PL142242B1 - Process for preparing glycosphingolipids regenerating the cells and tissues,in the form of dialysate - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania glikosfingolipidów regenerujacych komór¬ ki i tkanki, w postaci dializatu.Znane sa juz z europejskiego zgloszenia patentowego nr 81102 848.9, nr publikacji 0038 511 zwiazki, które wystepuja w narzadach i plynach ustrojowych ssaków, wzglednie mozna je z nich ekstrahowac i które wykazuja przespieszajace dzialanie na gojenie sie ran. Wedlug wymienionej publikacji ekstrahowanym substancjom czynnym przypisuje sie budowe glikosteroidu, wzglednie glikosfingolipidu.Glikosteroid odpowiada wzorowi strukturalnemu 1, w którym R oznacza grupe oligosacha- rydu skladajaca sie z pieciu jednostek cukrowych.Glikosfingolipid odpowiada wzorowi strukturalnemu 2, w którym R oznacza grupe oligosa- charydu skladajaca sie z pieciu jednostek cukrowych.Zwiazki te wyodrebnia sie z narzadów takich jak serce, pluca, miesnie i sledziona, oraz z plynów ustrojowych, jak z krwi, osocza i surowicy. Ssakami, które wytwarzaja te zwiazki, sa czlowiek, swinia, kon, owca i bydlo.Proces wytwarzania wedlug wymienionego europejskiego zgloszenia patentowego polega na homogenizacji surowca za pomoca 0,2% roztworu NaCI, odwirowaniu lub filtracji, a nastepnie ultrafiltracji homogenatu. Otrzymany po ultrafiltracji roztwór zateza sie w temperaturze 40°C do uzyskania mocy jonowej odpowiadajacej 0,8% roztworowi NaCI. Nastepnie koncentrat poddaje sie adsorpcji na weglu aktywnym, po czym wegiel aktywny ekstrahuje sie przy pomocy 10-30% kwasu octowego. Z otrzymanego ekstraktu odparowuje sie rozpuszczalnik i pozostalosc rozpu¬ szcza sie w 0,2 molowym kwasie octowym. Otrzymany roztwór poddaje sie chromatografii na sicie molekularnym, nastepnie prowadzi sie elucje za pomoca 0,2-2 molowego kwasu octowego. Z eluatu odparowuje sie rozpuszczalnik i pozostalosc rozpuszcza sie w kwasie octowym. Otrzymany roztwór poddaje sie adsorpcji na zelu krzemionkowym ze zwiazkiem o lancuchu zawierajacym 8 atomów wegla, a nastepnie eluuje mieszanina kwasu octowego, etanolu i wody, po czym zbiera sie frakcje zawierajaca 30% alkohol i odparowuje sie rozpuszczalnik.2 142142 Podczas dalszych badan okazalo sie, ze wzmiankowane przedtem glikosteroidy przy terapeu¬ tycznym zastosowaniu wykazuja niedostateczna trwalosc i nie zasluguja na dalsze zainteresowanie.Niespodziewanie stwierdzono, ze z takich samych, jak wymieniono wyzej, materialów wyjs¬ ciowych otrzymuje sie równiez glikolipidy o wlasciwosciach regenerowania komórek i tkanek.Sposób wytwarzania substancji regenerujacych komórki i tkanki szeregu glikolipidów polega wedlug wynalazku na tym, ze krew zadaje sie krótkolancuchowymalkoholem i srodkiem bakterio- statycznym i prowadzi sie ekstrakcje przez autolize krwi w ciagu 3 dni, w temperaturze pokojowej oraz dialize przez blone o zdolnosci zatrzymywania czastek o ciezarze czasteczkowym 10000, w stosunku do medium alkoholowo-wodnego, przy czym dializat i przeciwdiaiizat przetlaczane sa za pomoca pompy w przeciwpradzie, albo produkt autolizy oddziela sie przez dekantacje od produktu osadzajacego sie i nastepnie prowadzi sie dialize pozostalej cieczy. Korzystnie autolize i dialize przeprowadza sie jednoczesnie i w sposób ciagly w przeciwpradzie. Jako szczególnie odpowiedni material wyjsciowy stosuje sie krew bydleca lub cieleca, zwlaszcza cieleca.Z otrzymanego dializatu wytraca sie i oddziela glikolipidy, a w tym glikosfingolipidy, przez dodanie etanolu i odstawienie utworzonego roztworu etanolowego w temperaturze -15 do -25°C, lub tez otrzymany dializat rozdziela sie na fazy: stala (ciekla lub ciekla) ciekla przez dodanie nie mieszajacego sie z woda lub mieszajacego sie z nia w sposób ograniczony rozpuszczalnika lub mieszaniny rozpuszczalników, przy czym glikolipidy, a w tym glikosfingolipidy przechodza do stalej fazy wzglednie do organicznej mniej polarnej fazy, po czym faze zawierajaca glikolipidy oddziela sie i ewentualnie suszy w lagodnych warunkach.Jako organiczne rozpuszczalniki do rozdzielania dializatu na fazy: stala (ciekla lub ciekla) ciekla stosuje sie takie etery, weglowodory, chlorowcowane weglowodory, alkohole, estry kwasów karboksylowych oraz ich mieszaniny, które nie mieszaja sie z woda albo mieszaja sie z nia tylko w sposób ograniczony.Sposobem wedlug wynalazku otrzymuje sie surowy produkt, w którym pozadane substancje czynne wystepuja w zadziwiajaco wiekszych ilosciach, niz w przypadku metody znanej z wyzej wymienionego europejskiego zgloszenia patentowego.Poza tym stwierdzono takze, ze z wymienionego surowego produktu wyodrebnia sie glikoli¬ pidy, d w tym glikosfingolipidy znacznie prostsza droga, a mianowicie (A) wytraca sie je z etanolowego roztworu w niskiej temperaturze, np. okolo -20°C, albo (B) ekstrahuje rozpuszczalni¬ kiem organicznym nie mieszajacym sie albo mieszajacym sie w sposób ograniczony z woda i produkt z etapu (A) wzglednie (B) poddaje sie chromatografii na zelu krzemionkowym albo na wymieniaczujonowym, stosujac rozpuszczalnik o malej polarnosci. Ze wzgledu na to, ze rozdziela¬ nie droga chromatografii jest kosztowne, koniecznosc stosowania jednej jedynej chromatografii jest widoczna znaczna korzyscia nowego sposobu w stosunku do sposobu znanego, zwlaszcza, gdy chodzi o stosowanie przemyslowe.W ogóle nowy sposób, w wyraznym przeciwienstwie do sposobu znanego, nadaje sie dosko¬ nale do przeprowadzenia na skale przemyslowa takze dlatego, ze istotne etapy autolizy i dializy mozna prowadzic jednoczesnie i w sposób ciagly, w przeciwpradzie.Nizej jest opisany wyczerpujaco sposób wedlug wynalazku.Z wymienionych wyzej materialów wyjsciowych szczególnie korzystnajest odwlókniona krew i shomogenizowane narzady ssaków, jak krew bydleca lub cieleca, a przede wszystkim krew cieleca.Jak wspomniano wyzej, najpierw przeprowadza sie autolize materialu wyjsciowego i dialize autolizatu. Dla rozpuszczenia substancji powstajacych podczas autolizy zadaje sie najpierw mate¬ rial wyjsciowy alkoholem o krótkim lancuchu, zwlaszcza metanolem lub etanolem, w stezeniu -30% oraz substancja bakteriostatyczna, przewaznie 4-hydroksybenzoesanem metylu lub 4- hydroksybenzoesanem propylu w stezeniu 0,1-0,0001%. Autolize prowadzi sie w ten sposób, ze material wyjsciowy pozostawia sie na okres czasu od kilku godzin do kilku dni, przykladowo na trzy dni, w temperaturze od 4°C do temperatury pokojowej. Jednakze bardziej korzystne jest prowadzenie obydwu zabiegówjednoczesnie i w sposób ciagly, w przeciwpradzie, gdyz przez ciagle odbieranie autolizatu równowaga po stronie materialu wyjsciowego stale przesuwa sie na korzysc reakcji autolizy. Podczas autolizy uwalniaja sie sródkomórkowe enzymy kataboliczne, jak lizo- somy, np. katepsyny oraz inne proteazy, poza tym nukleotydazy, esterazy, fosfatazy i tym podobne. W dializacie znajduja sie substancje o ciezarze czasteczkowym ponizej 10000, miedzy tymi pozadane142 242 3 tymi pozadane glikosfingolipidy.A zatem dializa powodujejednoczesnie z przyspieszeniem auto- lizy, usuniecie szczególnie tych protein, które przy terapeutycznym stosowaniu produktu moga prowadzic do wywolania alergicznych reakcji. Jako srodowisko do przyjmowania substancji podczas dializy korzystne sa mieszaniny wody i niskich alkoholi alifatycznych, na przyklad metanolu i etanolu. Szczególnie odpowiednie mieszaniny skladaja sie z wody i 10-30% objetoscio¬ wych etanolu, np. woda z 15% objetosciowymi metanolu.Dla wyodrebnienia i oczyszczenia glikolipidów z otrzymanego dializatu postepuje sie w ten sposób, ze (A) wytraca sie je w niskiej temperaturze z etanolowego roztworu albo (B) ekstrahuje pewnymi organicznymi, np. lipofilowyrai rozpuszczalnikami, a nastepnie poddaje sie chromato¬ grafii na nieorganicznym srodkuadsorpcyjnym albo na wymieniaczujonowym. Korzystnie miedzy ekstrakcje (B) i chromatografie dodaje sie dalsze oczyszczanie przez wytracenie.Wytracenie (A) prowadzi sie z etanolowego roztworu w temperaturze -15 do -25°C. Daje ono tym lepsze wydajnosci glikolipidów, im wyzsze jest stezenie koncowe etanolu. Korzystniedo dializy dodaje sie tyle bezwodnego etanolu, zeby uzyskac jego stezenie co najmniej 60% objetosciowych, a najlepsze wyniki otrzymuje sie przy stezeniu koncowym etanolu 90% objetosciowych. Utworzony roztwór etanolowy pozostawia sie w podanej temperaturze przez kilka godzin.Oddzielenie stalych substancji prowadzi sie przez saczenie, odwirowanie lub sedymentacje i dekantacje. Nastepnie produkt poddaje siesuszeniuwlagodnych warunkach, to znaczyw tempera¬ turze najwyzej 37°C. Suszenie prowadzi sie przez ogrzewanie lub pod zmniejszonym cisnieniem, albo jednoczesnie przez ogrzewanie i pod zmniejszonym cisnieniem.Do ekstrakcji (B) stosuje sie dializat albo wpostaci wysuszonej, stalej albo w postaci wodnego roztworu lub roztworu w rozpuszczalniku organicznym, a dla wyekstrahowania uzywa sie rozpu¬ szczalnik organiczny lub mieszanine rozpuszczalników,które z woda riie mieszaja sie albo mieszaja sie w sposób ograniczony. Nadaja sie tu zwlaszcza etery, takie jak eter dwuetylowy i tetrahydrofu- ran, weglowodory, jak pentan, heksan, eter naftowy i benzen, chlorowcowane weglowodory, jak chloroform, dwuchlorometan, czterochlorek wegla, 1,2-dwuchloroetan oraz mieszaniny chloro¬ formu i metanolu, alkoholeJak alkohol butylowy iamylowy, oraz estry kwasów karboksylowych, jak octan etylu i octan butylu.Przez te esktrakcje uzyskuje sie rozdzielenie produktu wyjsciowego na fazy: ciekla (ciekla lub ciekla) stala i przez to rozdzielenie skladników na substancje malopolarne lub niepolarne i polarne albo jonowe. Pozadane glikolipidy przechodza w organiczna, malopolarna faze. Po oddzieleniu innej fazy cieklej albo fazy stalej suszy sie faze organiczna w delikatnych warunkach, jak juz opisano wyzej.Po ekstrakcji nastepuje korzystnie wytracenie glikolipidów aa podstawie ich rozpuszczalnosci w wodnym roztworze soli metalu i albo acetonie, eterze dwuetylowym, mieszaninie obydwu, albo etanolu w temperaturze -15 do -25°C. Wodnyroztwór zawiera sóljedno- do piecio- wartosciowego metalu, zwlaszcza sól metalu z nieorganicznym kwasem. Nadaja sie tu szczególnie chlorek magne¬ zowy, chlorek wapniowy, chlorek sodowy, chlorek potasowy, siarczan amonowy, siarczan sodowy, siarczan potasowy, azotan sodowy, wodorofosforan dwusodowy i dwuwodorofosforan sodowy.Wodny roztwór moze wykazywac dowolne stezenie, do stanu nasycenia. W roztworze tym rozpra¬ sza sie albo rozpuszcza pozostalosc otrzymana przy suszeniu.Chociaz mozna stosowac mieszaniny acetonu i eteru dwuetylowego, korzystnejest stosowanie samego acetonu lub eteru dwuetylowego, albo etanolu w niskiej temperaturze. Dodaje sie je do uprzednio utworzonej zawiesiny lub roztworu az do kilkakrotnej objetosci i calosc miesza sie.Powstaly przy tym osad zawiera glikolipidy.Osad ten oddziela sie od cieklej fazyprzez odsaczenie, odwirowanie lub sedymentacje. Nastepnie produkt suszy sie w delikatnych warunkach. Tensposób postepowania stanowi pierwsza postac wykonania etapu wytracania.Gdy osiagnie sie^tosunki rozpuszczalnosci dla wytracenia glikolipidów z mieszaniny acetonu lub eteru, albo etanolu w niskiej temperaturze i wodnego roztworu soli metalu, nastepuje pozadane wytracanie. Jezeli produkt otrzymany przez rozdzielenie faz ewentualnie zawiera sole w wystarcza¬ jacym stezeniu, zwlaszcza gdy materialem wyjsciowym jest krew, wówczas mozna dokonac wytra¬ cenia tylko przez dodanie acetonu lub eteru, albo etanolu w niskiej temperaturze. Ten sposób postepowania, w którym nie trzeba specjalnie dodawac soli metalu albo roztworu soli metalu, stanowi druga postac wykonania etapu wytracania.4 142 242 Wedlug trzeciej postaci wykonania mozna ekstrakcje i wytracanie przeprowadzic w tym samym etapie. Wówczasdializat traktuje sie mieszanina wzmiankowanego, nie mieszajacego sie z woda lub mieszajacego sie z nia w sposób ograniczony rozpuszczalnika organicznego i acetonu albo eteru w takim stosunku objetosciowym i takiej ilosci, najakie wskazuja objetosc i stezenie soli metalu dializatu, i przez to wytraca sie osad zawierajacy glikolipidy.Osad ten oddziela sie od fazy cieklej w wyzej podany sposób i delikatnie suszy.W ostatnim etapie sposobu produkt otrzymany przy wytraceniu etanolem (A) albo przy ekstrakcji'(B) oczyszcza sie chromatograficznie. Do tego celu nadaja sie nieorganiczne srodki adsorpcyjne, zwlaszcza zel krzemionkowy lub mieszaniny zelu krzemionkowego i tlenku metalu albo soli nieorganicznego kwasu, przykladowo znajdujacej sie w handlu mieszaniny zelu krze¬ mionkowegoi tlenku glinowego, tlenku magnezowego lub siarczanu magnezowego, albo wymie¬ niacze jonowe, zwlaszcza zasadowe i kwasowe pochodne celulozy, jak dwuetyloaminoetanolo- celuloza, karboksymetyloceluloza albo sulfopropyloceluloza.Produkt rozpuszcza sie najpierw w rozpuszczalniku organicznym o malej polarnosci. Jako rozpuszczalniki nadajasietu zwlaszcza metanol, mieszaniny metanolu i chloroformuorazetanolu i chloroformu, poza tym octan etylu i mieszaniny metanolu, chloroformu i malej ilosci wody.Roztwór podaje sie na kolumne chromatograficzna, która jest wypelniona w sposób bezwodny srodkiem adsorpcyjnym wtakim samymrozpuszczalnikualbo wjednymzinych wyzejpodanych rozpuszczalników. Do eluowania stosuje sie takie same rozpuszczalniki albo mieszanine rozpu¬ szczalników; mozna takze uzywac mieszanine rozpuszczalników,o zwiekszajacej ue polarnosci, co osiaga sie przez zastosowanie liniowego, wkleslego lub wypuklego, albo stopniowego gradiantu ilosciowego skladu mieszaniny rozpuszczalników.Frakcje eluatu mozna badac róznymi metodami na obecnosc glikolipidów,jak równiez ich zawartosc i czystosc. Odpowiednie charakterystyczne dla glikolipidów albo glikosfingolipidów barwne reakcje i metody wybarwien opisane sa w doswiadczalnej czesci. Frakcjemozna takze dalej rozdzielac w odpowiednim eluencie na cienkowarstwowych plytkach lub foliach pokrytych zelem krzemionkowym, zelem krzemionkowym z alkanem o 18 atomach wegla, poliamidem, celuloza albo poliakryloamidem. Oddzielone substancje eluuje sie z plytki lub folii nie uwodnionym rozpuszczalnikiem, np. mieszanina chloroformu i metanolu, i bada za pomoca chromatografii cienkowarstwowej, hydrolizy i analizy produktu hydrolizy, chromatografii gazowej, spektrometrii masowej, ustalenia skrócenia czasu gojenia uszkodzen powierzchniowych, u ssaków albo zaobser¬ wowania zachowania sie kultur komórek, którym podano te substancje. Wyniki wykazuja, ze w przypadku substancji czynnych chodzi o glikosfinolipidy.Za pomoca opisanych nizej badan farmakologicznych mozna bylo dowiesc, ze otrzymane substancje czynne maja zarówno wplyw wyraznie przyspieszajacy rozplem na uszkodzone uprzed¬ nio fibroblasty in vitro, jak tez dzialanie przyspieszajace regeneracje na odpowiednie populacje komórek in vivo. Jestjednoznaczne, ze nie chodzi tu przypadkiem o zwykle mitotycznie dzialajace substancje, gdyz normalnie otrzymane, zdrowe kultury komóreknie wykazuja zadnych zmian przy dodaniu wymienionych substancji. W przeciwienstwie do tego kultury uszkodzone uprzednio przez rózne czynniki uszkadzajace, o nienormalnie glebokim stopniu podzialu w ciagu krótkiego czasu przechodza ponownie do normalnego stopnia podzialu, który jest praktycznie identyczny ze stopniem podzialu zdrowej kultury.Ze wzgledu na to, ze substancje wytworzone sposobem wedlug wynalazku pobudzaja mecha¬ nizmy naprawy uszkodzonych populacji komórek zarówno in vitro, jak tez in vivo, nadaja sie one do terapeutycznego zastosowania, zwlaszcza w przypadku powoli i zle gojacych sie ran wzglednie owrzodzen, których zdolnosc gojenia jest ograniczona.Preparaty zawierajace substancje wytworzone sposobem wedlug wynalazku stosuje sie do leczenia zaburzen doplywu krwi, owrzodzenia goleni, cukrzycowej zgorzeli, ran, uszkodzen po¬ promiennych, oparzen, przeszczepów skórnych oraz mózgowych zaburjpn przemiany materii.Ponizsze doswiadczenia ze zwierzetami wykazuja dzialanie tych substancji przyspieszajace gojenie ran.Doswiadczenie 1.Uspionym szczurom usuwa sie ze skóry wlosy i na tulowiu zadaje im dwustronnie rane oparzeniowa przez nalozenie na 30 sekund mosieznego krazka o srednicy 2 cm i temperaturze142242 5 270°C. Substancje czynne wrabia sie w podstawe w postaci zelu tak, ze powstaje 20% zei leczniczy.Jako konstole wrabia sie do zelu wode lub fizjologiczny roztwór soli kuchennej. Kazde 10 zwierzat z dwiema ranami traktuje sia zelem miejscowo 2 razy dziennie i to traktowanie utrzymuje az do calkowitego wygojenia. Substancja o opisanej w przykladzie II wartosci Rf=0,65 daje w stosunku do grupy kontrolnej skrócenie czasu gojenia do 21%.Doswiadczenie 2 Prosietom zadaje sie grzbietowo po 4 rany oparzenioweJak w doswiadczeniu 1, oraz 4 rany wygniatane o srednicy 2,5 cm wiertlemw postaci pustego cylindra. Substancje czynne wrabia sie w postaci zelu do zawartosci 20%. Rany smaruje sie zelem 2 razy dziennie az do calkowitego wygojenia. Substancja o wartosci Rf=0,65 daje skrócenie czasu gojenia o 18%.Doswiadczenie 3 Prosietom zadaje sie rany oparzeniowe w sposób opisany w doswiadczeniu 1. Po 6,12,18 i 22 dniach codziennego traktowania ran usuwa sie zwierzeta z grupy traktowanej i zabija w narkozie.Wycina sie rany, przepolawia je i utrwala w 4% buforowanej formalinie. Te kawalki tkanek przerabia sie na histologiczne skrawki parafinowe o grubosci 4fan. Ponizsze parametry ujete sa ilosciowo: 1. Dlugosc pokrytej nablonkiem powierzchni rany. 2. Dlugosc nie pokrytej nablonkiem pewierzckm rany. 3. Dlugosc warstwy podstawnej naskórka. 4. Powierzchnia nowo utworzonego naskórka.. Powierzchnia mieszków wlosowych i gruczolów lojowych.Ocena parametrów wykazuje, ze opisana w przykladach II-IV oczyszczona substancja przys¬ piesza w stosunku do zwierzat kontrolnych tworzenie ziarnin oraz ich wedrówke do srodka rany.Dzialanie przyspieszajace gojenie ran okazuje sie przewaznie we wczesnej fazie rozwoju podscieli- ska, warstwy podstawnej oraz brodawek.Doswiadczenie 4 Uspionym szczurom zadaje sie rany wygniatane o szerokosci 1 cm i glebokosci 5 mm. W otworach ran umieszcza sie gabki wpostaci pustych cylindrów z celulozy wiskozowej. Do wewnetrz¬ nego wydrazenia pustego cylindra podaje sie codziennie 100 ml oczyszczonej substancji. Po uplywie 4, 10, 16 i 21 dni od wszczepienia wyjmuje sie gabki i bada je na zawartosc hemoglobiny, kwasu dezoksyrybonukleinowego i hydroksyproliny.Rany, które potraktowano oczyszczonymi substan¬ cjami, 4 i 10 dni po wszczepieniu nie maja wyzszej zawartosci hemoglobiny, kwasu dezoksyrybonu¬ kleinowego i hydroksyproliny we wszczepionych gabkach niz zwierzeta kontrolne,jednak 16 i 21 dni po wszczepieniu gabki wykazuja wyraznie wyzsza zawartosc hemoglobiny, kwasu dezoksyry¬ bonukleinowego i hydroksyproliny. Metoda podana jest w J. Nitnikoski i S. Renvall, Ada Chir.Scand. 145 (1979), 287-291.Oczyszczona substancja z przykladówII-IVprzyspiesza sie gojenie ran we wczesnym rozwoju podscieliska i warstwy podstawnej z wlósniczkami.Doswiadczenie 5 Kulture komórek, np. rosnace fibroblasty, mozna zahamowac w ich wzroscie przez rozpu¬ szczenie w pozywce wodoroweglanu sodowego. Dodanie do pozywki substancji opisanych w przykladach II-VIprowadzi do tego, ze komórki szybciej wychodza z tego dzialania hamujacego i ponownie osiagaja normalny stopien podzialu znacznie wczesniej, niz odpowiednio hamowane, ale nie traktowane kultury komórek.Liczbowe dane odnosnie mieszanin rozpuszczalników w przykladach odnosza sie stale do objetosci, np. eter: etanol 3:1 oznacza mieszanine 3 czesci objetosciowych eteru i 1 czesci objetos¬ ciowej etanolu.Przyklad I. Cieleca krew uzyskana z rzeznych zwierzat natychmiast w rzezni zadaje sie etanolem az do uzyskania stezenia jego 20% i traktuje substancjami bakteriostatycznymi p- hydroksybenzoesanem metylu (Methylparaben) i p-hydroksybenzoesanem n-propylu (Porpylpa- raban) az do stezenia kazdorazowo 0,02%. Krew poddaje sie autolizie w ciagu 3 dni w temperaturze pokojowej, przy czym nastepuje silna hemoliza oraz czesciowy rozpad nietrwalych skladników i skladniki blon zostaja wymyte z blon. Ten auiolizat oddziela sie przez zdekantowanie znad ustalego osadu i ustaly roztwór poddaje sie dializie przez 3 dni statycznie lub dynamicznie przez6 142 242 blone z granica wylaczenia 10000. W przypadku dynamicznej dializy dializat i przeciwdiaiizat pompuje sie w ciagu 3 dni przez blone dializujaca tak, ze ciagle ma miejsce mozliwie duzy spadek stezenia.Otrzymany przeciwdiaiizat zawiera sucha substancje w ilosci 5-80 mg/ml i zawiera substancje przyspieszajace gojenie ran w ilosci do 1 mg/mL Sposobem wedlug wymienionego na wstepie europejskiego zgloszenia patentowego otrzymuje sie odpowiednie glikosfingolipidy w ilosci 0,005 mg/ml.Przyklad IL 2 litry krwi cielecej miesza sie z 300 ml etanolu i poddaje autolizieprzez 3 dni w temperaturze pokojowej. Autolizat saczy sie przez ultraftltr o granicy wylaczenia 10000 (ciezar czasteczkowy) i przez to oddziela od kawalków tkanek i duzych protein. Przesacz miesza sie z 6 litrami mieszaniny etanol: eter o stosunku 3:1, przy czym powstaje osad skladajacy sie glównie z glikosfingolipidów.Osad poddaje sie sedymentacji przezodwirowanie z 18 000 g w ciagu 30 minut i oddziela od fazy cieklej.Osad suszy sie pod zmniejszonym cisnieniem w temperaturze 37°C i rozpuszcza w 20 ml mieszaniny chloroform: metanol w stosunku 65:35. Rozpuszczone glikosfingolipidy rozdziela sie chromatograficznie na kolumnie Fluorisil (Nazwafirmowa; zel krzemianu magnezowego, wysoko- selektywny adsorber firmy Floridin Corp. Pittsburg PA, USA) o srednicy 5,0cm i dlugosci 40 cm, która jest równowazona mieszanina chloroform : metanol w stosunku 65:35 i przez to usuwa sie reszte fosfolipidów. Glikosfingolipidy eluuje sie przy zastosowaniu stopniowego gradientu, uzywa¬ jac po 2 litry 35%, 50%, 75% metanolu w chloroformie i wreszcie 100% metanolu. Uzyskane w etapach elucji substancje poddano opisanemu we wstepie testowi gojenia ran i stwierdzono przy tym, ze ostatnia frakcja eluowana 100% metanolem zawiera substancje, które przyspieszaja gojenie sie ran.Zawarte w tej frakcji substancje nanosi sie na preparatywne cienkowarstwowe plytki z zelu krzemionkowego o grubosci warstwy 2 mm i chromatografuje metoda wystepujaca w eluencie chloroform:metanol:0,1% CaCk w wodzie = 55:45:10 na odcinku 18cm. Po chromatografii plytki suszy sie i ustawia na krótko w komorze o atmosferze nasyconej jodem. Zaznacza sie zabarwione przy tym na zólto strefy, po sublimacji jodu wyskrobuje je i eluuje z zelu krzemionko¬ wego mieszanina chloroform: metanol = 50: 50. Próby stwierdzenia skrócenia czasu gojenia sie ran oparzeniowych u szczurów przebiegaly pozytywnie z frakcja, która w wymienionym sposobie rozdzielania droga chromatografii cienkowarstwowej ma wartosc Rt = 0,65.Przyklad III. 2 litry przeciwdiazalitu z przykladu I suszy sie w wyparce obrotowej albo przez liofilizacje i przenosi do 4 litrów mieszaniny tetrahydrofuran: 0,01 m KC1 w stosunku 4:1.Czesci nie rozpuszczone oddziela sie droga saczenia przez bibule i przezroczysty roztwór zateza w wyparce obrotowej do objetosci 500 ml. Do tego dodaje sie 1 litr mieszaniny chloroform: metanol w stosunku 2:1 i rozdziela sie fazy: organiczna i wodna przez dodanie 200 ml wody. Faze górna, która zawiera glikolipidy, oddziela sie i zateza do sucha. Sucha substancje rozpuszcza sie w 10 ml mieszaniny chloroform! metanol: woda = 90:10:0,2 i podaje na kolumne A Bio-Sil o srednicy 1,5 cm i dlugosci 120 cm, równowazona w mieszaninie chloroform: metanol: woda = 90:10:0,2.Kolumneprzemywa sie 1,5 litrami takiego samego eluentu i nastepnie z kolumny eluuje glikolipid 1 litrem mieszaniny chloroform: metanol: woda w stosunku 85:15:0,2. Oczyszczona w ten sposób substancja jest glikolipid, który skraca czas gojenia ran oparzeniowych.Przyklad IV. 2 litry przeciwdiaiizatu z przykladu I ekstrahuje sie, jak w przykladzie II, mieszanina etanol: eter w stosunku 3:1 i osad przenosi do 20 ml mieszaniny chloroform: metanol o stosunku 2:8. Dwuetyloaminoetylo-Sephadex A 50 w postaci chlorku przey przemycie 0,1 n lugiem sodowym i 1 n kwasem octowym przeprowadza sie w postaci octanu, przemywa metanolem i umieszcza w kolumnie o srednicy 2,5 cm i dlugosci 20 cm. Do kolumny wprowadza sie material rozpuszczony w mieszaninie chloroform: metanol o stosunku 2:8 i kolumne przemywa stosujac po 200 ml 0,01 m roztworu octanu sodowego, 0,02 m roztworu octanu sodowego i 0,2 m roztworu octanu sodowego. Nastepnie glikolipid eluuje sie mieszanina chloroform: metanol o stosunku 2:8.Wyeluowany w ten sposób glikolipid skraca czas gojenia sie ran oparzeniowych. rze g^CPnLtt^ rze 85 C. Powstaly przy tym osad usuwa s,c za pomoca bibuly filtracyjnej i przezroczysty roLór142242 7 przechowuje przez 3 dni w temperaturze -20°C. W tym czasie wytraca sie poszukiwana substancja i osadza sie . Ustala ciecz dekantuje sie, a osad przenosi do mieszaniny chloroform: metanol o stosunku 2:1 i podaje na kolumne dwuetyloaminoetylo-Sephacel w postaci octanu. Kolumny eluuje sie mieszanina chloroform: metanol w stosunku 2 : 1 i zbiera eluat, który suszy sie w wyparce obrotowej i rozpuszcza w chloroformie. Roztwór podaje sie na kolumne wypelniona aktywowanym zelem krzemionkowym w chloroformie. Najpierw plucze sie chloroformem, potem mieszanina chloroform: metanol w stosunku 9:1 i te eluaty odrzuca sie. Nastepnie plucze sie mieszanina aceton: metanol w stosunku 9:1 i ta frakcja zawiera pozadane glikolipidy w czystej postaci.Charakterystyka substancji Oczyszczona sposobem wedlug przykladu II substancje rozdziela sie chromatograficznie na cienkowarstwowych plytkach z zelu krzemionkowego w eluencie metanol:chloroform:0,1% CaCl2 w wodzie = 55:45:10.Jako substancje porównawcze rozdziela siejednoczesnie nastepujace substancje: Asialogang- lozydMi w dalszym ciagu oznaczony skrótem Asialo-Giui, Asialo-GM2 Asialo-GM3, Asialo-Goia, Cerebrozyd i Psychozyne.Plytki zabarwia sie nastepujacymi metodami: L 20 mg fioletu krezylowego w 1000 ml 1% kwasu octowego; zabarwienie niebiesko-fioletowe. 2. 1% dwufenyloaminy w 2 ml etanolu, 100 ml stezonego kwasu solnego i 80 ml kwasu octowego; zabarwienie czerwone. 3. 5,25% kwas podchlorawy w 40 ml benzenu i 5 ml kwasu octowego, opryskac, wysuszyc, potem 1% benzydyny w 50% etanolu; zabarwienie niebieskie. 4. 0,1% orcynolu w 1 ml 1% chlorku zelazowego i 50 ml wody; zabarwienie brunatne.. Cienkowarstwowe plytki umieszcza sie w komorze zparamijodu. Substancje porównawcze, jak równiez substancja analizowana o wartosci Rf = 0,65 zabarwiaja sie na kolor zólty. 6. Przy zastosowaniu cienkowarstwowych plytek ze wskaznikiem fluorescencyjnym dla dlu¬ gosci fali 254 nm i 366 nm fluorescencja nie zostaje oslabiona przez analizowana substancje o wartosci Rf = 0,65 równiez, jak substancje porównawcze nie zmieniaja fluorescencji plytek. 7. 0,2% naftorezolcylon w acetonie i 10% kwas fosforowy jako odczynnik spray. Potrakto¬ wane plytki ogrzewa sie przez 5 minut w temperaturze 90°C. 8. 1 g p-anizydyny w 100 ml 70% etanolu; zabarwienie niebieskie.Oznaczenie jakosciowe i ilosciowe 1 ml oczyszczonej sposobem wedlug przykladu II substancji suszy sie w wyparce obrotowej pod zmniejszonym cisnieniem w temperaturze 37°C albo przez liofilizacje. Wysuszona substancje przenosi sie do 0,8 rnl 2 m siarkowego i 0,4 ml dioksanu i zespawa w ampulkach. Próbki hydrolizuje sie przez 3 godziny w temperaturze 95°C i potem zobojetnia przez dodanie 0,14 ml 10 n lugu sodowego. Zobojetniony hydrolizat buforuje sie przy uzyciu 1,66 ml 0,2 m boranu sodowego jako buforu o pH 8,0 i ekstrahuje w ciagu 5 minut w rodzielaczu 2,0 ml eteru dwuetylowego. Dolna warstwe odrzuca sie, a górna eterowa suszy w lazni wodnej w temperaturze 37°C. Wysuszona substancje przenosi sie do 3 ml chloroformu z 0,0025% fluorescamino-4-fenylo-spiro-/furano- 2/3H/-l'-ftaleno/-3,3'-dionu [M. Naoi,J. C. Lee i S. Rosman, Anal. Biochem. 58 (1974), 571-577] i miesza przez 30 sekund. Fluorescencje tego roztworu mierzy sie przy dlugosci fali wzbudzenia 385 mm i dlugosci fali emisyjnej 480 mm.Zastrzezenia patentowe 1. Sposób wytwarzania glikosfingoiipidów regenerujacych komórki i tkanki przez ekstrakcje substancji czynnej z krwi ssaków w postaci dializatu, znamienny tym, ze krew zadaje sie krótkolan- cuchowym alkoholem i srodkiem bakteriostatycznym i prowadzi sie autolize krwi w ciagu 3 dni, w temperaturze pokojowej oraz dialize przez blone o zdolnosci zatrzymywania czastek o ciezarze czasteczkowym 10000, w stosunku do medium alkoholowo-wodnego, przy czym dializat i prze- ciwdializat przetlaczane sa za pomoca pompy w przeciwpradzie, albo produkt autolizy oddziela sie przez dekantacje od produktu osadzajacego sie i nastepnie prowadzi sie dialize pozostalej cieczy. 2, Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze autolize i dialize przeprowadza siejednoczesnie i w sposób ciagly w przeciwpradzie.g 142 242 3. Sposób wedlug zastrz. 1 albo 2, zaamiewiy tym, zejako material wyjsciowy stosuje sie krew bydleca lub cieleca, zwlaszcza cieleca. 4. Sposób wedlug zastrz. 1, znamieny tym, ze z otrzymanego dializatu wytraca sie i oddziela glikolipidy, a w tym glikosfingoiipidy przez dodanie etanolu i odstawienie utworzonego roztworu etanolowego w temperaturze -15 do -25°C.. Sposób wedlug zastrz. 1, znamicBny tym, ze otrzymany dializat rozdziela sie na fazy: stala /ciekla lub ciekla/ ciekla przez dodanie nie mieszajacego sie z woda lub mieszajacego sie z nia w sposób ograniczony rozpuszczalnika lub mieszaniny rozpuszczalników,przy czym glikolipidy, a w tym glikosfingoiipidy przechodza do stalej fazy. wzglednie do organicznej mniej polarnej fazy, po czym faze zawierajaca glikolipidy oddziela sie i ewentualnie suszy w lagodnych warunkach. ó. Sposób wedlug zastrz. 5, nuuriemiy tym, zejako organiczne rozpuszczalniki do rozdziela¬ nia dializatu na fazy, stala /ciekla lub ciekla/ ciekla stosuje sie takie etery, weglowodory, chlorow¬ cowane weglowodory, alkohole, estry kwasów karboksylowych oraz ich mieszaniny, które nie mieszaja sie z wode albo mieszaja sie z nia tylko w sposób ograniczony.OH CH3- (CH^^-CH^^^YCHjrO-R NH / O^CoyiCH-CH-CHfOC l/lzór 2 Pracownia Poligraficzna UP PRL. Naklad 100 egz.Cena 130 zl PL

Claims (5)

1. Zastrzezenia patentowe 1. Sposób wytwarzania glikosfingoiipidów regenerujacych komórki i tkanki przez ekstrakcje substancji czynnej z krwi ssaków w postaci dializatu, znamienny tym, ze krew zadaje sie krótkolan- cuchowym alkoholem i srodkiem bakteriostatycznym i prowadzi sie autolize krwi w ciagu 3 dni, w temperaturze pokojowej oraz dialize przez blone o zdolnosci zatrzymywania czastek o ciezarze czasteczkowym 10000, w stosunku do medium alkoholowo-wodnego, przy czym dializat i prze- ciwdializat przetlaczane sa za pomoca pompy w przeciwpradzie, albo produkt autolizy oddziela sie przez dekantacje od produktu osadzajacego sie i nastepnie prowadzi sie dialize pozostalej cieczy.
2. 2. , Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze autolize i dialize przeprowadza siejednoczesnie i w sposób ciagly w przeciwpradzie.g 142 242
3. 3. Sposób wedlug zastrz. 1 albo 2, zaamiewiy tym, zejako material wyjsciowy stosuje sie krew bydleca lub cieleca, zwlaszcza cieleca.
4. 4. Sposób wedlug zastrz. 1, znamieny tym, ze z otrzymanego dializatu wytraca sie i oddziela glikolipidy, a w tym glikosfingoiipidy przez dodanie etanolu i odstawienie utworzonego roztworu etanolowego w temperaturze -15 do -25°C.
5. 5. Sposób wedlug zastrz. 1, znamicBny tym, ze otrzymany dializat rozdziela sie na fazy: stala /ciekla lub ciekla/ ciekla przez dodanie nie mieszajacego sie z woda lub mieszajacego sie z nia w sposób ograniczony rozpuszczalnika lub mieszaniny rozpuszczalników,przy czym glikolipidy, a w tym glikosfingoiipidy przechodza do stalej fazy. wzglednie do organicznej mniej polarnej fazy, po czym faze zawierajaca glikolipidy oddziela sie i ewentualnie suszy w lagodnych warunkach. ó. Sposób wedlug zastrz. 5, nuuriemiy tym, zejako organiczne rozpuszczalniki do rozdziela¬ nia dializatu na fazy, stala /ciekla lub ciekla/ ciekla stosuje sie takie etery, weglowodory, chlorow¬ cowane weglowodory, alkohole, estry kwasów karboksylowych oraz ich mieszaniny, które nie mieszaja sie z wode albo mieszaja sie z nia tylko w sposób ograniczony. OH CH3- (CH^^-CH^^^YCHjrO-R NH / O^CoyiCH-CH-CHfOC l/lzór 2 Pracownia Poligraficzna UP PRL. Naklad 100 egz. Cena 130 zl PL