JPS58126796A - アスパルチルフエニルアラニンアルキルエステルの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 キルエステルの製造方法に関するものである。

α一Ｌ−アスパルチルーＬ７ｘニルアラニン低級アルキ
ルエステル（以下、α−ＪＩＰＫと云う）、特にメチル
エステルは新しい甘味剤として注目されている有用な物
質である。

α−ムＰ１の製造法と１ては、Ｎ−保１ｉＬ−アスパラ
ギン酸無水物とＬ−フェニルアラニン低ａアルキルエス
テルを反応させてＮ−保鏝α−ムＰ１とし、保鏝基を除
去してα−ムＰＩとする方法、舅−保ＭＬ−アスパラギ
ン酸とフェニルアラニン低級アルキルエステルとを蛋白
分解酵素の存在下で反応させてＭ−保腰α−ムＰＩ、又
はＮ−保躾α−ムＰ　Ｉ　ドア　ｘニルアラニン低級ア
ル中ルエステルとの付加化合物とし、保護基を除去して
α−ＡＰＩとする方法などが知られている。

前者の方法は、ｙ−保一α−ムＰＩとともに、Ｎ−保護
β−ムＰ１が副生するという問題がある。

後者の方法は、そのような問題がない点、及び原料とＬ
７てう竜ミ体を使用できる点などで優れた方法である。

しかし、いずれの方法でも、原料のアスパラギン酸又は
その無水物は、アミノ基をベンジルオキシカルボニル基
のような保護基で保験したのち用いる必要があった。

これらの公知技術でＦｉ当然必費とされるアミノ基への
保躾基導入及び除去の１柱の不必要な方法を開発するこ
とができれば工程の簡略化とそれに伴なう原料、製品等
の損失を避けることができ、工業的に非常な利点が生ず
る。

本発明者らは、このような観点からアスパラギン酸ト７
ェニルアラニン低級アルキルエ、Ｘ　７’　ルカら直接
α−ＡＰＩを合成する方法について鋭意検討した結果、
シェードモナス属、アルカリ土類金属、トルロプシス属
、ロドトルラ属又はスポロポロマイセス鵬に属する微生
物の培養物又はその処理物を用いることによって、Ｌ−
アスパラギン酸とＬ−７工ニルアラニン低級アルキルエ
ステルがらα−ムｐｍが生成することを艶出した。

すなわち、本発明は、シェードモナス楓、アヤカリゲネ
ス鵬、トルロプシス楓、ロドトルラ縞又はスポロポロマ
イセス栖に撫し、Ｌ−アスパラギン酸とＬ−フェニルア
ラニン低級アルキルエステルカラα−Ｌ−アスパルチル
−Ｌ−７工ニルアラエン低級アルキルエステルを生成さ
せることのできゐ微生物の培養物又はその処理物をＬ−
アスパラギン酸及びＬ−フェニルアラニン低級アルキル
エステルと接触させることを特徴とするα−Ｌ−７ｘ　
、ｐニルチル−Ｌ−７工ニルアラニン低級アル中ルエス
テルの製造法を提供するものである。

本発明で用いる微生物は、上述の各属に属するα−ムＰ
１生ｊｌｉ１である０本発明者らによりて山口県＃ｒ南
陽市の土壌又は花より分離され九このよう危機生物の劇
学的性質は下記の通抄である。

シェードモナス　プチダ（Ｐｅｅｕｄｏｍｏｎａｇ　ヨ
１Ａす’ｒ８−１５０（Ｈ 分ｍｓ＋’土壌 （ＩＬ）影絵 内汁嘩天培地で３７℃、６〜２４時間生育した場合 ■細胞の形及び大きさ 桿Ｉ（α５へ仙７）ｘ（ｔｏ〜ｔＳ）−■細胞の多形性
の有無　単１又は双蕗 ■運動性の有無　　　　有　極鞭毛 ■　胞子の有無　　　　無 ■　グラ人染色性　　　陰性 ■抗酸性　　無 （ｂ）　　各培地における生育状態 ■　肉汁寒天平板培養（３７℃、２日間培養）イ）コミ
ニー形成の遅速普通　直径約６−ロ）コロニーの形　　
　　円形 ノ→　コロニー表面の形状平滑 二）コロニーの隆起状態半レンズ状 ホ）コロニーの周縁　　金縁 →　コロニーの内容　　　均質 ト）コロニーの色調　　乳白色 チ）コロニーの透明度　牛透明 す）コロニーの光沢　　鈍光 ヌ）可溶性色素の生成　可溶性淡緑色色票生成■　肉汁
寒天斜面培＠（５７℃、２日関培ＩＩ）イ）生育の良否
　　　　生前良好 口）コロニーの形　　　平滑 ７％）　　コロニーＷ′ｒ（３）の隆起状態　扁平状二
）コロニーの光沢　　鈍光 ホ）コロニー表面の形状平滑 →　コロニーの透明度　半透明 ト）コロニーの色　　　乳白色 チ）コロニーの質　　　バター質 ■　肉汁液体培養（３７℃、２日間培養）イ）ｌ！面の
生育　　　　　なし 口）濁　　　度　　　　　やや濁る ｌう沈　　　殿　　　　粉末状 二）ガス発生　　　　なし ホ）培地の着色　　　　なし ■　肉汁寒天穿刺培養（３７℃、２日間培ＩＩ）イ）生
育の場所　　　　上下一様 口）コロニーの形状　　乳頭状 ■　肉汁ゼラチン穿刺培養（２０℃、１４日間培養）イ
）ゼラチン液化　　　なし ■　リド１スンルク（５７℃、７日間培養）イ）反　　
　応　　　　　ＢＯＰを青色に、リドミスを實紫色にす
る 口）ｌＩ固、液化　　　　なし く０）　　生理学的性質 ■　硝ｆＩｌ塩の還元　　　　　　　−■　脱窒反応　
　　　　　　　− ■　ＭＲテスト　　　　　　　　− ■　ｙｒテスト　　　　　　　　− ■　インドールの生成　　　　　− ■　硫化水嵩の生成　　　　　　＋（Ｗ）■　デンプン
の加水分解　　　　− ■　クエン酸の利用　　　　　　十 ■　無機窒素源の利用　　　アンモニア態のみ利用［株
］　色素の生成　　　　　　緑黄色水溶性螢光色素生成
＠　ウレアーゼ　　　　　　　− ［相］　オキシダーゼ　　　　　　＋ ［相］　カタラーゼ　　　　　　　　＋［相］　生育の
範囲　　　　　　ｐＨ５〜９．５．温度１０〜ｂ＠＃票
に対するｍ度　　好気性 ＠　　０−１ｒテスト　　　　　　　０［相］　糖類か
らの醗及びガスの生成の有無酸　　　ガス （１）Ｌ−アラビノース　　＋　　　−（２１Ｄ−キシ
ロース　　　十　　　−酸　　　ガス （３）Ｄ−グルコース　　　十　　　　−（４）Ｄ−マ
ンノース　　　＋　　　−（５１Ｄ−７ラクトース　　
−− （６）ｐ−ガラクトース　　＋　　　　−（７）麦芽糖
　　−− （８）シ１糖　　−− （９）乳　　　糖　　　　　−− ■　トレハロース　　　　−　　　　−ＩＩＩ）　　Ｄ
−ソルビット　　　　　　　　　−ロ　Ｄ−マンニット
　　　−− ■　イノジット　　　　　−− 叡◆　グリセリン　　　　−− 鱈　デンプン　　　　　　−　　　　−＠　炭素源の利
用（３７℃、１〜７日間培養）利用する本の；Ｄ−グル
コース、Ｌ−バリン。

β−Ｌ−アラニン。

Ｌ−アルギニン ゲラニオール アルカリゲネＸ　フェーカリス（Ａｌｃａｌｉ　ｏｎｅ
ｓ　ｆａｅｅａｌｉｓ）テト１５０（１２ 分離源；土壌 ←）形態 肉汁嘩天培地で３７℃、６〜２４時間生育した場合■　
細胞の形及び大きさ 桿−（α５−１８）ｘ（１，０〜ｔＳ）μ■　細胞の多
形性の有無　　傘―又は双劇■　運動性の有無　　　　
　有　周鞭毛■　胞子の有無　　　　　　無 ■　グラム染色性　　　　　陽性 ■　抗酸性　　　　　　　　無 （ｂ）　　各培地における生育状緒 ■　肉汁寒天平板培養（５７℃、４日間培養）イ）コロ
ニー形成の遅速　遅い　直径約２■口）コロニーの形　
　　　円形 ノ→　コロニー表面の形状　　平滑 二）コロニーの隆起状態　　半レンズ状ホ）コロニーの
周縁　　　金縁 勺　コロニーの内容　　　均質 ト）コロニーの色調　　　乳白色 チ）コロニーの透明度　　半透明 り）コロニーの光沢　　　鈍光 ヌ）可溶性色素の生成　　々し ■　肉汁寒天斜面培養（５７℃、２日間培養）イ）生育
の真否　　　　　生育良好 口）コロニーの形　　　　平滑 ノ９　コロニ→へ断面ｍ件陳態　扁平状二）コロニーの
光沢　　　鈍光 ホ）コロニー表面の形状　平滑 へ）コロニーの透明度　　半透明 ト）コロニーの色　　　　乳白色 チ）コロニーの質　　　　パター質 ０肉汁液体培養（３７℃、２日間培養）イ）表面の生育
　　　　　かし 口）濁　　　置　　　　　やや濁る ノ勺沈　　　殿　　　　　粉末状 二）ガス発生　　　　表し ホ）培地の着色　　　　　なし ■　肉汁摩天穿刺培１１７℃、２日間培Ｉｆ）イ）生育
の場所　　　　　上下一様 口）コロニーの形状　　　乳頭状 ■　肉汁ゼラチン穿刺培養（５７℃及ｙ２ａ℃、１４日
間培養）イ）ゼラチン液化　　　　がし ■　リドマスミルク（５７℃、７日間培養）口）＃固、
液化　　　　　なし くｃ）　　生理学的性質 ■　硝ｗ塩の還元　　　　　　　− ■　脱窒反応　　　　　　　　　− ■　ＭＲテスト　　　　　　　　− ■　ｖｐテスト　　　　　　　　− ■　インドールの生成　　　　　− ■　砕化水素の生成　　　　　　− ■　デンプンの加水分解　　　　− ■　クエン酸の利用　　　　　　十 ■　無機窒素源の利用　　　アンモニア圃のみ利用［株
］　色票の生成　　　　　　　　−＠　ウレアーゼ　　
　　　　　　− ［相］　オキシダーゼ　　　　　　　＋［相］　カメラ
ーゼ　　　　　　　　＋（Ｗ）［相］　生育の範囲　　
　　　　ｐ［５〜ａＳ、温度１１〜４１℃＠　酸ＸＫ対
するｓｌＩ″　　　好気性＠　Ｏ−１テスト　　　　　
　酸化 ■　糖類からの酸及びガスの生成の有無酸　　　ガス ロ）　Ｌ−アラビノース　　　　−− （２）　Ｄ−キシロース　　　　　十　　　　　−（３
）Ｄ−グルコース　　　　　−− （４）　Ｄ−マンノース　　　　　−−（５）　Ｄ−フ
ックドース　　　　−−（６）Ｄ−ガラクトース　　　
　−　　　　　−（７）麦芽糖　　　−− （８）シ璽糖　　　−− （９）乳　　糖　　　　　　−− 龜呻　　トレＩ〜ロース　　　　　　　−−−Ｉ　Ｄ−
ソルビット　　　　　　−−輪　Ｄ−マンニット　　　
　　−− 輪　イノジット　　　　　　　−− ・４　グリセリン　　　　　　−− 一　デンプン　　　　　　　　　−− トルロプシス、カンジダ（ユ笠旦猛上１且ｃａｎｄｉｄ
ａ）Ｔ８−１５１０１ 分離源−花 （＆）形態 ｔ　　ＭＹ嘩天培地、２５℃、平板培養０）栄養細胞の
形状　　　楕円形 ■　栄養細胞の大きさ　　〔３〜５）Ｘ（４〜８）μ２
、　　ＭＹ液体培地、２５℃、７日間■　ガスの発生　
　　　　あり ■　表向の生育　　　　　リング状 ■　培地の混濁　　　　　やや濁る ■　沈殿の生成　　　　　粉末状 ■　培地の着色　　　　　なし ＡＭ！寒天培地、２５℃、５０日関；斜面培養■　生育
の程度　　　　　手前良好 ■　コロニーの周縁　　　波状 ■　コロニーの隆起状態　半レンズ状 ■　コロニーの表面の形状　平滑 ■　コロニーの光沢　　　鍼先 ■　コロニーの性状　　　バター状 ■　コロニーの色調　　　白色 （バレイシ璽培地、スライド培養 ■糸及び仮性菌糸は認められない。

（ｂ）　　子嚢胞子の形成　　　　　なしくＣ）　　射
出胞子の形成　　　　　なしくｄ）　　生理的性質 ■蛾適生育条件　　　　ｐＨ５〜７．５．　ｉｌ［１５
〜Ｓ　Ｏ℃■　生育の範囲　　　　　ｐＨ３〜＆２．温
度５〜３７℃■　硝酸塩の同化性　　　なし ■　脂肪の分解　　　　　あ抄（弱い）■　尿素の分解
　　　　　なし ■　ゼラチンの液化　　　あり ■　カロチノイド色素の生成　なし ■　顯着な有機酸の生成　なし ■　デンプン類似物質の生成　なし ［株］　ビタミン要求性　　　あり（ビオチン要求性）
（ｅ）　　縦水化物の同化性 Ｗｉｃｋｅｒｈａｍ培地、２５℃、７日間培養同化性　
　発酵性 ■　Ｄ−アラビノース　　　　　− ■　Ｌ−アラビノース　　　　　− ■　Ｄ−キシロース　　　　　　＋（ロ）■　Ｄ−グル
コース　　　　　　＋　　　　　＋■　Ｄ−ガラクトー
ス　　　　　＋（４）　　　−■麦芽糖　　　　十　　
− ■　　シ　　冒　糖　　　　　　　　　　　　　　十　
　　　　　　　−■　乳　　糖　　　　　　　−− 〇　　トレハロース　　　　　　　　＋［株］　ラフィ
ノース　　　　　　　十　　　　　−■　α−メチル−
Ｄ−グルコシド　＋（ロ）０　可溶性デンプン　　　　
　　＋（ロ）［相］　エタノール　　　　　　　　−・
　イノジット　　　　　　　　一 同化性　　発酵性 ＠　Ｄ−マンニット　　　　　　＋ ＠　Ｄ−ツルピッ斗　　　　　　十 ［相］　グリセリン　　　　　　　＋ ［相］　クエン酸　　　　　　　　　　　−ロドトロラ
　グルチニス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ　ｇｌｕｔｉｎ
ｉｓ）丁ｆ３−１５１０５ 分離源−花 （ａ）形態 ｔ、　　ＭＹＹ天培地、２５℃、平板培養（１）栄養細
胞の形状　　　楕円形 ■　栄養細胞の大きさ　　（３〜５　）ｘ（８〜１０）
声■　増殖の形式　　　　　多極出芽 菌糸及び仮性−糸なし ２、　　ＭＹ液液種培地２５℃、７日間（専）ガスの発
生　　　　　なし ■　表向の生育　　　　　平滑 ■　培地の混濁　　　　　やや濁る ■　沈歇の生成　　　　　粉末状 ■　培地Ｏ着色　　　　　なし 五　ＭＹＹ天培地、２５℃、５０日間、斜面培養■　生
育の程度　　　　　生育良好 ■　コロニーの周縁　　　金縁 ■　コロニーの隆起状態　半レンズ状 ■　コロニーの表面の形状　平滑 ■　コロニーの光沢　　　鍼先 ■　コロニーの性状　　　パター質 ■　コロニーの色調　　　紅色 表　バレイシ１培地、スライド培養 ―糸及び仮性菌糸は認められない。

（ｂ）　　子嚢胞子の形成　　　　　なしくＣ）　　射
出胞子の形成　　　　　なしくｄ）　　生理的性質 （１）ＩＩｋ適生育条件　　　　ｐＨ３〜７．５．温度
１５〜５０℃■　生育の範囲　　　　　ｐＨ５〜ａ２．
温度１〜３５℃■　硝ａｌ塩の同化性　　　あり ■　脂肪の分解　　　　　あり ■　尿素の分解　　　　　あり ■　ゼラチンの液化　　　あね ■　カロチノイド色票の生成　ア秒（紅色）■　顕著な
有機酸の生成　なし ■　デンプ／類似−質の生成　がし ［相］　ビタンン要求性　　　なし く、）　　炭水化物の同化性 Ｗｉｃｋｅｒｈａｍｊｉｉ地、２５℃、７日間培養同化
性　　発酵性 ■　Ｄ−アラビノース　　　　　　＋ ■　Ｌ−ブッとノース　　　　　　＋ ■　Ｄ−キシロース　　　　　　＋ ■　Ｄ−グルコース　　　　　　十　　　　　−■　Ｄ
−ガラクトース　　　　　十　　　　　−■麦芽糖　　
　　十　　− ■シ１糖　　　十　　− ■　乳　　糖　　　　　　　−− 〇　　トレハロース　　　　　　　　＋［株］　ラフィ
ノース　　　　　　　十　　　　　−＠　α−メチル−
Ｄ−グルコシド　＋ ［相］　可ｍ性デンプン　　　　　　＋［相］　エタノ
ール　　　　　　　　−［相］　イノジット　　　　　
　　　−同化性　　発酵性 ＠　Ｄ−マンニット　　　　　　＋ ＠　Ｄ−ソルビット　　　　　　＋ ＠　グリセリン　　　　　　　＋ ［相］　クエ糧　　　　　　　　　− テ８−１５１０５ 分離源；花 （１）形態 ｉ　　ＭＹ寒天培地、２５℃、平板培養Ｏ）栄養細胞の
形状　　　円筒形 ■　栄養細胞の大きさ　　（５〜５）ｘ（６〜１０）声
Ｉ　　ＭＹ液体培地、２５℃、７日間 ■　ガスの発生　　　　　なし ■　表面の生育　　　　　平滑 ■　培地の混濁　　　　　やや濁る ■　沈殿の生成　　　　　粉末状 ■　培地の着色　　　　　なし 五Ｍ！寒天培地、２５℃、３０日間、Ｎ面培養■　生育
の程度　　　　　生育良好 ■　コロニーの周綴　　　金縁 ■　コロニーの隆起状態　半レンズ状 ■　コロニーの表面の形状　平滑 ■　コロニーの光沢　　　鍼先 ■　コロニーの性状　　　バター質 ■　コロニーの色ｌｌ　　　　オレンジ色未　バレイシ
曹培地、スライド培養 繭糸、仮性菌糸は認ぬられない。

（ｂ）　　子嚢胞子の形成　　　　　なしくＣ）　　射
出胞子の形成　　　　　なしくｄ）　　生理的性質 ■　鍛適生育条件　　　　ｐＨ５〜７．へ温ｇ２０〜３
３℃（齢　生育の範囲　　　　　ｐＨ３４２，９ｇ　１
４〜３６℃（リ　硝酸塩の同化性　　　あり ■　脂肪の分解　　　　　なし ■　原票の分解　　　　　あり ■　ゼラチンの液化　　　なし ■　カロチノイド色素の生成　あり（オレンジ色）■　
顕著な有機酸の生成　なし ■　デンプン類似物質の生成　なし ［株］　ビタミン襞水性　　　なし くｅ）　　Ｒ水化物の同化性 Ｗｉｃｋｅｒｈａｍ培地、２５℃、７日間培養同化性　
　発酵性 ■　Ｄ−アラビノース　　　　　＋ ■　Ｌ−アラビノース　　　　　　＋ ■　Ｄ−キシロース　　　　　　＋ ■　Ｄ−グルコース　　　　　　＋　　　　　−■　Ｄ
−ガラクトース　　　　　　十　　　　　　−■麦芽糖
　　　　−− ■　　シ　　曹　糖　　　　　　　　　　　　　十　　
　　　　　　−■乳　糖　　　−− ■　　トレハロース　　　　　　　　＋［株］　ラフィ
ノース　　　　　　　＋　　　　　−＠　α−メチル−
Ｄ−グルコシド　＋ ＠　可鋳性デンプン　　　　　　＋ ［相］　エタノール　　　　　　　　−［相］　イノシ
フト　　　　　　　　−＠　Ｄ−マンニット　　　　　
　＋ 同化性　　　発酵性 ＠ｌ　Ｄ−フルビット　　　　　　＋ ＠　グリセリン　　　　　　　＋ ・　クエ４酸　　　　　　　　　横 これらの１株はいずれも工業技術院微生物工業技術研究
所に寄託されている。寄託番号は下記の通抄である。

シ島−ト箋ナス　プチダ（Ｐａａｕｄｏｍｏｎａｓ　Ｐ
５すＡりＴＩＩ）−１５００１黴工研■寄第６０３５号 アルカリゲネス　フェーカリス（４ｆａａｃａｌｉｓ）
Ｔト１５００２ 黴工研曹寄第６０３４号 トルロプシス　カンジダ（〒ｏｒｕｌｏｐｓｉｓ　　ｃ
ａｎｄｌａ）ＴＢ−１５１０１微工研−寄第６０５７号 ロドトルラ　グルチニス（Ｒｈｏａｏｔｏｒｕｌａ　ｇ
ｌｕｔｉｎｉｇ）〒８−１５１０３ 微工研厘寄第６０３８号 丁５−１５１０５ 黴工研曹寄第６０５９号 嵩源、窒Ｘ源、有機栄養源、無機栄養源などを含む通常
の栄養培地が使用できる。

脚素源としてはグルコース、シュクロース、糖蜜尋の畿
水化物ならびに酒石酸、フマール酸、マレイン酸、リン
ゴ酸等の有機酸及びその塩類を、窒素源としては通常の
発酵に剛いられる一鹸アンモニウム、頃化アンモニウム
、アンモニア、リン醗アンモニウム、硝酸アンモニウム
等の無＊＊嵩化合物及び尿素、コーン・ステイープ、リ
カー、カゼイン、ペプトン、酵母エキス、肉エキスなど
の有機窒素化合物を用いることができる。

その他無機栄養源と【２ては、ｆｌ杼ばカルシウム場、
マグネシウム塩、カリウム塩、リンｒＩＩ場、鉄塩、マ
ンガン塩、亜鉛塩、銅塩などが柑いられる。

トルロプシス　カンジダＴＳ−１５１０１株はビオチン
要求性であるので、培地にビオチン又はビオチン含有物
を添加する。

上記微生物の培養は、そわそれの菌種についての慣用の
方法を用いて行なうことができる。

例えば、シ龜−ドモナス　プチダ〒８−１５００１、ア
ルカリゲネス　フェーカリス〒８−１５００２の各細菌
については、通常、温度約２０ないし約４０℃、好まし
くは約２５ないし約３Ｓ℃で、坪約５ないし約９、好ま
しく　Ｆｉｐｕ約１５ないし約７．５で振盪９通気攪拌
などの手段によ抄好気的に行なわれる。一方、トルロプ
シス　カンジダ７Ｂ−１５１０１，ロドトルラ　グルチ
ニス〒８−１５１０３及びスポロボロマイセス　オドル
ス〒８−１５１０５０各酵母については、通常、温度約
１５ないし約５５℃、好オしくけ約２０ないし約３０℃
で、ｐＨ約５ないし約＆２．好ましくは約４カいし約ｚ
５で％ｉｉｉＩｍの場合と同様に振盪。

通気攪拌などの手段により好気的に行なわれる。

冑、培養に肖って、培地中にα−ムｐｍ、フェニルアラ
ニン低級アルキルエステル等を少量添加しておくことに
よって得られる微生物の培養物又はその処理物のα−ム
ｐｍ生産能を高めることがてきる。

本発明で用いる微生物の培養物又はその処理物とは、上
述し要員に輌する微生物を培養して得た培養液、この培
養ＩＩＩｅから採板した＃１体、これらを処理して得た
洗浄菌体、乾燥菌体、菌体破砕物、自己消化等による―
体消化物、＃４捧の超音波処理物、その他の＊ｉｉｍ生
成物又はこれらを固定化したものなどを云う。また、こ
れらの培養物から得られ九酵素蛋白質区分も含むもので
ある。

培養液からの菌体の分離、得られた菌体の処理碑は慣用
の方法で容易に行なうことができる。

本発明は、この微生物の培養物又はその処理物を水溶液
中でＬ−アスパラギン酸及びＬ−７工ニルアラニン低級
アルキルエステルと接触させることＫより行なうもので
ある。

オな本発明は、用いる微生物の培養途中で、培地中にＬ
−アスパラギン酸とＬ−フェニルアラニン低級アルキル
エステルを添加して培養を継続し、両者と本発明の微生
物の培養物とを接触させるととＫよっても実施できる。

本発明で微生物の培養物又はその処理物をＬ−アスパラ
ギン酸及びＬ−７エニルアラニン低級アルキルエステル
と接触させる際の濃１には格別の制限はないが、両者と
本通常は約１重を−ないし溶解度の許す範囲、好ましく
は約５重１−ないし約４０重量−程度である。

本発明の微生物の培養物又はその処理物の使用ＩＫも格
別の制限はないが、これらは通常モル濃度でよ抄低い濃
度の基質１モル当ね、漫画重量で約１０２ないし約１０
口ａｙ、好ましくは約５゜ｆないし約５０ｏｆの一体に
相当する培養物又はその処理物を用いる。

本発明の方法の反応温ｆは、通常約１０℃ないし約５０
℃、好ましくは約２５℃ないし約４０℃である。まえ、
反応液の液性は、卯約４ないし約７．好ましくは約５な
いし約６である。

反応時間は何ら限定的でないが、通常約１時間ないし約
４０時間、好ましくは約１０時間ないし約２０時間Ｉｉ
度が便利である。

本発明で用いるＬ−７工ニルアラニン低級アルキルエス
テルの低級アルキル基は、メチル基、エチル基、イング
ロビル基などの基である。アスパラギアｆｌｌ及ｒｊフ
ェニルアラニン低級アルキルエステルのＤ一体は利用さ
れず、また反応に関与しないので、これらのＬ−Ｋに代
オてラセミ体を用いてもよい。

生成したα−ＡＰＲは公知の分離精製手段によ秒分１１
１精製することができる。例えば、反応液に菌体畔の固
形分を含むときは、遠心分離、濾過眸によりこれを分離
したのち、必要に応じて除蛋白婢の処理を行ない、慣用
のカラムクロマトグラフィー、薄−クロマトグラフィー
、晶析、減圧下での乾燥郷の分離精製手段によりα−Ａ
ＰＩＣを精製単離することができる。

本発明によれば、ａ料であるし一アスパラギン酸のアミ
ノ基を保穫する必要がなく、直ちにα−ムＰＥの製造に
用いることができる。オた生化学反応を利用するので、
原料としてラセミ体を用いてもα−ムＰ１のＬＬ一体の
みを選択的に製造することができる。史にまた、本発明
ではβ−ＡＰＩの副生がない。

以下、実施例で本発明を更に詳細に欽明する。

実施例中、百分率はいずれも重量百分率を示す。

実施例１ ア！−ル酸アンモニウム２％、　　リン酸２水素１カリ
ウムａ１−、リンＨ１水素２カリウムα１−２ｉ１＃ｆ
ｆグネシウムｍ７水塩１０５％、＠＠第２鉄−７水場［
１０１％、塩化マンガンα０１−９塩化ナナトリウム１
０１及び残部水からなる培地（ｐＨ５，５）　ｔ　ｏ　
ｔを２を容ミニジャー型醗酵槽に入れ、１２０℃、１５
分間滅菌を行なった。

これＫこれと同一組成の培地（ｐＨ５’５）にシュード
モナス　プチダテ８−１５００１をｓ７℃で１６時間培
養して得友前培養液５０−を接種し、培養期間中ｐＨ１
５〜４０を維持するように２ＢＪ−’ａｃｔ水溶液、２
Ｍ−ＭａＯＨ水浴液を添加しながら培養温Ｗ１３７℃、
攪拌器回転数５００　ｒｐａｚ、通気量１を空気７分の
条件下で通気攪拌培養を行なった。

１６時間培養後、得られた培養液のうち、その５００−
を遠心分離して一体を集め（湿ａｍ体量Ｓｒ）、これを
１１５０ＭリンＩＩＩ塩緩衝液（ｐＨ４５）２５−に懸
濁した。この＠濁液をＬ−アスパラギン＠１５１．Ｌ−
７エニルアラニンメチルエステル、Ｌ５Ｆを含む水溶液
２５ｍ１Ｃ加え、振盪しながら５７℃で１６時間反応を
行なった。

反応終了後、反応液を１５℃、ＩＱＯＯＯｒｐｍで５０
分関連心分離して菌体を除いた。得られた上清液を水：
エタノール（容駿比８０：２０）を溶離液とするカラム
クロマトグラフィー（充填剤トヨバール５５１Ｆ　商標
、東洋曹達工業■製）により分画を行なった。α−Ｌ−
アスパルチルーＬ　−７エニルアラニンメチルエステル
に相当する分画区分を減圧下で濃縮を行ない白色粉末１
Ｑ（ｌｑ）を得た。このものの元素分析値及び物理化学
的性質は以下の通りであった。

０　５瓜８１　　　　　　５７．１４ Ｈ瓜０２　　　　　　　４１２ Ｎ　　　９．５５　　　　　　９．５２融点：２３５〜
２５６℃で分解ｌ、た。

比旋光＊：Ｃα界＋５Ｌ口（０−１，＃酸）アミノ基を
トリフロロアセチル化、カルボキシル基をメチル化した
ものの分子量は４０４でありた。

ｔ＋、　こｈｆＬ−ｙエニルアラニル−Ｉ、　−フェニ
ルアラニン、Ｌ−７ｘニルアラニル−Ｌ−フェニルアラ
ニンメチルエステル、ジケトピヘラジン。

Ｌ−フェニシアラニン、Ｌ−フェニルアラニンメチルエ
ステル、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−アスノくルチル−Ｌ
−フェニルアラニン、Ｌ−アスノ（ルチシーＬ−アスパ
ラギン醸、α−Ｌ−アスノ（ルチル−Ｌ−フェニルアラ
ニンメチルエステル、β−Ｌ−アスバにチＡ、−Ｌ−フ
ェニ髪アラニンを標準物質として薄層クロマトグラフィ
ー、高速１１＋ＥＫクロマトグラフイー及びアミノ酸分
析計で分析を行なった。更に塩酸メタノールによるメチ
ル化及びトリフロロアセテートメチルニスチャによるト
リフロロアセチル化処理を行なった試料のガスクロマト
グラフィーならびにガスクロマトグラフィー・マススペ
クトログラフィー分析によりこれがα−Ｌ−アスパルチ
ルーＬ−フェニルアラニ／メチルエステルであることを
同定確−した。

実施例２〜５ 実施例１と同様にして培養及び一体分離を行なって画体
懸濁液を得た。この懸濁液を第１表に示−ｔ−ｔのＬ−
アスパラギン酸及びＬ−フェニルアラニンメチルエステ
ルを含む水溶液２５−に加え、同表に示す反応条件で両
者を反応させた。

第１表に示す置のα−Ｌ−アスパルチルーＬ−フェニル
アラニンメチルエステルの白色粉末を得た。

第１表 実施−１４ 実施例１と同様にして培養及び菌体分−を行なって画体
懸濁液を得た。Ｌ−アスパラギン酸＆５Ｆ、及びＬ−フ
ェニルアラニンメチルエステルｔｓｔｆ含む水溶液２５
−に代えて、ＤＬ−アスパラギン酸モノナトリウム五ｓ
ｆ及びＤＬ−フェニルアラニンメチルエステル塩＊ｍｔ
ｓｒを含む水溶液２５−を用いて実施例１と同ｍにして
反応ヲ行なった。α−Ｌ−アスパルチル−も一フェニル
アラニンメチルエステル５０■を得た。

実施例７ シ凰−ドモナス　プチダＴ８−１５００１に代えてアル
カリゲネス　７エーカリスＴＳ−１５００２を用いて実
ＩＩＩＡ例１を繰返えした。α−Ｌ−アスパ髪チルーＬ
−７エニルアラニンメチルエステシの白色粉末８（ｌｙ
を得た。

実施例８ グルコ〜スｔｏｅ、フマール酸アンモニウムｔＯ慢、リ
ン＃１２水ｌＡ１カリウムα１チ、す／酸１水票２カリ
ウムａ１９１．硫酸マグネシウム・７水塩α０５慢、硫
Ｍ第２鉄−７水塩α０１−１塩化マンガン（ＬＯ１％、
塩化ナトリウム１０１％及び残部水からなる培地（ｐＨ
５，０）　Ｌ　ＯＬを２を容ミニジャーＩ！１１！ｌｌ
＃Ｉ槽に入れ、１２０℃、１５分間滅曹を行なった。

これにこれと同一組成の培地（ｐＨ５，０）　Ｋロドト
ルラ　ダルチェスＴ＆−１５１０３を５０℃で２４時間
培養して得た帥培Ｉｌｌ液５０−を！ＩＩＩＬ、培養期
間中ｐＨ５，０〜！Ｌ５を維持するように２Ｍ−Ｈ０Ｊ
水溶液、　２　Ｍ−ＭａＯＨ水躊液を添加しながら培養
４１０℃、攪拌器回転数５ｏａｒ％２通気量１Ｌ空気／
分の条件下で通気攪拌培養を行なった。

４・時間培養後、得られた培養液のうち、その５ａＯ−
を遠心分離して１を集め（温調一体音５ｆ）、この一体
を用いて実施例１と同様にしてＬ−アスパラギン酸とＬ
−７エニルアラニンメチルＸ　スｆ　ｋ　全反応させ、
α−Ｌ−アスパルチルーＬ−７エクルアラニンメチルエ
ステルの白色粉末８（１＋Ｆを得た。

実施例？ ロドトルラ　グルチェスフ１３−１５１０４ＳＫ代えて
スポロボロマイセス　オドヤスＴ８−１５１０５を用い
て実施例８を繰返えした。α−Ｌ−７．ＸパルチルーＬ
−７エニルアラニンメチルエステルの白色粉末７０ｗｇ
を得た。

実施例１０ グルコースｔｏｅ、フマーＡ／１１１アンモニウムｔｏ
ｅ、ｌＪン＃２水１１！７１ＪつＡ（１１％、＋）：／
ｅＭ１水嵩２カリクムｃＬ１％、硫諏マグネシウム・７
水塩α０５ｓ、硫酸第２鉄拳７水塩α０１−１塩化マン
ガン（１０１％、塩化ナトリウム（ＬＯ１％。

ビオチンα５　ｘ　１０＝　−及び残部水からなる培地
（ｐＨｌ）　１．　Ｏｔを２を答ミニジャー槃１！！１
＃槽に入れ、１２０℃、１５分間滅陶を行なった。

これにこれと同一組成の培地（ｐＨ５，ｏ）にトルロプ
シス　カンジダＴ８−１５１ｍ１を５０℃で２４時間培
養して得た５ｔｒｓ豊液５０−を接種し、培養期間中ｐ
Ｈ５，０〜５−５を維持するように２　Ｎ　−ＨＣ４水
溶液、２Ｎ−ＮａＯＨ水浴液を添加しなから培ＩＩ諷ｇ
５０℃、攪拌器回転数５００ｒ陣１通気普１を空気７分
の条件下で通気攪拌培養を行なった。

４０時間後、得られた培養液のうち、七の５０ローから
遠心外ｆｌＮｃより＃体を集め、これを純水にＪｌｌＩ
ＩＩＩＩしてｔｏＷｔと１．た。こねにアクリル酸アミ
ドＬ？ｆ、Ｎ、Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド（Ｌ
ｌｆ、２０％！−ジメチルアミノプロピオニトリル氷解
液α５ｄ及び過硫酸アンモニウム２ｆを加え、室温で１
０分間靜重した。

次に反応生成物を粉砕し、純水で沈降して固定化菌体１
４ｔを得た。

こうして得喪固＾体１０ＦをＬ−アス／シラギ／＠五ｓ
ｔ、Ｌ−フェニルアラニンメチルエステルＬ５ｆを含む
ｐＨＮ　５の水浴液２５’に加え、振盪しながらｓ７℃
、１８時間反応させた。

遠心分離で固形分を除いた後、この水浴液を実施例１と
同様にして処理を行ないα−Ｌ−アスノ（レチルーＬ−
フェニルアラニンメチルエステルの白色粉末４５ｓｙを
得た。

実施例１１ シェードモナス　プチダＴ８−１５００１を実施例１と
同一組成の培地に同一条件で培養した。

得られた培養液のうち、その５００−から遠心分離によ
り一体を集め（／１１１１１１９１１体量５２）、坏Ｏ
Ｍ体量酸場緩衝液２Ｓｄに懸濁し丸。こうして得た１体
懸濁液を５℃で１５分関超音波処理してｍ捧を破砕した
。破砕液を５℃、１α０００　ｒｐｍで１５分間遠心分
離して得た上清液ＩＩ、−アスノ（ラギン酸＆５ｆ及び
Ｌ−７エニルアラニンメチルエステル４．５ｆを含む水
溶液２５−に加え、振盪しながらｓ７℃で１６時間反応
を行なった。

以下実施例１と同様に処理を行ない、Ｌ−アスノくルチ
ル−Ｌ−７エニルアラニンメチルエステルの白色粉末７
０■を得た。

実施例１２ Ｌ−７エニルアラニンメチルエステルに代エテＬ−７エ
ニルエチレンアラニンエチルエステルを用いて実施例１
をく妙返えした。α−Ｌ−アスノくルチル−Ｌ−フェニ
ルアラニンエチルエステルの白色粉末６５ｗ５ｐｌを得
た。

元素分析： Ｃ５ａ５５　　　５＆４５ ■　　　　直６５　　　　　　４５４ Ｎ　　　　　１１２　　　　　　９．０？融点：２４４
〜２４６℃（分解） 比旋光度：［α］”　ニーｉ　（Ｃ！−１，メタノール
）アミノ基トリフロロメチル化及びカルボキシに基メチ
ルエステル化体の分子量＝４１８実施＄１１１５−１７ 第２１！に示す微生物を同表に示す実施例に従って培養
し友。

第２表記載の時間培養を行なったのち１．この培養物に
第２表記載の液性Ｋｖ１４節した、Ｌ−アスパラギア＠
７０　ｆ及びＬ−７エニルアラニンメチルエステル９０
ｆを含む水溶液２００ｍを無菌的に添加し、得た混合液
を更に第２Ｉ！！記載の時間培養を行なうことにより両
者を反応させ九。

こうして得た反応液を１５℃、ＩＱＯＯＯｒｐｍで３０
分間遠心分層して１体及び固形物を除去し丸。

得られた上滑液を実施例１に準じて処理し、第２表記載
の量のα−Ｌ−アスバルチＲｙ　　Ｌ　　７：をニルア
ラニンメチルエステルの白色粉末を得た。

第　２　表 特許出願人　東洋１達工業株式会社 ５５５

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （鳳）　　シ為−ドモナス属、アルカリゲネス輿、トル
   ロプシスｗ４．ロドトル２輌又はスポロポロマイセス嬌
   に属し、Ｌ−アスパラギン酸とＬ−フェニルアラニン低
   級アルキルエステルからα−Ｌ−７スパルチルーＬ７ｚ
   ニルアラニン低級アルキルエステルを生成させることの
   できる微生物の培養物又はその処理物を、Ｌ−アスパラ
   ギン酸及びＬ−フェニルアラニン低級アルキルエステル
   と接触させることを特徴とするアスパルチルフエニにア
   ラニンアルキルエステルの製造法。 （２）反応をｐＨ約４ｆ！いし約７で行なう特許請求の
   範囲第１項記載の製造法。 体）微生物の培養物がその菌体である特許請求の範囲第
   １墳又は第２ｒＡ記載の製造法。 （４）微生物の培養物の処理物がその固定化された１体
   である特許請求の範囲第１ｍないし第１項のいずれかの
   項記載の製造法。 俸）微生物の培養物の処理物がその溶菌生成物である特
   許請求の範囲第１項にいし第４項のいずれかの項記載の
   製造法。 ＋６）　　Ｌ−フェニルアラニン低級アルキルエステル
   及ヒα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−７工ニルアラニン低級
   アルキルエステルの低級アルキル基がメチル基又はエチ
   ル基である特許請求の範囲第１項ない【７第５項のいず
   れかの項記載の製造法。