JPH11506764A

JPH11506764A - 非凝集エリスロポエチン徐放性組成物

Info

Publication number: JPH11506764A
Application number: JP9501068A
Authority: JP
Inventors: イー．ゼイル，スティーヴン; エイ．バーク，ポール; バーンスタイン，ハワード; ブリックナー，アブラム
Original assignee: アルカームズコントロールドセラピューティックス，インコーポレイテッド
Priority date: 1995-06-07
Filing date: 1996-06-03
Publication date: 1999-06-15
Also published as: EP0871433A2; AU5972496A; AU705451B2; WO1996040073A2; CZ390897A3; CN1187134A; NZ309533A; WO1996040073A3; CN1177612C; MX9709699A; CA2223834A1; PL323736A1; US5716644A

Abstract

(57)【要約】生理活性非凝集エリスロポエチン（ＥＰＯ）の徐放性放出のための組成物ならびに該組成物の生成方法および使用方法。本発明の徐放性組成物は、生体適合性ポリマーと生理活性凝集安定化ＥＰＯ粒子とのポリマーマトリックスを含み、該粒子は生体適合性ポリマー内に分散されている。生理活性ＥＰＯの徐放性組成物の製造のための本発明の方法は、ポリマー溶媒中に生体適合性ポリマーを溶解させてポリマー溶液を生成させ、該ポリマー溶液に生理活性凝集安定化ＥＰＯ粒子を分散させ、次いで、ポリマーを固化させて該ＥＰＯ粒子の分散物を含有するポリマーマトリックスを生成させる。本発明の組成物の使用方法は、ある持続期間、患者に生理活性非凝集エリスロポエチンの治療上有効な血中レベルを提供する方法である。本方法において、患者は、本発明の徐放性組成物の有効用量が投与される。

Description

【発明の詳細な説明】非凝集エリスロポエチン徐放性組成物発明の背景エリスロポエチン（ＥＰＯ）は糖タンパク質の１種で、尿から単離したり組み替え遺伝子技術によって製造することができ、レシピエント体内の赤血球数を増大させる目的で造血薬として使用される。赤血球が正常に産生されるためには、腎臓によるＥＰＯの分泌が必要である。ＥＰＯは骨髄中の受容幹細胞群の増殖と分化を引き起こし、成熟段階の赤血球系細胞におけるヘモグロビン合成を刺激し、骨髄から循環への赤血球放出を促進することで、赤血球量を増大させる。ＥＰＯは通常、貧血とくに腎不全に伴う貧血を有する患者の治療に使用される。現在では、ＥＰＯ水溶液を皮下または静脈内ボーラス注射剤として１週あたり３回の頻度で患者に投与し、適正な血清中ＥＰＯ値を維持する。ＥＰＯの長期投与を受けている患者の場合、このような頻回の注射を行なうと血清中ＥＰＯ値が大幅に変動するとともに、患者のコンプライアンスの問題も生じる。ＥＰＯ水溶液の反復注射に伴う問題を解決するために、ポリマーおよび／またはタンパク質にカプセル化したボーラス注射より高用量のＥＰＯを含む制御放出装置であってＥＰＯが約１週間以上の期間にわたりイン・ビボで放出される装置を処方するための試みがなされている。しかしながら、これらの制御放出装置はＥＰＯ放出の初期バーストが大きく、その後のＥＰＯ放出がほとんどなくなるのが普通であった。さらに、これらの制御放出装置内のＥＰＯ濃度が高いため、数日後にＥＰＯ分子（モノマー）が凝集し、ＥＰＯモノマーとは異なってイン・ビボで免疫原性を示す凝集ＥＰＯを形成する傾向があった。そこで、ＥＰＯの放出期間中に免疫系応答を引き起こさないでイン・ビボの生理活性ＥＰＯ放出を維持する手段が求められている。発明の概要本発明は、非凝集生理活性エリスロポエチン（ＥＰＯ）の徐放性組成物ならびに該組成物の生成および使用方法に関する。本発明の徐放性組成物は、生体適合性ポリマーのポリマーマトリックスおよびその生体適合性ポリマーに分散させた生理活性凝集安定化ＥＰＯ粒子から成る。本発明の非凝集ＥＰＯ徐放用組成物の生成方法は、生体適合性ポリマーをポリマー溶媒に溶解させてポリマー溶液を生成させ、そのポリマー溶液に生理活性凝集安定化ＥＰＯ粒子を分散させ、次いで、そのポリマーを固化させて該ＥＰＯの分散物を含むポリマーマトリックスを生成させる工程を含む。このＥＰＯ徐放処方の利点としては、イン・ビボ血中ＥＰＯ値がより長期的かつより安定的に持続すること、ＥＰＯの初期バーストがより低減されること、および血清中ＥＰＯ値の変動が排除されることで治療効果が向上することなどが挙げられる。必要注射回数が減ることで、患者のコンプライアンスと受け入れが向上するという利点もある。さらに別の利点としては、血清中ＥＰＯ値が治療閾値により近い水準に維持されることによって、ボーラス注射方式よりもＥＰＯの使用量を減らすことができることなどが挙げられる。図面の簡単な説明図１は、ａ）モノマーＥＰＯの累積放出、ｂ）ＥＰＯ（モノマーＥＰＯプラス凝集ＥＰＯ）の累積放出、およびｃ）所定の時点からその直前の時点までに１０％（ｗ／ｗ）のＭｇＣＯ₃および５％（ｗ／ｗ）の実施例１のＡｍｌ処方を含む非ブロックポリ（ラクチド−コ−グリコリド）ポリマー（ＰＬＧＡ）（分子量１０，０００ダルトン）の微小球からイン・ビトロでＨＥＰＥＳ緩衝液中のモノマーとして放出されるＥＰＯの百分率の２８日間の経時変化をプロットした図である。図２は、ａ）モノマーＥＰＯの累積放出、ｂ）ＥＰＯ（モノマーまたは凝集体）の累積放出、およびｃ）１０％（ｗ／ｗ）のＭｇＣＯ₃および５％（ｗ／ｗ）の実施例１のＡｍ７処方を含む非ブロックＰＬＧＡ（分子量１０，０００ダルトン）の微小球からイン・ビトロでＨＥＰＥＳ緩衝液中のモノマーとして放出されるＥＰＯの百分率の２８日間の経時変化をプロットした図である。図３は、ａ）モノマーＥＰＯの累積放出、ｂ）ＥＰＯ（モノマーまたは凝集物）の累積放出、およびｃ）１０％（ｗ／ｗ）のＺｎＣＯ₃および１０％（ｗ／ｗ）の実施例１のＺｎ１処方を含むブロックＰＬＧＡ（分子量１０，０００ダルトン）の微小球からイン・ビトロでＨＥＰＥＳ緩衝液中のモノマーとして放出されるＥＰＯの百分率の２８日間の経時変化をプロットした図である。図４は、０日目に１０，０００単位の実施例５で説明するＥＰＯ徐放性微小球ＲＭＡｍ７の皮下注射を受け、２８日目に２，０００単位のＥＰＯ水溶液のボーラス注射投与を受けたＣＳ／ＨＣ処理および非処理ラットの血液中の網状赤血球の百分率の３６日間の経時変化をプロットした図である。図５は、実施例３で説明する様々なＥＰＯ徐放性微小球の皮下注射を受けたラットの血清中ＥＰＯ濃度（ＩＵ／ｍｌ）の２２日間の経時変化をプロットした図である。図６は、実施例３で説明する様々なＥＰＯ徐放性微小球１０，０００単位の皮下注射を受けたラットの血液中網状赤血球百分率の２８日間の経時変化をプロットした図である。図７は、ａ）１０，０００ダルトン、ｂ）３１，０００ダルトン、またはｃ）４８，０００ダルトンの分子量を有する非ブロックＰＬＧＡポリマー中に実施例１のＡＭ７処方を含む実施例２の微小球１０，０００単位の皮下注射を受けたラットの血清中ＥＰＯ濃度（ＩＵ／ｍｌ）の２８日間の経時変化をプロットした図である。発明の詳細な説明本明細書で定義するエリスロポエチン（ＥＰＯ）は、ＥＰＯ−αやＥＰＯ−β などあらゆる型のＥＰＯを含む。ＥＰＯは動物源から得ることもできるし、米国特許第４，７０３，００８号明細書に記載のように、組み替え技術により製造することもできる。本発明において使用するＥＰＯは、分子（モノマーまたは非凝集）態の生理活性ＥＰＯである。モノマーＥＰＯは免疫原性を示さないのが普通である。凝集するＥＰＯ分子は赤血球産生を刺激する生理活性を示さないことがある。さらに、凝集ＥＰＯは、抗ＥＰＯ抗体を生じる免疫応答を誘導することがある。これが長期ＥＰＯ療法の有効性を低下させることがある。また、凝集ＥＰＯは内因性ＥＰＯに対する自己免疫応答を刺激することがある。生理活性非凝集エリスロポエチンの徐放とは、ＥＰＯ水溶液の直接投与後に得られるものよりも長期にわたり測定可能な血清中生理活性モノマーＥＰＯ値をもたらす放出をいう。徐放は約１週間以上の期間にわたるＥＰＯの放出であることが好ましく、約２週間以上の期間にわたるものがさらに好ましい。生理活性非凝集ＥＰＯのポリマーマトリックスからの徐放は連続的であっても不連続的であってもよく、放出速度は比較的一定であってもよいし、変化してもよい。放出されるＥＰＯの連続性および放出されるＥＰＯのレベルは、１種類以上のポリマー組成物、ＥＰＯ負荷率、および／または目的の効果を得るために選ばれる添加剤をとくに使用することによって確立することができる。本明細書で定義する凝集安定化エリスロポエチンは、少なくとも１つの抗凝集剤によって凝集安定化させた生理活性モノマーＥＰＯから成るものである。１つの態様においては、抗凝集剤として適当な物質の種類または物質の組み合わせとしては、ＰＢＳ、ＨＥＰＥＳ、または体液（たとえばリンパ）などの水性液体中のＥＰＯの溶解度を低下させることで、有意なＥＰＯ分子凝集が起きる濃度を下回る局所ＥＰＯ濃度を維持する物質などが挙げられる。本明細書で定義する局所ＥＰＯ濃度とは、徐放性微小球または装置の内部、間隙、または隣接部における溶媒和（solvated）ＥＰＯ濃度をいう。別の態様においては、適当な抗凝集剤としては、何らかの理由によりＥＰＯモノマーの有意な凝集を防止する炭水化物などが挙げられる。有意な凝集とは、カプセル化ＥＰＯモノマーの初期量の約１０％以上を凝集させる凝集量をいう。凝集は、ＥＰＯモノマーの初期量の約５％未満に保つのが好ましい。凝集は、初期量の約２％未満に保つのがさらに好ましい。本発明の徐放性組成物で見られる凝集度に関する詳細な説明を実施例３および４に示した。１つの態様においては、水溶液からＥＰＯを沈殿させることによって抗凝集剤がＥＰＯ溶解度を低下させることで、適度に低い局所ＥＰＯ濃度を維持する。タンパク質を変性させないでタンパク質を沈殿させるのに適した物質としては、トーマス・イー・クライトン（Thomas E．Creighton）著Proteins: Structures an d Molecular Principles，p．149-150 （W.H．Freeman and Company，New York 発行）に記載されているようなホッフマイスター系血清グロブリン沈殿剤に属する塩（「塩析塩」）などが挙げられる。本発明における使用に適した塩析塩としては、たとえばＭｇ⁺²、Ｌｉ⁺、Ｎａ⁺、Ｋ⁺、およびＮＨ⁴⁺から選ばれる１種類以上のカチオンを含むとともにＳＯ₄ ^-2、ＨＰＯ₄ ^-2、酢酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、Ｃｌ^-、ＮＯ₃ ^-、ＣｌＯ₃ ^-、Ｉ^-、ＣｌＯ₄ ^-およびＳＣＮ^-から選ばれる１種類以上のアニオンを含む塩なども挙げられる。別の態様においては、抗凝集剤はマンニトールなどの少なくとも１つの炭水化物を含む。凝集に対してＥＰＯを安定化させる抗凝集剤候補の適性を、当該分野に熟練せる者であれば、実施例３に記載のように、徐放性組成物からの放出期間を通じて、該抗凝集剤を含むＥＰＯ粒子から得たタンパク質に対してＳＥＣ、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）、および力価試験など様々な安定性判定法を実施することによって判定することができる。生理活性凝集安定化エリスロポエチンの粒子として適当なものは、リオフィライズ粒子（lyophilized particles）、凍結乾燥粒子、圧縮ペレットなどの固体粒子、および１つの成分が温度感受性である２成分（たとえばＥＰＯや抗凝集剤）混合物から固体粒子を生成するこれら以外の当該分野において公知の手段によって形成された粒子である。生理活性凝集安定化ＥＰＯをリオフィライズする場合、該ＥＰＯは、リオフィライズ時のｐＨ変化に起因する生理活性の有意喪失を防止する範囲内にｐＨを保つための緩衝剤をも含んでいることが好ましい。適当なｐＨ条件としては通常、約４．０ないし約８．０のｐＨ値が挙げられる。好ましいｐＨ範囲は約５．０ないし約７．０である。適当なｐＨ条件は通常、重炭酸ナトリウムなどの水性緩衝液を使用することで実現される。好ましい緩衝剤の例としては、リン酸塩緩衝液、クエン酸塩緩衝液、およびこれらを組み合わせたものなどが挙げられる。ＥＰＯ粒子は、安定剤や増量剤など上記以外の添加剤を含有することもできる。安定剤は、ＥＰＯ放出期間を通じてＥＰＯの力価を維持する目的で添加される。適当な安定剤としては、たとえば炭水化物、アミノ酸、脂肪酸、および界面活性剤などが挙げられ、当該分野に熟練せるものにとって公知のものである。安定剤の使用量はＥＰＯに対する重量比に基づいている。アミノ酸、脂肪酸、およびシュークロース、マルトース、イヌリン、デキストラン、ヘパリンなどの炭水化物の場合、ＥＰＯに対する炭水化物の質量比は通常約１：１ないし約２０：１である。ツィーン（TWEEN^TM）やプルロニック（PLURONIC^TM）などの界面活性剤の場合、ＥＰＯに対する界面活性剤の質量比は通常約０．０１：１ないし約１：１である。増量剤は通常、不活性物質から成る。適当な増量剤は、当該分野に熟練せるものにとって公知である。本発明の徐放性組成物のポリマーマトリックスの形成に適したポリマーは、生分解性または非生分解性ポリマーまたはそれらの混和物またはコポリマーのいずれかであってもよい生体適合性ポリマーである。本明細書で定義する生分解性とは、組成物がイン・ビボで分解または侵食されてより小型の化学種を生成することをいう。分解はたとえば酵素的、化学的、および物理的プロセスによって起こりうる。適当な生体適合性生分解性ポリマーとしては、たとえばポリ（ラクチド）、ポリ（グリコリド）、ポリ（ラクチド−コ −グリコリド）、ポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）、ポリ（乳酸−コ−グリコール酸）、ポリカプロラクトン、ポリカーボネート、ポリエステルアミド、ポリ無水物、ポリ（アミノ酸）、ポリオルトエステル、ポリシアノアクリレート、ポリ（ｐ−ジオキサノン）、ポリ（アルキレンオキサレート）、生分解性ポリウレタン、これらの混和物およびコポリマーなどが挙げられる。本発明の調節放出組成物に適した生体適合性非生分解性ポリマーとしては、ポリアクリレート、エチレン−酢酸ビニルおよびその他のアシル置換酢酸セルロースのポリマー、非分解性ポリウレタン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリフッ化ビニル、ポリ（ビニルイミダゾール）、クロロスルホネートポリオレフィン、ポリエチレンオキサイド、これらの混和物およびコポリマーから成る群から選ばれる非生分解性ポリマーなどが挙げられる。ポリマーまたはポリマーマトリックスは、そのポリマーおよびそのポリマーのいかなる分解産物もレシピエントに対して毒性を示さず、しかも注射部位における免疫反応など重大な悪影響または好ましくない影響を示さないものであれば生体適合性といえる。さらに、ポリマーの末端官能基を修飾することができる。たとえば、ポリエステルはブロックポリマーであっても非ブロックポリマーであってもよく、ブロックポリマーと非ブロックポリマーの混和物であってもよい。従来、当該分野においては、ブロックポリマーは、具体的にはブロックされたカルボキシル末端基を有するポリマーであると定義されている。一般に、ブロック基は重合開始剤に由来するものであって、通常はアルキル基である。非ブロックポリマーは当該分野における従来の定義のように、具体的には遊離のカルボキシル末端基を有するものである。本発明で使用するポリマーの許容分子量は、目標のポリマー分解速度、機械的強度などの物理的性質、および溶媒中のポリマーの溶解速度などの因子を考慮したうえで、当該分野に熟練せる者によって決定することができる。通常、分子量の許容範囲は約２，０００ダルトンないし約２，０００，０００ダルトンである。好ましい態様においては、ポリマーは生分解性のポリマーまたはコポリマーである。さらに好ましい態様においては、ポリマーは約１：１のラクチド：グリコリド比および約５，０００ダルトンないし約７０，０００ダルトンの分子量を有するポリ（ラクチド−コ−グリコリド）（以下「ＰＬＧＡ」という）である。なおさらに好ましい態様においては、本発明において使用するＰＬＧＡの分子量は約１０，０００ダルトンの分子量を有する。徐放性微粒子の１回投与量またはそれに替わる生理活性凝集安定化ＥＰＯ粒子を含む徐放性装置に含まれるＥＰＯの量は、治療上または予防上有効な量であり、当該技術分野に熟練せる者であれば、体重、治療すべき病態、使用するポリマーのタイプ、およびポリマーからの放出速度などの因子を考慮してこれを決定することができる。１つの態様においては、ＥＰＯ徐放性組成物は、生理活性凝集安定化ＥＰＯ粒子を約０．０１％（ｗ／ｗ）ないし約５０％（ｗ／ｗ）含む。かかるＥＰＯ粒子の使用量は、目的とするＥＰＯ効果、計画放出レベル、ＥＰＯ放出時点、およびＥＰＯ放出期間によって異なる。好ましいＥＰＯ粒子負荷率の範囲は、約０．１％（ｗ／ｗ）ないし約３０％（ｗ／ｗ）のＥＰＯ粒子である。より好ましいＥＰＯ粒子負荷率の範囲は、約０．１％（ｗ／ｗ）ないし約１０％（ｗ／ｗ）のＥＰＯ粒子である。最も好ましい生理活性凝集安定化ＥＰＯ粒子の負荷率は、約５％（ｗ／ｗ）である。さらに別の態様においては、ＥＰＯ徐放性組成物は、生理活性凝集安定化ＥＰＯ粒子中には含まれないがポリマーに分散された状態で存在する生体適合性金属カチオン成分をさらに含む。本明細書で定義する金属カチオン成分は、少なくとも１種類の多価金属カチオン（＋２以上の価数を有するもの）を非解離状態、解離状態、または非解離状態と解離状態の混合状態で含む成分である。適当な金属カチオン成分としてはたとえば、金属塩、金属水酸化物、および弱酸の塩基性（ｐＨ約７以上）塩などであって塩が金属カチオンを含むものなどが挙げられる。金属カチオンは二価であることが好ましい。金属カチオン成分は、使用量においてレシピエントに対して毒性を示さず、かつ注射部位における免疫反応などレシピエントの身体に対して重大な悪影響または好ましくない影響を示さないものであれば生体適合性といえる。金属カチオン成分は、ＥＰＯ粒子中の抗凝集剤に含まれるカチオン種および／またはアニオン種を任意に含んでいてよい。金属カチオン成分は、徐放性組成物のポリマーマトリックスからのＥＰＯの放出を調節する作用を示し、組成物中のＥＰＯの安定性を増大させることもできる。調節ＥＰＯ放出においては、少なくとも１つのＥＰＯ放出特性、たとえば初期ＥＰＯ放出レベル、その後のＥＰＯ放出レベル、放出期間、および／またはＥＰＯの放出量などが、分散金属カチオン成分を含まないポリマーマトリックスから放出されているＥＰＯが示す放出特性と異なる。放出の調節に用いる金属カチオン成分は通常、少なくとも１つのタイプの多価金属カチオンから成る。ＥＰＯ放出の調節に適した金属カチオン成分の例としては、たとえばＭｇ（ＯＨ）₂、ＭｇＣＯ₃（４ＭｇＣＯ₃・Ｍｇ（ＯＨ）₂・５Ｈ₂ ０など）、ＺｎＣＯ₃（３Ｚｎ（ＯＨ）₂・２ＺｎＣＯ₃など）、ＣａＣＯ₃、Ｚｎ₃ （Ｃ₆Ｈ₅Ｏ₇）₂、Ｍｇ（ＯＡｃ）₂、ＭｇＳＯ₄、Ｚｎ（ＯＡｃ）₂、ＺｎＳＯ₄、ＺｎＣｌ₂、ＭｇＣｌ₂、およびＭｇ₃（Ｃ₆Ｈ₅Ｏ₇）₂などが挙げられるが、これらを含むものであってもよい。ポリマーに対する金属カチオン成分の比率としては、たとえば重量比で約１：９９ないし約１：２が適当である。最適比率は、使用するポリマーおよび金属カチオン成分によって決まる。ポリマーマトリックスからの生理活性剤の放出を調節するための分散金属カチオン成分を含むポリマーマトリックスについては、１９９４年５月３日出願の同時係属米国特許出願第０８／２３７，０５７号明細書および同時係属ＰＣＴ特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９５／０５５１１号パンフレットにさらに詳細に説明されているが、これら文献の開示内容はすべて参考により本願に合体される。さらに別の態様においては、水溶性の塩、糖、またはアミノ酸など少なくとも１つの孔隙形成剤を微粒子に含有させて、微粒子の微小構造を変化させる。ポリマー溶液に添加される孔隙形成剤の比率は約１％（ｗ／ｗ）ないし約３０％（ｗ／ｗ）である。少なくとも１つの孔隙形成剤が本発明の非生分解性ポリマーマトリックスに含まれることが好ましい。本発明のＥＰＯ徐放性組成物は、フィルム、ペレット、シリンダー、ディスク、または微粒子など多くの形状に成型することができる。本明細書で定義する微粒子は、約１ミリメートル未満の直径を有するとともに、生理活性凝集安定化ＥＰＯ粒子を分散状態で有するポリマー成分を含むものである。微粒子は、球状であっても非球状であってもよいし、不規則形状であってもよい。微粒子は微小球であることが好ましい。通常、微粒子は注射に適したサイズのものである。好ましい微粒子サイズ範囲は、２３ゲージ注射針による注射用のものなど直径約１ないし約１８０ミクロンである。本発明の生理活性非凝集ＥＰＯ徐放性組成物の生成方法においては、適当量の生理活性凝集安定化ＥＰＯ粒子をポリマー溶液内に分散させる。ＥＰＯ粒子は、攪拌、アジテーション、超音波処理、またはその他の公知の混合手段によってポリマー溶液に分散させることができる。次いで、生理活性凝集安定化ＥＰＯ分散物を含むポリマー溶液を適当な手段によって固化させ、本発明のＥＰＯ徐放性組成物を生成させる。別法として、生理活性凝集安定化ＥＰＯ粒子とポリマーを連続的、逆順的、間欠的、独立的、または同時的添加によってポリマー溶媒に混合し、ポリマー溶液中にＥＰＯ粒子分散物を生成させることもできる。適当なポリマー溶液は、適当な生体適合性ポリマーを約１％（ｗ／ｗ）ないし約３０％（ｗ／ｗ）含むが、その生体適合性ポリマーは通常、適当なポリマー溶媒に溶解させる。ポリマー溶液は約２％（ｗ／ｖ）ないし約２０％（ｗ／ｖ）のポリマーを含むことが好ましい。５％ないし約１０％（ｗ／ｗ）のポリマーを含むポリマー溶液が最も好ましい。本明細書で定義する適当なポリマー溶媒は、ポリマーが可溶であるが凝集安定化ＥＰＯ粒子は実質的に不溶で反応性を示さない溶媒をいう。適当なポリマー溶媒の例としては、塩化メチレン、クロロホルム、酢酸エチルおよびアセトンなどの極性有機液体などが挙げられる。本発明のＥＰＯ徐放性微粒子の調製法については、実施例２でさらに説明する。生理活性凝集安定化ＥＰＯ粒子を調製するために、ＥＰＯを少なくとも１つの適当な抗凝集剤とともに適当な水性溶媒中で混合し、安定混合物を生成させるが、この安定混合物の各成分は懸濁状でも溶液状でもよく、両者を組み合わせたものであってもよい。安定混合物を生成する際、抗凝集剤の含有率は通常、ＥＰＯ粒子中の全固体の約１０％（ｗ／ｗ）ないし約８０％（ｗ／ｗ）であるが、約４０％を超えるものが好ましい。抗凝集剤と接触させる前のＥＰＯは固体状でも溶液状でもよいものとする。また、ＥＰＯと接触させる前の抗凝集剤は固体状でも溶液状でもよいものとする。好ましい態様においては、ＥＰＯの水溶液を抗凝集剤の水溶液と混合し、安定混合物を生成させる。次いで、安定混合物を生理活性凝集安定化エリスロポエチン粒子に成型する。一方の成分が温度感受性である２成分混合物から固体粒子を生成させるための当該分野において公知の方法であれば、いずれも使用することができる。たとえば、溶媒和安定混合物を蒸発、リオフィライゼーション、または凍結乾燥することができる。固体状の安定混合物はペレット状に圧縮することができる。より好ましい態様においては、安定混合物は、粒子形成中（たとえばリオフィライゼーション中）のｐＨ変化に起因する生理活性の有意喪失を防止する範囲内にｐＨを保つ量の緩衝剤で緩衝された溶媒和混合物である。通常、安定混合物中のＥＰＯに対する緩衝剤の含有率は全固体の約５％（ｗ／ｗ）ないし約２０％（ｗ／ｗ）である。適当な溶媒とは、水性重炭酸ナトリウム緩衝液または水性リン酸塩緩衝液など、ＥＰＯおよび抗凝集剤がそれぞれ少なくともわずかに溶けるものをいう。水性溶媒の場合、使用する水は脱イオン水または注射用水のいずれかであることが好ましい。安定混合物は通常、約４．０ないし約８．０のｐＨに緩衝される。好ましいｐＨ範囲は約５．０ないし約７．０である。適当なｐＨ条件は通常、重炭酸ナトリウムなどの水性緩衝液を使用することによって達成される。より好ましい緩衝剤としては、リン酸塩緩衝液、クエン酸塩緩衝液、およびこれらを組み合わせたものなどが挙げられる。適当なｐＨ範囲は、緩衝剤により透析を行なったり、緩衝剤をＥＰＯおよび／または抗凝集剤の溶媒として使用したり、抗凝集剤の添加の前、添加途中、および／または添加後に緩衝剤を１回以上バルク添加したりすることによって達成することができる。次いで、リオフィライゼーションなどによって溶媒和安定混合物を乾燥させ、生理活性凝集安定化ＥＰＯを生成させる。安定混合物は、全体をバルクで乾燥させてもよいし、小分け後に乾燥させてもよい。好ましい態様においては、超音波ノズルなどを用いて安定混合物を微小化させ、凍結させ、次いでリオフィライゼーションに付して生理活性凝集安定化ＥＰＯ粒子を生成させる。別の好ましい態様においては、安定混合物をＥＰＯ、硫酸アンモニウム（ＥＰＯ１グラムあたり約６グラムないし約８グラムの硫酸アンモニウム）、および緩衝溶液（ＥＰＯ１グラムあたり約５グラムないし約３０グラムの緩衝溶液）から成る約５ないし約７のｐＨを有する緩衝化溶液である。緩衝溶液は５ｍＭクエン酸塩／５ｍＭリン酸塩緩衝液または５ｍＭリン酸塩緩衝液（ｐＨ７）であることがさらに好ましい。凝集安定化ＥＰＯの粒子は、直径が約１ないし約６マイクロメートルであることが好ましい。ＥＰＯ粒子を、生理活性物質の小粒子製造方法について説明している１９９３年１月２１日出願の同時係属米国特許出願第０８／００６，６８２号明細書の説明に従い、独立的にフラグメント化することができるが、この文献の開示内容はすべて参考により本願に合体される。別法として、ＥＰＯ粒子を、超音波プローブや超音波ノズルなどによりポリマー溶液に添加した後でフラグメント化してもよい。生理活性凝集安定化ＥＰＯ粒子の合成については実施例１でさらに説明する。生理活性凝集安定化ＥＰＯ粒子を含む微小球およびその放出薬物動態ならびに薬物動力学的性質に関するさらに詳細な説明を実施例２〜５に示す。本発明の方法のさらに好ましい態様においては、ＥＰＯ粒子に含まれない金属カチオン成分もポリマー溶液に分散させてＥＰＯの放出を調節する。金属カチオン成分および凝集安定化ＥＰＯ粒子を連続的、逆順的、間欠的、独立的、または同時的添加によってポリマー溶液に分散させることもできるものとする。別法として、ポリマー、金属カチオン成分、および凝集安定化ＥＰＯを連続的、逆順的、間欠的、独立的、または同時的添加によってポリマー溶媒に混合させることもできる。生分解性ポリマーからの生理活性物質の放出を調節するための組成物の生成方法については、同時係属米国特許出願第０８／２３７，０５７号明細書および同時係属ＰＣＴ特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９５／０５５１１号パンフレットにさらに詳細に説明されている。凝集安定化ＥＰＯ粒子および金属カチオン成分を含む微小球に関するさらに詳細な説明を実施例２に示す。ポリマー溶液を固化させてポリマーマトリックスを生成させるのに適した１つの方法は、シュノーリング（Schnoring）らに付与された米国特許第３，７３７，３３７号、ブランチェン（Vranchen）らに付与された米国特許第３，５２３，９０６号、キタジマ（Kitajima）らに付与された米国特許第３，６９１，０９０号、またはティセ（Tice）らに付与された米国特許第４，３８９，３３０号に説明されている溶媒蒸発法であるが、これら文献の開示内容はすべて参考により本願に合体される。溶媒蒸発を用いて、微粒子またはその他の成型ＥＰＯ徐放性装置を生成させることができる。溶媒蒸発法においては、凝集安定化ＥＰＯ粒子分散物を含むポリマー溶液を、ポリマー溶媒が一部相溶性を示す連続相に混合するか、その連続相とともに攪拌して、乳剤を生成させる。連続相は通常、水性溶媒である。連続相に乳化剤を添加して乳剤の安定化を図ることが多い。次いで、ポリマー溶媒を数時間以上かけて蒸発させることで、ポリマーを固化させ、凝集安定化ＥＰＯ粒子の分散物を含むポリマーマトリックスを生成させる。この方法においては、ＥＰＯ粒子中のＥＰＯの変性が起こりうる温度までポリマー溶液を加熱することがないように注意しなければならない。本発明の微粒子中で維持される通常＞９８％に達する高レベルの生理活性について、実施例２でさらに詳しく考察する。ポリマー溶液を固化させて凝集安定化ＥＰＯの粒子を含むポリマーマトリックスを生成させるのに適した別の方法として、米国特許第４，６７５，８００号明細書に説明されている相分離法があるが、この文献の開示内容はすべて参考により本願に合体される。この方法においては、ポリマー溶媒と相溶性がないポリマー非溶媒をポリマー溶液に添加して乳剤を生成させることで、ＥＰＯ粒子周囲に凝集安定化ＥＰＯ粒子を含むポリマー溶液内のポリマーを沈殿させる。ポリマー溶液から凝集安定化ＥＰＯ微粒子を生成させる方法として好ましいものは、ゴムボッツ（Gombotz）らに付与された米国特許第５，０１９，４００号明細書および１９９５年５月１８日出願の同時係属米国特許出願第０８／４３３、７２６号明細書に説明されているような急速凍結および溶媒抽出を用いるが、これらの文献の開示内容はすべて参考により本願に合体される。相分離など他の方法と比べると、この微小球生成方法は、特定のＥＰＯ含有率を有する徐放性組成物の製造に必要なＥＰＯの量をさらに減らす。この方法による微粒子処方についてのさらに詳細な説明についても、実施例２を参照されたい。この方法においては、ＥＰＯ粒子分散物を含むポリマー溶液を処理して、液滴を生成させるが、少なくとも有意比率の液滴がポリマー溶液および生理活性凝集安定化ＥＰＯ粒子を含むものとする。次いで、これらの液滴を微粒子生成に適した手段によって凍結させる。ポリマー溶液分散物を処理して液滴を生成させる手段の例としては、分散物を超音波ノズル、圧力ノズル、レイリージェット（Rayl eigh jet）に通過させる手段や、その他の公知の、組成物から液滴を生成させる手段などが挙げられる。液滴を凍結させて微粒子を生成させるのに適した手段としては、液体アルゴンや液体窒素などの液化ガス中またはその付近に液滴を通過させて凍結微小液滴を生成させた後、液化ガスから分離する方法などが挙げられる。次いで、凍結微小液滴をエタノール単独またはヘキサンまたはペンタンと混合したエタノールなどの非溶媒液体と接触させる。凍結微小液滴中の溶媒を、固体および／または液体として非溶媒中に抽出し、微粒子含有生理活性凝集安定化ＥＰＯを生成させる。エタノールをヘキサンまたはペンタンなどその他の非溶媒と混合すると、エタノール単独使用の場合より、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）ポリマーなどのある種のポリマーからの溶媒抽出速度を高めることができる。たとえば超音波ノズルの直径を変えることによって液滴サイズを変化させることで、広いサイズ範囲のＥＰＯ徐放性微粒子を調製することができる。非常に大きな微粒子が所望される場合、微粒子をシリンジから冷液体中に直接押し出すことができる。ポリマー溶液の粘度を上げることによっても微粒子のサイズを増大させることができる。たとえばこのプロセスによって製造される微粒子のサイズは、直径約１マイクロメートル以下から約１０００マイクロメートル以上まで広範囲に変化しうる。ポリマー溶液からＥＰＯ徐放性組成物を生成させるさらに別の方法においては、型の中などでフィルム注型することによってフィルムまたは特定の形状を形成させる工程が含まれる。たとえば、凝集安定化ＥＰＯ粒子の分散物を含むポリマー溶液を型に入れた後、一定の乾燥重量を有するフィルムまたは形状が得られるまで、当該分野において公知の手段によってポリマー溶媒を除去するか、ポリマー溶液の温度を低下させる。生理活性物質を含むポリマー溶液のフィルム注型については、同時係属米国特許出願第０８／２３７，０５７号にさらに詳細に説明されている。本発明の生理活性ＥＰＯ徐放性組成物の生成方法は、水溶液に可溶性であって十分に高い溶液濃度において凝集して生理的に不活性のポリマーを形成する傾向を有するその他の生理活性物質の徐放性組成物を形成する目的にも使用することができる。ＥＰＯの放出は２種類の機構によって起こりうると考えられる。ＥＰＯは、その溶解によって、または徐放性組成物合成時のポリマー溶媒の除去に伴い生じるボイドによるなどして、ポリマーマトリックス中にできた水性飽和チャンネルを通過する拡散によって放出されうる。ポリマー加水分解速度は非中性ｐＨ値によって上昇することがある。したがって、微粒子の生成に使用するポリマー溶液に酸性または塩基性添加剤を添加することで、ポリマー侵食速度を変えることができる。第２の機構は、ポリマーの分解によるＥＰＯの放出である。分解速度は、ポリマーの水和速度に影響を及ぼすポリマー物性を変えることによってこれを制御することができる。これらの物性としては、たとえば、ポリマーを構成するラクチドおよびグリコリドなどの異種モノマーの比率；ラセミ混合物の代替として使用するＬ−異性体モノマー；ポリマーの末端基およびポリマーの分子量などが挙げられる。これらの物性は、ポリマーの水和速度を制御する親水性および結晶性に影響を及ぼしうる。塩、炭水化物、および界面活性剤などの親水性添加剤も水和性を増大させる目的に使用することができ、これによりポリマーの侵食速度を変えることができる。ポリマーの物性を変化させることによって、ＥＰＯ放出に対する拡散および／またはポリマー分解の影響を制御することができる。たとえば、ブロックポリマーの替わりに非ブロックポリマーを使用してポリマーの分子量を低下させたり、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）ポリマーのグリコリド含有率を上げると、ポリマーの加水分解が増大し、ポリマー侵食によるＥＰＯ放出が増大する。様々な分子量の非ブロックＰＬＧＡポリマーの影響について、実施例５でさらに詳細に説明する。本発明の徐放性組成物は、様々な医学的状態のＥＰＯ治療を目的として、ヒトまたはヒト以外の動物に、注射剤、埋め込み剤（たとえば皮下、筋肉内、腹腔内、頭蓋内、膣内、および皮内）、粘膜投与剤（たとえば鼻腔内投与または座剤）、またはイン・サイチュ送達剤（たとえば浣腸剤やエアゾル噴霧剤）として投与することで、既知測定項目値に基づいて決定される目標用量を提供することができる。以下の実施例により、本発明をさらに具体的に説明する。実施例１生理活性凝集安定化エリスロポエチンの調整米国特許第４，７０３，００８号明細書の説明に従い、エリスロポエチンを得た。このＥＰＯを脱イオン水に溶解して、約１ｍｇ／ｍｌの濃度を有する水溶液を生成させた。次いで、このＥＰＯ溶液の複数サンプルを、適当な処方緩衝液（５ｍＭリン酸塩緩衝液（ｐＨ７）、５ｍＭクエン酸塩緩衝液（ｐＨ７）、５ｍＭクエン酸塩／５ｍＭリン酸塩緩衝液（ｐＨ７）、または１０ｍＭ重炭酸塩緩衝液（ｐＨ７））に対して３回透析した。透析後、２８０ｎｍにおける吸光度（ε＝１．３４５Ｌｇｍ^-1ｃｍ^-1）を測定することによって透析溶液中のＥＰＯ濃度を求めたところ、約１ｍｇ／ｍｌであることが確認された。次いで、透析ＥＰＯ溶液の一部を候補抗凝集剤（すなわち、硫酸アンモニウム、酢酸亜鉛、マンニトール／シュークロース、またはマンニトール／マルトース）の濃縮溶液と混合して、下記表Ｉに示したＥＰＯ処方を生成させた。候補抗凝集剤溶液には、さらに別の添加剤（すなわち、イヌリン、グリシン、およびＴＷＥＥＮ２０^TM界面活性剤）も含ませた。抗凝集剤溶液は、後の添加先であるＥＰＯ溶液の透析に使用したものと同じ緩衝液中で個別に調製した。各抗凝集剤溶液および追加緩衝液の適当量を５０ｍｌのポリプロピレン試験管に加えて、目的濃度の処方（表Ｉに示した）を得た。次いで、各透析ＥＰＯ溶液を適当な抗凝集剤溶液に加えた後、溶液を静かに転倒させて混合した。処方した各ＥＰＯ溶液をテフロン管につないだ６０ｍｌのプラスチックシリンジに吸引した後、常に霧化物質が液体窒素に浸漬しているように注意しながら、超音波ノズル（タイプＶ１Ａ；Sonics and Materials，Inc.社、Danbury，CT）を通して液体窒素入りポリプロピレン容器中に霧化させて、凍結粒子を生成させた。容器は、液体窒素が完全に蒸発するまで−８０℃に保った。生理活性凝集安定化ＥＰＯを含む凍結粒子をガラスビーカーに移した後、リオフィライズして、生理活性凝集安定化ＥＰＯ粒子を形成させた。このＥＰＯ粒子を乾燥窒素雰囲気下でリオフィライザーから取り出し、低湿環境で操作し、−８０℃で乾燥保存した。実施例２生理活性凝集安定化エリスロポエチン含有ＰＬＧＡ微小球の調製実施例１の凝集安定化ＥＰＯ処方を含む微小球を、Boehringer Ingelheim Che micals，Inc.社（Montvale，NJ）から入手した非ブロックＰＬＧＡ（５０：５０；分子量１０，０００ダルトン）またはBirmingham Polymers，Inc．社（Birmin gham，AL）から入手したブロックＰＬＧＡ（５０：５０；分子量１０，０００ダルトン）から調製した。また、凝集安定化ＥＰＯ粒子のＡｍ７処方を含む微小球を、分子量約３１，０００ダルトンまたは４５，０００ダルトンの非ブロック（５０：５０）ＰＬＧＡ（Boehringer Ingelheim Chemicals，Inc.社、Montvale，NJ）から調製した。ゴムボッツら（Gombotz et al.）が記載している方法（米国特許第５，０１９，４００号明細書）を用いて、実施例１の凝集安定化ＥＰＯ粒子をＰＬＧＡ中にカプセル化した。いずれの場合も、ポリマーを５．１ｍｌの塩化メチレンに溶解して、ポリマー溶液を生成させた。炭酸マグネシウムまたは炭酸亜鉛を３８マイクロメートルのフルイにかけた後、最終濃度が１０％ｗ／ｖｏｌとなるようにポリマー溶液に添加した。続いて、ポリマー／塩懸濁液を３０ｍｇの凝集安定化ＥＰＯ粒子と合わせた。懸濁させた塩およびＥＰＯ粒子を含むポリマー溶液を氷水浴に入れ、超音波プローブ（Virtis Co.社、Gardiner，NY）を用いて超音波処理して、タンパク質粒子サイズを直径約２ないし３マイクロメートルにし、ポリマー溶液内にＥＰＯ粒子の分散液を形成させた。ポリプロピレン管を液体窒素で囲んだ後、追加した液体窒素で凍結エタノールを覆うことによって、管中でエタノール凍結床を調製した。次いで、１〜２ｍｌ／分の速度で、シリンジポンプ（Orion Research Inc．社、Boston，MA）によってシリンジから凍結エタノールおよび液体窒素の容器の上に置いた超音波ノズル中にＥＰＯ／ポリマー懸濁液を圧送した。ＥＰＯ／ポリマー懸濁液を液滴状に霧化させたところ、これらの液滴は液体窒素に接触すると同時に凍結して微小球を形成し、凍結エタノールの表面上に堆積した。容器を−８０℃に置いて、液体窒素を蒸発させるとともにエタノールを融解させた。エタノールの融解に伴い、微小球がエタノール中に沈殿し、塩化メチレンが微小球から抽出された。２４時間後、あらかじめ−８０℃まで冷却しておいたエタノールを容器に追加した。微小球の調製から２日後、あらかじめ冷却しておいたフィルター装置を用いて、エタノール／微小球スラリーを０．６５ミクロンのデュラピュア（Durapure^R）膜（Millipore 社、Bedford，MA）で濾過した。濾過は、あらかじめ窒素ガスをフラッシュしておいたグラブボックス中で行なった。次いで、濾過した微小球が乾燥するまで（あらかじめ−４０℃まで冷却しておいた棚の上で）リオフィライズした。続いて、タンパク質を抽出し、放射免疫測定法（ＲＩＡ）（Inscar：Stiullwa ter 社、MN）で分析することによって、これらの徐放性微小球中のＥＰＯの免疫反応性を測定した。微小球からＥＰＯを抽出するために、約１０ｍｇの微小球を２５０μｌの塩化メチレン入りの試験管に入れた。サンプルを１０ないし２０秒間ボルテックスで攪拌し、室温で５分間放置して、ポリマーを溶解させた。アセトンのサンプル（７５０μｌ）を加え、さらに１０秒間ボルテックスで攪拌し、１４，０００ｒｐｍ、４℃で３０秒間遠心分離して、ＥＰＯをペレット化させた。上清を除去し、塩化メチレンおよびアセトンの工程をさらに２回繰り返した。サンプルをリオフィライザーまたは真空オーブン中で１４〜１８時間にわたり室温乾燥させた。約１０秒間ボルテックスで攪拌した後、完全に溶解するまで室温で約１時間放置することによって、ＥＰＯペレットを１ｍｌのＨＥＰＥＳ緩衝液中で再構成した。抽出したＥＰＯを緩衝液（８．１ｍＭＮａ₂ＨＰＯ₄、１．５ｍＭＫＨ₂ＰＯ₄、４００ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．５）中で約２５μｇ／ｍｌの濃度まで希釈して分析に備えた。ＥＰＯの免疫反応性は、ＥＰＯ１ｍｇあたり１２１，０００±５０００単位であることがわかった。この特異的活性は、バルクのＥＰＯで得られた範囲（ＥＰＯ１ｍｇあたり１３０，０００〜１４０，０００単位）に匹敵するものであることから、本発明の徐放性組成物生成方法によるＥＰＯ活性の低下は問題とならないことが示された。すべての微小球について、モノマー含有率は９８％を超えることがわかった。Ａｍ１およびＡｍ７のＥＰＯ粒子を含む微小球についても、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によるＥＰＯダイマーの測定、およびＳＤＳ−ＰＡＧＥ／ウエスタンブロット分析による高分子量ＥＰＯ凝集体の測定を行なった。ＥＰＯダイマーや高分子量凝集体は検出されなかった。実施例３ＰＬＧＡ微小球内の凝集安定化粒子からのＥＰＯのイン・ビトロ放出ＰＬＧＡ微小球内の凝集安定化粒子からのＥＰＯのイン・ビトロ放出動態を、ＨＥＰＥＳ緩衝液（７５ｍＭＨＥＰＥＳ、１１５ｍＭＮａＣｌ、０．１％（容量比）ＴＷＥＥＮ２０^TM、０．１％（重量比）アジ化ナトリウムをＮａＯＨでｐＨ７．４まで滴定したもの）または２％もしくは２０％ヒツジ血清含有ＨＥＰＥＳ緩衝液中で評価した。血清含有緩衝液は、８０％（容量比）前記に２０％（容量比）ヒツジ血清を加えたものである。試験は、３７℃で８〜１０ｍｇの微小球を１〜５[？]ｍｌの緩衝液に懸濁させることによって実施した。所定の時点で緩衝液を全部除去し、新鮮緩衝液と交換した。ＨＥＰＥＳ緩衝液中で保温したサンプルにおいて、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によってＥＰＯモノマー（生理活性ＥＰＯ）およびＥＰＯ凝集体（生理不活性ＥＰＯ）の経時放出を測定した。微小球がａ）処方Ａｍ１またはＡｍ７を含む非ブロックＰＬＧＡ（分子量１０，０００ダルトン）微小球、およびｂ）Ｚｎ１含有ブロックＰＬＧＡ（分子量１０，０００ダルトン）微小球である様々な微小球のＨＥＰＥＳ緩衝液中でのイン・ビトロ放出動態に関するＳＥＣ分析の結果をそれぞれ図１、２、および３に示した。図１および２は、硫酸アンモニウムを抗凝集剤として含有する処方から放出されたＥＰＯは、放出期間全体を通じてほぼすべてがモノマー状ＥＰＯであることを示している。図３は、酢酸亜鉛を抗凝集剤として含有する処方から放出されたＥＰＯは、放出期間全体を通じてかなりの上昇を示した有意量の凝集体を含んでいることを示している。ＨＥＰＥＳ緩衝液中およびＨＥＰＥＳ／血清中における、実施例１の様々なＥＰＯ処方を含む様々な微小球（すべて１０，０００ダルトンＰＬＧＡ中のもの）のイン・ビトロ放出動態に関するＳＥＣおよびＲＩＡ分析の結果を表ＩＩに示した。初期バーストおよび放出速度は、ＲＩＡによりＨＥＰＥＳ／血清試験で測定した。放出されたＥＰＯの蓄積は、ＨＥＰＥＳ緩衝液中でＳＥＣによって評価した。これらの分析は、適当な抗凝集剤を添加すると、放出期間を通じてＥＰＯの凝集が有意に低減されたことを示している。これらの分析で、ポリマーに金属カチオン成分（たとえば塩）を添加し、ポリマーのタイプ（たとえばブロックまたは非ブロック）を選択すると、初期バースト値および放出期間に有意な影響が及ぶことも証明された。実施例４ＰＬＧＡ微小球内の硫酸アンモニウム凝集安定化ＥＰＯ粒子から放出されたＥＰＯの蓄積本実験の目的は、様々な濃度の硫酸アンモニウムを有する微小球から放出されたＥＰＯの蓄積を測定することであった。１０％、２０％、または４０％の硫酸アンモニウムを有する以外はＡＭ７と同じ凝集安定化ＥＰＯ処方を、実施例１の説明に従い調製した。硫酸アンモニウムと塩化ナトリウムまたはシュークロースの合計重量が７９％になるように、硫酸アンモニウムを除去し、塩化ナトリウムまたはシュークロースと置換した。イン・ビトロにおける３５日および４２日間の放出後にモノマー状ＥＰＯおよび凝集ＥＰＯの百分率を求めた。ＡＭ７処方ならびに４０％硫酸アンモニウム／ＮａＣｌ処方は、両方の時点において３〜４％の凝集体を生成したのに対し、１０％および２０％硫酸アンモニウム／ＮａＣｌ処方は５〜６％の凝集体を生成した。マンニトール処方は１０％および２０％硫酸アンモニウム処方と同様の結果を示した。硫酸アンモニウムをシュークロースと置換した場合、４０％硫酸アンモニウム処方からは定量可能な量の薬物は放出されなかった。シュークロースと混合した１０％および２０％硫酸アンモニウム処方は、塩化ナトリウムと混合したものと同様に、ＡＭ７処方で見られたものより多い凝集体（６〜９％）が見られた。実施例５エリスロポエチンのイン・ビボ薬物動態に及ぼす同時投与シクロスポリンおよびヒドロコルチゾンの影響体重４００±５０ｇ（Ｓ．Ｄ．）のスプラーグ−ドーレー系雄性ラットを動物モデルとして使用した。ラットは実験前に絶食させず、その後規定食と鉄補給を与え、自由に飲水させた。５ｍｇ／ｋｇのデキストラン鉄（Sigma Co.,社、St． Louis，MO）を毎週２回腹腔内注射した。これらの実験では、１９９５年６月７日出願の同時係属米国特許出願第０８／４８０，３１３号（代理人ドケット番号ＡＣＴ９５−０３））に説明されている、正確な血清中ＥＰＯ値のプロフィルを得るために放出された（または注射された）ＥＰＯに応答して起きる試験動物中の抗体産生を抑制する方法を用いた。該方法においては、試験動物へのシクロスポリンＡおよびヒドロコルチゾンの投与によって抗体産生が抑制される。第１の実験の１つの目的は、徐放性微小球から放出されるＥＰＯのイン・ビボ薬物動態作用、とくに血清中網状赤血球プロフィルに及ぼす作用を、ボーラスとして皮下注射されたＥＰＯと比較することであった。ラットを３頭づつ２群に分け、０日目に１０，０００単位のＲＭＡｍ７ＥＰＯ微小球（１０％ＭｇＣＯ₃ および５％Ａｍ７を含む非ブロック１０ＫＰＬＧＡ）を肩甲骨間領域に皮下注射した後、２８日目に２，０００単位のＥＰＯ水溶液のボーラス注射を行なった。対照群には、試験群に対して行なったシクロスポリンＡ／ヒドロコルチゾン療法を行なわなかった。注射１、３、４、８、１０、１４、１６、２０、２４、２８、３０または３１、３２、および３６時間後に、各ラットの尾静脈から血液サンプルを採取した。次いで、その後４〜５日間、ほぼ１日１回の頻度で血液サンプルを追加採取した。各血液サンプルの血中網状赤血球値を計数した。結果を図４に示した。図４は、免疫抑制ラットにおいて、ＥＰＯ微小球およびＥＰＯボーラスの両方に反応して網状赤血球数が高くなったことを示している。非免疫抑制ラット（対照群）は、ＥＰＯに対する免疫系応答に起因する抗体形成のために、網状赤血球値が低くなった。これはとくに、２８日目のＥＰＯボーラス投与後の対照群において網状赤血球値の有意上昇がなかったことによって裏付けられる。図４はまた、徐放性微小球を注射したところ、ＥＰＯのボーラス注射の場合よりも長期的に血清中網状赤血球値が上昇したことを示している。第２の実験の目的は、様々な徐放性微小球から放出されるＥＰＯのイン・ビボ薬物動態および薬動力作用を比較することであった。４群のそれぞれに属するラット（Ｎ＝３）の肩甲骨間領域に下記４つの微小球処方のうちの１つを皮下注射した。ＲＭＡｍ１非ブロック１０ＫＰＬＧＡ／１０％ＭｇＣＯ₃／５％Ａｍ１ＲＭＭａ１非ブロック１０ＫＰＬＧＡ／１０％ＭｇＣＯ₃／５％Ｍａ１ＰＺＺｎ１ブロック１０ＫＰＬＧＡ／１０％ＺｎＣＯ₃／５％Ｚｎ１ＲＭＡｍ７非ブロック１０ＫＰＬＧＡ／１０％ＭｇＣＯ₃／５％Ａｍ７各ラットに、１頭あたり１０，０００ないし１２，０００単位を投与した。各ラットには、注射用無菌食塩水０．５ｍｌに溶解した１０ｍｇのシクロスポリンＡ（Sandimmune^R注射剤、Sandoz社、East Hanover，NJ）および５ｍｇのヒドロコルチゾン（Spectrum Co.，社、Gardena，CA）の腹腔内注射を毎日１回、０ないし１４日間行ない、次いで、毎週２回の注射を１５ないし２８日間行なった。これらの注射はＥＰＯに対するラットの免疫系応答を抑制するためのものであった。注射１、２、４、８、１０（任意）、２４、３６、および４８時間後に、各ラットの尾静脈から血液サンプルを採取した。次いで、その後４〜５日間、ほぼ１日１回の頻度で血液サンプルを追加採取した。ラット血清サンプル中のＥＰＯ濃度をＥＬＩＳＡを用いて測定した。また、血中網状赤血球値を計数した。これらの処方の血清中ＥＰＯおよび血中網状赤血球プロフィルを、図５および６に示した。ＥＰＯ値は、これらの動物においては約１４日間、ベースライン値を上回っており、生理活性ＥＰＯの徐放性が証明された。網状赤血球値の上昇が約１７日間にわたり見られた。さらに、ＥＰＯ処理後の未成熟網状赤血球値および総網状赤血球値の応答は比例的であり、互いに有意差はなかった。実施例６ラットにおけるＥＰＯ放出に及ぼすポリマー分子量の影響３つの試験群に分けたラット（Ｎ＝３）に、実施例４の説明に従い、異なる分子量（１０，０００ダルトン、３１，０００ダルトン、または４５，０００ダルトン）のＰＬＧＡポリマー中のＡｍ７ＥＰＯ処方を有する実施例２の微小球を注射した。各ラットの用量は約１０，０００単位とした。試験の目的は、持続ＥＰＯ放出値および放出期間に及ぼすポリマー分子量の影響を判定することであった。注射３、７、１０、１４、１７、２１、２４、および２８日後に、各ラットの尾静脈から血液サンプルを採取した。ラット血清サンプル中のＥＰＯ濃度をＥＬＩＳＡを用いて測定した。結果を図７に示した。図７は、ポリマー分子量をかなり低下させると、２％ＭｇＣＯ₃含有非ブロックＰＬＧＡ中のＥＰＯ放出速度が増大し、放出期間が短縮することを示している。均等物当業者であれば、単なる日常的実験手法により、本明細書に記載された発明の具体的態様に対する多くの均等物を認識し、あるいは確認することができるであろう。かかる均等物は下記請求の範囲に記載されるような本発明の範疇に含まれるものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者バーク，ポールエイ. アメリカ合衆国マサチューセッツ 02155 メドフォード，ジャクソンロード 26 (72)発明者バーンスタイン，ハワードアメリカ合衆国マサチューセッツ 02139 ケンブリッジ，ナンバー．２ビーマサチューセッツアベニュー 929 (72)発明者ブリックナー，アブラムアメリカ合衆国マサチューセッツ 02146 ブルックライン，ケンウッドストリート 55

Claims

【特許請求の範囲】１．下記を含むポリマーマトリックスからの生理活性非凝集エリスロポエチンの徐放性組成物：ａ）生体適合性ポリマー；ｂ）エリスロポエチン粒子、ここで、該エリスロポエチンは、水溶液中でエリスロポエチンの溶解性を低下させる塩で凝集に対して安定化されている。２．該塩が、Ｍｇ⁺²、Ｌｉ⁺²、Ｎａ⁺、Ｋ⁺、ＮＨ₄ ⁺およびそれらの組み合わせからなる群より選ばれたカチオンを含むものである請求項１記載の組成物。３．該塩が、ＳＯ₄ ^-2、ＨＰＯ₄ ^-2、酢酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、Ｃｌ^-、ＮＯ₃ ^-、ＣｌＯ₃ ^-、Ｉ^-、ＣｌＯ₄ ^-、ＳＣＮ^-およびそれらの組み合わせからなる群より選ばれたアニオンを含むものである請求項１または２記載の組成物。４．該塩が硫酸アンモニウムである、請求項１記載の組成物。５．該塩の含有量が、エリスロポエチン粒子中の全固体の約１０〜８０重量％または少なくとも約４０重量％である前記請求項いずれか記載の組成物。６．エリスロポエチンの凝集が、初期投与量の約５％未満、好ましくは約２％未満に維持されている前記請求項いずれか記載の組成物。７．該ポリマーがポリ（ラクチド）、ポリ（グリコリド）、ポリ（ラクチド−コ −グリコリド）、ポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）、ポリカプロラクトン、ポリカーボネート、ポリエステルアミド、ポリ無水物、ポリ（アミノ酸）、ポリオルトエステル、ポリシアノアクリレート、ポリ（ジオキサノン）、ポリ（アルキレンオキサレート）、ポリウレタン、それらの混和物およびそれらのコポリマーからなる群より選ばれたものである前記請求項いずれか記載の組成物。８．該ポリマーがポリ（ラクチド）、ポリ（グリコリド）およびポリ（ラクチド −コ−グリコリド）からなる群より選ばれたものである請求項７記載の組成物。９．エリスロポエチン粒子が、約０．１〜約３０重量％、好ましくは約０．１〜約１０重量％の濃度で該ポリマー中に存在している前記請求項いずれか記載の組成物。１０．エリスロポエチン粒子が、約５重量％の濃度で該ポリマー中に存在している請求項９記載の組成物。１１．エリスロポエチンが、約４．０〜約８．０のｐＨで、好ましくは約５．０〜約７．０のｐＨで維持されている緩衝液の存在下で凍結乾燥される前記請求項いずれか記載の組成物。１２．緩衝液が、リン酸塩緩衝液およびクエン酸塩緩衝液から選ばれたものである請求項１１記載の組成物。１３．生体適合性ポリマーがさらに金属カチオン成分を含んでなる、前記請求項いずれか記載の組成物。１４．金属カチオン成分の金属カチオンが、Ｚｎ⁺²、Ｍｇ⁺²およびＣａ⁺²のごとき多価イオンである請求項１３記載の組成物。１５．金属カチオン成分が、Ｍｇ（ＯＨ）₂、ＭｇＣＯ₃、ＺｎＣＯ₃、ＣａＣＯ₃ 、Ｚｎ₃（Ｃ₆Ｈ₅Ｏ₇）₂、Ｍｇ（ＯＡｃ）₂、ＭｇＳＯ₄、Ｚｎ（ＯＡｃ）₂、ＺｎＳＯ₄、ＺｎＣｌ₂、ＭｇＣｌ₂およびＭｇ₃（Ｃ₆Ｈ₅Ｏ₇）₂からなる群より選ばれたもの、好ましくはＭｇＣＯ₃である請求項１４記載の組成物。１６．金属カチオン成分のポリマーに対する重量比が、約１：９９〜約１：２である請求項１４または１５記載の組成物。１７．金属カチオン成分が、全組成物の約１０重量％の濃度の炭酸マグネシウムである請求項１６記載の組成物。１８．治療用医薬の調製における使用のための前記請求項いずれか記載の組成物。１９．エリスロポエチンのリオフィライズ溶液、硫酸アンモニウムおよび約４〜８のｐＨ、好ましくは約５〜７のｐＨを有する緩衝液を含有してなる生理活性凝集安定化エリスロポエチン。２０．硫酸アンモニウムの含有量が、全固体の約１０〜８０重量％または少なくとも約４０重量％である請求項１９記載のエリスロポエチン。２１．緩衝液が、リン酸塩緩衝液またはクエン酸塩緩衝液である請求項２０記載のエリスロポエチン。２２．徐放性組成物の製造における使用のための請求項１９〜２１いずれか記載のエリスロポエチン。２３．下記工程を含む生理活性凝集安定化エリスロポエチン粒子の調製方法：ａ）抗凝集剤、生理活性エリスロポエチンおよび約４〜８のｐＨ、好ましくは約５〜７のｐＨを有する緩衝液を混合して、凝集安定化混合物を生成させる工程；およびｂ）該混合物を凍結乾燥して、生理活性凝集安定化エリスロポエチンを生成させる工程。２４．抗凝集剤が硫酸アンモニウムであり、硫酸アンモニウムが全固体の約１０〜８０重量％または少なくとも約４０重量％の濃度で添加される請求項２３記載の方法。２５．緩衝液が、リン酸塩緩衝液またはクエン酸塩緩衝液である請求項２３記載の方法。