JPH03117493A - 光学活性アミノ酸類の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産１よＬ科朋分野 本発明は、微生物を利用してニトリル化合物、特にラセ
ミ体のα−アミノニトリル化合物並びにα−（Ｎ−アル
キリデンアミノ）ニトリル化合物から光学活性アミノ酸
類を製造する方法に関する。

光学活性アミノ酸類は、食品、飼料、医薬および化粧品
等の分野に利用される重要な化学物質である。

従未且ｊ仔 従来、光学活性アミノ酸類を製造する方法としては、発
酵法、合成法、酵素法及び抽出法が知られている。これ
らの方法のうち、合成法による光学活性アミノ酸の製造
は、ストレッカー法或はその変法を用いてＤＩ、−α−
アミノ酸を合成し、次いで該アミノ酸を光学分割して光
学活性アミノ酸を製造するものであって、光学分割の方
法としてアミノアシラーゼを用いる酵素法等を採用して
いる（［化学」誌増刊「不斉合成と光学分割の進歩」昭
和５７年１０月１５日発行、第１７５頁）。

しかし、上記合成法による光学活性アミノ酸の！ｉＪ造
法は、光学分割段階においてコスト高となるため、経済
的理由から近年、アミノ酸の製造に占める割合が徐々に
低下してきている。

また、上記ストレッカー法によるα−アミノ酸の８・成
における合成中間体であるＤ　Ｌ、−α−アミノニトリ
ルから微生物を利用してα−アミノ酸を′１Ｍ造しよう
とする試みも報告されている（’／、Ｆｕｋｕｄａｅｔ
　ａｌ、、［ジャーナルオブフアーメンテーションテク
ノロジイ」（Ｊ、Ｆｅｒｍｅｎｔ、Ｔｅｈｎｏｌ、）　
４９．　ｔｏｌｌ（１９７１）　）。しかし、この報告
では、コリネノ＜クテリウム（ｃｏｉｉμ立ａｃｔβ１
！蕉−３ｐ、）に属する微生物を用いてＤＬ−α−アミ
ノプロピオニトリル並びにＩ）Ｉ、−α−アミノイソバ
レロニトリルを加水分解して旧−５−アラニン並びに旧
、−ノ＼リンを製造するものであって、Ｌ、−α−アミ
ノ酸は直接１１られない。また、ブレビバクテリウム属
＜Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｔａ３ｐ、）の菌株Ｒ３１２
を用いてＤＬ−α−アミノニトリルを加水分解してアミ
ノ酸を製造する報告［Ｊ。

Ｃ，Ｊａｌｌａｇａｓ　ｅｔ　ａｌ、　’アドパンスオ
ブノ臼オケミカルエンジニアリングＪ　（Ａｄｖ、Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ、Ｆｎｇｉｎｅｅｒ、、）貝、０１９８０）
　）においても、Ｄ　Ｉ−一α−アミノニトリルからは
Ｄｌ、−α−アミノ酸しか得られていない。因に、上記
報告は、ブレビバクテリウム属の菌株Ｒ３１２から得ら
れた変異株であるブレビバクテリウムｓｐ、Ａ４を用い
ることによりＤ　Ｌ、〜αアミノニトリルからし一α−
アミノ酸とＤ−αアミノ酸アミドとを生成し得ることを
開示しているが、ＤＬ−α−アミノニトリルから１．−
αアミノ酸のみを直接得ることに関しては、報告しでい
ない。

また、Ｄ　Ｌ−α−アミノニトリルの鏡像異性混合物の
溶液をエナンチオ選択的なニトリラーゼで処理し、光学
活性なアミノ酸及びアミノ酸アミドを調製する方法が開
示されている（特表昭６３−５００００４）。

上記報告は、ニトリラーゼを生産する株第３１１号を用
いることによりＤ　Ｌ−α−アミノニトリルから４０％
ｅ、ｅ、のＬ−アミノ酸アミドを得ることを開示してい
るが、一方し−アミノ酸を得るためには、反応液から酵
素を除去し、２Ｍの水酸化ナトリウム溶液を加えてｐＨ
を１１に調整することを反応６時間の間に５回繰り返す
という、化学的なＬ−アミノ酸アミドの加水分解を行わ
なければならないという問題点を有していた。

一方、本発明者は、α−アミノニトリル化合物及びα−
（Ｎ−アルキリデンアミノ）ニトリル化合物から特定の
微生物を用いて光学活性アミノ酸を直接得る方法を提室
した（特開平１−３１７３９２号公報、特開平１−３１
７３９３号公報及び特開平１−３１７３９４号公報）。

しかし、ノカルディオプシス属又はバチルス属の微生物
を利用して加水分解して光学活性なαアミノ酸を製造す
る方法は未だ知られていない。

しよ”と　る 本発明は、特定な属から選択されるニトリルの加水分解
能を有する微生物を利用して、１〕１−一αアミノニト
リル類から直接光学活性アミノ酸類を製造するだめの方
法を提供することを課題とする。

■尤蟇ロ忙状ｊ−ｉ友■−ｑ手−段一 本発明は、ノカルディオプシス属又はバチルス属に属す
るニトリル加水分解能を有する微生物を、ＤＬ−α−ア
ミノ酸類に作用させると光学活性アミノ酸類を選択的に
産生ずることの知見に基いてなされたものである。

したがって、本発明は、 下記に示す一般式（１）乃至（ＴＶ）で表わされる１種
又は２挿置」−のニトリル化合物に、ノカルディオプシ
ス属又はバチルス属に属するニトリル加水分解能を有す
る微生物を作用させて光学活性アミノ酸類を産生ずるこ
とを特徴とする光学活性アミノ酸類の製造方法、 　Ｈｚ Ｒ−ＣＨ−ＣＮ　　　　　（［） ＮＨ。

Ｒ−ＣＨ，−ＣＨ−ＣＮ　　（ｎ） （ただし、式（１）および（ＩＮ）中Ｒばアルキル基、
置換アルキル基、フェニル基、置換フェニル基、イミダ
ゾリル基、置換イミダゾリル基、インドリル基、置換イ
ンドリル基、フリル基、置換フリル基、ピリジル基、置
換ピリジル基、チアゾリル基、置換チアゾリル基を示す
） Ｎ＝ＣＨ，−Ｒ。

Ｒ，□ＣＨ−ＣＮ　　　　　　　（ＩＩＩ）Ｎ　＝　Ｃ
Ｈ−ＣＨ、Ｒ。

Ｒ，−ＣＨ，−ＣＨ−ＣＮ　　　　（ＴＶ）（ただし、
式（Ｉｌｌ）および（ＩＶ）中Ｒ，及びＲはアルキル基
、置換アルキル基、フェニル基、Ｗ　ｆＡフェニル基、
イミダゾリル基、置換イミダゾリル基、インドリル基、
置換インドリル基、フリル基、置換フリル基、ピリジル
基、置換ピリジル基基、チアゾリル基、置換チアゾリル
基を示し、Ｒ。

及びＲ２はそれぞれ同じ基でも、異なる基でも良い）。

また、本発明は、上記一般式（１）又は（ＩＩ）で表わ
される１種又は２種以上のα−アミノニドＪル化合物を
出発物質として用いる場合、下記に示す一般式（Ｖ）も
しくは（Ｖｌ）で表わされるアルデヒドの存在下に、上
記微生物を作用させて光学活性アミノ酸を産生ずること
も特徴とする。

Ｒ−ＣＨＯ（Ｖ　） または、下記一般式（Ｖｌ） Ｒ−ＣＨ，ＣＨＯ（Ｖｌ） （ただし、式中Ｒは上記一般式（Ｉ）又は（ＩＩ）と同
し）。

本発明において利用される微生物は、上述のごとく、ノ
カルディオプシス属又はバチルス属に属する群から選択
されるニトリル加水分解能を有するものであって、下記
表１に示すものが例示し得る。

表 １ 表１０こみられるとおり、これらの微生物は、工Ｙ技術
院微生物研究所に受託されている。

次に、Ｊ二掲の各微生物の菌学的性状及び化学的性状を
次に示す。尚、本ノカルディオプシス属菌株の同定は主
としてＳｂｉｒｌｉｎｇ、Ｅ、Ｒ，、とＧｏＬｔｌｉｅ
−ｂ、Ｄ。

により　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｊｏｕｒｎａｌ
　ｏｆ　ＳｙｓｔｅｍａｔｉｃＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｅ
ｙｌ−６，３１３−３４１’）、　１９６６に記載され
ているブ）法に従い行った。

ノカルディオプシス　　Ａ　１０４２ １、形態 Ａ　１０−１２株は光学顕微鏡下で、よく分枝した網目
状の基中菌糸を伸長する。基中菌糸から伸長した気菌糸
は真直〜曲状（Ｒｅｃｔｉｆｌｅｘｉｂｉｌｅｓ）、或
いは釣ｔ１状〜ループ状（Ｒｅ　ｔ　１ｎａｃｕ　Ｉ　
１ａｐｅｒ　ｔ　ｉ）の形態を示し、しばしばＺｉｇ−
ｚａｇ状に生育し、培養時間にともない桿菌様に分断す
る。輪生技、菌核、胞子のう等の特殊な器官は認められ
ない。成熟しまた胞子は通常１０ＷＡ以−りの胞子を連
鎖し、その大きさは０．５〜０゜８Ｘ１．０〜２．０ミ
クロン位で、表面は平滑である。胞子の運動性は観察さ
れない。

２、　各種培地上での生育状態 色調の記載は日本色彩研究所パ色の標〈Ｖ“’　１９５
１年、また、〔〕内に記載した記号および色調はコンテ
イナー・コーボｌ／−ジョン・オブ・アメリカ（Ｃｏｎ
ｔａｉｎｅｒ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａｍｅ
ｒｉｃ、ａ）のカラハーモニー働マーユアル（Ｃｏｌｏ
ｒ　ｈａｒｍｏｎｙ　「１ｌａｎｕａｌ）をそれぞれ用
いた。

■）リンゴ酸石灰寒天培地（２７°Ｃ培養）生育が遅く
接種後２週間目で無色の発育を形成する。３週間目には
うず黄〔２ｅａ、Ｌｔ　Ｉｖｏｒｙ’）の発育−Ｌに白
色の気菌糸をうつすらと着生し、可：容性色素は認めら
れない。

２）グルコース・モ１１酸塩寒天培地（２７”Ｃ培養）
うす苗条（２ｅｃ、　Ｂ１５ｃｕｉｔ　）の発育りに茶
「］（３ｃａ、５ｈｅｌｌ）の気菌糸を着生し、可溶性
色素はＪ忍められない。

３）グルコース・アスパラギン寒天培地（２７°Ｃ培養
）無色の発育上に僅かに白色の気菌糸を着生し、可溶性
色素は認められない。

４）スターチ・合成寒天培地（２７°Ｃ培養）無色から
うす黄（２ｃａ。１、ｔｌνｏｒｙ　）の発育トにうつ
すらと白色の気菌糸を着生し、可溶性色素の生産は認め
られない。

５）シ艮クロース・硝酸塩寒天培地（２７”Ｃ培養）う
す′＠茶（２ｃａ〜２ｇｃ、Ｌｔ　［ｖｏｒｙ＝Ｒａｍ
ｂｏｏ）の発育上に茶灰１：２ｂａ、　Ｐｅａｒｌ　：
ｌの粉状の気菌糸を豊富に着生し、可溶性色素はＪ４２
められない。

６）イースト・麦芽寒天培地（２７”Ｃ培？ｊ）うず苗
条（２ｉｃ、１ｌｏｎｅｙ　Ｇｏｌｄ）の発育Ｊ−に白
色の気菌糸を着生し、可溶性色素は観察されない。

７）オートミール寒天培地（Ｉ　Ｓ　Ｐ　３）　（２７
’Ｃ培養）うず黄（２ｇｃ　、　Ｂａｓ＋ｂｏｏ　）の
発育」二に白色の気菌糸を着生し、可溶性色素は観察さ
れない。

８）スターチ無機塩寒天培地（Ｉ　Ｓ　Ｐ　４）　（２
７’Ｃ咄養）うず黄［２ｅａ〜２Ｈｃ、　Ｌｔ　Ｗｈｅ
ａｔ〜Ｂａｌ１ｌｂｏｏ）の発育上に白色からうす黄（
２ｃ、ａ、１．ｔ　Ｉｖｏｒｙ）の気菌糸を着生し、可
溶性色素は観察されない。

９）グリセリン・アスパラギン寒天培地（ＩＳＰ５）（
２７°Ｃ培養） うず黄（２ｇｃ、　Ｂａｍｂｏｏ　）の発育上に白色の
気菌糸を着生し、可溶性色素は観察されない。

１０）チロシン寒天培地（Ｉ　Ｓ　Ｐ　７）　（２７”
ｃ培養）うす黄（２ｅａ〜２ｇｃ、Ｌｔ　Ｗｈｅａｔ＋
＋Ｂａｍｂｏｏ’３の発育上に白から黄味灰（２ｃｃ、
Ｂ１５ｃｕｉｔｌの気菌糸を着生し、可溶性色素は認め
られない。

１１）栄養寒天培地（２７℃培養） うす黄（２ｃａ、Ｌｊ、　Ｉｖｏｒｙ）の発育上に白色
の気菌糸を豊富に着生し、可溶性色素の生産は認められ
ない。

３、生理学的性質 １）生育）温度範囲 イーストエキストラクト・スターチ寒天培地を用いて１
０　”Ｃ２２０℃、２５’Ｃ，３１°Ｃ１３６°Ｃ１４
０゛Ｃ１４５゛Ｃ１５０°Ｃの各温度で培養した結果、
Ａ　１０−１２株は１０℃から３６°Ｃまでいずれの温
度でも生育したが、４０’Ｃ１４５°Ｃ１５０°Ｃでは
発育しなかった。

生育最Ｊ温度は２５°Ｃから３１°Ｃ付近と思われる。

２）ゼラチンの液化（１５％単純ゼラチン２０゛Ｃ培養
、グルコース・ペプトン・ゼラチン２７°Ｃ培養）いず
れの培地においても液化は認められなかった。

３）スターチの加水分解性（スターチ無機塩寒天培地２
７゛Ｃ培養） 培養後１４日目頃かられずかに氷解性が認められ、その
作用は弱いほうである。

４）脱脂牛乳の凝固およびペプトン化 （脱脂牛乳３７°Ｃ培＃） 培養１０日目頃から凝固が始まり、２１日目頃に完了、
ペフ゛トン化は１４日目頃から始まり、２１日目にほぼ
完了した。その作用は弱いほうである。

５）リンゴ酸石灰の利用 （リンゴ酸石灰寒天培地２７°Ｃ培養）リンゴ酸石灰の
溶解は認められない。

６）ｌ＋ｔ’ｌ酸塩の還元反応（１，０％硝酸ソーダ含
有ペプトン水　ｌ５Ｐ８２７℃培養） 陽性である。

７）セルロースの分解（２７°Ｃ培養）陰性である。

８）メラニン様色素の生成（トリプトン・イースト・ブ
ロス　ｌ５ＰＩ、ペプトン・イースト・鉄寒天培地　ｌ
５Ｐ６、チロシン寒天培地　ｌ５Ｐ７　いずれも２７゛
Ｃ培養） いずれの培地に於いても、メラニン様色素の生産は認め
られない。

９）炭素源の資化性（ブリードハム・ゴトリーブ寒天培
地　ｌ５Ｐ９．２７°Ｃ培養） Ｄ−グルコース、Ｄ−キシロース、Ｄ−フラクトース、
Ｌ−アラビノース、Ｄ−マンニトールおよびＬ−ラムノ
ースを資化してよく生育し、シュクロースも資化する。

イノシトールはおそらく資化しないものと思われ、ラフ
ィノースは資化しない。

４、細胞壁成分 Ｌｅｃｈｅｖａｌ　ｉｅｒ、Ｍ、Ｐ、、Ｌｅｃｈｅｖａ
ｌｉｅｒ、Ｈ，八、、Ａｃｔｉｎｏｍｙｅｅｔｅ　Ｔａ
ｘｏｎｏｍｙ　Ｗｏｒｋｓｈｏｐ、　Ｓｏｃ、Ｉｎｄ、
Ｍｉｅｒｏｂｉｏｌ。

Ａｕｇ、１３１９７８のテキストの方法に従い、全菌体
の細胞壁タイプを調べたところ■型を示した。

また、全菌体の糖成分タイプはリポースのみが検出され
るＣ型を示し、ムラミン酸のアシルタイプはアセチル型
であった。

以りの性状を要約するとＡ　１０−１２株は寒天培地上
で基中菌糸は良く分枝して網目状に伸長する。

培養初期にジグザグ状に生育する気菌糸が観察され、生
育と共に菌糸の分断が認められる。気菌糸は真直から曲
状（Ｒｅｅｔｉｆｌｅｘｉｂｉｌｅｓ）、或いは釣針状
からループ状（Ｒｅ　ｔ　１ｎａｃｕ　Ｉ　ｔａｐｅｒ
　ｔ　ｉ）に生育する。

胞子は０．５〜０．８Ｘ１．０〜２．０ミクロンの大き
さを示し、通常１０個以上連鎖し、その表面は平滑（Ｓ
ｍｏｏｔｈ）である。

各種寒天培地上で、胞子のう、車軸分枝、菌核などの特
殊な器官は認められない。Ａ　１０−１２株は各種寒天
培地でうす苗条の発育上に白色の気菌糸を着生し、可溶
性色素の生産は認められない。

Ａ　１０−１２株の硝酸塩の還元性、ミルクの凝固、ミ
ルクのペプトン化、リンゴ酸石灰の利用性は陽性を示し
たが、澱粉の氷解、ゼラチンの液化、セルロースの分解
、メラニン様色素の生産（ＩＳＰｌ、ｌ５Ｐ６、ｌ５Ｐ
７）は陰性であった。また、本菌株は７．５％以上〜ｌ
Ｏ％以下の耐塩性を示す、中性塩の放線菌である。

Ａ　ｔｏ−１２株の全菌体を用いた細胞壁タイプはｍ型
、糖成分タイプはＣ型、ムラミン酸のアシルタイプはア
セチル型を示した。

これらの性状をＢｅｒｇｅｙ’ｓ　ｍａｎｕａｌ　ｏｆ
　ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ　ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏ
）（ｙ　（第８版）および“放線菌の同定実験法°゛日
本放線菌学会１１１９８５年において検索したところ、
Ａ　１０−１２株は細胞壁タイプが■型、２０個以上の
胞子を連鎖する点からＡｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ、Ｅｘ
ｃｅｌ　！ｏｓｐｏｒａ、Ａｃｔｉｎｏｓｙｎｎｅｍａ
　、、Ｎｏｃａｒｄｉｏｐｕｓｉｓの各属の何れかに属
すると推察した。しかし、ＡｅｔｉｎｏＩｌａｄｕｒａ
、　Ｅｘｃｅｌｌｏｓｐｏｒａ属とはＡ　１０−１２株
が細胞壁中にｍａｄｕｒｏｓｅを含まない点で、また、
Ａｃｔｉｎ。

ｓｙｎｎｅｍａ属は気菌糸に連動Ｖ１細胞が形成される
点でＡ株とはＷなる。

Ａ　１０．４２株は（１）気菌糸を形成ｊ〜、胞子が１
０個以−に連鎖、（２）気菌糸がＺｉｇ−ｚａｇ状に生
育し、時間の経過とともに分断する、（３）細胞壁タイ
プが■型、（４）細胞壁に含まれる糖がｒｉｌ）ｏｓｅ
のみであるタイプＣ２（５）うす苗条の発育−ヒＧこ自
から黄味仄の気菌糸、等の特徴を持つ点から、Ｊ　、　
Ｍｅｙｅｒが提唱したＮｏｃａｒｄｉｏｐｕｓｉｓ属（
Ｎｏｃａｒｄｉｏｐｓｉｓ、、ａ　ｎｅｗ　ｇｅｎｕｓ
ｏｆ　ｔｌ＋ｅ　ｏｒｄｅｒ　Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔ
ｅｓ、　Ｉｎｔ、Ｊ、５ｙｓｔ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、
。

２６（４）、４８７−４９３．１９７６）に所属させる
のが妥当と考える。

Ｎｏｃａｒｄｉｏｐｕｓｉｓ属にはＮ、ａｌｂａ、　Ｎ
、ａｔｒａ、　Ｎ、ｃｏｅｒｕｌｅｏｆｕｓｃａ、　Ｎ
、ｆｌａｖａ、　Ｎ、Ｉｏｎｇｉｓｐｏｒａ＋　Ｎ、ｍ
ｕｔａｂ自ｉｓ。

Ｎ、５ｙｒｉｎ＠ａｅ、　Ｎ、ｄａｓｓｏｎｖｉｌｌｅ
ｉ＋　Ｎ、ａｎｔ、ａｒｔｉｃｕｓ、　Ｎ。

ｔｒｅｈａｌｏｓｅｉ、Ｎ、ａｆｒｉｃａｎｅ、Ｎ、５
ｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒｕｓ　　などの“種°′が知られ
ているが、Ａ　１０−１２株は炭素源の資化性、および
、菌体中の糖成分とｊ４．てｒｉｂｏｓｅのみが検出さ
れる点でおそら＜　Ｎ、ｄａｓｓｏｎν１ｌｌｅｉに近
似する種であると考える。

以上Ａ　１０−１２株は形態学的、生理学的、および細
胞壁の成分等の特徴からＮｏｃａｒｄｉｏｐｕｓｉｓ属
に属する放線菌であると判定する。

隻Ｊ」↑６−抹 １、形態 Ｂ　９−４７株は光学顕微鏡士で、よく分枝したＩＪ、
１目状の基中菌糸を伸長する。恭中菌糸から伸長した気
菌糸は真直〜曲状（Ｒｅｃｔｉｆｌｅｘｉｂｉｌｅｓ）
、或いは釣針状−ループ状（Ｒｅｔｉｎａｃｕｌｉａｐ
ｅｒｔｉ）の形態を示し、しばＵ７ばＺｉｇ−ｚａｇ状
に生育し、培養時間にともない桿菌様に分断する。輪生
技、菌核、胞子のう等の特殊な器官は認められない。成
熟した胞子は通常ｌＯ個以」二の胞子を連鎖し、その大
きさは０．５〜０．８Ｘ１．Ｏ〜２゜０ミクロン位で、
表面は平滑である。胞子の運動性は観察されない。

２、各種培地−１−での生育状態 色調の記載は［］木色彩研究所゛色の標ｒ゛１９５１年
、また、（］内に記載した記号および色調はコンテイナ
ー・二１−ボレーション・オフ゛・アメリカ（Ｃｏｎｔ
ａｉｎｅｒ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａｍｅｒ
ｉｃａ）のカラハーモニ　０マニユアル（Ｃｏｌｏｒ　
ｈａｒｍｏｎｙ　ｍａｎｕａｌ）をそれぞれ用いた。

１）リンゴ酸石灰寒天培堆（２７’ｃ培養）無色の発育
−にに白色の気菌糸を着生し、可溶性色素は認められな
い。

２）グルコース・硝酸塩寒天培地（２７°Ｃ培養）うず
苗条（２ｅｅ、Ｂ１５ｃｕｉｔ：ｌの発育−にに白色の
気菌糸を着生し、ｉｉＪ溶性色素は茶味を帯びる。

３）グルコース・アスパラギン寒天培地（２７”Ｃ培養
）殆ど生育は認められなかった。

４）スターチ・合成寒天培地（２７°Ｃ培養）うす苗条
［２ｇｃ、　Ｂａｍｂｏｏ　］の発育上に白色の気ｒｌ
′１糸を着生し、可溶性色素は黄味を帯びる。

５）シュクロース・硝酸塩寒天培地（２７’Ｃ培養）無
色の発育−トに白色の気菌糸を着生し、可溶性色素は認
められない。

６）イースト・麦芽寒天培地（２７’Ｃ培養）無色の発
育上に白色の気菌糸を着生し、可溶士１色素は観察され
ない。

７）オートミール寒天培地（Ｉ　Ｓ　Ｐ　３）　（２７
’Ｃ培養）無色の発育上に白色の気菌糸を着生し、可溶
性色素は観察されない。

８）スターチ無機塩寒天培地（ＩＳＰ４）（２７°Ｃ’
ｆｌりうす位茶（２ｅａ、Ｉ、を匈ｈｅａｔ）の発育上
〇こうず苗だいだい（３ｃａ、５ｈｅｌｌ　）の気菌糸
を着生し、可溶性色素は観察されない。

９）グリセリン・アスパラギン寒天培地（ＩＳＰ５）（
２７”Ｃ培養） うす黄（２＠ｃ、　Ｂａｓ＋ｂｏｏ　）の発育上１５こ
白色の気菌フを着生し、可溶性色素は観察されない。

１０）チロシン寒天培地（ＩＳＰ７）（２７°Ｃ培養）
うす黄（３（ＩＣ，Ｂ１５ｑｕｅ　）の発育上に白色の
気菌１を着生し、赤味をおびた可溶性色素を認める。

１１）栄養寒天培地（２’７’ｃ培養）うず黄（３ｅｃ
、Ｂ１５ｑｕｅ）の発育−Ｌに白色の気菌香を豊富に着
生し、可溶性色素の生産は認めら才ない。

３、　生理学的性質 １）生育温度範囲 イーストエキストラフ（・・スターチ寒天培地等用いて
１０’Ｃｌ２Ｏ°Ｃ２２５゛Ｃ１３１゛Ｃ１３６“Ｃ１
４０°Ｃ１４５゛Ｃ１５０°Ｃの各温度で培養した結果
、Ｂ　９−４７株は１０゛Ｃから３６°Ｃまでいずれの
温度でも生育したが、４０”Ｃ，４５°ｃ、ｓｏ’ｃで
は発育しなかった。

生育最適温度は２５°Ｃから３１゛Ｃ付近と思われる。

２）ゼラチンの液化（１５％単純ゼラチン２０°ＣｔＡ
養、グルコース・ペプトン・ゼラチン２７℃培養）いず
れの培地においても液化を認め、その作用は中程度であ
る。

３）スターチの加水分解性（スターチ無機塩寒天培地２
７゛Ｃ培養） 培養後１４日目頃かられずかに氷解性が認められ、その
作用は弱いほうである。

４）脱脂牛乳の凝固およびペプトン化 （脱脂牛乳３７°Ｃ培養） 培養１０日目頃から凝固が始まり、２１日目頃に完了、
ペプトン化は１４日目頃から始まり、２１日目ζこほぼ
完了した。その作用は弱いほうである。

５）リンゴ酸石灰の利用 （リンゴ酸石灰寒天培地２７°Ｃ培谷）リンゴ酸石灰の
溶解は認められｔ（い。

６）硝酸塩の還元反応（１，０％硝酸ソーダ含有ペプト
ン水　ｌ５Ｐ８２７°Ｃ培養） 陽性である。

７）セルロースの分解（２７°Ｃ培養）陰性である。

８）メラニン様色素の生成（トリプトンフロス　ＩＳＰ
Ｉ、ペプトン・イースト・鉄寒天培地　ＩＳＰ６、チ［
１シン寒天培地　ＩＳＰＩ　いずれも２７゛ｃ培養） いずれの培地に於いても、メラニン様色素の生産は認め
られない。

９）炭素源の資化性（ブリードハム・ゴトリーブ寅天培
地　ｒｓＰ９、２７°Ｃ培養） Ｄ−グルコース、Ｄ−＝キシロース、Ｄ−フラクトース
、Ｌ−アラビノースおよびＤ−マンニトルを資化してよ
く生育し、イノシ１ーーール、シュクロース、１、−ラ
ムノースおよびラフィノスは資化しない。

４、細胞壁成分 Ｌｅｃｈｅｖａ　Ｉ　ｉｃｒ，　Ｍ．　Ｐ．　、　１．
ｅｃｈｅｖａ　Ｉ　ｉｅｒ，　Ｈ．　Ａ．　、　Ａｃ　
ｊｉｎｏｍｙｃｅｔｅ　Ｔａｘｏｎｏｍｙ　ＷｏｒｋＳ
ｈｏｐ，　Ｓｏｃ．Ｉｎｄ．ｔｌｉｃｒｏｂｉｏｌ。

Ａｕ）（、１３　１９７８のデキス１−の方法に従い、
全菌体の細胞壁タイプを調べたところ■型を示した。

また、全菌体の糖成分タイプはリボースと若干のグルコ
ースが検出されるＣ型を示し、）、ラミン酸のアシルク
イブはアセチル型であった。

以上の性状を要約すると８　９−４７株は夾天培地上で
基中菌糸は良く分枝して網目状に伸長する。

培養初期にジグザグ状に生育する気菌糸が観察され、生
育と共に菌糸の分断が認められる。気菌糸は真直から曲
状（Ｒｅｃｔｉｆｌｅｘｉｂｉ！ｅｓ）、或いは釣針状
からループ状（Ｒｅｔｉｎａｅｕｌｉａｐｅｒｔｉ）に
生育する。

胞子は０．５〜０．８Ｘ１．０〜２．０ミクロンの大き
さを示し、通常２０個以ト連鎖し、その表面は平滑（Ｓ
ｍｏｏｔｈ）である。

各種寒天培地りで、胞子のう、車軸分枝、菌核などの特
殊な器官は認められない，　Ｂ　９−４７株は各種寒天
培地でうす黄〜うす苗条の発育上に、白色の気菌糸を着
生し、可溶性色素は赤味−茶味が認められる。

Ｂ　９−４７株のＩ′ｉｌ′ｉ酸塩の還元性、ミルクの
凝固、ミルクのベブ［・ン化、ゼラチンの液化は陽性を
示したが、リンゴ酸石灰の利用性、澱粉の氷解、セルロ
ースの分解、メラニン様色素の生産（ＩＳＰｌ、ｌ５Ｐ
６、ｌ５Ｐ７）は陰性であった。また、本菌株は７．５
％以上〜１０％以下の耐塩性を示す、中性塩の放線菌で
ある。

Ｂ　９−４７株の全菌体を用いた細胞壁タイプは■型、
糖成分タイプはＣ型でリボースおよび若干のグルコース
を含む。ムラミン酸のアシルタイプはアセチル型を示し
た。

これらの性状をＢｅｒｇｅｙ’ｓ　ｍａｎｕａｌ　ｏｆ
　ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ　ｂａｃｔｅｒｔｏｌｏ
ｇｙ　（第８版）およびＩＩ放線菌の同定実験法“日本
放線菌学会Ｗ　１９８５年において検索したところ、Ｂ
　９−４７株は細胞壁タイプが■型、２０個以Ｊ二の胞
子を連鎖する点からＡｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａＦｘｃｅ
ｌｌｏｓｐｏｒａ、＋Ａｃｔｉｎｏｓｙｒｉｎｅｍａ　
５Ｎｏｅａｒｄｉｏｐｕｓｉｓの各属の何れかに属する
と推察した。しかし、ＡｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａＳＥｘ
ｃｅｌｌｏｓｐｏｒａ属とはＢ　９−４７株が細胞壁中
にｍａｄｕｒｏｓｅを含まない点で、また、Ａｃｔｉｎ
。

ｓｙｎｎｅｍａ属は気菌糸に運動性細胞が形成される点
でＢ　９−４７株とは異なる。

Ｂ　９−４７株は（＋）気菌糸がジグザグ状に生育し時
間の経過とともに分断する、（２）細胞壁タイプが■型
、（３）細胞壁に含まれる糖がｒｉｂｏｓｅのみである
等の特徴を持つ点から、Ｊ、Ｍｅｙｅｒが提唱したＮｏ
ｃａｒｄｉ。

ｐｕｓｉｓ属（Ｎｏｃａｒｄｉｏｐｓｉｓ、、ａ　ｎｅ
ｓｖ　ｇｅｎｕｓ　ｏｆ　ｔｌｌｅｏｒｄｅｒ　Ａｃｔ
ｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ、　Ｉｎｔ、Ｊ、５ｙｓｔ、Ｂａ
ｅｔｅｒｉｏｌ、。

２６（４）、４８７−４９３．１９７６）に所属させる
のが妥当と考える。

Ｎｏｅａｒｄｉｏｐｕｓｉｓ属にはＮ、ａｌｈａ、　Ｎ
、ａｔｒａ、　Ｎ、ｃｏｅｒｕｌｅｏｆｕｓｃａ、　Ｎ
、ｆｌａｖａ、　Ｎ、１ｏｎｇｉｓｐｏｒａ＋　Ｎ、ｍ
ｕｔａｂｉｌｉｓ。

Ｎ、ｓｙｒｉｎｇａｅ、　Ｎ、ｄａｓｓｏｎｖｉｌｌｅ
ｉ、　Ｎ、ａｎｔａｒｔｉｃｕｓ、　Ｎ。

ｔｒｅｈａｌｏｓｅｉ、　Ｎ、ａｆｒｉｅａｎｅ＋　Ｎ
、５ｔｒｅｐｉｏｓｐｏｒｕｓなどの“種”が知られて
いるが、Ｂ　９−４７株は炭素源の資化性、および、菌
体中の糖成分としてリボスおよび若干のグルコースが検
出される点でおそら＜　Ｎ、ｄａｓｓｏｎｖｉｌｌｅｉ
、　　Ｎ、ａｎｔａｒｔｉｃｕｓ、　　Ｎ、　ｔｒｅｈ
ａｌｏｓｅｉのいずれかに近似する種であると考える。

以上Ｂ　９−４７株は形態学的、生理学的、および細胞
壁の成分等の特徴からＮｏｃａｒｄｉｏｐｕｓ　ｉｓ属
に属する放線菌であると判定する。

次にバチルス属の菌株の菌学的性状及び化学的性状を示
す。

本発明において、上記各微生物を利用して光学活性アミ
ノ酸を生産するのに用いる基質であるＤＬ−α−アミノ
ニトリル化合物（以下原料ニトリルと略記する）は、例
えば〔［オルガニック　シンセシス　コレクティブボリ
ウム（Ｏｒｇ、Ｓｙｎ、Ｃｏ１．Ｖｏｌ、）１、ｐ、２
１、及びＩＩＩ、ｐ、８４　Ｊ　）並びに（Ｙ、Ｆｕｋ
ｕｄａ　ｅｔａｌ、、　ｒジャーナル　オブ　フアーメ
ンテーションテクノロジイＪ　（Ｊ、Ｆｅｒｍｅｎｔ、
Ｔｅｃｈｎｏｌ、＋）　４９．１０１１（１９７１）　
３等に記載された方法に従って容易に合成し得る。

本発明の基質として用いるα−アミノニトリル化合物の
、一般式（１）　、（ＩＩ）におけるＲには特に制限が
ないが、置換アルキル基等のそれぞれに含まれる置換基
は例えばヒドロキシ、メトキシ、メルカプト、メチルメ
ルカプト、アミノ、ハロゲン、カルボキシル、カルボフ
サミド、フェニル、ヒドロキシフェニルあるいはグアニ
ルなどである。

α−アミノニトリル化合物としては、２−アミノプロパ
ンニトリル、２−アミノブタンニトリル、２アミノ−３
−メチルブタンニトリル、２−アミノ−４−メチルペン
タンニトリル、２−アミノ−３−メチルペンタンニトリ
ル、２−アミノ−３−ヒドロキシプロパンニトリル、２
−アミノ−３−ヒドロキシブタンニトリル、２−アミノ
−５−グアニジノペンタンニトリル、２アミノ−３−メ
チルカプトプロパンニトリル、２．７ジアミノー４，５
−ジチアオクタンジニトリル、２−アミノ−４−メチル
チオブタンニトリル、２−アミノ−３フエニルプロパン
ニトリル、３−（４−ヒドロキシフェニル）プロパンニ
トリル、３−アミノ−３−シアノプロパンｆｌＪ、４−
アミノ−４−シアノブタン酸、３−アミノ−３−シアノ
プロパンアミド、４−アミノ−４−シアノブタンアミド
、２．６−シアミツヘキサンニトリル、２．６−ジアミ
ツー５−ヒドロキシヘキサンニトリル、２アミノ−３−
（３−インドリル）プロパンニトリル、２アミノ−３−
（４−イミダゾイル）プロパンニトリル、２シアノピロ
リジン、２−シアノ−４−ヒドロキシビロリジン、２−
アミノ　２−フェニルエタンニトリル等を例示し７得る
。

また、」−記各原料二トリルは、２種以上を混合して用
いても何ら支障がないことは云うまでもない。

なお、本発明で原料基質として用いる前記一般代（ＩＩ
Ｉ）および（ｒＶ）で表わされるα−（Ｎ−アルキリデ
ンアミノ）ニトリル化合物は、例えばストレッカー法の
第１段目の反応であるα−アミノニトリル化合物の合成
〔例えば、ジャーナル　オブファ　メンテーションテク
ノロジイ（Ｊ、Ｆｅｒｍｅｎｔ。

Ｔｅｃｈｎｏｌ、）、４９．１０１１　（１９７１）あ
るいはケミストリ［メタ　ズ（Ｃｈｅｍ、Ｉ−ｅｔｔ、
）、６８７　（１９８７）　〕において、原料アルデピ
ドの消失がガスクロマトグラフィー等ζこよる分析にお
いて確認されたならば、たたらに濾過あるいは抽出等の
操作で無機塩を分離し、濃縮することにより得ることが
できる。

このようにして得られる粗生成物は、前記一般式（ＩＩ
Ｉ）および（ＩＶ）で表わされるα−（Ｎ−アルキリデ
ンアミノ）ニトリル化合物の部分加水分解物であるα−
アミノニトリルと、その合成原料であるアルデヒドを不
純物として含むことがあり、これらを分留等の操作で除
去した後、基質として用いる。しかし、上記粗生成物を
そのまま基質として用いることも可能である。なお、α
−（Ｎ−アルキリデンアミノ）ニトリル化合物としては
前掲の各ニトリル化合物と、これらのα−アミノニトリ
ルの合成原料であるアルデヒドとのシッフベース体を例
示し得る。

本発明においては、上述したニトリル化合物（以下原料
ニトリルという）に、ノカルディオプシス属又はバチル
ス属に属するニトリルの加水分解能を有する微生物、例
えばノカルディオプシスｓｐ、Ａ１０−１２　、ノカル
ディオプシスｓｐ、Ｂ　９−４７、バチルスｓｐ、　Ｂ
　９−４０又はバチルスｓｐ、Ａ９−１を作用させて光
学活性アミノ酸を生産するには、下記（ａ）乃至（Ｃ）
として例示したいずれかの方法を適用するとよい。

才なわら、（δ）微生物を、ニトリル化合物、例えばプ
し１ビすニトリルを含む培地中で培養して増殖してｉ４
られた菌体を、対応するアルデヒドの存在ト］、二原料
ニトリルを接触させて反応させる方法、（ｔｌ）微生物
を予め培養し、増殖して得られた菌体を二１−リル化合
物、例えばプロピオニトリルに接触させた後、該菌体に
原料ニトリルおよび対応するアルデヒ１を加えて反応さ
せる方法、及び（Ｃ）　ｍ生物を予め量合養し２、増殖
して得られた菌体に原料二ｌ・リル台よびアルデヒドを
直接接触させて反応さ１゛る方法を適用する。これらの
反応方法では、１ｈＪ！。

ノ［物として増殖後の菌体の破砕物、乾燥菌体、あるい
は分離精製されたニトリルの加水分解酵素などの菌体処
理物、あるいは常法に従って固定化した菌体および菌体
処理物を用いることもできる。

■−１記（ａｌ　、＆び［ｂｌの方法で用いるニトリル
化合物としては、プロピオニトリルのほかに、アセトニ
ド！ル、ｎ−ブチロニトリル、ｎ−カプロニトリル、メ
タクリＯＳ　）リル、イソブチロニトリル、ゲルタロニ
トリル、トリアクリロニトリル、クロトノニトリル、ラ
クトニトリル、サクシノニトリル、アクリロニトリル、
ヘンジニトリル及びフェニルアセトニトリル等を例示し
得る。

上記ｆａｒの方法では、ニトリル化合物のほかに７、炭
素源としてグルコース、シュクロース、糖蜜、澱粉加水
分解物のような糖質、もしくは酢酸等のごとき菌体増殖
作用を有する物質を培地に添加し７、更に、塩化アンモ
ニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、硝酸
アンモニウム、尿素、アンモニウム、硝酸ナトリウム、
アミノ酸及びその他の資化性有機窒素化合物のような窒
素源、リン酸カリウム、リン酸ナトリウム、硫酸マグネ
シウム、硫酸マンガン、硫酸第１鉄、塩化第２鉄、塩化
カルシウム、塩化マンガンのごとき無機塩類、及びホウ
素、銅、亜鉛などの塩、すなわち、いわゆる微量元素、
更には必要に応してビタミン類、酵母エキス、コーンス
テープリカーの如き成長促進物質を添加した培地に、上
記各微生物の種菌を接種し、好気的条件下で培養して菌
体を増殖させる。このようにして得られた菌体培養物、
又は該培養物から分離した菌体の懸濁液あるいは菌体処
理物に、原料ニトリルおよびアルデヒドを供給して反応
させる。

反応は、ｐＨ５〜１２、好ましくはｐＨ８〜１２の範囲
で１〜６日間行う。反応には種々の緩衝液を用い得るが
、アンモニア系の緩衝液がよく、アンモニア水と塩化ア
ンモニウム水溶液の混合物、アンモニア水と硫酸アンモ
ニウム水溶液との混合物、アンモニア水と酢酸アンモニ
ウム水溶液との混合物、アンモニア水と燐酸アンモニウ
ム水溶液との混合物等が好ましい。また、ｐｌ＋調節用
のアルカリとしてはアンモニア水を用いることが好まし
い。

なお、原料ニトリルの加水分解をアルデヒドの存在下で
行う場合には、原料ニトリルに対するアルデヒドの添加
割合は原料二Ｉ・ツル１モルに対し、アルデヒド０．１
モル〜１０モルを適用し得るが、０．５モル〜３モルを
用いることが好ましい。反応温度は２０〜７０℃の範囲
が好ましく、また、反応中に菌体増殖に用いた上記炭素
源、窒素源、その他の成分を適宜添加して菌体濃度や菌
体のニトリル加水分解能を維持し、かつ高めることがで
きるやまた、原料ニトリルおよびアルデヒドの供給方法
としては、反応の開始時に添加する方法、間けつ的に添
加する方法、連続的に添加する方法のいずれも用い得る
。

上記反応により生成した光学活性アミノ酸は、相分離、
濾過、抽出、カラムクロマトグラフィー等の公知の手段
を適用して分離、採取する。

次に、前記山）の方法では、上記Ｃａ）の方法における
菌体の培養増殖時にニトリル化合物を加えずに、菌体の
増殖後にニトリル化合物を加えて該菌体微生物のニトリ
ル加水分解能を活性化した後、原料ニトリルにおよびア
ルデヒドを加えて反応させて光学活性アミノ酸を生産さ
−Ｕる。

また、前記（Ｃ１の方法は、上記（ｂｌの方法における
菌体の増殖後に直ちに原料ニトリルおよびアルデヒドを
加えて反応させて光学活性アミノ酸を生産させるもので
ある。

なお、上記（ｂ）及び（Ｃ）のいずれの方法においても
、培４条件、反応条件及び生成した光学活性アミノ酸の
分離、採取には、前記ｆａｔの方法におけるものを適用
し得る。

ト述のごとくして本発明に従って得られる光学活性アミ
ノ酸は、食品、飼料、医薬及び化粧品等の種々の分野に
おいて利用される。

以下実施例により本発明を具体的に説明する。

実施例１ ■培地の調製 ブ・イヨン（Ｎｕｔｒｉｅｎｔ　Ｂｒｏｔｈ　（ＯＸＯ
［Ｄ））　２５ｇとグルコース１０．をイオン交換水９
００−に加えて攪拌し、これをＡ液とする。、Ａ液を坂
ロフラスコに９０−ずつ加え、１２０℃で２０分間オー
トクレーブで殺菌する。ＮａＣ０１１２Ｈｚ０２７ｇを
イオン交換水１００ｍ　Ｉ！に加え、１２０℃で２０分
間オー　トクレープで殺菌し、これをＢｉとする。クリ
ーンベンチ中で坂ロフラスコにＢ液を１０−ずつ加え、
これを培地とする。

■菌体の培養増殖 上記培地に下記の２種の菌株の３白金耳をそれぞれ摂取
し、３０℃の温度に、１４０ｒ門で４８時間振とう培養
を行った。

使用菌株： 菌巷−各　　　　　　　　　Ｆ　Ｅ　ＲＭ−Ｒ））胤ノ
カルディオプシスＡ　１０−１２　　　　２４２２（Ｎ
ｏｃａｒｄｉｏｐｓｉｓ　ｓｐ、）ノカルディオプシス
Ｂ　９−４７　　　　２４２３＜Ｎｏｃａｒｄｉｏｐｓ
ｉｓ　ｓｐ、）上記培養により得られた菌糸を遠心分離
で分離し、ＮＨａＣｌ−ＮＨｌの０．１Ｍ緩衝液（ｐ）
Ｉ　１０）で２回洗浄後、光学的濃度（ＯＤ）がｉｏｃ
、＝なるよう？：Ｎｌ１４ＣＩ−Ｎ）１３の０．１Ｍ纒
衝液に再懸濁した。

■反応 −Ｅ述のようにして得られる各菌体懸？Ｂ　液５　ｍρ
を、φ２４１Ｉｌｌｌｌの試験管に収容し２、これにＤ
Ｉ−２７ミノ３−メチルブタンニトリル５０μｐを加え
て密栓し、３０℃の温度に、３００ｒｐｍで４８時間振
とう培養を行った。

反応終了後、反応液をエーテル５ｍ（！を用いて２１１
ｉ′Ｉ抽出し２、得られた水相を高速液体クロマトグラ
フ・イーで分析した。

生成した１、−バリンの定ｌはカラム充填剤としてＡｓ
ａｈｉｐａｋイナートシル０ＤＳ（旭化成社製）を用い
て行い、その絶対配置と光学純度の決定には同し；　＜
　ＣＩＩＩＲＡｌ、Ｐ且Ｗｌｌ　（ダイセル化学工業社
製）を用いて行った。結果は表２に示すとおりである。

表　　２ 実施例２ 実施例１に記載した方法で調製した懸濁液５−をφ２４
ｍｍの試験管に収容し、これにＤＬ−２−アミノ−４−
メチルペンタンニトリル５０μｐを加えて密栓し、３０
℃の温度に、３００ｒｐｍで４８時時間上う培養を行っ
た。

反応終了後、反応液をエーテル５１Ｒ１を用いて２回抽
出し、得られた水相を高速液体クロマトグラフィーで分
析した。

生成したＬ−ロイシンの定量はカラム充填剤としてＡｓ
ａｈ　１ｐａｋイナートシルＯＤＳ　（旭化成社製）を
用いて行い、その絶対配置と光学純度の決定には同じく
Ｃ旧ＲＡＬＰＡＫ　ＷＥ　（ダイセル化学工業社製）を
用いて行った。結果は表３に示すとおりである。

表３ 実施例３ 実施例１に記載した方法で調製した菌懸濁液５ＩＩＩを
φ２４ｍｍの試験管に収容し、これにＤＬ−２−アミ八
メチルペンタンニトリル５０μｌを加えて密栓し、３０
℃の温度に、３００ｒｐｍで４８時時間上う培養を行っ
た。

反応終了後、反応液をエーテル５−を用いて２回抽出し
、得られた水相を高速液体クロマトグラフィーで分析し
た。

生成したＩ、−ノルバリンの定量はカラム充填剤として
Ａｓａｈｉｐａｋイナートシル００５　（旭化成社製）
を用いて行い、その絶対配置と光学純度の決定には同し
く　　ＣＩＩＲＡＬｆ’Ａに畦（ダイセル化学工業社製
）を用いて行った。結果は表４に示すとおりである。

表 実施例４ 実施例１に記載した方法で調製したｒａ懸濁液５Ｈ１を
φ２４層−の試験管に収容し、これにＤＩ、２アミノ−
４−ヘキサンニトリル５０ｐ（！を加えて密栓し、３０
℃の温度に、３００ｒｐｍで４８時時間上う培養を行っ
た。

反応終了後、反応液をエーテル５−を用いて２回抽出し
、得られた水相を高速液体クロマトグラフィーで分析し
た。

生成したＬ−ノルロイシンの定量はカラム充填剤として
へ５ａｈｉｐａｋイナー　トシルＯＤＳ　（旭化成社製
）を用いて行い、その絶対配置と光学純度の決定には同
しく　ＣＩＩＩＲＡＩＰＡＫすＥ　（ダイセル化学工業
社製）を用いて行った。

結果は表５に示すとおり である。

表 Ｘ施−外回 実施例１に記載した方法で調製した菌懸濁液５　ｍｅを
φ２４Ｉｌ＋Ｉｌノ試験管に収容し、これにＤＬ−２了
ミノ−３−メチルブタンニトリル５０μｐおよびイソブ
チルアルデヒド６０μｌを加えて密栓し、３０℃の温度
己こ、３００ｒｐ＋ｎで４８時間振とう培養を行った。

反応終了後、反応液をエーテル５１１ｄを用いて２回抽
出し７、得られた水相を高速液体クロマトグラフィーで
分析した。

生成したＩ、−バリンの定量はカラム充填剤としてＡｓ
ａｈｉｐａｋイナートシル０ＤＳ（旭化成社製）を用い
て行い、その絶対配置と光学純度の決定には同じ＜　Ｃ
）ＩＩｌ？ＡＬＰＡＫ　Ｗｌ（（ダイセル化学工業社製
）を用いて行った。結果は表６に示すとおりである。

表６ 叉遣−例−多− 実施例１に記載した方法で調製した閏懸濁液５−をφ２
４ｍｍの試験管に収容し、これにＤ　Ｉ−、、−２アミ
ノ−４−メチルペンタンニトリル５０μρおよびイソバ
レルアルデヒド６０μａを加えて密栓し、３０℃の温度
に、３００ｒｐｍで４８時間振とう培養を行った。

反応終了後、反応液をエーテル５−を用いて２回抽出し
、得られた水相を高速液体クロマトグラフィーで分析し
た。

生成１．たＩ、−ロイシンの定量はカラム充填剤として
ＡｓａｈｉｐａｋイナートシルＯＤＳ　（旭化成社製）
を用いて行い、その絶対配置と光学純度の決定には同じ
＜　ＣＩ＋　Ｉ　ＲＡ　Ｌ　Ｐ　Ａ　Ｋ畦（ダイセル化
学工業社製）を用いて行った。結果は表７に示すとおり
である。

表７ 犬−１例−Ｌ 実施例１に記載した方法で調製した菌懸濁液５ｄをφ２
４ｍｍの試験管に収容し、これにＤＬ−２アミノペンタ
ンニトリル５０μρおよびローブチルアルデヒド６０１
Ｊ（！を加える以外は実施例１に記載した方法で反応を
行った。

反応終了後、反応液をエーテル５−を用いて２回抽出し
、得られた水相を高速液体クロマトグラフィーで分析し
た。

生成したＬ−ノルバリンの定量はカラム充填Ｗ１として
ＡｓａｈｉｐａｋイナートシルＯＤＳ　＜旭化成社製）
を用いて行い、その絶対配置と光学純度の決定には同じ
＜　ＣＩＩＩＲＡＬＰＡＫ　ＷＥ　（ダイセル化学工業
社製）を用いて行った。結果は表８に示す。

表”８ 実施例８ 実施例１に記載した方法で調製した菌懸濁液５　ｍｅを
φ２４ｍｍの試験管Ｑこ収容し、これＧこＤＩ、−２ア
−ミノヘキサニ／ニトリル ラ〜゛ヒ１−６０μｅを加える以外は実施例１に記載し
た方法で反応を行った。

反応終了後、反応液をエーテル５−を用いて２回抽出し
７、得られた水相を高速液体クロマ［・グラ″７　イ　
＝で分冬斤し５た。

生成した１，−ノルロイシンの定量はカラム充填１’ｆ
ｌｌとしてＡｓａｈｉｐａｋイナートシル００Ｓ（旭化
成社製）を用いて行い、その絶対配置と光学純度の決定
には同ｆ；　＜　　ＣＩＩＩＲＱＬＰ八にＷＥ　（ダイ
セル化学工業社製）を用いて行った。結果は表９に示す
。

表９ 夫侮伊Ｉ一 実施例１に記載した方法で調製１〜た菌懸濁液５　ｍｌ
をφ２４ｍｍの試験管に収容し、これにＤＩ，３メチル
−２−　（Ｎ−２−メチルプロピリデン）アミノペンタ
ンニトリル５０μｌを加えて密栓し、３０℃の温度に、
３００ｒｐｍで４８時間振とう培篠を行った。

反応終了後、反応液をエーテル５　ｍｌ．を用いて２回
抽出し、得られた水相を高速液体クロマ［・グラフィー
で分析した。

生成したし一バリンの定量はカラム充填剤としてＡｓａ
ｈｉｐａｋイナートシルＯＯＳ　＜旭化成社製）を用い
て行い、その絶対配置と光学純度の決定には同じ＜　Ｃ
ＩＩＩＲＡＬＰＡＫ　Ｗｌ＋　（ダイセル化学工業社製
）を用いて行った。結果は表１０に示すとおりである。

表 実施例１０ だ施例１に記載した方法で調製した菌懸濁液５　ｍｌ！
に、４−メ千月へ２−（Ｎ−３−メチルブチリデンアミ
ノ）ペンタンニトリル５０ｔｔｌを加える以外は実施例
０に記載した方法で反応を行った。

Ｎ応終了後、反応液をエーテル５−を用いて２回抽出し
、得られた水相を高速液体クロマｌ−グラフィ　で分析
した。

牛成し７た［、−ロイシンの定量はカラム充填剤と１）
でＡｓ，１ｈｉｐａｋ　　イナートシルＯＤＳ　（旭化
成社製）を用いて行い、その絶対配置と光学純度の決定
には同しく　　ＣＩｌｌｌｌ＾ＬＰＡＫ　ＷＥ　（ダイ
セル化学工業社製）を用いて行った。

結果は表１ １に示すとおりであ る。

表 実施例１に記載した方法で調製した菌懸濁液５１ｔ！．
に、２−（Ｎ−ブチリデンアミノ）ペンタンニトリル５
０μβを加える単列は実施例１に記載した方法で反応を
行った。

反応終了後、反応液をエーテル５ｄを用いて２回抽出し
、得られた水相を高速液体クロマトグラフィーで分析し
た。

生成したし一ノルバリンの定量はカラム充填剤としてＡ
ｓａｈｉｐａｋイナートシルＯＤＳ　（旭化成社製）を
用いて行い、その絶対配置と光学純度の決定には同じ（
ＣＩＩＲＡＬＰＡＫ　ＷＥ　（ダイセル化学工業社製）
を用いて行った。その結果を表１２に示す。

表１２ 実施例１に記載した方法で調製した菌懸濁液５　ｍｌに
、２−（Ｎ−ペンチリデンアミノ）ペンタンニトリル５
０μｅを加える以外は実施例１に記載した方法で反応を
行った。

反応終了後、反応液をエーテル５−を用いて２回抽出し
、得られた水相を高速液体クロマトグラフィーで分析し
た。

なお、Ｌ−ノルロイシンの定量はカラム充填剤としてＡ
ｓａｈｉｐａｋイナートシルＯＤＳ　（旭化成社製）を
用いて行い、その絶対配置と光学純度の決定には同じ＜
　ＣＩＩＩＲＡＬＰＡＫ　ＷＥ　（ダイセル化学工業社
製）を用いて行った。その結果を表１３に示す。

表１３ 実施例１３ ■　培地の調製 ブイヨン（Ｎｕｔｒｉｅｎｔ　Ｂｒｏｔｈ　（ＯＸＯＩ
Ｄ）　）　２５ｇとグルコース１０ｇをイオン交換水９
００−に加えて撹拌し、これをＡ液とする。　Ａ液を坂
ロフラスコに９゜ｍｌスつ加え、１２０°Ｃで２０分間
オートクレーブで殺菌するる。ＮａｚＣＯｘ　’　１２
Ｈ２０２７ｇをイオン交換水１００成に加え、　１２０
”Ｃで２０分間オートクレーブで殺菌し、これをＢＦｉ
とする。クリーンベンチ中で坂ロフラスコに８液を１０
　ｍｌｌずつ加え、これを培地とする。

■　培地の培養増殖 上記培地に下記の２種の菌株の３白金耳をそれぞれ採取
し、３０°Ｃの温度に、１４０ｒｐｍで４８時間振とう
培養を行った。

使用菌株； 菌株名　　　　　　　　　　ＦＥＲＭ−Ｐ　ｋバチルス
Ｂ９−４０（Ｂａｒ：１ＬＬｕｓ　ｓｐ、）　　　Ｐ−
１１４７８バチルスＡ９−１　（Ｂａｃ４Ｌｌｕｓ　ｓ
ｐ、）　　　Ｐ−１１４７７上記培養により得られた菌
糸を遠心分離で分離し、ＮＨ４Ｃ１−ＮＨｊのＯ，１Ｍ
緩衝液（ｐＨｌｏ）で２回洗浄後、光学的濃度（ＯＤ）
が１０となるように、ＮＨ，Ｃ１−ＮＨ３の０．１門緩
街液に再懸濁した。

■反応 上述のようにして得られる各菌体懸濁液５　ｍｆｌを、
φ２４ｍｍの試験管に収容し、これにＤＬ−２−アミノ
−４−メチルペンタンニトリル５０μｌを加えて密栓し
、３０°Ｃの加温に、３００ｒｐｍで４８時間振とう培
養を行った。

反応終了後、反応液をエーテル５　ｍｌを用いて２回抽
出し、得られた水相を高速液体クロマトグラフィーで分
析した。

生成したし一ロイシンの定量はカラム充填剤としてＡｓ
ａｈｉｐａｋ　　イナートシルＯＤＳ　（旭化成社製）
を用いて行い、その絶対配置と光学純度の決定には同じ
＜ＣＨＩＲＡＬＰＡＫ　ＷＥ　（ダイセル化学工業社製
）を用いて行った。結果は表１４に示すとおりである。

表１４ 実施例１４ 実施例１３に記載した方法で調製した懸濁液５ｄをφ２
４ｍｎ１の試験管に収容し、これにＤＬ−２−アミツメ
千ルベンクンニトリル５０μＰを加えて密栓し、３０°
Ｃの温度に、３００ｒｐｓ＋で４８時間振とう培養を行
った。

反応終了後、反応液をエーテル５！Ｉ１．を用いて２回
抽出し、得られた水相を高速液体クロマトグラフィーで
分析し、た。

生成したＩ、−ノルバリンの定量はカラム充填剤として
Ａｓａｈｉｐａｋ　　イナートシルＯＤＳ　（旭化成社
製）を用いて行い、その絶対配置と光学純度の決定には
同じ＜　Ｃ）ＩＩＲＡＬＰＡＭ　ＷＥ　（ダイセル化学
工業社製）を用いて行った。

結果は表１５に示すとおりであるや 表１５ 実施例１５ 実施例１３に記載した方法で調製した菌体懸濁液５ｄを
φ２４ｍの試験管に収容し、これにＤＬ−２−アミノ−
４−ヘキサンニトリル５０μｌを加えて密栓し、３０゛
Ｃの温度に、３００ｒｐｍで４８時間振とう培養を行っ
た。

反応終了後、反応液をエーテル５ｄを用いて２回抽出し
、得られた水相を高速液体クロマトグラフィーで分析し
た。

生成したし一ノルロイシンの定量はカラム充填剤として
八５３ｂｉｐａｋ　　イナートシルＯＤＳ　（旭化成社
製）を用いて行い、その絶対配置と光学純度の決定には
同じ＜　ＣＨＩＲＡＬＰＡＫ　ＷＥ　（ダイセル化学工
業社製）を用いて行った。結果は表１６に示すとおりで
ある。

表１６ 実施例１６ 実施例１３に記載した方法で調製した閑懸濁液５ｍｌを
φ２４ｍの試験管に収容し、これにＤＬ−２−アミノ−
４−メチルペンタンニトリル５０μｌおよびイソバレル
アルデヒド６０μｐを加えて密栓し、３０°Ｃの温度に
、３００ｒｐｍで４８時間振とう培養を行った。

反応終了後、反応液をエーテル５Ｉｌｄ１．を用いて２
回抽出し、得られた水相を高速液体クロマトグラフィー
で分析した。

生成したし一ロイシンの定量はカラム充填剤としてＡＳ
ａｈｉｌ）ａｋ　　イナートシル００５　（旭化成社製
）を用いて行い、その絶対配置と光学純度の決定には同
じ＜　ＣＨＩＲＡＬＰＡＫ　ＷＥ　（ダイセル化学工業
社製）を用いて行った。結果は表１７に示すとおりであ
る。

実施例１７ 実施例１３に記載した方法で調製した菌体懸濁液５ｄを
４２４ｍｍの試験管に収容し、これにＤＬ−２−アミノ
ペンタンニトリル５０μＰおよびｎ−ブチルアルデヒド
６０ＩＰを加える以外は実施例１３に記載した方法で反
応を行った。

反応終了後、反応液をエーテル５ｄを用いて２回抽出し
、得られた水相を高速液体クロマトグラフィーで分析し
た。

生成した１、−ノルバリンの定量はカラム充填剤として
飴、１ｈｉｐａｋ　　イナートシルＯＤＳ　（旭化成社
製）を用いて行い、その絶対配置と光学純度の決定には
同し；　＜　ＣＩＩＩＲＡｌ、ＰＡＫ畦（ダイセル化学
工業社製）を用いて行った。結果は表１８に示す。

表１８ 実施例１８ 実施例１３に記載１〜た方法で調製した菌体懸濁液５　
ｄをφ２４ｍｍの試験管に収容し、これにＤＬ−２アミ
ノヘキサンニトリル５０μｌおよびバレルアルデヒド６
０μｒを加える以外は実施例１３に記載した方法で反応
を行った。

反応終了後、反応液をエーテル５ａｌ！を用いて２回抽
出し７、得られた水相を高速液体クロマトグラフィーで
分析した。

生成したし一ノル１′：ｌイシンの定量はカラム充ｔａ
　剤としてＡｓａｂｉｐａｋ　　イナートシルＯＤＳ　
（旭化成社製）を用いて行い、その絶対配置と光学純度
の決定には同じくＣ旧ＲＡＬＰＡＫ　ＷＥ　（ダイセル
化学工業社製）を用いて行った。結果は表１９に示す。

表１９ 実施例１９ 実施例１３に記載した方法で調製した菌懸濁液５ｍ１を
φ２４卿の試験管に収容し、これに４−メチル−２（Ｎ
−３−メチルブチリデンアミノ）ペンタンニトリル５０
ｕｉを加える以外は実施例１３に記載した方法で反応を
行った。

反応終了後、反応液をエーテル５ｄを用いて２回抽出し
、得られた水相を高速液体クロマトグラフィーで分析し
た。

生成し７た１、−ロイシンの定量はカラム充填剤として
Ａｓａｈｉｐａｋ　　イナートシル００５　（旭化成社
製）を用いて行い、その絶対配置と光学純度の決定には
同じ＜　ＣＩＩＩＩ？ＡＬＰＡＸ　ＷＥ　（ダイセル化
学工業社型）を用いて行った。結果は表２０に示すとお
りである。

表２０ 実施例２０ 実施例１３に記載した方法で調製した閑懸濁液５杼に、
２−（Ｎ−ブチリデンアミノ）ペンタンニトリル５０／
Ｉｐを加える単列は実施例１３に記載した方法で反応を
行った。

反応終了後、反応液をエーテル５−を用いて２回抽出し
、得られた水相を高速液体クロマトグラフィーで分析し
た。

生成したＩ５−ノルバリンの定量はカラム充填剤として
Ａｓａｈｉｐａｋ　　イナートシル０ＤＳ（旭化成社製
）を用いて行い、その絶対配置と光学純度の決定には同
じくＣ旧ＦｊＡＬＰＡＫ　ＷＥ　（ダイセル化学工業社
型）を用いて行った。その結果を表２１に示す。

表２１ 実施例２１ 実施例１３に記載した方法で調製した菌体懸濁液５ｍＩ
に、２−（Ｎ−ペンチリデンアミノ）ペンタンニトリル
５０μＰを加える以外は実施例１３に記ｉｙｂた方法で
反応を行った。

反応終了後、反応液をエーテル５ｍρを用いて２回抽出
し、得られた水相を高速液体クロマＦ・グラフィーで分
析した。

なお、し−ロイシンの定量はカラム充填剤としてＡｓａ
ｂｉｐａｋ　　イナートシルＯＤＳ　（旭化成社製）を
用いて行い、その絶対配置と光学純度の決定には同（、
；＜　ＣＩＩＩＲＡＬＰＡＫ　ＷＥ　（ダイセル化学工
業社製）を用いて行った。その結果を表２２に示す。

表２２ 以上述べたとおり、本発明によると、微生物をｆｌｌ用
してＤＩ−α−アミノニトリル化合物から直接光学活性
アミノ酸類を選択的に製造しうるので、上記種々の分野
において利用される光学活性アミノ酸類の製造上有益で
ある。

手続補正書 （方式） ％式％ 事件の表示 平成２年特許願第１５５６６１、 発明の名称 光学活性アミノ酸類の製造方法 補正をする者 事件との関係

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）下記に示す一般式（ I ）乃至（IV）で表わされ
   る１種又は２種以上のニトリル化合物に、ノカルディオ
   プシス属又はバチルス属に属するニトリル加水分解能を
   有する微生物を作用させて光学活性アミノ酸類を産生す
   ることを特徴とする光学活性アミノ酸類の製造方法、 ▲数式、化学式、表等があります▼（ I ） ▲数式、化学式、表等があります▼（II） （ただし、式（ I ）および（II）中Ｒはアルキル基、
   置換アルキル基、フェニル基、置換フェニル基、イミダ
   ゾリル基、置換イミダゾリル基、インドリル基、置換イ
   ンドリル基、フリル基、置換フリル基、ピリジル基、置
   換ピリジル基、チアゾリル基、置換チアゾリル基を示す
   ） ▲数式、化学式、表等があります▼（III） ▲数式、化学式、表等があります▼（IV） （ただし、式（III）および（IV）中Ｒ＿１及びＲ＿２
   はアルキル基、置換アルキル基、フェニル基、置換フェ
   ニル基、イミダゾリル基、置換イミダゾリル基、インド
   リル基、置換インドリル基、フリル基、置換フリル基、
   ピリジル基、置換ピリジル基、チアゾリル基、置換チア
   ゾリル基を示し、Ｒ＿１及びＲ＿２はそれぞれ同じ基で
   も、異なる基でもよい）。
2. （２）下記一般式（ I ）又は（II） ▲数式、化学式、表等があります▼（ I ） ▲数式、化学式、表等があります▼（II） ただし、式（ I ）および（II）中Ｒはアルキル基、置
   換アルキル基、フェニル基、置換フェニル基、イミダゾ
   リル基、置換イミダゾリル基、インドリル基、置換イン
   ドリル基、フリル基、置換フリル基、ピリジル基、置換
   ピリジル基、チアゾリル蟇、置換チアゾリル基を示す）
   で表わされる１種又は２種以上のα−アミノニトリル化
   合物に 下記一般式（Ｖ） ▲数式、化学式、表等があります▼（Ｖ） または、下記一般式（VI） ▲数式、化学式、表等があります▼（VI） （ただし、式中Ｒは上記一般式（ I ）又は（II）と同
   じ）で表わされる対応するアルデヒドの存在下に、ノカ
   ルディオプシス属又はバチルス属に属するニトリル加水
   分解能を有する微生物を作用させて光学活性アミノ酸類
   を産生することを特徴とする光学活性アミノ酸類の製造
   方法。