FI77373C - Foerfarande foer tillvaratagande av cell- och vaevnadsregenererande substanser. - Google Patents

Description

77373

Menetelmä soluja ja kudoksia uudistavien aineiden talteen saamiseksi

Keksintö koskee menetelmää soluja ja kudoksia uu-5 distavien aineiden talteen saamiseksi nisäkkäiden verestä tai elinhomogenaateista.

Nykyisin tunnetaan jo tiettyjä yhdisteitä (eurooppalainen patenttihakemus no. 81102848.9, julkaisu-no. 0 038 511), jotka esiintyvät nisäkkäiden elimissä 10 ja ruumiinnesteissä tai, joita voidaan uuttaa niistä ja, joilla on haavan parantumista nopeuttava vaikutus. Mainitun julkaisun mukaisesti uutetuilla vaikuttavilla aineilla on erityisesti glykosteroidin tai glykosfingo-lipidin rakenne.

15 Glykosteroidin tulee vastata seuraavaa rakenne- kaavaa: 0 0

25 H CT

jossa R on viidestä sokeriyksiköstä koostuvan oligosakkaridin tähde.

Glykosfingolipidillä puolestaan tulee olla seu-30 raava rakenne: 2 77373

OH

CH3-( CH2) x-CH2/<V^Np-CH2-0-R

^JH

5 CH3~(CH2)g—CH=CH—CH2—OC

jossa R on viidestä sokeriyksiköstä koostuvan oligosakkaridin tähde.

Nämä yhdisteet on eristetty elimistä, kuten sydä-10 mestä, keuhkoista, lihaksista ja pernasta, ja ruumiin nesteistä, kuten verestä, plasmasta ja seerumista. Nisäkkäitä, jotka tuottavat näitä yhdisteitä, ovat ihminen, sika, hevonen, lammas ja nauta.

Mainitun patenttihakemuksen mukainen valmistusme-15 netelmä käsittää erityisesti aktiivihiiliadsorption (affiniteettikromatografia) ja 10-30 %:sella etikkahapol-la uuttamisen, toisen molekyyliseulalla tapahtuvan kro-matografioinnin ja eluoinnin laimennetulla etikkahapolla, ja kolmannen kromatografioinnin silikageelillä sekä elu-20 oinnin etanolin ja metyleenikloridin seoksella tai kroma tograf ioinnin Cg-ketjuilla päällystetyllä silikageelillä ja eluoinnin etikkahapon, etanolin ja veden seoksilla.

Nyt todettiin yllättävää kyllä, että samoista lähtöaineista, jotka on esitetty edellä, voidaan samoin 25 saada glykolipidejä, joilla on soluja- ja kudoksia uudis tavia ominaisuuksia, kuitenkin saantojen ollessa oleellisesti korkeampia, jos lähtöaineelle suoritetaan ensiksi autolyysi ja dialyysi alkoholipitoista - vesipitoista väliainetta vastaan. Täten saadaan itseasiassa raakatuo-30 te, jossa halutut vaikuttavat aineet ovat rikastuneet hämmästyttävästi suuremmissa määrissä kuin miten oli asianlaita jo tunnetun menetelmän kohdalla.

Keksinnön mukaista menetelmää kehitettäessä tosin ilmeni, että aluksi mainituilla glykosteroideilla 35 ei ole terapeuttisessa käytössä riittävää pysyvyyttä, jotta ne ansaitsisivat laajempaa kiinnostusta.

3 77373

Edelleen todettiin myös, että glykolipidit voidaan eristää mainitusta raakatuotteesta merkittävästi yksinkertaisemmalla tavalla siten, että ne (A) saostetaan etanoli-pitoisesta liuoksesta alhaisessa lämpötilassa, esim. suun-5 nilleen -20°C:ssa tai (B) ne uutetaan jollakin veteen sekoit-tumattomalla tai ainoastaan rajoitetusti sekoittuvalla orgaanisella liuottimena ja vaiheesta (A) tai (B) saatu tuote kromatografioidaan silikageelillä tai ionivaihtajalla vähän polaarista liuotinta käyttäen. Jos ajatellaan kroma-10 tografisten erotusten käyttöä, niin silloin on uudella menetelmällä huomattavana etuna tunnettuun menetelmään nähden yksi ainoa välttämätön kromatografiointi, varsinkin jos kyseessä on teollinen käyttö.

Ylipäätänsä uusi menetelmä, joka on selvästi vasta-15 kohtainen vanhempaan menetelmään nähden, soveltuu erinomaisesti teollisessa mittakaavassa tapahtuvaan käyttöön, eikä vähiten sen vuoksi, että autolyysin ja dialyysin oleelliset vaiheet voidaan suorittaa samanaikaisesti ja jatkuvina vas-tavirtamenetelmää käyttäen.

20 Keksinnön mukaiselle menetelmälle on tunnusomaista, että vereen tai elinhomogenaattiin ensin sekoitetaan lyhyt-ketjuinen alkoholi ja bakteerien kasvua estävä aine ja sitten suoritetaan useammista tunneista muutamiin päiviin kestävä autolyysi lämpötilan ollessa 4°C:n ja huoneen lämpöti-25 lan välillä ja dialyysi veden ja alemman alifaattisen alkoholin seosta vastaan, siten että aine, jonka molekyylipai-no on alle 10 000 on dialysaatissa.

Seuraavassa keksintöä kuvataan tarkemmin.

Edellä mainituista lähtöaineista pidetään edullisi-30 na nisäkkäiden elinhomogenaatteja ja verta, josta on poistettu fibriini, kuten naudan- tai vasikan verta, ennen Y; kaikkea jälkimmäistä.

Kuten edellä mainittiin, suoritetaan ensiksi läh töaineen autolyysi ja autolysaatin dialyysi. Autolyysin 35 aikana muodostuvien aineiden liukenemiseksi on edullista lisätä ensiksi lähtöaineeseen lyhyketjuista alkoholia, edullisesti metanolia tai etanolia konsentraation ollessa 10-30 %, ja bakteriostaattista ainetta, edullisesti 4 77373 4-hydroksibentsoehappo-metyyliesteriä tai 4-hydroksibent-soehappo-propyyliesteriä konsentraation ollessa 0,1 -0,0001 %. Autolyysi voi tapahtua siten, että lähtöaineen annetaan seistä itsekseen tietyn ajanjakson ajan, joka 5 on muutamista tunneista joihinkin päiviin, esim. 3 päivän ajan 4°C:een ja huoneen lämpötilan välisessä lämpötilassa. Kuitenkin on edullisempaa suorittaa molemmat toimenpiteet samanaikaisesti ja jatkuvina vastavirtamenetelmää käyttäen, koska autolyysituotteiden jatkuvan poistumisen 10 johdosta tasapaino siirtyy lähtöaineen puolella jatkuvas ti autolyysireaktion hyväksi. Autolyysin aikana vapautuu intrasellulaarisia katabolisia entsyymejä, kuten lysosomeja, esim. katepsiinejä ja muita proteaaseja, edelleen nukleotidaaseja, esteraaseja, fosfataaseja jne.

15 Dialysaatissa on aineita, joiden molekyylipaino on alle 10'000, näiden joukossa haluttuja glykolipidejä. Dialyysi siis saa aikaan, samanaikaisesti autolyysin kiihtymisen ohella, erityisesti niiden proteiinien poistumisen, jotka tuotteen terapeuttisessa käytössä voivat 20 johtaa allergisten reaktioiden syntymiseen. Väliaineiksi aineiden liukenemiseksi dialyysin aikana soveltuvat tarkoituksenmukaisesti veden ja alempien alifaattisten alkoholien, esimerkiksi metanolin ja etanolin seokset. Erityisen hyvin tarkoitukseen soveltuvat seokset koostu-25 vat vedestä ja 10-30 tilavuus-%:sta etanolia, esim. ve destä ja 15 tilavuus-%:sta etanolia.

Mahdollisesti raakatuote suojataan seuraavaksi tapahtuvia eristys- ja erotustoimenpiteitä varten inter-mediäärisesti. Tähän tarkoitukseen soveltuvat melko ylei-30 sesti samat suojaryhmät, jotka ovat tässä tarkoituksessa peptidikemiasta tunnettuja. Liittämällä suojaryhmät selektiivisesti suojataan siis vaikuttavien aineiden funktionaaliset ryhmät ja vaikuttavat aineet saatetaan reaktioseoksesta uuttamiselle edullisempaan muotoon. Eris-35 tyksen ja puhdistuksen päätyttyä suojaryhmät lohkaistaan.

5 77373

Esimerkkejä tarkoitukseen soveltuvista suojaryhmistä ja menetelmistä niiden lohkaisemiseksi mainittakoon bentso-yyliryhmä / lohkaisu laimennetulla alkalilipeällä; bentsyylioksikarbonyyli / lohkaisu bromivedyllä jääeti-5 kassa, trifluorietikkahapossa tai muissa orgaanisissa liuottimissa, kloorivedyllä etanolissa, trifluorietikkahapossa lämpimässä tai metallipitoisella natriumilla nestemäisessä ammoniakissa; bentsyyli- ja p-tolueenisul-fonyyliryhmä/lohkaisu natriumilla nestemäisessä ammo-10 niakissa; tert.-butyyliryhmä/lohkaisu kloorivedyllä orgaa nisissa liuottimissa, bromivedyllä jääetikassa, tai tri-fluorietikkahapossa. Tert.-butyyliryhmä voidaan liittää erityisen hienolla tavalla suorittamalla hapolla katalysoitu eetteröinti isobuteenilla.

15 Glykolipidien eristäminen ja puhdistaminen saa dusta dialysaatista voi tapahtua (A) saostamalla kylmässä etanolipitoisesta liuoksesta tai (B) uuttamalla määrätyillä orgaanisilla, esim. lipofiilisillä liuottimilla, ja tämän jälkeen kromatografioimalla epäorgaanisel-20 la adsorptioaineella tai ionivaihtajalla. Edullisesti voidaan uuttamisen (B) ja kromatografioinnin välillä suorittaa lisäksi eri puhdistusta saostamalla.

Saostus (A) tapahtuu etanolipitoisesta liuoksesta -15 reen ja -25°C:een välisellä lämpötila-alueella.

25 Glykolipidien saannot ovat sitä parempia, mitä korkeam pi on etanolin loppukonsentraatio. Tarkoituksenmukaisesti lisätään dialysaattiin niin paljon vedetöntä etanolia, että siitä saavutetaan vähintäin 60 tilavuus-%:n kon-sentraatio; parhaimmat tulokset saavutetaan loppukonsent-30 raation ollessa 90 tilavuus-%. Muodostuneen etanolipi- toisen liuoksen annetaan seistä mainitussa lämpötilassa useamman tunnin ajan.

Kiinteiden aineiden erottaminen voi tapahtua suodattamalla, sentrifugoimalla tai sedimentoimalla ja dekan-35 toimalla. Lopuksi tuote kuivataan säästävissä olosuhteis- e sa, so. korkeintaan 37°C:een lämpötilassa. Kuivaus tapah- 6 77373 tuu lämmittämällä tai vakuumissa tai suorittamalla molemmat toimenpiteet samanaikaisesti.

Uuttamiseen (B) dialysaattia käytetään joko kuivatussa, kiinteässä muodossa tai vesipitoisena liuokse-5 na tai orgaanisessa liuottimessa olevana liuoksena.

Uuttamiseen käytetään jotakin veteen sekoittamatonta tai ainoastaan rajoitetusti sekoittuvaa orgaanista liuotinta tai liuotinseosta. Tähän tarkoitukseen soveltuvat erityisesti eetterit, kuten dietyylieetteri ja tetrahydrofuraa-10 ni, hiilivedyt, kuten pentaani, heksaani, petrolieette- ri ja bentseeni, halogenoidut hiilivedyt, kuten kloroformi, dikloorimetaani, hiilitetrakloridi, 1,2-dikloori-etaani ja kloroformin ja metanolin seokset, alkoholit, kuten butanoli ja amyylialkoholi, ja karbonihappoesterit, 15 kuten etyyliasetaatti ja butyyliasetaatti.

Tällä uuttamisella saavutetaan lähtötuotteen erottuminen nestemäisiksi/nestemäisiksi faaseiksi tai neste-mäisiksi/kiinteiksi faaseiksi, ja täten aineosien erottuminen vähän polaarisiksi tai ei-polaarisiksi ja polaa-20 risiksi tai ionisiksi aineiksi. Halutut glykolipidit muuttuvat orgaaniseksi, vähemmän polaariseksi faasiksi.

Sen jälkeen kun on erotettu toisesta nestemäisestä faasista tai kiinteästä faasista orgaaninen tuote kuivataan varovasti, kuten edellä jo kuvattiin.

25 Uuttamista seuraa edullisesti glykolipidien saos- taminen sen perusteella miten ne kulloinkin liukenevat metallisuolan vesipitoiseen liuokseen ja joko asetoniin, dietyylieetteriin, molempien seokseen, tai etanoliin -15:een - -25°C:een välisellä lämpötila-alueella. Vesi-30 pitoinen liuos sisältää yksi- - viisiarvoisen metallin suolaa, edullisesti epäorgaanisen hapon metallisuolaa. Tähän tarkoitukseen soveltuvat erityisesti magnesiumklori-di, kalsiumkloridi, natriumkloridi, kaliumkloridi, ammo-niumsulfaatti, natriumsulfaatti, kaliumsulfaatti, nat-35 riumnitraatti, dinatriumvetyfosfaatti ja natrium- divetyfosfaatti. Vesipitoisella liuoksella voi olla mie- 7 77373 livaltainen konsentraatio, aina liuoksen kyllästymiseen saakka. Tähän liuokseen suspensoidaan tai liuotetaan nyt kuivauksen yhteydessä jäljellejäänyt jäännös.

Vaikkakin voidaan käyttää asetonin ja dietyyli-5 eetterin seoksia, niin asetonin tai dietyylieetterin käyttöä yksinään, tai etanolin käyttöä kylmässä, pidetään edullisena. Siitä lisätään ensiksi muodostuneeseen suspensioon tai liuokseen jopa moninkertainen tilavuusmäärä ja koko seosta sekoitetaan. Tällöin muodostuva saostuma 10 sisältää glykolipidejä; se erotetaan nestemäisestä faa sista, mikä voi tapahtua suodattamalla, sentrifugoimalla tai sedimentoimalla ja dekantoimalla. Lopuksi tuote kuivataan varovasti . Tämä työskentelytapa muodostaa saostus-vaiheen ensimmäisen suoritustavan.

15 Jos liukoisuusolosuhteet glykolipidien saostami- seksi asetonin tai eetterin seoksesta tai etanolista kylmässä, ja vesipitoisesta metallisuolaliuoksesta, on saavutettu, tapahtuu haluttu saostuminen. Mahdollisesti faasinerotuksella saatu tuote sisältää riittävän konsent-20 raation suoloja - erityisesti, jos lähtöaineen kohdalla on kyse verestä, niin että saostuminen voidaan saada aikaan yksinomaan lisäämällä asetonia tai eetteriä, tai etanolia kylmässä. Tämä työskentelytapa, jota käytettäessä ei tapahdu mitään erityistä metallisuolan tai metal-25 lisuolaliuoksen lisäystä, muodostaa saostusvaiheen toisen suoritustavan.

Kolmannen suoritustavan mukaan voidaan jopa uuttaminen ja saostaminen suorittaa samalla työskentelyker-ralla. Niinpä dialysaattia voidaan käsitellä mainitun 30 veteen sekoittumattoman tai ainoastaan rajoitetusti sekoittuvan orgaanisen liuottimen ja asetonin tai eetterin seoksella sellaisessa tilavuussuhteessa toisiinsa nähden ja sellaisessa määrässä, jotka noudattavat dialy-saatin metallisuolakonsentraatiota ja tilavuutta, ja 35 siten saavat aikaan glykolipidejä sisältävän saostuman.

Saostuma erotetaan nestemäisistä faaseista, kuten edellä β 77373 ilmoitettiin ja kuivataan varovasti.

Viimeisessä menetelmävaiheessa etanolisaostuk-sessa (A) tai uuttamiseen (B) saatu tuote puhdistetaan kromatografisesti. Tällöin tarkoitukseen soveltuvat epä-5 orgaaniset adsorptioaineet, erityisesti silikageeli tai silikageelin ja metallioksidin tai epäorgaanisen hapon suolan seokset, esimerkiksi kaupalliset silikageelin ja alumiinioksidin, magnesiumoksidin tai magnesiumsulfaatin seokset, tai myös ioninvaihtajat, erityisesti emäksiset 10 ja happamet selluloosajohdannaiset, kuten dietyyliamino- etaani-selluloosa, karboksimetyyliselluloosa tai sulfo-propyyliselluloosa.

Tuote liuotetaan ensiksi vähän polaariseen orgaaniseen liuottimeen. Liuottimiksi soveltuvat erityisesti 15 metanoli, metanolin ja kloroformin seokset ja etanolin ja kloroformin seokset, edelleen etyyliasetaatti ja seokset, jotka koostuvat metanolista kloroformista ja pienestä määrästä vettä. Liuos pannaan kromatografiapylvää-seen, joka on täytetty samassa liuottimessa tai jossa-20 kin muussa edellämainituista liuottimista olevalla adsorp- tioaineella vedettömästi. Eluointiin voidaan käyttää samaa liuotinta tai liuotinseosta; mutta voidaan myös käyttää liuotinseosta, jossa polaarisuus lisääntyy, mikä saavutetaan käyttämällä kvantitatiivisen koostumuksen 25 suoraa, koveraa tai kuperaa tai astegradienttia.

Eluaatin fraktiot voidaan tutkia glykolipidien esiintymisen sekä niiden pitoisuuden ja puhtauden suhteen eri menetelmiä käyttäen. Tähän tarkoitukseen soveltuvat kokeellisessa osassa kuvatut, glykolipideille tai glykos-30 fingolipideille karakteristiset värireaktiot ja värjäys- menetelmät. Fraktiot voidaan myös erottaa edelleen sili-kageelillä, C-18-alkaani-derivoidulla silikageelillä, polyamidilla, selluloosalla tai polyakryyliamidilla kerrostetuilla ohutkerroslevyillä tai -kalvoilla sopivaa 35 eluointiainetta käyttäen. Erotetut aineet eluoidaan vedet tömällä liuottimena, esim. kloroformin ja metanolin 9 77373 seoksella levyltä tai kalvolta ja niitä tutkitaan käyttäen apuna ohutkerroskromatografiaa, hydrolyysiä ja hydro-lyysituotteiden analyysiä, kaasukromatografiaa, massaspektrometriaa, sekä toteamalla pintavaurioiden paran-5 tumisajan lyheneminen nisäkkäillä tai tarkkailemalla, miten käyttäytyvät soluviljelmät, joihin näitä aineita on lisätty. Tulokset osoittavat, että vaikuttavien aineiden kohdalla on kyse glykosfingolipideistä.

Seuraavassa kuvatuilla farmakologisilla kokeilla 10 voitiin osoittaa, että saaduilla vaikuttavilla aineilla on sekä selvä uusiutumista edistävä vaikutus esivahingoi-tettuihin fibroblasteihin in vitro että myös uudistumista edistävä vaikutus vastaaviin solupopulaatioihin in vivo.

Se, että tällöin eivät ole kyseessä tavalliset mitootti-15 sesti vaikuttavat aineet, on selvää, koska normaalisti käyttäytyvät, terveet soluviljelmät eivät osoita minkäänlaisia muutoksia mainittuja aineita lisättäessä. Päinvastoin erilaisilla vahingoittavailla aineilla esivahin-goitetut viljelmät, joilla on epänormaalin alhainen ja-20 kautumisaste, saatetaan lyhyen ajan sisällä jälleen nor maaliin jakautumis normiin, joka on käytännöllisesti katsoen identtinen terveen viljelmän jakautumisnormin kanssa.

Sen tosiasian perusteella, että keksinnön mukai-25 sesti valmistetut aineet kiihdyttävät vahingoitettujen solupoppulaatioiden uudistumismekanismeja sekä in vitro että myös in vivo, soveltuvat nämä yhdisteet terapeuttiseen käyttöön, erikoisesti kun on kyse hitaasti tai huonosti paranevista haavoista tai haavaumista, joiden 30 uudistumiskyky on rajoittunut.

Näiden aineiden haavojen parantumista edistävä vaikutus voidaan osoittaa seuraavilla eläinkokeilla.

Koe 1

Narkoosissa olevilta rotilta poistetaan karvat, 35 ja niille aiheutetaan molemmin puolin vartaloa palohaava 10 77373 asettamalla 270°C:nen messinkilevy, jonka halkaisija on 2 cm, 30 sekunnin ajaksi iholle. Vaikuttavat aineet työstetään geeli-pohjaan, niin että muodostuu 20 %:nen hoito-geeli. Kontrollina työstetään vettä tai fysiologis-5 ta keittosuolaliuosta. Aina 10 eläintä, joilla on kulla kin 2 haavaa, hoidetaan 2 kertaa päivässä paikallisesti geelillä, ja todetaan aika, joka kuluu lopulliseen parantumiseen. Aineella, jolla on esimerkissä 2 kuvattu R^-arvo 0,65, saadaan tulokseksi kontrolliryhmään verrat-10 tuna parantumisajan lyheneminen aina 21 %:tiliä.

Koe 2

Pienille porsaille aiheutetaan selän puolelle kulloinkin 4 palohaavaa, kuten esimerkissä 1. kuvattiin ja ontto-sylinteri-poralla 4 lävistyshaavaa, joiden läpi-15 mitta on 2,5 cm. Vaikuttavia aineita työstetään geeli- pohjaan, kunnes pitoisuus on 20 %. Haavoihin sivellään 2 kertaa päivässä geeliä ja todetaan aika, joka kuluu lopulliseen parantumiseen. Aineella, jonka R^-arvo on 0,65, saadaan tulokseksi parantumisajan lyheneminen 20 18 %:tiliä.

Koe 3

Pienille porsaille aiheutetaan palohaavat, kuten esimerkissä 1. kuvattiin. 6, 12, 18 ja 22 päivän kuluttua päivittäisestä haavanhoidosta poistetaan eläimet käsitte-25 lyryhmästä ja tapetaan narkoosissa. Haavat leikataan pois, puolitetaan ja kiinnitetään 4 %:seen puskuroituun formaliiniin. Nämä kudoskappaleet työstetään 4 ^,u:n paksuisiksi histologisiksi parafiinileikkeiksi. Seuraa-vat parametrit määritetään kvantitatiivisesti: 30 1. Epitelisoituneen haavapinnan pituus 2. Epitelisoitumattoman haavapinnan pituus 3. Orvaskeden tyvikerroksen pituus 4. Uudelleenmuodostuneen orvaskeden pinta 5. Karvapussien ja talirauhasten pinta 35 Parametrien tulkinta osoittaa, että esimerkeissä 2-6 kuvattu puhdistettu aine nopeuttaa epiteliin muodos- n 77373 tumista ja sen siirtymistä haavan keskustaan päin kontrollieläimiin verrattuna. Haavan parantumista nopeuttava vaikutus ilmenee etupäässä peruskudoksen, tyviker-roksen ja nystyjen kehittymisen varhaisvaiheessa.

5 Koe 4

Narkoosissa oleville rotille tehdään 1 cm levyinen ja 5 mm syvä lävistyshaava. Näihin haavan reikiin asetetaan viskoosi-se1luloosa-onttosy1interi-sienet. Onttosylinterien sisäonteloihin pannaan päivittäin 100 10 ^ul puhdistettua ainetta. 4, 10, 16 ja 21 päivän kulut tua implantaatiosta sienet poistetaan ja tutkitaan hemoglobiini-, deoksiribonukleiinihappo- ja hydroksiproliini-pitoisuus. Niillä haavoilla, jotka oli käsitelty puhdistetuilla aineilla, ei ollut 4. ja 10. päivänä implan-15 taatiosta korkeampaa hemoglobiini-, DNA- ja hydroksi- proliinipitoisuutta implantoiduissa sienissä kuin kontrol-lieläimillä, mutta 16. ja 21. päivänä oli sienillä merkittävästi korkeampi hemoglobiini-, DNA- ja hydroksipro-liinipitoisuus. Viitaten menetelmään, kts. J. Niinikoski 20 und. S. Renvall, Acta Chir. Scand. 145 (1979), 287-291.

Esimerkkien 2-6. mukaisen puhdistetun aineen vaikutuksesta nopeutuu haavan parantuminen peruskudoksen ja hiussuonia sisältävän tyvikerroksen varhaisessa kehittymisessä.

25 Koe 5

Soluviljelmien, esim. kasvavien fibroblasiten kasvua voidaan estää jättämällä pois natriumbikarbonaatin elatusaineet. Esimerkissä 2. ja 6. kuvattujen aineiden lisääminen elatusaineeseen johtaa siihen, että solut 30 toipuvat tästä estovaikutuksesta nopeammin ja normaali jakautumisaste saavutetaan jälleen selvästi aikaisemmin kuin vastaavasti estetyillä, mutta käsittelemättömillä soluviljelmillä.

Lukumääräiset tiedot koskien liuottimien seoksia 35 esimerkeissä tarkoittavat aina tilavuuksia: esimerkiksi i2 77373 tarkoittaa eetteri:etanoli =3:1 seosta, jossa on 3 ti-lavuusosaa eetteriä ja 1 tilavuusosa etanolia.

Esimerkki 1

Teuraseläimistä saatuun vasikan vereen lisätään 5 heti teurastuspaikalla etanolia, kunnes konsentraatio on 20 %, ja käsitellään bakteriostaattisilla aineilla -p-hydroksi-bentsoehappometyyliesterillä (metyyliparabeni) ja p-hydroksibentsoehappo-n-propyyliesterillä (propyyli-parabeni), kunnes konsentraatti on kulloinkin 0,02 %.

10 Verta autolysoidaan 3 päivän ajan huoneen lämpötilassa, jolloin tapahtuu voimakas hemolyysi sekä ei-stabiilien aineosien osittainen hajoaminen, ja jolloin membraani-komponentit irrottautuvat membraaneista. Tämä autolysaat-ti erotetaan dekantoimalla sedimentistä ja jäljellejää-15 nyttä osaa dialysoidaan 3 päivän ajan staattisesti tai dynaamisesti membraanin läpi, jonka erotuskyky on 10'000. Dynaamisessa dialyysissä dialysaattia ja vastadialysaat-tia pumpataan vastavirtamenetelmää käyttäen 3 päivän ajan dialyysimembraanin läpi, niin että muodostuu mah-20 dollisimman suuri konsentraatiogradientti.

Tulokseksi saadun vastadialysaatin kuivapaino on 5-80 mg/ml ja se sisältää haavan parantumista edistäviä aineita jopa 1 mg/ml. Alussa mainitun eurooppalaisen patenttihakemuksen mukaisen menetelmän mukaan saa-25 daan vastaavia glykosfingolipidejä 0,005 mg/ml.

Esimerkki 2 2 litraan vasikan verta sekoitetaan 300 ml etanolia ja autolysoidaan 3 päivän ajan huoneen lämpötilasi· sa. Autolysaatti suodatetaan ultrasuodattimen läpi, 30 jonka erotuskyky on 10'000 (molekyylipaino) ja erote taan täten solukappaleista ja suurista proteiineista. Suodokseen sekoitetaan 6 litraa etanoli: eetteriä suhteessa 3:1, jolloin muodostuu pääasiallisesti glykosfingo-lipideistä koostuva saostuma. Saostuma sedimentoidaan 35 sentrifugoimalla 18*000 g:llä 30 min. ajan ja erotetaan nestemäisestä faasista.

i3 77373

Saostuma kuivataan vakuumissa 37°C:ssa ja liuotetaan 20 ml saan kloroformi: metanolia suhteessa 65:35. Liuenneet glykosfingolipidit erotetaan kromatograafises-ti käyttäen Florisil-pylvästä (kauppanimi; magnesium-5 silikaattigeeli, hyvin selektiivinen adsorbentti, firma

Floridin Corp., Pittsburgh PA, USA), jonka läpimitta on 5,0 cm ja pituus 40 cm, ja joka on tasapainotettu kloroformi: metanolilla suhteessa 65:35, ja näin poistetaan jäljelläolevat fosfolipidit. Glykosfingolipidit 10 eluoidaan käyttäen astegradienttia, joka käsittää kul loinkin 2 litraa 35 %, 50 %, 75 % metanolia kloroformissa ja lopuksi eluoidaan 100 %:lla metanolia. Eluointivai-heissa saaduille aineille suoritetaan johdannossa kuvattu haavanparantamistesti ja tällöin todetaan, että vii-15 meinen, 100 % metanolilla eluoitu fraktio sisältää aineita, jotka nopeuttavat haavan parantumista.

Tämän fraktion sisältämät aineet levitetään pre-paratiivisille silikageeliohutkerros-levyille, joiden kerroksen paksuus on 2 mm ja kromatografioidaan käyttäen 20 eluointiaineena kloroformi: metanoli: 0,1 % CaC^sta vedessä = 55: 45: 10, 18 cm:n pituisen matkan. Levyt kuivataan kromatografioinnin jälkeen ja asetetaan lyhyeksi ajaksi kyllästetyssä jodi-atmosfäärissä olevaan tilaan. Tällöin keltaiseksi värjäytyvät vyöhykkeet merkitään, jo-25 din sublimoitumisen jälkeen rapsutetaan pois ja eluoi daan kloroformi: metanolilla = 50:50 silikageelistä. Kokeet rotilla esiintyneiden palohaavojen parantumisajän lyhentymisen toteamiseksi sujuvat positiivisesti sillä fraktiolla, jonka R^-arvo on 0,65 mainitussa ohutkerros-30 kromatograafisessa erotusmenetelmässä.

Esimerkki 3 2 litraa esimerkisä 1. saatua vastadialysaattia kuivataan rotaatiohaihduttiraessa tai lyofilisoimalla ja liuotetaan 4 litraan tetrahydrofuraani: 0,01 M KCl:ää 35 suhteessa 4:1. Liukenematon aine erotetaan paperisuoda- tinta käyttäen ja kirkas liuos haihdutetaan rotaatiohaih- 14 77373 duttimessa 500 ml:ksi. Siihen lisätään 1 litra kloroformi smetanolia suhteessa 2:1, ja orgaaniset ja vesipitoiset faasit erotetaan lisäämällä 200 ml vettä. Ylempi faasi, joka sisältää glykolipidejä, erotetaan ja haihdu-5 tetaan kuiviin. Kuiva aine lisätään 10 ml:aan kloroformi: metanoli: vettä = 90:10:0,2 ja liuos viedään kloroformi: metanoli:vesiseoksella 90:10:0,2 tasapainotettuun Bio-SilA-pylvääseen (läpimitta 1,5 cm, pituus 120 cm). Pylväs pestään 1,5 litralla samaa eluointiainetta ja gly-10 kolipidi eluoidaan tämän jälkeen 1 litralla kloroformi: metanoli:vettä = 85:15:0,2 pylväästä. Tällä menetelmällä puhdistettu aine on glykolipidi, joka lyhentää palo-haavojen parantumisaikaa.

Esimerkki 4 15 2 litraa esimerkin 1. vastadialysaattia uutetaan, kuten esimerkissä 2. kuvattiin, etanoli: eetterillä suhteessa 3:1 ja saostuma liuotetaan 20 ml:aan kloroformi :metanolia = 2:8. Cl -muodossa oleva dietyyliaminoetyy- li-Sephadex A50 saatetaan asetaatti-muotoon pesemällä 20 0,1 N natronlipeällä ja 1 N etikkahapolla, pestään meta- nolilla ja täytetään pylvääseen, jonka halkaisija on 2,5 cm ja pituus 20 cm. Kloroformi:metanoliin = 2:8 liuotettu aine lisätään ja pylväs pestään kulloinkin 200 ml :11a 0,01 M natriumasetaattia, 0,02 M natriumasetaattia ja 25 0,2 M natriumasetaattia. Sitten glykolipidi eluoidaan kloroformi:metanolilla suhteessa 2:8. Tällä menetelmällä eluoitu glykolipidi lyhentää palohaavojen parantumisaikaa.

Esimerkki 5 30 200 ml esimerkin 1. vastadialysaattia haihdutetaan kuiviin rotaatiohaihduttimessa tai lyofilisoimalla ja kuivataan eksikaattorissa vähintäin 3 tunnin ajan fosforipen-toksidilla. Kuivaan aineeseen lisätään 15 ml juuri valmistettua 20 %:sta bentsoehappoanhydridi-liuosta pyridii-35 nissä, tämän jälkeen 15 ml 10 %:sta p-dimetyyliaminopyri- is 77 37 3 diini-liuosta pyridiinissä. Astia suljetaan tiiviisti ja sitä inkuboidaan 2 tunnin ajan 37°C:ssa. Astia jäähdytetään ja sisältö erotetaan liukenemattomasta aineesta suodatinta käyttäen tai sentrifugoimalla.

5 Pyridiini poistetaan typpivirrassa ja kuiva ma teriaali liuotetaan 30 ml saan heksaania. Heksaani pestään kolme kertaa kulloinkin 18 ml :11a alkalista metano-li-vesi-liuosta, joka koostuu 0,4 gssta/100 mlssta natriumkarbonaattia metanoli: vedessä = 80:20. Heksaani-10 faasi kuivataan typpiatmosfäärissä ja liuotetaan 4 %:iin etyyliasetaattia heksaanissa.

per-0-bentsoyloitu glykolipidi eluoidaan korkea-paine-neste-kromatografiasilikageelipylväällä gradientin ollessa 4 % - 45 % etyyliasetaattia heksaanissa. Tällä 15 menetelmällä eristettyä per-0-bentsoyloitu glykolipidiä hydrolysoidaan bentsoyyliryhmien poistamiseksi 0,6 N natronlipeässä 1 tunnin ajan 37°C:ssa. Hydrolysaattiin sekoitetaan 5 tilavuusosassa asetonia ja saostettu luonnon glykolipidi suodatetaan ja sentrifugoidaan.

20 Tämän menetelmän mukaisesti puhdistettu glykoli pidi lyhentää palohaavojen parantumisaikaa.

Esimerkki 6

Dialysaattiin lisätään 9 tilavuusosaa etanolia ja sekoitetaan 30 min. ajan 85°C:ssa. Tällöin muodostunut 25 sakka poistetaan suodatinpaperia käyttäen ja kirkasta liuosta säilytetään 3 päivän ajan -20°C:ssa. Etsitty aine saostuu ja sedimentoituu tänä aikana. Ylijäävä osa dekantoidaan ja sedimentti liuotetaan kloroformi^etanoliin = 2:1 ja pannaan asetaatti-muodossa·olevalle di-30 etyyliaminoetyyli-Sephacel-pylvääseen. Pylväs eluoidaan kloroformi:metanolilla = 2 : 1 ja eluaatti otetaan talteen. Tämä kuivataan rotaatiohaihduttimessa ja liuotetaan kloroformiin. Liuos pannaan pylvääseen, joka on täytetty aktivoidulla silikageelillä kloroformissa. Ensiksi huuh-35 dellaan kloroformilla, sitten kloroformi:metanolil- la = 9:1 ja nämä eluaatit heitetään pois. Tämän jälkeen ie 7 7373 huuhdellaan asetonirmetanolilla = 9:1 ja tämä fraktio sisältää haluttuja, puhtaassa muodossa olevia glykoli-pidejä.

Aineen karakterisointi 5 Esimerkin 2. mukaan puhdistettu aine erotetaan kromatografisesti silikageeliohutkerroslevyillä käyttäen eluointiaineena metanoli:kloroformi: 0,1 % CaC^Jta vedessä =55 : 45 : 10.

Vertailuaineina erotetaan samanaikaisesti seuraa-10 vien aineiden seos: AsialogangliosidiMI, seuraavassa lyhennetty Asialo-GMI: llä, Asialo-G^' Asialo-G^' Asialo-GD^a, Cerebrosidi ja Psykosiini.

Levyt värjätään seuraavia menetelmiä käyttäen: 1. 20 mg kresyyliviolettia 1000 ml:ssa 1 %:sta etikka-15 happoa; sini-violetti väri.

2.1% difenyyliamiinia 2 ml:ssa etanolia, 100 ml kons. suolahappoa ja 80 ml etikkahappoa; punainen väri.

3. Ensiksi suihkutetaan 5,25 % alikloorihapoketta 40 ml:ssa bentseeniä ja 5 ml:ssa etikkahappoa, kuivataan, sitten 20 lisätään 1 % bentsidiiniä 50 %:ssa etanolia; sininen väri.

4. 0,1 g Orcinolia 1 ml:ssa 1 % rauta(III)-kloridia ja 50 ml:ssa vettä; ruskea väri.

5. Ohutkerroslevyt asetetaan kammiossa jodihöyrylle alt- 25 tiiksi. Vertailuaineet sekä analysoitava aine, jonka R^-arvo on 0,65, värjäytyvät keltaisiksi.

6. Käytettäessä ohutkerroslevyjä fluoresenssi-indikaattorilla, joka on tarkoitettu aallonpituuksille 254 nm ja 366 nm, fluoresenssi ei heikkene analysoitavan aineen 30 (R^-arvo 0,65)vaikutuksesta samoin kuin vertailu aineet eivät muuta levyjen fluoresenssia.

7. 0,2 % naftoresorkinolia asetonissa ja 10 %:sta fosfo-rihappoa spray-reagenssina. Käsiteltyä levyä kuumennetaan 5 minuutin ajan 90°C:ssa; sini-punainen väri.

35 8. 1 g p-ansidiiniä 100 ml:ssa 70 %:sta etanolia; sini nen väri.

17 77373

Kvalitatiivinen ja kvantitatiivinen määritys 1 ml esimerkin 2. mukaan puhdistettua ainetta kuivataan rotaatiohaihduttimessa vakuumissa 37°C:ssa tai lyofilisoimalla. Kuiva aine liuotetaan 0,8 ml:aan 2M rik-5 kihappoa ja 0,4 mlraan dioksaania ja suljetaan ampullei hin. Näytteitä hydrolysoidaan 3 tunnin ajan 95°C:ssa ja tämän jälkeen neutraloidaan lisäämällä 0,14 ml 10 N nat-ronlipeätä. Neutraloitu hydrolysaatti puskuroidaan 1,66 ml:lla 0,2 M natriumboraatti-puskuria, jonka pH 10 on 8,0 ja uutetaan erotussuppilossa 2,0 ml:11a dietyyli- eetteriä 5 minuutin ajan. Alempi faasi heitetään pois ja ylempi eetterifaasi kuivataan vesihauteessa 37°C:ssa. Kuiva aine liuotetaan 3 ml:aan kloroformia, jossa on 0,0025 % fluorescamiini-4-fenyylispiro-/furaani-2(3H)-15 1'-ftalaani/-3,31-dionia ^M. Naoi, J. C. Lee und S.

Rosman, Anal. Biochem. 58 (1974), 571-577/ ja sekoitetaan 30 sekunnin ajan. Tämän liuoksen fluoresenssi mitataan viritysaallonpituuden ollessa 385 nm ja emissio-aallonpituuden ollessa 480 nm.

20

Claims (6)

18 77373

1. Menetelmä soluja ja kudoksia uudistavien aineiden talteen saamiseksi nisäkkäiden verestä tai elinhomo-5 genaateista, tunnettu siitä, että vereen tai elin-homogenaattiin ensin sekoitetaan lyhytketjuinen alkoholi ja bakteerien kasvua estävä aine ja sitten suoritetaan useammista tunneista muutamiin päiviin kestävä autolyysi lämpötilan ollessa 4°C:n ja huoneen lämpötilan välillä 10 ja dialyysi veden ja alemman alifaattisen alkoholin seosta vastaan, siten että aine, jonka molekyylipaino on alle 10 000 on dialysaatissa.

2. Patenttivaatimuksen 1. mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että autolyysi ja dialyysi suori- 15 tetaan samanaikaisesti ja jatkuvina, vastavirtamenetel-mää käyttämällä.

3. Patenttivaatimuksen 1. tai 2. mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että lähtöaineena käytetään naudan- tai vasikan verta, edullisesti viimeksimainittua.

4. Patenttivaatimuksien 1, 2 tai 3. mukainen me netelmä, tunnettu siitä, että saadusta dialysaa-: tista seostetaan ja erotetaan glykolipidit lisäämällä etanolia ja antamalla muodostuneen etanolipitoisen liuoksen seistä -15 - -25°C:een välisellä lämpötila-- 25 alueella.

5. Patenttivaatimuksien 1, 2 tai 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että saatu dialysaat-ti erotetaan lisäämällä veteen sekoittumatonta tai ainoastaan rajoitetusti sekoittuvaa liuotinta tai liuo-30 tinseosta, kiinteiksi/nestemäisiksi tai nestemäisiksi/- nestemäisiksi faaseiksi, jolloin glykolipidit muuttuvat kiinteäksi faasiksi tai orgaaniseksi, vähemmän polaariseksi faasiksi, glykolipidejä sisältävä faasi erotetaan ja mahdollisesti orgaaninen faasi kuivataan varo-35 vasti. 19 77373

6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että orgaanisina liuottimina dialysaatin erottamiseksi kiinteiksi/nestemäisiksi tai nestemäisiksi/ nestemäisiksi faaseiksi käytetään sellaisia eettereitä, 5 hiilivetyjä, halogenoituja hiilivetyjä, alkoholeja, karbo-nihappoestereitä ja niiden seoksia, jotka eivät sekoitu veteen tai sekoittuvat ainoastaan rajoitetusti. 20 7 7 3 7 3