理を行なつた。固形物を懸濁状で含有する
有機相は、水相から分離したのち、ロータリーエ
バポレーターで溶媒を留去し、残渣を酢酸エチル
−ｎ−ヘキサンより再結晶し、Ｚ−APMとＬ−
フエニルアラニンメチルエステル（以下、Ｌ−
PMと云う）の１：１付加化合物98.68g（収率81.2
％）を得た。 Ｚ−APMとＤ−PMの１：１付加化合物であ
ることは、NMR、IR、元素分析、旋光度が特開
昭53−92729号に開示されているデータと同一で
あることにより確認した。 実施例 ５ Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−アスパラ
ギン酸5.345gとDL−フエニルアラニンメチルエ
ステル塩酸塩10.784gを200mlのフラスコにとり、
蒸留水40ml、5N−カ性ソーダ水溶液10ml及びサ
ーモライシン200mg、酢酸カルシウム−水塩130mg
を加え、40℃で撹拌しながら反応させた。７時間
後、反応混合液にメチルイソブチルケトン100ml
を加え、40℃で20分間撹拌混合した。撹拌停止10
分後、固形物を含む有機相と均一な水相とを分離
し、有機相は20mlの0.5％酢酸カルシウム水溶液
で２回洗浄を行なつた後、ロータリーエバポレー
ターで溶媒を留去し、残渣を酢酸エチル−ｎ−ヘ
キサンより再結晶し、Ｚ−APMと主にＤ−PM
の１：１の付加化合物の結晶10.34g（収率85.2％）
を得た。 実施例 ６ サーモライシンの代りにPS−プロテアーゼ1g
を用いた以外は実施例５と同様の操作でペプチド
生成、付加化合物の形成及び反応後の処理を行な
つた。再結晶後、得られたＺ−APMと主にＤ−
PMの１：１付加化合物の収量は9.87g（収率81.2
％）であつた。 実施例 ７ Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−α−Ｌ−アス
パルチル−Ｌ−フエニルアラニンメチルエステル
のトリウム塩50gを20mlの水に溶解し、この液を
DL−バリンメチルエステルの塩酸塩5.0gを含む
20mlの水溶液中に撹拌しながら滴下した。室温に
２時間静置したのち、50mlのメチルイソブチルケ
トンを加えて撹拌した。有機溶媒相を水相から分
離したのち過乾燥し、Ｎ−ベンジルオキシカル
ボニル−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フエニルアラニ
ンメチルエステルとバリンメチルエステルとの付
加化合物5.9gを得た。 この付加化合物を１規定の塩酸水溶液で処理し
た光学純度72％のＤ−バリンメチルエステルを得
た。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 一般式 で表わされるジペプチドエステルとアミノ酸エス
   テルとの加付化合物（式中R₁及びR₄は低級アル
   キル基、R₂及びR₃はアミノ酸の側鎖基、Ｘは置
   換基を有することのあるベンジルオキシカルボニ
   ル基であり、ｎは１又は２である）を固相で含む
   水性混合液に水と二相を形成することのできる有
   機溶媒を加えて混合し、この付加化合物の実質的
   部分を固相で含む有機溶媒相と水相との二液相を
   形成させ、有機溶媒相を水相から分離し、この付
   加化合物を有機溶媒のスラリーとして回収するこ
   とを特徴とするジペプチドエステルとアミノ酸エ
   ステルとの付加化合物の回収法。 ２ 水と二相を形成することのできる有機溶媒が
   水と二相を形成することのできるケトン類、脂肪
   族系もしくは芳香族系の炭化水素類又はエーテル
   類である特許請求の範囲第１項記載の回収法。 ３ 水と二相を形成することのできる有機溶媒を
   付加化合物を完全に溶解できる量未満の量で用い
   る特許請求の範囲第１項又は第２項記載の回収
   法。 ４ 水と二相を形成することのできる有機溶媒を
   付加化合物１重量部に対して約１ないし約20重量
   部の量加える特許請求の範囲第１項ないし第３項
   のいずれかの項記載の回収法。 ５ 付加化合物のジペプチド部分がLL−型であ
   る特許請求の範囲第１項ないし第５項記載の回収
   法。 ６ 水性混合液が一般式 で表わされるアミノ酸エステル（式中R₁は低級
   アルキル基、R₂はアミノ酸の側鎖基である）と
   一般式 で表わされるＮ−保護アミノジカルボン酸（式中
   Ｘは置換基を有することのあるベンジルオキシカ
   ルボニル基であり、ｎは１又は２である）を水性
   媒体中、蛋白分解酵素の存在下で反応させて一般
   式 で表わされるジペプチドエステルとアミノ酸エス
   テルとの付加化合物（式中R₁、R₂、Ｘ及びｎは
   前記同様であり、R₃及びR₄はそれぞれR₂及びR₁
   と同一の基である）を生成させた反応生成液であ
   る特許請求の範囲第１項ないし第５項のいずれか
   の項記載の回収法。 ７ 付加化合物、アミノ酸エステル及びＮ−保護
   アミノジカルボン酸の一般式中のR₁及びR₄がメ
   チル基、R₂及びR₃がベンジル基、ｎが１である
   特許請求の範囲第６項記載の回収法。 ８ 用いるアミノ酸エステル及びＮ−保護アミノ
   ジカルボン酸がそれぞれ独立にＬ−型又はＬ−型
   とＤ型の混合物である特許請求の範囲第６項又は
   第７項記載の回収法。 ９ 用いる蛋白分解酵素が金属プロテアーゼであ
   る特許請求の範囲第６項ないし第８項のいずれか
   の項記載の回収法。