JPS58219120A - 細胞および組織再生作用物質の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は哺乳動物の臓器および体液中に存在し、それよ
り抽出することができ、創傷の治癒を促進する作用を有
する既知化合物（ヨーロッパ特許登録番号第８１１０２
８４８．９号、公開番号第００３８５１１号）に関する
ものである。上記公開公報によれば、抽出された作用物
質は特にグリコステロイドの構造ならびにグリコスフイ
ンゴリピツドの構造を有する。

グリコステロイドは次の構造式に適合するものである。

即ち： 但し式中、Ｒは５個の糖単位から成るオリゴ糖残基を意
味する。

グリコスフィンゴリピッドは次の構造式を以てＣＨ３−
（ＣＨ２）９−ＣＩ−Ｉ　＝　ＣＪ（−ＣＨ２−ＱＣ’
但し式中、ｋは５個の糖単位から成るオリゴ糖残基を意
味する。

これらの化合物は心臓、肺、筋肉および肺臓の如き臓器
および血液、血漿および血清の如き体液から分離される
。化合物を産生ずる哺乳動物はヒト、ブタ、馬、羊およ
び牛である。

前記、特許公報による製造法は、特に活性炭への吸着（
アフィニティクロマトグラフィー）および１０〜３０％
酢酸によるその抽出、分子ふるいを用いた第２のクロマ
トグラフィーおよび希酢酸によるその溶出、シリカゲル
を用いた第３のクロマトグラフィーと工□”タノールと
メチレンクロライド混合液による溶出、ならびにＣ８−
鎖で被覆せるシリカゲルを用いたクロマトグラフィーと
酢酸、エタノール、水の混合液によるその溶出を包含す
る。

今回、上にかＮげた同一の出発原料から、初めに出発原
料をアルコール性−水性溶媒に対して自己溶解（分解）
させ、次いで透析を行なうと、細胞−および組織−再生
活性を有する同様のグリコリピッドが、本質的に高収量
で得られるという意外な事実が見出だされた。かくして
別件公知の製法によって得られるよりはるかに大量に、
目的とする作用物質か濃縮されている粗製品を入手でき
ることとなった。

何よりも更に有益なことは、先に言及したグリコステロ
イドが治療上の使用に際し充分に安定でなかったという
ことが、今回見い出された製造法の開発により明らかに
されたことである。

本発明者らは、粗製品から、（Ａ）エタノール性溶液か
ら、例えは約−２０℃の如き低温で沈澱させるか、ＣＢ
）水と全く混合しないかまたは制限的にしか混合しない
有機溶媒を用いて抽出し、（Ａ）ならびに（Ｂ）の段階
により得られた生成物をシリカゲル上、またはイオン交
換樹脂上で極性の低い溶媒を用いてクロマトグラフィー
にかけるという極めて簡単な方法によりグリコリピッド
を分離できることを見出した。クロマトグラフィーによ
る分離が経費を要することを考慮すると、一連のクロマ
トグラフィー操作を不可欠とする従来法に比べて、新た
に開示された上記製造法の著しい優位性は特に工業的規
模の応用に際し注目されるべきである。

本発明は、旧製法と対比して、工業的規模で実施するに
際して優れているだけでなく、更に自己溶解と透析とい
う本質的段階を向流操作により同時に且つ連続的に行な
うことができる点で特に明らかに新規性を備えている。

本発明に基づく方法は′、血液又は臓器のホモジネート
を自己分解およびアルコール性水性溶媒に対する透析に
かけるという点で特徴づけられる。

以下、発明の詳細について記す。

前述の如く、哺乳動物のフィブリンを除いた血液および
臓器のホモジネートを出発原料とするが、牛または子牛
の血液、とりわけ後者が望ましい。

前述の如く、出発原料の自己溶解と分解産物の透析が実
施される。先ず、出発原料に短鎖アルコール、特に１０
〜３０％濃度のメタノールまたはエタノール、および防
腐剤として、特に４−ヒドロキシ安息香酸メチルエステ
ルまたは４−ヒドロキシ安息香酸プロピルエステルの０
．１〜０．０００１％濃度を加えて、自己溶解中に生成
する物質を溶解し易くする。自己溶解は４℃から室温ま
での温度で、数時間から、２．３日の経過時間、例えば
３日間原料物質を放置することにより行なわれる。しか
＼ し、向流操作法により両者の工程を同時に継続して進行
させ、自己溶解生成物を絶えず除去することにより、出
発原料の側の平衡か自己溶解反応へと絶えず移行する様
にするのが好都合である。自己溶解中にリソシームの如
き細胞内の分解酵素、例えばカテプシンおよびその他の
蛋白分解酵素、更にヌクレオチダーゼ、エステラーゼ、
フォスファターゼ等が遊離する。分子量１ｏｏｏｏ以下
の成分が透析物量に見出され、目的とするグリコリピッ
ドはその中に含まれる。透析は自己溶解の促進と同時に
、特に治療適用に際しアレルギー反応の誘因となるよう
な蛋白の除去をも行なう。透析中の成分をとり込むため
の溶媒としては、水と低級脂肪族アルコール、例えば目
的に応じメタノールまたはエタノールの混合液が用いら
れる。特に適した混合液は水とｌＯ〜３０容積％のエタ
ノール、例えば１５容積％のエタノールを含有する水で
ある。

必要あれば、粗製品はその後の単離操作および分離操作
に対し中間的に保護する。ペプチド化学でこの目的のた
めに知られている一般的なこの種の保護基が、この場合
適用される。保護基の選択的な導入により、作用物質の
官能基を保護し、作用物質を反応混合液から抽出するの
に都合のよい形に変化させる。ついで単離精製後、保護
基を離脱せしめる。使用に適している保護基およびその
離脱方法の例としてはベンゾイル基／希アルカリ溶液に
よる離脱；ベンゾイルオキシカルボニル基／臭化水素の
氷酢酸、トリフルオロ酢酸またはその他の有機溶媒溶液
中、塩化水素のエタノール溶液中、トリフルオロ酢酸溶
液中での加温による離脱、または金属ナトリウムの液体
アンモニア溶液による離脱；ベンジル基およびｐ−）ル
エンスルホン酸基／ナトリウムの液体アンモニア溶液ニ
ヨる離脱；ｔｅｒｔ、−ブチル基／塩化水素の有機溶媒
溶液、臭化水素の氷酢酸またはトリフルオロ酢酸溶液に
よる離脱が挙げられる。ｔｅｒｔ、−ブチル基はイソブ
チン中酸触媒によるエーテル化反応によって導入できる
特に優れた方法である。

得られた透析物からグリコリピッドを単離精製するには
（Ａ）エタノール性溶液を冷却して沈澱させるか、また
はＣＢ）例えば親油性のある種の有機溶媒で抽出し、次
いで無機の吸着剤またはイオン交換樹脂を用いるクロマ
トグラフィーにより行なうことができる。更に抽出（Ｂ
）とクロマトグラフィーとの間にもう一回沈澱による精
製を挿入することは効果的である。

沈澱（Ａ）はエタノール性溶液を−１５〜−２５℃の範
囲の温度にすることにより得られる。エタノールの最終
濃度を高める程、グリコリピッドの収量をよくすること
ができる。そこで少くとも６０容積％の濃度になるよう
適宜無水エタノールを透析物に追加注入する；最終濃度
が９０容積％の場合に最高の成績が得られる。得られた
エタノール性溶液は前記温度でできるだけ長時間静置す
る。

固形成分は濾過、遠心分離または沈積と傾瀉法により分
離できる。次いで生成物を緩和な条件下、即ち最高３７
℃以下の温度で、蒸発乾固させる。蒸発乾固は加温また
は減圧下あるいはその両方を同時に用いて行なわれる。

蒸発乾固した固体または水溶液もしくは有機溶媒中に溶
解した形の透析物に抽出ＣＢ）を組合せる。

抽出には水と全く混合しないかまたは制限的にしか混合
しない有機溶媒またはその混合液が使用される。特にエ
ーテルとしてジエチルエーテルおよびテトラヒドロフラ
ン、炭化水素としてペンタン、ヘキサン、石油エーテル
およびベンゼン、ハロゲン化炭化水素としてクロロ−ホ
ルム、ジクロルメタン、四塩化炭素、１．２−ジクロル
エタンおよびクロロホルムとメタノールとの混合液、ア
ルコールとしてブタノールおよびアミルアルコール、ま
た、カルボン酸エステルとして酢酸エチルおよび酢酸ブ
チルの如きものが適している。

この抽出を通じて粗製物の液／液相または液／固相の分
離が行なわれ、それによって構成成分の極性の低いまた
は無極性の物質と、極性を有するまたはイオン化した物
質との分離が行なわれる。

目的とするグリコリピッドは有機性の極性の低い層へ移
行する。他の液層または固層を分別し、有機溶媒層を前
述の如く注意深く蒸発乾固する。

抽出に引続き、金属塩水溶液と、アセトン、ジエチルエ
ーテル、または両者の混合液、あるいはエタノール中、
−１５〜−２５℃の範囲で、その都度、特にその溶解性
に基づきグリコリピッドの沈澱が生成する。水溶液中に
は１〜５価の金属の塩が含まれ、特に無機酸の金属塩が
望ましい。金属１ 塩としては特に塩化マグネシウム、塩化・カルシウム、
塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸アンモニウム、硫
酸ナトリウム、硫酸カリウム、硝酸ナトリウム、リン酸
水素ジナトリウムおよびリン酸二水素す）　ＩＪウムが
挙げられる。その水溶液は飽和に至るまでの任意の濃度
をとり得る。この溶液中に蒸発乾固した残溜物を懸濁ま
たは溶解せしめる。

アセトンとジエチルエーテルとの混合液も使用できるが
、アセトンまたはジエチルエーテル単独、または冷エタ
ノールの使用が優先する。これを、予じめ調製した懸濁
液または溶液に数倍量になるまで追加し全体をよく混和
する。この際に生成する沈澱にグリコリピッドが含有さ
れている；濾過、遠心分離または沈積と傾瀉法によりそ
れを液層から分取する。次いで生成物を慎重に乾燥する
。以上の操作により最初の沈澱生成物が得られる。

アセトン、エーテルまたは冷エタノールと金属塩水溶液
との混合液からグリコリピッドの沈澱が生成する点に溶
解比が到達すると、所期の沈澱物が得られる。液層分離
を行なって得られた生成物は−特に血液を出発原料とし
ている場合は一十分す濃度の塩を含有しているので、ア
セトン、エーテルまたは冷エタノールを追加するだけで
沈澱が生成される。このように金属塩または金属塩溶液
を特に追加しなくとも、この操作法により第２段階の沈
澱生成物が得られる。

第３段階の沈澱生成も全く同様の抽出と沈澱生成の操作
を実施することにより得られる。透析物を前に述べた水
と全く混合しないかまたは制限的にしか混合しない有機
溶媒とアセトンまたはエーテルとの混合液で、その相互
の量的関係と、また透析物の量および含有している金属
塩の濃度とに応じて、処理し、かくすることによりグリ
コリピッドを含有する沈澱を生じさせることができる。

液層から前述の如く沈澱物を分取し、注意深く乾燥する
。

最後の工程は、エタノール沈澱法（Ａ）または抽出法（
Ｂ）により得られた生成物をクロマトグラフィーの手法
により精製することにある。この場合、無機の吸着剤、
特にシリカゲルまたはシリカゲルと金属酸化物または無
機酸塩との混合物、例えば市販のシリカゲルと酸化アル
ミニウム、酸化マグネシウムあるいは硫酸マグネシウム
との混合物が適しており、またさもなければイオン交換
樹脂、特にジエチルアミノエタン−セルローズ、カルボ
キシメチルセルローズまたはスルホプロピルセルローズ
の如き塩基性および酸性セルローズ誘導体が適−してい
る。

まず初めに生成物を少量の極性有機溶媒に溶解する。溶
媒としては、特にメタノール、メタノールとクロロホル
ムの混合液、エタノールとクロロホルムの混合液および
、更にそれに酢酸エチルを加えたもの、およびメタノー
ル、クロロホルムと少量の水との混合液が適している。

溶液を、あらかじめ同じ溶媒かまたは上に挙げた他の水
を含まない溶媒中で処理した吸着剤を充填したクロマト
グラフィーカラムにかける。溶出には同じ溶媒または溶
媒混合液を使用する。更に使用する混合溶媒の極性を順
次高めて行くことにより、即ち直線的、凹型または凸型
、あるいは段階的な濃度勾配を適用することにより、定
量的に組成物を得ることができる。

溶出液の各分画について種々の試験法により、グリコリ
ピッドの存在、含量および純度を測定できる。実験の部
に記載した如く、グリコリピッドもしくはグリコスフイ
ンコリピツドには特徴的な発色反応および呈色試験法が
ある。またその分画は、シリカゲノペＣ−１８−アルカ
ン誘導体で処理したシリカゲル、ポリアミド、セルロー
ズまたはポリアクリルアミドで層を作った薄層板または
薄層膜上で適当な展開剤により更に分離できる。

分離した物質は、例えばクロロホルムとメタノールの如
き無水性溶媒で板上または膜上から溶出せしめた後、こ
の物質を用いて薄層クロマトグラフィー、加水分解と分
解産物の分析、ガスクロマトグラフィー、質量分析、唾
乳動物における表皮損傷の治癒期間短縮作用の確認、あ
るいは細胞培養に対する挙動の観察により試験する。得
られた結果はグリコスフインコリピツドが活性成分とし
て働いていることを示している。

以下に記載する薬理学的試験により、得られた作用物質
はインビトロで予じめ損傷を与えた線維芽細胞に対しは
つきりした増殖促進効果を示し、またインビボでもこれ
に対応した細胞群に対する再生促進効果をもつことが証
明された。正常に保たれている健康な細胞培養にこの物
質を添加しても何らの変化をも示さないことから、この
場合、通常の有糸分裂に作用するような物質として働い
ているのではないことは明らかである。これに反し、種
々の傷害要因により予じめ損傷を与え細胞分裂速度が異
常に低下している培養では、それによって短時間の間に
健康な培養と事実り異らない正常な分裂速度に回復する
。

本発明に従って製造された物質によって、インビトロの
みならずインビボにおいても、損傷を受けた細胞群の修
復機序が活性化される事実に基づき、本物質は特に修復
機能が低下している慢性化した、または治療し難い創傷
または潰瘍の治療的使用に適したものである。

本物質の創傷の修復促進作用を以下の動物実験により示
す。

実験　１゜ 麻酔したラットを刺毛し、胴体の両側に載せた直径２ｃ
の真鍮円板を通じて２７０℃の熱を３０秒間加え火傷を
起す。作用物質を２０％濃度になるようにシェリー基剤
に加え治療用シェリーを調製する。対照として水または
生理食塩液を加える。

それぞれ２箇所ずつの傷をもった動物１０匹を１日２回
ずつそのシェリーで局所的に治療し、完全冶癒するまで
の期間を記録する。実施例２に記載したＲ（値、０．６
５の物質は対照に比し治癒期間を２１％まで短縮した。

実験　２゜ ミニ豚の背面に、実験ｌに記載した如くそれぞれ４箇所
ｒつ火傷を作り、更にコルクポーラを用いて直径２．５
印の搾孔側を４箇所つける。作用物質はシェリー基剤を
用いて２０％含量になるよう調製する。１日２回ずつシ
ェリーを傷に塗布し、完全治癒までの期間を記録する。

ＦＬ（値０．６５の物質は治癒期間を１８％短縮する。

実験　３゜ ミニ豚に実験１に記載した如く火傷を起す。毎日、傷の
治療を行ない、（治療開始後）６日、１２日、１８日お
よび２２日目に治療群から動物を分離し、麻酔下に屠殺
する。傷を切りとり、半分ずつに分け、４％中性緩衝ホ
ルマリン液で固定する。

この組織片をパラフィン切片とし、４μの厚さの病理切
片を作る。以下のパラメータを定着的に実測する。

１、上皮形成をしている創傷の表面の長さ２、上皮形成
をしていない創傷表面の長さ３、表皮基底層の長さ ４、新生表皮の平坦さ ５、毛嚢および皮脂腺の平坦さ パラメーターを評価した結果、実施例２〜６に記載され
ている精製物質は上皮の舌状突起（Ｅｐｉｉ−ｈｅｌｚ
ｕｎｇｅｎ）の形成とその損傷中心方向への伸びを対照
動物に比し促進することが示された、創傷の治癒促進作
用は間質、基底層、（皮膚）乳頭が形成される早い時期
に優位に示される。

実験　４゜ 麻酔したラットに幅１α、深さ５ｒＩｎのうち抜き傷を
つける。この傷口にビスコースーセル口−ズ−中空円柱
−海綿をとりつける。この円柱の空洞の内側に毎日１０
０μノの精製した物質を加える。

移植後４．ｔｏ、１６．２１日口重海綿をとりその内容
物のヘモグロビン、デスオキシリボ核酸（ＤＮＡ　）、
ハイドロキシプロリン量を分析する。精製物質で処置し
た創傷の側は移植後４日およびｐ日までは対照動物と比
較して、移植した海綿中のヘモグロビン、ＤＮＡおよび
ハイドロキシプロリン含量はなんら高値を示さなかった
が、１６日から２１日まででは海綿中のヘモグロビン−
１ＤＮＡ−、ハイドロキシプロリン量は有意に高値を示
した。この方法に関してはＪ　、Ｎｉ　１ｎｉｋｏｓｋ
ｉおよびＳ、　Ｒｅｎｖａｌｌ、　Ａｃｔａ　Ｃｈｉｒ
、　５ｃａｎｄ、１４５　（１９７９）、２８７−２９
１、参照。

実施例２〜６により得られた精製物質によって、毛細管
を伴う間質および基底層の形成初期において創部冶癒作
用は促進され、る。

実験　５゜ 例えば成長している線維芽細胞の如き細胞培養において
培養基中の炭酸水素すｌ−ＩＪウムを省くと発育が阻害
される。実施例２〜６に記載した物質を培養基に添加す
ることにより、対応する阻害されたままの未処理の細胞
培養より、細胞そのものはより速かに阻害作用をもとに
もどし、明らかにより早く正常な分裂速度に再び達する
結果を得た。

実施例中の溶媒混合に関連した数の記載は常に容積で示
しである。例えばエーテル：エタノール＝３＝１とは３
容債のエーテルと１容積のエタノールとの混合液を示し
ている。

実施例１ 屠殺場から子牛の血液を屠殺後直ちに入手し、２０％エ
タノールと混和する。防腐剤としてｐ−ヒドロキシ安息
香酸メチルエステル（メチルパラベン）およびＰ−ヒド
ロキシ安息香酸エステル（プロピルパラベン）をその都
度０．０２％濃度まで加える。その血液を３日間室温で
自己溶解させ、その間に安定でない成分が部分的に分解
を起すような強い溶血が起り、また膜の構成成分が膜か
ら溶出される。この自己溶解物は傾瀉法により沈渣から
分取し、その上清を３日間、静的または動的に透析限界
分子量１０′０００の膜を通して透析する。

動的透析の場合は、透析液と透析外液との濃度勾配をで
きるだけ大きく維持するためにポンプを用い、３日間透
析膜を通じて向流操作を行なう。

得られた透析外液は５〜８０ｍｇ／Ｐ／の乾燥重量をも
ち、１ｍ９７ｍ１までの範囲の傷治癒促進物質を含む。

冒頭に既述したヨーロッパ特許公報に基づく方法では対
応するグリコスフインゴリピツドの含量は０．００５　
’ｎ９　／　ｍｌの範囲である。

実施例２ ２リツトルの子牛の血液を３００ｍ１のエタノールと混
和し、３日間室温で自己溶解させる。その分解物を濾過
限界１０’０００（分子量）までの限外濾過器にかけて
濾過し細胞断片および大きい蛋白質を除く。濾液を３＝
１の割合のエタノール：エーテル混合液６リツトルと混
合すると、主としてグリコスフインゴリピツドから成る
沈澱物が生成する。沈澱物を１８’０００！ｉ’回転で
＋３０分間遠心分離し液層と分離する。

沈澱物を減圧下３７℃で乾燥し、クロロホルム：メタノ
ール（６５：　３５）の混合液２０−に溶解する。溶解
させたグリコスフインゴリピツドを直径５．０　ｃｍ　
、長さ４０口のＦｌｏｒｉｓｉｌ−カラム（商品名；高
い選択能をもつマグネシウムシリケートゲル吸着剤、Ｆ
ｉｒｍａ　Ｆｌｏｒｉｄｉｎ　Ｃｏｒｐ、Ｐｉｔｔｓｂ
ｕｒｇｈ。

ＰＡ、ＵＳＡ製）を用い、クロロホルム：メタノール比
６５　：　３５の平衡を保ちつつクロマトグラフにかけ
て分離し、残余の燐脂質分を除去する。

グリコリピッドはクロロホルム中それぞれ３５％、５０
％、７５％メタノール混液２ノずつで濃度勾配溶出法に
より溶出し、最後に１００％メタノールで溶出する。濃
度勾配溶出法により得られた物質は先に記載の創傷治癒
試験を行ない、最後の１００％メタノール溶出分画中に
創傷治癒促進物質が含まれていることが確認された。

この物質が含まれている分画を、２ｒｒｍの厚さに調製
したシリカゲルの薄層板上に置き、クロロホルム：メタ
／　−／Ｉ／　：　０．１％Ｃａ　Ｃ４２水溶液（−５
５：４５：１０）の展開溶媒で１８Ｃ＋＋＋の距離の上
昇クロマトグラフィー展開を行なう。クロマトグラフィ
ー終了後、薄層板を乾燥し、ヨード蒸気飽和の室内に短
時間放置する。かくして得られた発色帯を標識し、ヨー
ドを昇華して除去し、クロロホルム：メタノール（＝５
０　：５０）でシリカゲルを溶出する。上記の薄層クロ
マトグラフィーによる分離法でＪ−値０．６５を示す分
画を用い、ラットによる火傷の治癒時間短縮作用試験を
行ない陽性の結果を得た。

実施例３ 実施例１の透析外液２リツトルを回転蒸発装置中または
凍結乾燥法により蒸発乾固し、次いでテトラヒドロフラ
ン：０．０１モルＫＣＪ液の比が４：１の混液４リツト
ルで抽出する。不溶物を濾紙上で濾別し、透明な濾液を
回転蒸発装置で５００−まで濃縮する。これにクロロホ
ルム：メタノール比２：１の混液１リツトルを加え、更
に２００ｄの水を加えて有機溶媒層と水層に分離する。

グリコリピッドを含有する上層を分取し、濃縮乾固する
。

乾燥物質をクロロホルム：メタノール：水＝９０：１０
：０．２の混液１０ｍ１に溶解し、クロロホルム：メタ
ノール：水＝９０：ｔｏ：０．２の混液中で平衡に達せ
しめた直径１．５Ｇ、長さ１２００のＢｌｏ−８ｉｌ　
Ａ−ｓＡｕｒｅカラムに吸着させる。カラムを１．５リ
ツトルの同じ展開液で洗滌後、グリコリピッドをクロロ
ホルム：メタノール：水＝８５：１５：０．２の混液ｌ
リットルでカラムから溶出させる。この操作により精製
した物質は、火傷の治癒期間短縮作用を有するグリコリ
ピッドである。

実施例４ 実施例１の透析外液２リツトルを、実施例２に記した如
くエタノール：エーテル比３：１の混液で抽出し、その
沈澱物をクロロホルム：メタノール＝２＝８の混液２０
ｍ／中にとる。ジエチルアミノエチル−セファデックス
Ａ５０のＣノー型を０１ＩＮ−苛性ソーダ波とｌＮ−酢
酸で洗滌してアセテート型とし、メタノールで洗滌婢、
直径２．５　ｃｍ、長さ２０ｃＩｎのカラムに充填し、
クロロホルム：メタノール＝２−８の混故に溶解させた
物質を吸着させる。０．０１Ｍ酢酸ナトリウム、０．０
２Ｍ酢酸ナトリウム、０．２ＭＩ￥Ｆ酸ナトリウム液そ
れぞれ２００ｍ１でカラムを洗滌した後、次にクロロホ
ルム：メタノール比２：８の混合液でグリコリピッドを
溶出する。この方法により溶出したグリコリピッドは火
傷の治癒期間短縮作用を有する。

実施例５ 実施例１の透析外液２００ｍ１を回転蒸発装置中または
凍結乾燥法により乾固するまで濃縮し、デシケータ−中
、五酸化燐上で少くとも３時間乾燥する。乾燥物を新た
に調製した無水安息香酸の２０％ピリジン溶液１５−中
に加え、ついでＰ−ジメチルアミノピリジンの１０％ピ
リジン溶１１５ｍ／を加える。容器を固く密閉し、２時
間、３７℃に保温する。容器を冷却し、内容物を濾過ま
たは遠心分離することにより不溶物を分離除去する。

窒素気流中でピリジンを除去し、乾固した物質を３０ｍ
／のへキサンで抽出する。このヘキサン液をメタノール
：水−８０：２０の０．４Ｐ／１００−の炭酸ナトリウ
ムを含むアルカリ性メタノール−水溶液各１８ｍ１ずつ
で３回洗滌する。ヘキサン層を窒素気流中で蒸発乾固し
、４％酢酸エチル含有のヘキサンで抽出する。

クリコリピッドのペルー〇−ベンゾイル化物をシリカゲ
ルカラムを用いた高圧液体クロマトグラフィーにかけ、
４％〜４５％の濃度勾配を有する酢酸エチル含有へキサ
ンを用いて溶出する。この操作により単離されたペルー
〇−ベンゾイル化グリコリピッドは、０，６Ｎ苛性ソー
ダ溶液中で１時間、３７℃で加水分解してベンゾイル基
を離脱させる。加水分解物を５倍量のアセトンと混合し
、沈澱して来る遊離のグリコリピッドを濾過または遠心
分離により得る。

この方法により精製されたグリコリピッドは火傷の治癒
期間短縮作用を有する。

実施例６ 透析物を９倍量のエタノールに混和し、３０分間８５℃
で攪拌する。この時生じる沈渣を濾紙上で除き透明な濾
液を一２０℃で３日間放置する。

この間に目的とする物質が析出し沈澱する。上澄液を傾
瀉して除き、沈澱にクロロホルム：メタノール−２＝１
の混液を加え、アセテート型のジエチルアミンエチル・
セファセル・カラムに吸着させる。カラムをクロロホル
ム：メタノール＝２：ｌの混液で溶出し、溶出液を集め
る。これを回転蒸発装置中で蒸発乾固しクロロホルム中
に溶解する。クロロホルム中で活性化させたシリカゲル
を充填したカラム上にこの溶液を吸着させる。最初にク
ロロホルム、次いでクロロホルム：メタノール−９＝１
の混液で洗い、この溶出液は除く。次にアセトン：メタ
ノール−９：ｌの混液で洗い、この分画に目的とするグ
リコリピッドが純粋な形で含有されている。

物質の確認法 実施例２により得られた精製物質をシリカゲル薄層板上
でメタノール：クロロホルム：０．１％ＣａＣノ２水溶
液−５５　：　４５　：　１０の展開液を用いクロマト
グラフィー分離を行なう。

比較物質として下記の物質の混合物を同時に処理する：
無唾液症神経節細胞（以下Ａｓ　ｉ　ａ　ｌ　Ｏ−ＣＭ
Ｉと略す）　１．　Ａｓｉａｌｏ−ＧＭ２、Ａｓｉａｌ
ｏ−ＧＭ３．Ａｓ１ａｌ。

−ＧＤ　ｌ　ａ　ｓセレブロシツド、プシコシン。

薄層板は下記の方法により発色させる：１、２０〜のタ
レジルヴアイオレットのｌｏｏｏｍｌ。

１％酢酸溶液；青紫色に発色。

２、　１％ジフェニルアミンのエタノール溶液２ｍ／。

１００ｄ濃塩酸および８０ｍ／酢酸混液；赤色に発色。

３、最初に、５．２５％次亜塩酸のベンゼン溶液４０ｉ
と５−酢酸混液を噴霧、乾燥後、１％ベンチジンの５０
％エタノール液；青色に発色。

４、Ｏ，１ｇのオルシノールの１％塩化鉄（ＩＩＩ）溶
液ｌ−と５０−の水；褐色に発色。

５、　ヨード蒸気飽和の室内に薄層板を放置する。

試験物質と同様比較物質もともにＲｆ−値０．６５に黄
色に発色する。

６、波長２５４　ｎｍ右よび３６５　ｎｍに対する螢光
指示薬を加えた薄層板を用いる。Ｒ（−値０．６５の位
置の試験物質の螢光は、比較物質の薄層板の螢光が変化
しないのと同様に弱められない。

７、０．２％ナフトレゾルシノールのアセトン溶液およ
び１０％燐酸を噴霧試薬とする。処理した板を５分間９
０℃に加熱する；青−赤色に発色。

８．１ｆｉ’ｐ−アニシデインの７０％エタール１０〇
−液；青色に発色。

定性および定量試験 実施例２により得られた精製物質１ｒｎｌを回転蒸発装
置中で減圧下３７℃で、あるいは凍結乾燥法により蒸発
乾固する。乾燥物質を２Ｍ硫酸０．８　ｒｎｌとジオキ
サン０．４ｄ中にとりアンプル中に封入する。検体を９
５℃で３時間加温、加水分解し、その後１ＯＮ苛性ソー
ダ液０．１４ｍ１を加えて中和する。中和した加水分解
物に０．２Ｍホウ酸ナナトリウム緩衝液１．６６を加え
、ｐＨ８，０に調製し、２．０−のジエチルエーテルで
分液ロート中で５分間抽出する。１層を除き、上層のエ
ーテル層を水浴上３７℃で蒸発乾固する。乾燥物質を０
．００２５％のフルオレスカミン−４−フェニルスピロ
−〔フラン−２（３Ｈ）−１’−フタラン］　−３，３
’−ジオン〔Ｍ、　Ｎａｏ　ｉ　、　Ｊ　、　Ｃ，Ｌｅ
ｅ　およびＳ、Ｒｏｓｍａｎ、　Ａｎａｌ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、５８（１９７４）、５７１−５７７３
を含む３−のクロロホルム液にとり、３０秒間混合する
。

励起波長３８５　ｎｍおよび螢光波長４８Ｑ　ｎｍで、
この溶液の螢光強度を特徴する

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、哺乳動物の血液または組織ホモジネートをアルコー
   ル性水性溶媒に対する自己分解および透析にかけること
   を特徴とするグリコリピッド系の細胞および組織再生作
   用物質の製造方法。 ２、向流操作により同時にしかも連続して自己分解と透
   析とを実施することを特徴とする特許請求の範囲第１項
   に記載の方法。 ３、出発原料として牛または子牛の血液、特に後者を使
   用することを特徴とする特許請求の範囲第１項または第
   ２項に記載の方法。 ４、得られた透析物にエタノールを加えて調製したエタ
   ノール溶液を、−１５〜−２５℃の範囲の温度で静置せ
   しめることによりグリコリピッドを沈澱分取することを
   特徴とする特許請求の範囲第１項、第２項または第３項
   のいずれかに記載の方法。 ５、水に全く混合しないがあるいは制限的にしが混合し
   ない溶媒もしくは溶媒混合物を、得られた透析物に加え
   て固／液層または液／液層に分離することにより、グリ
   コリピッドを固層または極性の低い有機液層に移行させ
   、グ１．リコリピツドを含む層を分別し、場合により有
   機層を緩和な条件下に蒸発乾固することを特徴とする特
   許請求の範囲第１項、第２項または第３項のいずれかに
   記載の方法。 ６、透析物を固／液層もしくは液／液層に分別する目的
   で、エーテル、炭化水素、ハロゲン化炭化水素、アルコ
   ール、カルボン酸エステルの如キ水と全く混合しないか
   または制限的にしか混合しない有機溶媒またはそれらの
   混合液を使用することを特徴とする特許請求の範囲第５
   項に記載の方法。 ７、特許請求の範囲第１項〜第６項の方法に従い製造さ
   れた細胞および組織再生作用を有する物質。 ８６特許請求の範囲第７項により得られた物質を作用成
   分とする創傷および潰瘍治療剤。 ９、血行障害、下腿潰瘍、糖尿病性壊痘、創傷、放射線
   障害、火傷、植皮手術および脳代謝障害の治療に有用な
   特許請求の範囲第８項に記載の治療剤。