SU1396958A3 - Способ получени производных гликолипидов,стимулирующих регенерацию клеток и тканей (его варианты) - Google Patents

Abstract

Изобретение предназначено дл  получени  соединений, ускор ющих заживление ран. Цель изобретени  - повышение выхода целевого.продукта. После обработки этанолом и бактерк- остатиком кровь подвергают автолизу. Надосадочную жидкость подвергают диализу . Противодиализат вьюушивают и раствор нзт в смеси тетрагидрофурана и хлористого кали . В прозрачный раствор после упаривани  добавл ют смесь хлороформа и метанола. Верхнн о фазу упаривают досуха. Сухой остаток раствор ют в смеси хлороформа, метанола и воды. Колонку промьюают и злюируют из нее гликопипид смесью хлороформа, метанола и воды. Благодар  применению очищенного соединени  ускор етс  заживление ран на ранней стадии образовани  стромы и базаль- ного сло  с капилл рами. 4 с.п. ф-лы. со

Description

со

СО О5

со ел

00

см

Изобретение относитс  к медицине, в частности к способам получени  соединений , ускор ющих заживление ран,

Цель изобретени  - повышение выхода целевого продукта.

П р и м е р 1.

а. 2л полученной из убойных тел  крови тут же на бойне смешивают с 300 МП этанола и обрабатывают бакте- риостатиком - метиловым эфиром п-ок- сибензойной кислоты (метилпарабен) и н-пропиловым эфиром п-оксибензой- ной кислоты (пропил-парабен) до концентрации каждого из них 0,02%. Обработанную таким образом кровь подвегают автолизу в течение трех дней при комнатной температуре. При этом происходит сильный гемолиз и частичное разложение неустойчивых компонен тон, а также растворение проход щих через мембрану компонентов. Полученный автолизат отдел ют от осадка декантацией , а надосадочную жидкость

подвергают в течение трех дней диали-25 жани  исходного материала.

зу через мембрану, не пропускающую соединени  с молекул рным весом более 10000, статическим или динамическим способом. В случае динамического диализа диализат и противодиа- лизат в течение трех дней перекачивают через мембрану насосом, чтобы поддерживалс  максимальный градиент концентраций. При этом процессе кровь одновременно автолизуют и полученные продукты автолиза могут непрерывно диффундировать через диализную мембрану . Чтобы в каждый момент времени правильно поддерживать оптимальный уровень концентрации, проход щий автолиз осуществл ют противотоком.

Образующийс  противодиализат или фильтрат имеет содержание сухого вещества 5-80 мг/мп. Содержание в нем способствующих заживлению ран соединений доходит до 1 мг/мп (по извест- ному способу получают продукт с содержанием гликосфинголипидов 0,005 мг/мл)

б. Фильтрат смешивают с 6 л смеси этанола и эфира в соотношении 3:1. При этом происходит вьвдавлива- ние осадка,, содержащего главным образом гликосфинголипиды.-Осадок подвергают центрифугированию в центрифуге с ускорением 18000 g в течение 30 мин и отдел ют от жидкой фазы.

Полученный осадок высушивают в вакууме при , после чего раствор ют в 20 мл смеси хлороформа и мета

нола в соотношении 65:35. Растворенные гликосфинголипиды пропускают через заполненную флорисилом (торговое название гел  силиката мaгfш  высокоселективного адсорбента фирмы Flori- din Corp Питтсбург, штат Пенсильвани , США) колонку диаметром 5,0 и высотой 40 см с использованием в качестве подвижной фазы смеси хлороформа и метанола в соотношении 65:35, в результате чего из него удал ютс  остатки фосфолипидов. Гликосфинголипиды элю- ируют из колонки последовательно смес ми хлороформа и метанола по 2 л с содержанием метанола 35, 50, 75% и, наконец, 100%-ным метанолом. Получаемые на отдельных стади х элюирова- ни  соединени  испытывали на способность заживл ть раны. При этом оказалось , что содержащиес  в последней, элюируемой 100%-ным метанолом, фракции соединени  ускор ют заживление ран. Выход составл ет 18% от содер30

35

0

0

5

Содержащиес  в этой фракции соединени  нанос т на препаративные пластины дл  тонкослойной хроматографии с покрытием из силикагел  тол- 2 мм. Восход щую хроматографию провод т с использованием в качестве подвижной фазы смеси хлороформа , метанола и О,1%-ного водного раствора хлористого кальци  в соотношении 55:45:10. Рассто ние - 18 см, После хроматографии пластины высушивают и ненадолго помещают в камеру с атмосферой, насыщенной парами йода. Окрашиваемые при этом в желтый цвет зоны отмечают, после сублимации йода , соскребают с пластины силикагель и провод т элюирование смесью хлороформа и метанола в соотношении 50:50. В опытах по ускор ющему действию на заживление ожоговых ран у крыс положительные результаты получены при использовании фракции со значением Rr при разделении указанным методом тонкослойной хроматографии, равным 0,65. I

Пример 2.2л противодиализата , полученного по примеру 1а, высушивают в ротационном выпарном аппарате или с помощью лиофилизации и раствор ют в 4 л смеси тетрагидрофзфана и 0,01 М раствора КС1 в соотношении 4:1. Нерастворимый остаток отфильтровывают на бумажном фильтре, а про- зрачньй раствор упаривают в ротационном вьтарном аппарате до объема

500 МП, добавл ют к нему 1 л смеси хлороформа и метанола в соотношении 2:1 и органическую и водную фазы раздел ют путем добавлени  к смеси 200 мл воды. Верхнюю фазу, содержащую гли- колипиды, отдел ют и упаривают досуха . Сухой остаток раствор ют в 10 мл смеси хлороформа, метанола и воды в

соотношении 90:10:0,2. Колонку промы-io в соотношении 9:1 и отбрасывают эти

вают 1,5 л смеси того же состава, после чего элюируют из нее гликолипид в 1 л смеси хлороформа, метанола и воды в соотношении 85:15:0,2. Выход

составл ет 21% от содержани  исход- 15 Форме. Выход составл ет 41% от содерного материала, RC 0,65. Получаемое зтим способом очищенное соединение представл ет собой гликолипид, ускор ющий заживление ожоговых ран.

Пример 3,2л противодиали-

зата, полученного по примеру 1а, экстрагируют описанным в примере 16 образом смесью этанола и эфира в соотношении 3:1 и осадок раствор Еот в 20 мл смеси хлороформа и метанола в соотношении 2:8. Диэтиламиноэтил- сефадекс А50 в С1-форме путем промывки О, 1 н. раствором едкого натра и 1 и. раствором уксусной кислоты перевод т в ацетатную форму, промы- вакгг метанолом и заполн ют им колонку диаметром 2,5 и высотой 20 см. Растворенный в смеси хлороформа и метанола в соотношений 2:8 продукт перено

с т в колонку и промывают ее последо- - ламинарным потоком посто нно удал - вательно порци ми по 200 мл 0,001,ютс  продукты гидроли.за, которые прошли через мембрану.

Результатом этого  вл етс  то, что к каждому моменту времени создаетс  оптимальный перепад концентра0 ,002 и 0,2 М ацетата натри . После этого гликолипид элюируют смесью хлороформа и метанола в соотношении 2:8, Выход составл ет 48% от содержани 

4Q

исходного материала, Rr 0,65, Элю- ируемый таким образом гликолипид ускор ет заживление ожоговых ран.

Пример 4, Противодиализат примера 1а смешивают с 9 объемами этанола и перемешивают смесь в течение 30 мин при 85 С, Выпадающий при этом осадок отфильтровывают через бумажный фильтр, а прозрачный раствор вьщерживают в течение 3 дней,при температуре 20°С. Выпадающий осадок целевого соединени  за это врем  оседает . Надосадочную жидкость отдел ют декантацией, а остаток раствор ют в смеси хлороформа и метанола в соотношении 2:1 и перенос т раствор в колонку, заполненную модифицированным диэтиламиноэтиловым сефацелем )в ацетатной форме, Элюирование провод т

смесью хлороформа и метанола в соотношении 2:1, Элюант собирают, упаривают в ротационном выпарном аппарате и раствор ют в хлороформе. Раствор перенос т в колонку, заполненную активированным углем в хлороформе. Колонку промывают вначале хлороформом, затем смесью хлороформа и метанола

элюаты. После этого колонку промывают смесью ацетона и метанола в соотношении 9:1, В зтой фракции содержитс  целевой гликолипид в чистой

жани  исходного материала, RfS 0,65,

Благодар  применению автолиза и диализа выход гликолипидов в значительной степени увеличиваетс  (до 1 мг/мл по сравнению с 0,005 мг/мл).

Кроме того, используетс  только одно хроматографическое вьделение в то врем  как по известному способу требуетс  три хроматографических вы- делени .

Если автолиз и диализ провод тс  одновременно и непрерывно методом противотока, то эффективность способа в дальнейшем увеличиваетс , Благодар  диализу методом противотока у автолизата посто нно забираютс  низкомолекул рные продукты гидролиза , так как на другой стороне мембраны, т,е, на стороне диализата,

4Q

ции продуктов гидролиза между стороной диализа и автолиза мембраны. Удаление этих продуктов приводит далее к тому, что гидролиз на стороне авто- ли за мембраны не может достичь равновеси  и в соответствии с этим дает полный гидролиз целевого продукта, что при статической ультрафильтрации или статическом диализе невозможно, так как здесь достигаетс  равновесие , при котором количество целевого продукта и гидролизата константно, С помощью фармакологических опытов было показано, что полученные активные вещества способствуют пролиферации предварительно поврежденньк фи- бробластов in vitro и, кроме того, способствуют регенерации соответствующих клеточных попул ций in vivo

В данном случае речь идет не об обычных соединени х, оказывающих митоти- ческое действие, поскольку при добавке упом нутых соединений к обычным здоровым клеточным культурам не происходит никаких изменений,а культуры с нормально низкой степенью делени , вызванной добавкой к ним вредных агентов, после добавки к ним указанных соединений в течение короткого времени вновь восстанавливают свои функции в отношегщи степени делени , которые практически идентичны соответствующей функции здоровой культуры.

С учетом того факта, что восстановительные механизмы клеточных попул ций как in vitro, так и in vivo стимулируютс  соединени ми, получав- мыми предлагаемым способом, последние можно рекомендовать дл  терапевтического применени , в частности при лечении медленно или плохо зажив л кнцихс  ран или ульцераций, восста- новительные способности которых ограничены . Благопри тное действие зтих соединений на исцеление ран иллюстрируетс  следующими опытами на животны

Опьп 1. Наркотизированным крысам сбривают шерсть и с обеих сторон те- -ла вызывают ожоговые ранени  прикладванием к оголенной коже на 30 с латунных дисков диаметром 2 см, нагретых до 270°С. Активное вещество ввод т в железообразную основу. В результате получают мазь с 20%-ным содержанием активного вещества. Дл  сравнени  готов т контрольную мазь путем введени  в желе, воды или физиологического раствора поваренной соли . Двум парти м подопытных животных (по 10 животных в каждой партии) ежедневно (по два раза в день) обрабатывают раны мазью до полного выздоров- лени . В случае соединени  ,описанного в примере 2, со значением R 0,65 врем  излечени  по сравнению с контрольной группой сокращаетс , причем это сокращение может доходить до 21%. .

Опыт 2. Наркотизированным крысам нанос т путем штамповани  раны шириной 1 см и глубиной 5 мм. В отверсти  раны ввод т полые циливдры с вискозно-целлюлозной губкой. Во внутреннюю полость цилиндрической трубки ежедневно ввод т по 100 мкл очищенного соединени . Через 4, 10, 16 и 2

день после начала имплантаиии губку извлекают и анализируют на содержани гемоглобина, дезоксирибонуклейновой кислоты и оксипиролина. Содержание указанных соединений в имплантированных губках, извлеченных из ран через 4 и 10 дней после начала введени  чистых соединений, было не выше, чем в губках, извлеченных из ран контролных животных. Однако через 16 и 21 день содержание в губках гемоглобина дезоксирибонуклеиновой кислоты и оксипиролина было значительно вьш1е.

Благодар  очищенному соединению в соответствии с примерами 1-4 ускор етс  заживление ран на.ранней стадии образовани  стромы и базального сло  с капилл рами.

Опыт 3. Рост клеточных культур, например растущих фибробластов, можно затормозить, убрав из питательной среды карбонат натри . Добавка к питательной среде описанных в примерах 1-4 соединений приводит к тому, что клетки быстрее восстана1вливают свои функции. Нормальна  скорость делени  у них достигаетс  быстрее, чем у та- КИМ же образом заторможенных, но не подвергнутых дополнительной обработке клеточных культур.

Claims (3)

1. Способ получени  производных гликолипидов, стимулирующих регенерацию клеток и тканей, путем вьщеле- ни  активного начала из крови теленка с последующей хроматографией, о т- личающийс  тем, что, с цеью повышени  выхода целевого продукта , вьщеление провод т путем автоиза крови в течение 3 дней при комнатной температуре и диализа-через мембрану с пределом растворени  Ю ООО относительно водно-спирТовой среды, при этом диализат и противо- диализат непрерывно перекачивают насосом в противотоке или автолизат отдел ют декантацией от осадка с последующим диализом надосадочной жидкости , затем к противодиализату добавл ют смесь этанола и эфира в соотношении 3:1, полученный осадок центри- фугируют при 18000 g в течение 30 мин, сушат и раствор ют в смеси хлороформа и метанола в соотношении 65:35 и элюцию провод т смесью хлороформа и метанола при возрастающей концентра

ции метанола, а в качестве подвижной фазы при хроматографии активной фракции используют смесь хлороформа, метанола и водного раствора хлористого кальци  в соотношении 55:45:10.

2.Способ получени  производных гликолипидов, стимулирующих регенерацию клеток и тканей, путем вьще- лени  активного начала из крови теленка с последующей хроматографией, отличающийс  тем, что, с целью повышени  выхода целевого продукта , вьщеление провод т путем автолиза крови в течение 3 дней при комнатной температуре и диализа через мембрану с пределом растворени  10000 относительно водно-спиртовой среды, при этом диализат и противо- диализат непрерывно перекачивают при помощи насоса в противотоке или авто- лизат отдел ют декантащей от осадка с последующей диализацией надосадоч- ной жидкости, затем противодиализат высушивают и раствор ют в смеси из тетрагидрофурана и водного раствора хлорида кали  в соотношении 4:1, раствор фильтруют и упаривают, концентрат смешивают со смесью хлороформа

и метанола в соотношении 2:1, раздел ют на органическую и водную фазы, добавл   воду, отдел ют надосадочную органическую фазу с последующей ее сушкой и растворением в смеси хлороформа , метанола и воды в соотношении 90:10:0,2, а хроматографию провод т на колонке Bio-Sil-А с той же смесью растворителей.

3.Способ получени  производных гликолипидов, стимулируюших регенерацию клеток и тканей, путем вьще- лени  активного начала из крови теленка с последующей хроматографией, отличающийс  тем, что, с целью повышени  выхода целевого продукта , вьщеление провод т путем автолиза крови в течение 3 дней при комнатной температуре и диализа через мембрану с пределом растворени  Ю ООО относительно водно-спиртовой, среды,

Редактор М. Петрова

10

20

25

при этом автолизат и противодиализат непрерывно перекачивают насосом в противотоке или автолизат отдел ют декантацией от осадка с последующим диализом надосадочной жидкости, смешивают противодиализат с 9 объемами этанола и перемешивают при ,фильтруют и фильтрат вьщерживают в течение 3 дней при 20 С, надосадочную жидкость отдел ют декантацией и остаток раствор ют в смеси хлороформа и метанола в соотношении 2:1, а хроматографию провод т в колонке, запол- 5 ненной модифицированным дизтиламино- этиловым сефацелем в ацетатной форме с той же смесью растворителей, после чего осуществл ют злюирование смесью хлороформа с метанолом в соотношении 9:1 и затем смесью ацетона с метанолом в том же соотношении.

4, Способ получени  производных гликолипидов, стимулирукщих регенерацию клеток и тканей, путем вьщеле- ни  активного начала из крови теленка с последующей хроматографией, отличающийс  тем, что, с целью по- вьш1ени  выхода целевого продукта, вьщеление провод т путем автолиза крови в течение 3 дней при комнатной температуре и диализа через мембрану с пределом растворени  10000,относительно водно-спиртовой среды, при этом диализат и противодиализат непрерывно перекачивают при помощи насоса в противотоке или aвтoл зaт отдел ют декантацией от осадка с последукмцей даализахщей надосадочной жидкости, затем к противодиализу добавл ют смесь этанола с эфиром в соотношении 3:1, полученный осадок отдел ют центрифугированием при 18000 g в течение 30 мин, высушивают и раствор ют смесью хлороформа и метанола в соотно-. шении 2:8, а хроматографию раствора провод т на колонке, заполненной ди- этиламиноэтил-сефадексом А50 в ацетатной форме, и элюцию осуществл ют смесью хлороформа и метанс(ла в соотношении 2:8.

Составитель Л. Шилина

Техред Л.Сердюкова Корректор А.Обручар

30

35

40

45

50

10

5

20

5

25

30

35

40

45

50