HU189286B - Process for producing materials, regenerating cells and tissue - Google Patents

Description

Ismeretes, hogy emlős állatok szerveiben és testnedveiben előforduló, illetve onnan extrahálható bizonyos vegyületek a sebek gyógyulását meggyorsító hatással rendelkeznek (81 102 848.9 sz.,

038 511 számon nyilvánosságra hozott európai szabadalmi bejelentés). Az idézett nyilvánosságra hozott európai szabadalmi bejelentés szerint az extrahált hatóanyagok szerkezetük alapján elsősorban a glikoszteroidok és glikoszfingolipidek csoportjába sorolhatók. ¹

A glikoszteroidok az (I) általános képletnek felelnek meg. A képletben R jelentése 5 cukoregységből álló oligoszacharid.

A glikoszfingolipid a (II) általános képletnek felel meg. A képletben R jelentése 5 cukoregységből álló oligoszacharid.

A fenti vegyületek különböző szervekből (pl. szív, tüdő, izmok, lép, testnedvek, mint pl. vér, plazma és szérum) izolálhatok. A fenti vegyületek , kinyerésére alkalmas emlősök közül az embert, ser- ² tést, lovat és birkát említjük meg.

Az idézett európai szabadalmi bejelentés szerinti eljárás során az alábbi lépéseket alkalmazzák; aktívszénen történő abszorpció (affinitás-kromatog- , ráfia) és 10-30 %-os ecetsawal végzett extrakció, ‘ molekulaszitán történő második kromatografálás és híg ecetsavas eluálás, kovasavgélen végzett harmadik kromatografálás és etanolnak metilénkloriddal képezett elegyével történő eluálás, illetve , Cg-szénlánccal bevont kovasavgélen történő eluá- ‘ lás és ecetsav, etanol és viz elegyével végrehajtott eluálás.

Meglepő módon azt találtuk, hogy a fentiekben felsorolt kiindulási anyagokból a sejt- és szövetregeneráló tulajdonságokkal rendelkező glikolipidek ³ lényegesen magasabb kitermeléssel nyerhetők ki oly módon, hogy a kiindulási anyagokat előbb alkoholos-vizes közeggel szemben autolízisnek és dialízisnek vetjük alá. Ily módon a kívánt hatóanyagokat az ismert eljárás termékéhez viszonyítva előre nem látható módon, rendkívül nagy mértékben feldúsítva tartalmazó nyersterméket kapunk.

A találmányunk szerinti eljárás kidolgozása során továbbá azt találtuk, hogy a fentiekben említett glikoszteroidok a gyógyászati felhasználás követel- ⁴ ményeit nem kielégítő kismértékű stabilitással rendelkeznek.

Azt találtuk továbbá, hogy a kapott nyerstermékből a glikolipideket lényegesen egyszerűbben izolálhatjuk oly módon, hogy ⁵

A) etanolos oldatból alacsonyabb hőmérsékleten - pl. - 20 ’C körüli hőmérsékleten - kicsapjuk; vagy

B) vízzel nem vagy csupán korlátozottan elegyedő szerves oldószerrel extraháljuk; ⁵ és az A), illetve B) lépésnél kapott terméket kovasavgélen vagy ioncserélőn kevéssé poláros oldószerrel kromatografáljuk.

A kromatográfiás szétválasztások közismerten költséges volta miatt lényeges előny, hogy a találmányunk szerinti eljárásnál csupán egyetlen kromatográfiás lépésre van szükség és a találmányunk szerinti eljárásnak az ismert módszerekhez viszonyított fenti előnye különösen ipari körülmények között történő megvalósítás esetében jelentős. 6

A találmányunk szerinti eljárás ipari megvalósításának további előnye, hogy az autolízis és dialízis fontosabb lépései egyidejűleg és folyamatosan, ellenáramú eljárással végezhetők el.

A találmányunk tárgyát képező eljárást az jellemzi, hogy a vért vagy szervhomogenizátumot alkoholos-vizes közeggel szemben autolízisnek és dialízisnek vetjük alá.

Az alábbiakban találmányunk részleteit ismertetjük.

Kiindulási anyagként előnyösen emlősök fibrinmentesitett vérét és szervhomogenizátumát - pl. szarvasmarha- vagy borjúvért, különösen előnyösen borjúvért - alkalmazhatunk.

A kiindulási anyagot - mint már említettük előbb autolízisnek vetjük alá, és az autolizátumot dializáljuk. Az autolizisnél képződő anyag feloldódásának biztosítása céljából előnyösen oly módon járhatunk el, hogy a kiindulási anyagot rövidszénláncú alkohollal (előnyösen 10-30% koncentrációban metanollal vagy etanollal) és valamely bakteriosztatikummal (előnyösen 0,1-0,0001% koncentrációban 4-hidroxi-benzoesav-metilészterrel vagy 4-hidroxi-benzoesav-propilészterrel) elegyítjük. Az autolizist oly módon végezhetjük el, hogy a kiindulási anyagot néhány óra és néhány nap közötti időtartamon át (pl. 3 napig) 4 °C és szobahőmérséklet közötti hőmérsékleten állni hagyjuk. A két műveletet azonban előnyösen egyidejűleg és folyamatosan ellenáramban végezhetjük el, minthogy az autolizált terméknek a kiindulási anyag oldalán történő folyamatos elvétele az egyensúlyt állandóan az autolizis-reakció irányában tolja el. Az autolízis alatt az intracelluláris katabolikus enzimek (pl. liposzómák, mint pl. katepszin és más proteázok, továbbá nukleotidázok, észterázok, foszfatázok, stb.) felszabadulnak.

A dialízis során az anyagok - közöttük a kívánt glikolipidek - molekulasúlya 10000 alatti érték. A dialízis tehát egyrészről meggyorsítja az autolízist, másrészről eltávolítja a gyógyászati felhasználás során allergiás reakciók előidézésére képes fehérjéket. A dialízis alatt az anyagok felvételére szolgáló közegként víz és kis szénatomszámú alifás alkoholok (pl. metanol és etanol) elegyét alkalmazhatjuk. Előnyösen alkalmazhatunk vízből és 10-30 térfogat% etanolból - különösen vízből és 15 térfogat % etanolból - álló oldószer-elegyeket.

A nyers terméket adott esetben a soron következő izolálási és szétválasztási lépések időtartamára átmenetileg megvédhetjük. A megvédést a peptidkémiából hasonló célra ismert védőcsoportokkal végezhetjük el. A védőcsoportok szelektív bevitelével a hatóanyagok funkcionális csoportjait blokkoljuk és a hatóanyagokat a reakcióelegyből történő extrakció szempontjából előnyösebb formává alakítjuk. Az izolálás és tisztítás után a védőcsoportokat lehasítjuk. Az alábbi védőcsoportokat és lehasítási módszereket alkalmazhatjuk előnyösen:

Benzoilcsoport (lehasítás híg lúggal); benziloxi-karbonil-csoport (lehasítás brómhidrogénsavval jégecetben, trifluorecetsavban vagy más szerves oldószerekben; sósavval etanolban; trifluorecetsawal melegen vagy fémnátriummal folyékony ammóniában);

189 286 benzil- és p-toluol-szulfonil-csoport (lehasítás nátriummal folyékony ammóniában), tercier butil-csoport (lehasítás sósavval szerves oldószerekben; bróm-hidrogénsawal jégecetben vagy trifluorecetsavban).

A tercier butil-csoportot különösen elegáns módon vihetjük be izobuténnel történő savban katalizált éterezéssel.

A glikolipideknek a kapott dializátumból történő izolálását és tisztítását

A) hidegen etanoios oldatból történő kicsapással; vagy

B) bizonyos szerves (pl. lipofil) oldószerekkel történő extrakcióval;

majd szervetlen abszorbensen vagy ioncserélőn történő kromatografálással végezhetjük el.

A B) extrakció és a kromatografálás közé előnyösen további kicsapásos tisztítási lépést iktathatunk be.

Az A) kicsapást előnyösen etanoios oldatban,

- 15 ’C és -25 °C közötti oldatban végezzük el. A glikolipid kitermelés annál jobb, minél nagyobb az etanol végkoncentrációja. A dializátumhoz célszerűen annyi vízmentes etanolt adunk, hogy a koncentráció legalább 60 térfogat% legyen. A legjobb eredményeket 90 térfogat %-os végkoncentráció mellett kapjuk. A képződő etanoios oldatot az említett hőmérsékleten több órán át állni hagyjuk.

A szilárd anyagokat szűréssel, centrifugálással vagy ülepitéssel és dekantálással választjuk el. A terméket végül kíméletes körülmények között azaz 37 ’C-nál nem magasabb hőmérsékleten - szárítjuk. A szárítást melegítéssel vagy vákuumban vagy melegítés és vákuum együttes alkalmazásával hajtjuk végre.

A B) extrakciós lépéshez a dializátumot szárított szilárd formában, vizes oldat alakjában vagy szerves oldószerrel képezett oldat formájában alkalmazhatjuk. Az extrakcióhoz vízzel nem vagy csak korlátozottan elegyedő szerves oldószerek vagy ezek elegyei alkalmazhatók. E célra különösen az alábbi oldószerek bizonyultak előnyösnek: éterek (pl. dietiléter és tetrahidrofurán), szénhidrogének (pl. pentán, hexán, petroléter és benzol), halogénezett szénhidrogének (pl. kloroform, diklór-metán, szén-tetraklorid és 1,2-diklór-etán), kloroformmetanol elegy, alkoholok (pl. butanol és amilalkohol) és karbonsav-észterek (pl. etil-acetát és butilacetát).

A fenti extrakciós lépéssel a kiindulási anyagokat folyadék/folyadék fázisokra vagy folyadék/szilárd fázisokra és ily módon a komponenseket kevésbé poláros vagy apoláros és poláros vagy ionos anyagokra választjuk szét. A kívánt glikolipidek a kevésbé poláros szerves fázisba mennek át. A szerves fázist a másik folyadékfázistól vagy szilárd fázistól való elválasztás után a fentiekben leírt módon kíméletesen megszárítjuk.

Az extrakció után a glikolipideket előnyösen kicsapjuk, fémsók vizes oldataiban mutatott oldékonyságuk alapján. A kicsapást acetonban, dietiléterben vagy ezek elegyében vagy pedig etanolban

- 15 °C és - 25 °C közötti hőmérsékleten végezzük el. A vizes oldat valamely szervetlen sav 1-5 vegyértékű fémmel képezett sóját (előnyösen fémsóját) tartalmazza. Sóként előnyösen magnézium-kloridot, kálcium-kloridot, nátrium-kloridot, káliumkloridot, ammónium-szulfátot, nátrium-szulfátot, kálium-szulfátot, nátrium-nitrátot, dinátrium5 hidrogén-foszfátot és nátrium-dihidrogén-foszfátot alkalmazhatunk, A vizes oldat koncentrációja a telítődésig bármilyen érték lehet. A szárításnál viszszamaradó anyagot ebben az oldatban szuszpendáljuk vagy oldjuk.

Aceton és dietiléter elegyet is alkalmazhatunk, azonban előnyösen acetont vagy dietilétert vagy hidegen etanolt használhatunk. A képződő szuszpenzióhoz vagy oldathoz többszörös térfogatú oldószert adunk, majd az elegyet jól összekeverjük.

¹⁵ A képződő csapadék tartalmazza a glikolipideket. A csapadékot a folyadékfázistól elválasztjuk (pl. szűrés, centrifugálás vagy útépítés és dekantálás útján). A terméket végül kíméletesen szárítjuk. Ez a módszer a kicsapási lépés első foganatosítási ²⁰ módja.

Amennyiben az oldhatósági viszonyok a glikolipideknek aceton és éter elegyéböl vagy hidegen etanolból és vizes fém-só-oldatokból történő kicsapásához megfelelőek, a termék kiválása bekövetke²⁵ zik. Bizonyos esetekben - különösen ha kiindulási anyagként vért alkalmazunk - a fázis-szétválasztással kapott termék megfelelő koncentrációban sókat is tartalmaz és ilyen esetekben a kicsapást önmagában acetonnal vagy éterrel vagy etanollal hidegen ³⁰ végezhetjük el. Ennél a módszernél tehát fém-sót vagy fém-só-oldatot nem adunk külön hozzá. Ez a módszer a kicsapási eljárás második foganatosítási módja.

A harmadik foganatosítási mód szerint az ext³⁵ rakciót és kicsapást ugyanabban a munkalépésben végezzük el. A dializátumot a fent említett, vízzel nem vagy csak korlátozottan elegyedő oldószer és aceton vagy éter elegyével kezeljük. Az oldószerelegy mennyiségét és komponenseinek térfogatará⁴⁰ nyát a dializátum térfogatának és fém-só koncentrációjának megfelelően választjuk meg és ily módon csapjuk ki a glikolipideket. A csapadékot a folyékony fázisoktól a fentiekben ismertetett módon elválasztjuk és kíméletesen szárítjuk.

⁴5 Az utolsó eljárási lépésben az A) etanoios kicsapásnál vagy B) extrakciónál kapott terméket kromatográfiás tisztításnak vetjük alá. E célra szervetlen abszorbenseket alkalmazhatunk, különösen kovasavgélt vagy kovasavgél és valamely fém-oxid vagy szervetlen savas só keverékét (pl. a kereskedelmi forgalomban levő kovasavgél és alumíniumoxid, magnézium-oxid vagy magnézium-szulfát keveréke), továbbá ioncserélőket, különösen bázikus és savas cellulóz-származékokat (pl. dietil-amino55 etán-cellulózt, karboxi-metil-cellulózt vagy szulfopropil-cellulózt).

A terméket előbb kevéssé poláros szerves oldószerben oldjuk. Oldószerként különösen előnyösen metanolt, metanol-kloroform vagy etanol-kloro60 form elegyet, etil-acetátot, valamint metanol, kloroform és kevés víz elegyét alkalmazhatjuk. Az oldatot abszorbenssel ugyanabban az oldószerben vagy más oldószerben vízmentesen feltöltött kromatografáló oszlopra visszük fel. Az eluáláshoz 65 ugyanazt az oldószert vagy oldószer-elegyet alkal3

189 286 mázzuk; eljárhatunk azonban oly módon is, hogy növekvő polaritású oldószer-elegyeket használunk és a kvantitatív összetételt lineáris, konkáv vagy konvex vagy lépcsőzetes gradiens szerint változtatjuk.

Az eluátum-frakció glikolipid-tartalmát és tisztaságát különböző módszerekkel határozhatjuk meg. E célra a kísérleti részben leírt, glikolipidekre vagy glikosphingolipidekre jellemző színreakciókat és színezési módszereket alkalmazhatunk. A frakciókat pl. kovasavgéllel, C_lg-alkán-származékokat tartalmazó kovasavgéllel, poliamiddal, cellulózzal vagy poliakríl-amiddal bevont vékonyréteglemezeken vagy -fóliákon, megfelelő futtatószerben további szétválasztásnak vethetjük alá. A szétválasztott anyagokat nem vizes oldószerrel (pl. kloroform és metanol elegyével) eluáljuk a lemezről vagy fóliáról és vékonyrétegkromatográfia, a hidrolizált terméket hidrolízise és elemzése, gázkromatográfia, tömegspektrum, az emlősök felületi sérülései gyógyulási idejének megrövidítése vagy a sejttenyészetek viselkedésének megfigyelése útján vizsgáljuk. Az eredmények azt mutatják, hogy a hatóanyagok a glikoszfingolipidek szerkezetének felelnek meg.

Az alábbiakban ismertetésre kerülő farmakológiai kísérletek igazolják, hogy az előállított hatóanyagok egyrészről előkárosított fibroblastokra in vitro kifejezett burjánzáselősegítő hatást fejtenek ki, másrészről a megfelelő sejttenyészetekre in vivő regenerálódást elősegítő hatást gyakorolnak. E hatóanyagok esetében egyértelmű, hogy nem csupán szokásos mitotikus hatású anyagokról van szó, minthogy a normál egészséges sejttenyészetek e hatóanyagok hozzáadásakor semmilyen elváltozást nem mutatnak. Ezzel szemben az abnormálisán alacsony osztódási arányt mutató, különböző károsító ágensekkel előkárosított tenyészeteket e hatóanyagok rövid időn belül ismét az egészséges tenyészettel gyakorlatilag azonos osztódási arányra állítják vissza.

Minthogy a találmányunk szerinti eljárással előállított hatóanyagok a károsított sejtpopulációk regenerációs mechanizmusát in vitro és in vivő körülmények között egyaránt helyreállítják, ezeket a hatóanyagokat a gyógyászatban különösen lassan vagy nehezen gyógyuló, kis gyógyulási készségű sebek vagy fekélyek kezelésére alkalmazhatók.

A találmányunk szerinti eljárással előállított anyagok sebek gyógyulására kifejtett hatását az alábbi kísérletekkel igazoljuk:

1. kísérlet

Narkotizált patkányok szőrzetét eltávolítjuk és a törzs mindkét oldalán 2 cm átmérőjű, 270 °C hőmérsékletű tárcsa 30 másodpercen át történő rányomásával égési sebeket ejtünk. A hatóanyagot zselé-alapanyagba bedolgozva 20%-os hatóanyagtartalmú zselét használunk. Kontrollként vizet vagy fiziológiás nátrium-klorid-oldatot alkalmazunk. 10-10 állatot (minden állaton két sebet ejtettünk) a zselével naponta kétszer helyileg kezelünk és megállapítjuk a gyógyulás befejeződéséig eltelt időt. A 2. példában leírt, R_f=0,65 értéknek megfe4 lelő anyag a kontroli-csoporthoz viszonyítva a gyógyulási időt 21%-ig megrövidíti.

2. kísérlet

Minisertések hátán az 1. kísérletnél leírt módon négy égési sebet ejtünk és 2,5 cm átmérőjű, üreges hengeres fúróval 4 lyuggatott sebet ejtünk. A hatóanyagokat 20%-ig terjedő koncentrációban dolgozzuk be a zselé-alapanyagba. A sebeket naponta kétszer bekenjük a zselével és meghatározzuk a seb teljes gyógyulásához szükséges időt. A 0,65 R_rértéket mutató anyag a gyógyulási időt 18%-kal csökkenti.

3. kísérlet

Minisertéseken az 1. kísérletnél leírt módon égési sebeket ejtünk. A kezelt csoportok állatait naponta kezeljük és a csoportokból 6,12, 18 és 22 nap után állatokat kiválasztunk és narkózisban leölünk. A sebeket kivágjuk, kettéosztjuk és 4%-os pufferolt formáimnál fixáljuk. A szövetdarabokból 4 μ vastagságú hisztológiás paraffin-metszeteket készítünk. Az alábbi paramétereket kvantitatív meghatározzuk :

1. A hámosodott sebfelület hossza.

2. A nem hámosodott sebfelület hossza.

3. A felhám Stratum basale hosszúsága.

4. Az újonnan képzett felhám felülete.

5. A szőrtüszők és faggyúmirigyek felülete.

A fenti paraméterek kiértékelése azt mutatja, hogy a 2-6. példák szerint tisztított anyagok a felhámosodást és a felhám immigrációját a kontroli-állatokhoz képest gyorsítjuk. A sebgyógyulást gyorsító hatás túlnyomórészt a Stroma, Stratum basale és szemölcsök képződésének kezdeti szakaszában jelentkezik.

4. kísérlet

Narkotizált patkányokon 1 cm széles és 5 mm mély szúrt sebeket ejtünk. A sebekbe viszkóz-cel(ulóz-üregeshengert tartalmazó szivacsot helyezünk. Az üregeshenger belső üregébe naponta 1001 tisztított hatóanyagot juttatunk. Az implantáció utáni 4., 10., 16. és 21. napon a szivacsokat kivesszük és a haemoglobin-, dezoxiribonukleinsav- és hidroxiprolin-tartalmat meghatározzuk. A tisztított hatóanyagokkal kezelt sebek esetében az implantáció utáni 4. és 10. napon implantált szivacsokban levő haemoglobin-, dezoxiribonukleinsav- és hidroxiprolin-tartaltm nem nagyobb, mint a kontroli-állatok esetében; a 16. és 21. napon azonban a szivacsokban a haemoglobin-, DNS- és hidroxi-prolintartalom lényegesen magasabb. A módszerek leírása az alábbi irodalmi helyen található: Niinikoski J. és RenvallS.: Acta Chir. Scand. 145 (1979), 287-291.

A 2. és 6. példa szerint tisztított hatóanyagok a sebgyógyulást a Stroma és Stratum basale korábbi kialakításával kapilláris úton gyorsítják.

189 286

5. kísérlet

Sejttenyészetek (pl. növekvő fibroblastok) növekedését oly módon gátolhatjuk, hogy a tápanyaghoz nem adunk nátrium-hidrogén-karbonátot.

A 2-6. példában leírt anyagokat a táptalajhoz hozzáadva a sejtek a fenti gátló hatás alól hamarabb felépülnek és normális osztódási tevékenységüket lényegesen hamarabb érik el, mint a megfelelő gátolt és kezeletlen sejttenyészetek.

Eljárásunk további részleteit az alábbi példákban ismertetjük anélkül, hogy találmányunkat a példákra korlátoznánk.

A példákban az oldószer-elegyekkel kapcsolatban közölt számadatok térfogatrészekre vonatkoznak. így pl. a 3 : 1 arányú éter-etanol-elegy 3 térfogatrész éter és 1 térfogatrész etanol elegyének felel meg.

I. példa

Vágóhídon leölt borjúk véréhez a vágás helyén azonnal 20% koncentrációban etanolt adunk és a vért 0,02% bakteriosztatikus hatású p-hidroxibenzoesav-metilészterrel (Metilparaben) és phidroxi-benzoesav-n-propilészterrel (Propilparaben) kezeljük. A vért szobahőmérsékleten 3 napon át autolizáljuk; ez alatt erős hemolízis és a nem stabil komponensek részleges lebomlása játszódik le és a membránokból a membránkomponensek kioldódnak. A kapott autolizátumot az üledéktől dekantálással elválasztjuk és a felül elhelyezkedő folyadékot 3 napon át statikusan vagy dinamikusan 10 000 kizárás határú membránon át dializáljuk. A dinamikus dialízis során a dializátumot és az ellen-dializátumot 3 napon keresztül ellenáramban szivattyúzzuk át a dialízis membránon és ily módon végig a lehető legnagyobb koncentráció-esést biztosítjuk.

A kapott elien-dializátum szárazanyag tartalma ⁴⁰ 5-80 mg/ml és 1 mg/ml értékig terjedő mennyiségben tartalmaz sebgyógyulást elősegítő hatóanyagokat. A leírásunk elején idézett európai szabadalmi bejelentés szerinti eljárással a glikoszfingolipidek 0,005 mg/ml koncentrációban állíthatók elő. ⁴⁵

2. példa liter borjúvért 300 ml etanollal elegyítünk és 3 ⁵⁰ napon át szobahőmérsékleten autolizálunk. Az autolizátumot az 1. példában leírt módon dialízisnek vetjük alá. A kapott ellen-dializátumot 6 liter 3 : 1 arányú etanol-éter eleggyel összekeverjük és ekkor főként glikoszfingolipidekből álló csapadék kelet- ⁵⁵ kezik. A lecsapott anyagot 18 000 g mellett 30 percen át végzett centrifugálással ülepítjük és a folyékony fázistól elválasztjuk.

A csapadékot vákuumban 37 “C-on szárítjuk és 20 ml 65 : 35 arányú kloroform-metanol elegyben 60 oldjuk. Az oldott glikoszfingolipideket 5,0 cm átmérőjű és 40 cm hosszú, 65 : 35 arányú kloroformmetanol eleggyel egyensúlyba hozott Florisil oszlopon (védjegy, magnézium-szilikátgél, a Floridin Corp. Pittsburgh PPA, USA cég nagyszelektivitású 65 abszorbense) kromatográfiás úton szétválasztjuk és a maradék foszfolipideket eltávolítjuk. A glikoszfingolipideket 2-2 liter, 35%, 50% és 75% metanoltartalmú kloroform-metanol elegyekkel emelkedő 5 metanol-gradienssel, végül 100%-os metanollal elúáljuk. Az eluálási lépéseknél kapott anyagokat a korábban leirt sebgyógyítási tesztekben kipróbáljuk. Azt találtuk, hogy az utolsó, 100%-os metanollal eluált frakció a sebgyógyulást meggyorsító anyagokat tartalmaz.

Az ily módon nyert frakcióban levő anyagokat 2 mm rétegvastagságú preparatív kovasavgélvékonyréteglemezekre visszük fel és 55 :45 : 10 arányú kloroform : metanol : 0,1 %-os vizes kalcium-klorid-oldat elegyben, 18 cm-es szakaszon felfelé áramolva kromatografáljuk. A lemezeket kromatografálás után szárítjuk és rövid ideig jóddal telített légkört tartalmazó kamrába helyezzük. A sárgán elszíneződő zónákat megjegyezzük, a jód szublimálása után kikaparjuk és kovasavgélen 50 : 50 arányú kloroform-metanol eleggyel eluáljuk. A fenti vékonyréteg-kromatográfiás elválasztási eljárásnál nyert, 0,65 R_f értéknek megfelelő frakció patkányon az égési sebek gyógyulási idejének megrövidítését vizsgáló kísérletben pozitív eredményt ad.

3. példa

Az 1. példa szerint előállított, 2 liter térfogatú ellen-dializátumot forgóbepárlóban vagy liofilizálással beszárítunk és tetrahidrofurán és 0,01 mólos kálium-klorid-oldat 4 : 1 arányú elegyében felveszünk. Az oldhatatlan anyagot papírszűrőn elválasztjuk és az átlátszó oldatot forgóbepárlón 500 ml-re bepároljuk. A maradékhoz 1 liter 2 : 1 arányú kloroform-metanol elegyet adunk, majd a szerves és vizes fázist 200 ml víz hozzáadásával elválasztjuk. A glikolipideket tartalmazó felső fázist elválasztjuk és szárazra pároljuk. A száraz anyagot kloroform-metanol-víz 90: 10: 0,2 arányú elegyében (10 ml) oldjuk és 1,5 cm átmérőjű, 120 cm hosszúságú, 90: 10: 0,2 arányú kloroform-metanol-víz eleggyel egyensúlyba hozott oszlopra viszszük fel. Az oszlopot 1,5 liter fenti összetételű futtatóeleggyel mossuk és a lipideket 1 liter 85: 15; 0,2 arányú kloroform-metanol-víz eleggyel eluáljuk. Az ily módon tisztított anyag az égési sebek gyógyulási idejét megrövidítő glikolipid.

4. példa liter, az 1. példa szerint kapott ellen-dializátumot 6 liter 3 : 1 arányú etanol-éter eleggyel összekeverünk, mikoris túlnyomórészt glikoszfingolipidekből álló csapadék keletkezik. A csapadékot 18 000 g sebességgel történő centrifugálással 30 percen át ülepítjük és a folyékony fázistól elválasztjuk. A csapadékot vákuumban 37 ’C-on szárítjuk és 20 ml 2 : 8 arányú kloroform-metanol elegyben felvesszük. Cl'-formában levő dietilaminoetil-Sephadex A 50-t 0,1 n nátrium-hidroxid-oldattal és 1 n ecetsavval történő mosással acetát-formába viszünk, metanollal mossuk, majd 2,5 cm átmérőjű és 5

189 286 cm hosszú oszlopba töltjük. A 2 :8 arányú kloroform-metanol elegyben oldott anyagot az oszlopra felviszük, majd az oszlopot 200-200 ml 0,01 mólos nátrium-acetát-oldattal, 0,02 mólos nátriumacetát-oldattal és 0,2 mólos nátrium-acetát-oldattal mossuk. A glikolipidet 2 :8 arányú kloroformmetanol eleggyel eluáljuk. Az ily módon nyert eluált glikolipid az égési sebek gyógyulási idejét megrövidíti.

5. példa

200 ml, az 1. példa szerint kapott ellen-dializátumot forgóbepárlóban vagy liofilezéssel szárazra párolunk és exikátorban foszfor-pentoxid felett legalább 3 órán át szárítunk. A szárított anyaghoz 15 ml frissen elkészített 20%-os piridines benzoesavanhidrid-oldatot, majd 15 ml 10%-os piridines p-dimetilamino-piridin-oldatot adunk. Az edényt át nem eresztő módon lezárjuk és 2 órán 37 ’C-on inkubáljuk. Az edényt lehűtjük és tartalmát az oldhatatlan anyagtól szűrőn vagy centrifugálással elválasztjuk.

A piridint nitrogén-áramban eltávolítjuk és a száraz anyagot 30 ml hexánban felvesszük. A hexánt 3 x 18 ml lúgos metanolos vizes oldattal mossuk (ez 0,4 g nátrium-karbonát 100 ml, 80 : 20 arányú metanol-víz eleggyel képezett oldatából áll). A hexános fázist nitrogén-atmoszférában szárítjuk, majd 4% etilacetátot tartalmazó hexánban felveszszük.

A per-O-benzoilezett glikolipidet nagy nyomású folyadék-kromatográfiás kovasavgél-oszlopon kromatografáljuk és 4%-tól 45%-ig terjedő etilacetát gradiens szerint hexán-etilacetát elegyekkel eluáljuk.

Az eljárás során izolált per-O-benzoilezett-glikolipidet a benzoilcsoportok eltávolítása céljából 0,6 n nátrium-hidroxid-oldattal 1 órán át 37 ’C-on hidrolizáljuk. A hidrolizátumot 5 térfogat acetonnal elegyítjük és a kiváló natív glikolipidet szűrjük vagy centrifugáljuk.

A fenti eljárással tisztított glikolipid égési sebek gyógyulási idejét megrövidíti.

6. példa

Az 1. példa szerint kapott dializátumot 9 térfogat etanollal elegyítjük és 30 percen át 85 ’C-on keverjük. A keletkező csapadékot szűrőpapíron leszűrjük és az átlátszó oldatot 3 napon át - 20 ’C-on állni hagyjuk. A kívánt anyag kiválik és ez alatt az idő alatt leülepedik. A felül elhelyezkedő folyadékot dekantáljuk, az üledéket 2 : 1 arányú kloroform-metanol elegyben felvesszük és acetát-formában levő dietilaminoetil-Sephacel-oszlopra felviszszük. Az oszlopot 2 : 1 arányú kloroform-metanol eleggyel eluáljuk, az eluátumot összegyűjtjük, majd forgóbepárlóval betöményítjük és a maradékot kloroformban oldjuk. Az oldatot aktív kovasavgéllel kloroformban töltött oszlopra visszük fel. Az oszlopot előbb kloroformmal, majd 9 : 1 arányú kloroform-metanol eleggyel átöblítjük és az eluátu6 ' mot elöntjük. Az oszlopot ezután 9 : 1 arányú aceton-metanol-eleggyel öblítjük át és ez a frakció a kívánt glikolipidet tiszta állapotban tartalmazza.

Az anyag jellemzése

A 2. példa szerint tisztított anyagot kovasavgélvékonyréteglemezeken történő kromatografálással és metanol, kloroform és 0,1 %-os vizes kalciumklorid-oldat 55 :45 : 10 arányú elegyével végzett eluálással választjuk szét.

összehasonlító anyagként az alábbi anyagok keverékét együttesen szétválasztjuk:

Asialogangliosid_M, (a továbbiakban Asia1o-G_Mi), Asialo-G_M2, Asialo-G_M3, Asialo-G_Dla, Cerebrosid és Psychosin.

Az Asialogangliosidok (G_MI, G_M2, G_M3, G_Dla) kémiai összetételét és nomenklatúráját Handa S. és Kushi Y. [Advances in Experimental Medicine and Biology 152, 23-31 (1982)], míg a Cerebrosid és Psychosin kémiai összetételét és nomenklatúráját Burton R. M. [„Glycolipid Methodology”, kiadó: American Oil Chemists' Society, Champaign (IL, USA), 1-11 (1976] írták le.

A lemezek színezését az alábbi módszerekkel végezzük el:

1. 20 mg Krezil-ibolya, 1000 ml 1%-os ecetsavban, kék-ibolya színeződés.

2. 1% difenilamin 2 ml etanol, 100 ml tömény sósav és 80 ml ecetsav elegyében; vörös színeződés.

3. Előbb 5,25% hipoklorossavat 40 ml benzol és 5 ml ecetsav elegyében permetezünk a lemezre, szárítószekrényben 60 ’C-on szárítjuk, majd 1 % benzidin 50%-os etanollal képezett oldatával kezeljük; kék színeződés.

4. 0,1 g orcinol 1 ml 1%-os vas(III)klorid-oldat és 50 ml víz elegyében, barna színeződés.

5. A vékonyréteglemezeket kamrában jódgőzök hatásának tesszük ki. Az összehasonlító anyagok és az analizálandó minta (Ráérték 0,65) sárgán elszíneződnek.

6. 254 nm és 366 nm hullámhosszon fluoreszkáló indikátorral kezelt vékonyréteglemezek felhasználása esetén a fluoreszcenciát a 0,65 Rf-értéknek megfelelő analizálandó anyag nem gyengíti; hasonlóképpen az összehasonlító anyagok sem változtatják a lemezek fluoreszkálását.

7. 0,2% naftorezorcin acetonban és 10%-os foszforsavban. A fenti permetező reagenssel kezelt lemezeket 5 percen át 90 ’C-on melegítjük; kék-vörös színeződés.

8. lg anizidin 100ml 70%-os etanolban; kék színeződés.

Minőségi és mennyiségi meghatározás ml, a 2. példa szerint tisztított anyagot forgóbepárlón vákuumban 37 ’C-on vagy liofilizálással szárítunk. A szárított anyagot 0,8 ml 2 mólos kénsav és 0,4 ml dioxán elegyében felvesszük és az ampullákat lezárjuk. A mintát 3 órán át 95 ’C-on hidrolizáljuk, majd 0,14 ml 10 n nátrium-hidroxid-61

189 286 oldat hozzáadásával semlegesítjük. A semlegesített hidrolizátumot 1,66 ml 0,2 mólos 8,0 pH-jú nátrium-borát-pufferrel pufferoljuk és választótölcsérben 2,0 ml dietil-éterrel 5 percen át extraháljuk. Az alsó fázist elöntjük és a felső éteres réteget vízfürdőn 37 ’C-on szárítjuk. A száraz anyagot 3 ml kloroformban [amely 0,0025% fluoreszcamint - 4-fenil-spiro-[furan-2(3H)-r-ftalán]-3,3'-diont (M. Naoi, J. C. Lee és S. Rosman, Anal. Biochem. 58 (1974), 571-577) - tartalmaz] felvesszük és 30 percen át keverjük. Az oldat fluoreszcenciáját 385 nm gerjesztő hullámhossz és 480 nm emissziós hullámhossz mellett mérjük.

7. példa

Vágóhídon nyert borjúvért a vágás helyén azonnal 20%-os koncentráció eléréséig etanollal kezelünk és 0,02-0,02% koncentrációban bakteriosztatikus szerként p-hidroxi-benzoesav-metil-észtert (Metilparaben) és p-hidroxi-benzoesav-n-propilésztert (Propilparaben) adunk hozzá. A vért 3 napon át szobahőmérsékleten dializájuk. A művelet során egyidejűleg a vér autolízise is lejátszódik és a keletkező autolízis-termékeket dializáló membránon keresztül folyamatosan ^; átdiffundáltatjuk. A mindenkori optimális koncentráció-viszonyok fenntartása céljából a dializáló eljárást és az ezzel együtt lejátszódó autolízist ellenáramban végezzük. A kapott ellen-dializátum szárazanyag tartalma 5-80 mg/ml és 1 mg/ml értékig tartalmaz sebgyógyulást elősegítő anyagokat.

Claims (4)

1. Szabadalmi igénypontok

   1. Eljárás a glikolipid-sorba tartozó, sejt- és szövetregeneráló anyagoknak emlősök véréből történő előállítására, amely anyagok az alábbi jellemző tulajdonságokkal rendelkeznek:

   - R_rérték = 0,65 (kovasavgél-lemezen, kloroform/metanol/0,1 %-os vizes kalcium-klorid-oldat 55 : 45 : 10 arányú elegyében, felszálló, jódgózzel láthatóvá téve);

   - az alábbi színreakciók:

   1.20 mg krezil-ibolya 1000 ml 1%-os ecetsavban: kékes-ibolya színeződés;
2. 2. 1% difenil-amin 2 ml etanol, 100 ml tömény sósav és 80 ml ecetsav elegyében: vörös színeződés;
3. 3. előbb 5,25% hipoklórossavat 40 ml benzol és 5 ml ecetsav elegyében a lemezre permetezünk, 60’C-on szárítószekrényben szárítjuk, majd 1% benzidin 50%-os etanollal képezett oldatával kezeljük: kék színeződés;
4. 4. 0,1 g orcinol 1 ml 1%-os vas(III)klorid-oldat és 50 ml víz elegyében: barna színeződés;

   - vizes oldatból - 15 ’C és -25 ’C közötti hőmérsékleten legalább 60 térfogat % - előnyösen 90 térfogat% - etanol-koncentráció eléréséig történő etanol-hozzáadás hatására kiválás, azzal jellemezve, hogy a vért több óra és néhány nap közötti időtartamon át, 4 ’C és szobahőmérséklet között hőmérsékleten, vizes, 10-30 térfogat % metanolt vagy etanolt tartalmazó közegben ugyanezzel a közeggel szemben 10 000 kizárás határú membránon keresztül autolízisnek és dialízisnek vetjük alá, és kívánt esetben az így nyert dializátumokat további tisztításnak vetjük alá.

   • 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az autolízist és dialízist egyidejűleg és folyamatosan, ellenáramú eljárásban végezzük el.

   3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy további tisztítás céljából a kapóit dializátumhoz etanolt adunk, a képződő etanolos oldatot - 15 ’C és - 25 ’C közötti hőmérsékleten állni hagyjuk és a glikolipideket kicsapjuk és elválasztjuk.

   4. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy további tisztítás céljából a kapott dializátumot valamely, vízzel nem vagy csak korlátozottan elegyedő éter, szénhidrogén, halogénezett szénhidrogén, alkohol, karbonsavészter vagy ezek elegye hozzáadásával szilárd/folyékony vagy folyékony/folyékony fázisokra szétválasztjuk, ti glikolipideket a szilárd fázisba, illetve a kevésbe poláros szerves fázisba átvisszük, a glikolipideket tartalmazó fázist elválasztjuk és a szerves fázist adott esetben kíméletes körülmények között szárítjuk.