JPH11501813A

JPH11501813A - デンプンを液化する方法

Info

Publication number: JPH11501813A
Application number: JP8527628A
Authority: JP
Inventors: エルアントリム，リチャード; ミッチンソン，コリン; ピーソルヘイム，リーフ
Original assignee: ジェネンコアインターナショナルインコーポレーテッド
Priority date: 1995-03-09
Filing date: 1996-03-07
Publication date: 1999-02-16
Also published as: NZ305062A; AU710631B2; ATE258989T1; US5756714A; DE69631471T3; WO1996028567A1; EP0813607B2; CN1492045A; KR19980702782A; MX9706706A; DE69631471T2; NO974072D0; EP0813607B1; DE69631471D1; CA2214383A1; CA2214383C; CN1112446C; AU5298496A; CN1177983A; NO974072L

Abstract

(57)【要約】本発明により、デンプンを液化する前または同時にデンプンを処理して、デンプン中に存在する酵素阻害組成物を不活化および／または除去して処理デンプンを形成し、α−アミラーゼを処理デンプンに添加し、処理デンプンを液化するのに効果的な時間と温度で処理デンプンを反応させる各工程からなるデンプンを液化する方法を提供する。デンプンを処理する効果的な手段の例としては、フィテート分解酵素の添加および、必要に応じて濾過または遠心分離後の、顆粒状デンプンまたはデンプン溶液の熱処理が挙げられる。

Description

【発明の詳細な説明】デンプンを液化する方法関連出願の説明本出願は、1995年３月９日に出願され、ここに引用される米国特許出願第08/4 01,325号の一部継続出願である。発明の背景本発明は、穀物デンプンをブドウ糖、果糖およびアルコールのような下流生成物に転化するのにα−アミラーゼを使用することの改良に関するものである。特に、本発明は、液化の前または最中における顆粒状デンプンからの酵素阻害組成物の除去および／または不活化に関するものである。トウモロコシのような穀物がデンプンの供給源として長い間使用されてきた。工業工程に使用するためにデンプンを分離および精製するよく知られた方法の１つに湿式磨砕がある。この方法は、できるだけ完全に穀物穀粒の主成分を分離するように設計された高特異的総合システムに発達した（Stanley A．WatsonのSta rch:Chemistry & Technology ，第II巻，Industrial Aspects，Academic Press， New York，1967年、30-51頁参照のこと）。通常の湿式磨砕工程においては、デンプン製品の製造に用いられる乾燥穀物に、浸漬と呼ばれるソーキング工程を最初に施す。浸漬中に、穀物は、フィテート (phytate)とフィチン酸、糖類、塩類およびタンパク質類を含む多くの可溶性物を穀物顆粒から分離する逆流水流に曝される。浸漬された穀物は、ソーキング水（浸漬水）から分離され、機械式の分解および磨砕工程が施される。次いで、浮動技術および遠心分離技術を用いて、デンプン、繊維およびタンパク質から胚芽を分離する。次いで、得られた、内胚乳（デンプン）、繊維およびタンパク質のスラリーをさらに磨砕して、スクリーニングして、繊維を分離する。最後に、タンパク質および内胚乳関連成分が、逆流水洗および遠心分離により密度に基づいて分離され、タンパク質／グルテン流からデンプンが分離される。次いで、単離されたデンプン流を粗く濯いで、無機塩のような可溶性物、およびフィテートとフィチン酸の塩のような化合物を含む、非顆粒状デンプン関連可溶性物を除去する。得られた生成物は、果糖に転化するための出発生成物として機能する不溶性顆粒状デンプンの高度に精製されたスラリーである。一般的に、デンプンから果糖への加工は４つの工程からなる：顆粒状デンプンの液化、液化されたデンプンのブドウ糖への糖化、精製および果糖への異性化。デンプン液化工程の目的は、デンプン高分子顆粒の濃縮懸濁液を、低密度で、鎖長がより短い可溶性デキストリンの溶液に転化することにある。この工程は、標準的な設備により都合よく処理するのに、そして、グルコースまたは他の糖類に効率的に転化するのに必要である。顆粒状デンプンを液化するためには、顆粒状デンプンの温度を約72℃より高く昇温させることにより顆粒をゲル化することが必要である。加熱工程は即座に不溶性デンプン顆粒を分裂させて、水溶性デンプン溶液を生成する。次いで、可溶化されたデンプン溶液をα−アミラーゼ（ＥＣ３．２．１．１．）により液化する。通常の酵素液化工程には、水酸化カルシウム、水酸化ナトリウムまたは炭酸ナトリウムを加えることにより、顆粒状デンプンスラリーのｐＨを、バチルスリケニホルミス(Bacillus licheniformis)由来のα−アミラーゼに最適なｐＨである 6.0および6.5の間に調節する工程が含まれている。水酸化カルシウムを加えることには、不活化に対してα−アミラーゼを安定化させることが知られているカルシウムイオンを供給する利点がある。α−アミラーゼを加える際に、懸濁液を汲み上げて蒸気噴射に通し、その温度を80℃−115℃の間まで即座に上昇させる。デンプンは、直ちにコ化され、α−アミラーゼが存在するために、（１−４）グリコシド結合のα−アミラーゼによる無作為の加水分解により、容易にポンプで送られる流体に解重合される。２番目の液化工程の変更例においては、α−アミラーゼをデンプン懸濁液に加え、この懸濁液を80-100℃の温度に保持してデンプン顆粒を部分的に加水分解し、部分的に加水分解されたデンプン懸濁液を汲み上げて約105℃より高い温度の噴射に通して残りの顆粒構造を完全にコ化する。コ化したデンプンを冷却した後、α−アミラーゼを再度加えて、デンプンをさらに加水分解しても差し支えない。この工程の３番目の変更例は、乾式磨砕工程と呼ばれている。乾式磨砕において、整粒を磨砕して、水を配合する。浮動分離または同等の技術により、胚芽を必要に応じて除去する。デンプン、繊維、タンパク質および穀物の他の成分を含有する、得られた混合物をα−アミラーゼを用いて液化する。この業界では、乾式磨砕工程を用いる場合には、より低い温度で酵素液化が一般的に行われる。一般的に、低温液化は、デンプンを可溶性デキストリンに転化するのには、高温液化よりも効率的ではないと考えられている。典型的にデンプン溶液は、コ化後に、10-20のＤＥが達成されるまで、通常１ −３時間の期間に亘り、α−アミラーゼの存在下で高温に保持される。ブドウ糖当量（ＤＥ）は、乾燥重量基準でＤ−グルコースとして計算された全還元糖の濃度を測定する工業規格である。加水分解されていない顆粒状デンプンは実質的にゼロのＤＥを有しているが、Ｄ−グルコースのＤＥは100と定義されている。 α−アミラーゼを含有するデンプン溶液を保持できる最高温度は、酵素が得られる微生物供給源およびα−アミラーゼ分子の分子構造に依存する。枯草菌またはバチルスアミロリケファシエンス(B．amyloliquefaciens)の野生型菌株により産生されるα−アミラーゼは典型的に、約90℃以下の温度で用いられる。これは、この温度よりも高いと、過剰に急速に熱不活化が行われてしまうからである。一方、バチルスリケニホルミスの野生型菌株により産生されるα−アミラーゼは約110℃までの温度で使用しても差し支えない。デンプンおよびカルシウムイオンが存在することにより、不活化に対してα− アミラーゼが安定化されることが知られている。それにもかかわらず、α−アミラーゼは、６より大きいｐＨ値で用いられ、急速な不活化に対して保護されている。低温では、バチルスリケニホルミス由来のα−アミラーゼは、５ほどの小さいｐＨ値でデンプン基質に優れた加水分解活性を有することが知られている。しかしながら、通常の噴射温度、例えば、102℃および109℃の間の温度でのデンプン加水分解に酵素を使用する場合には、ｐＨを少なくともｐＨ5.7より大きく維持して、過剰で急速な不活化を避けなければならない。ｐＨ値が6.0より大きいと、望ましくない副生物、例えば、麦芽糖が生成されてしまうので、残念なことに、ｐＨの必要条件により、加工機会の領域が狭くなってしまう。したがって、実際には、液化ｐＨを5.9および6.0の間に維持して、加水分解されたデンプンを満足に生成しなければならない。液化のｐＨに関連する別の問題には、湿式磨砕段階から生じるときのトウモロコシデンプン懸濁液のｐＨである約４から、5.9-6.0まで、デンプン懸濁液のｐＨを上昇させる必要があることがある。このｐＨの調節には、コストのかかる酸中和化学物質を添加する必要があり、また、最終的なデンプン転化生成物をイオン交換精製してこの化学物質を除去する必要がある。さらに、液化後の次の工程、典型的には液化されたデンプンのグルコースへの糖化には、4-4.5のｐＨが必要である。したがって、ｐＨは5.9-6.0から4-4.5に調節しなければならず、これには、化学物質の添加工程および精製工程が必要である。多くの植物の種子に共通しているように、ミオイノシトールのヘキサリン酸エステルであるフィチン酸は、フィチン酸カリウム、カルシウムおよびマグネシウムのようなフィテート塩の形態で穀物穀粒中に存在することが知られている。上述したように、トウモロコシの穀粒中に存在するフィチン酸のほとんどの量が、浸漬工程中の穀粒から浸み出して、さらなる加工の前に液化流から除去されると一般的に考えられている。驚いたことに、ここに記載するように、浸漬および粗い水洗後に顆粒状デンプン中にフィテートの形態が存在することが分かった。理論により拘束することを意図するものではないが、残りのフィテートは、実際にデンプン顆粒自体の内部に結合しており、したがって、粗い水洗工程中にはデンプンから分離できないと考えられる。米国特許第5,322,778号において、重亜硫酸塩またはその塩、アスコルビン酸またはその塩、エリソルビン酸(erythorbic acid)のような酸化防止剤、もしくはブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、またはα−トコフェロールのようなフェノール酸化防止剤を液化スラリーに加えることにより、ｐＨ4.0からｐＨ6.0までの間で液化が行われた。この特許によると、重亜硫酸ナトリウムを５ｍＭより濃い濃度で加えなければならない。米国特許第5,180,669号において、溶液に緩衝作用を与えるのに必要な量より多い炭酸イオンを粉にひかれたデンプンのスラリーに加えることにより、5.0から6.0までの間のｐＨで液化が行われた。炭酸イオンの添加により生じる増大したｐＨ効果のために、このスラリーは、水素イオンの供給源、例えば、塩酸または硫酸のような無機酸を加えることにより、一般的に中和される。ＰＣＴ公間公報ＷＯ94/02597号において、１つ以上のメチオニンがシステインまたはメチオニン以外のアミノ酸により置き換えられた、酸化安定性の改良された変異体α−アミラーゼが記載されている。ＰＣＴ公開公報ＷＯ94/18314号において、１つ以上のメチオニン、トリプトファン、システイン、ヒスチジンまたはチロシン残基が耐酸化性アミノ酸により置き換えられた、酸化安定性の改良された変異体アミラーゼが記載されている。ＰＣＴ公開公報ＷＯ91/00353号において、α−アミラーゼを遺伝子操作して、熱、酸およびアルカリに対する増大した安定性を含む特性を備えさせることにより、液化に関連する問題に取り組んでいる。米国特許第4,914,029号において、フィターゼをトウモロコシ浸漬溶液に加えて、トウモロコシ浸漬溶液中のフィチン酸の量を減少させて、動物用飼料中のトウモロコシ浸漬溶液をより効率的に使用している。従来技術で進歩が遂げられているにもかかわらず、市販のα−アミラーゼを用いて低いｐＨレベルでデンプンを液化する効率的な手段が必要とされている。同様に、この業界で、より高温で乾燥磨砕穀物を液化することのできる方法が必要とされている。それにもかかわらず、上述されたどの方法も、非効率なまたは存在しない酵素に促進される低ｐＨデンプン液化の原因である組成物の除去および／または不活化できる重要な利点を有していない。さらに、上述したどの方法も、酸化防止剤または中和酸の添加、遺伝操作された酵素の調製、または例外的な低ｐＨ安定性特性を有する新しいα−アミラーゼの発見を必要としない液化に対して柔軟に取り組むことができない。発明の概要本発明の目的は、容易に得られる変異体または野生型のα−アミラーゼ酵素を用いて効率的な低ｐＨデンプン液化を行うことにある。本発明のさらなる目的は、低ｐＨでのα−アミラーゼによる非効率な液化の主な原因である顆粒状デンプン中に存在する酵素阻害組成物の除去および／または不活化を行うことにある。本発明のさらなる目的は、高価な酸化防止剤を添加せずにデンプンを液化する方法を提供することにある。本発明のさらなる目的は、方法に柔軟性をもたせ、遺伝子操作されたα−アミラーゼを使用する必要のない単純で効率的なデンプン液化方法を提供することにある。本発明によると、デンプンを液化する方法であって、デンプンの液化の前または同時にデンプンを処理してデンプン中に存在する酵素阻害組成物を不活化および／または除去して処理デンプンを形成し、この処理デンプンにα−アミラーゼを加えて、処理デンプンを液化するのに効果的な時間と温度で処理デンプンを反応させる各工程からなる方法を提供する。本発明の別の実施の形態によると、5. 7未満のｐＨでα−アミラーゼおよび水性デンプンの混合物からなる組成物であって、不活化された酵素阻害組成物を含有するか、または酵素阻害不活化組成物を実質的に含有しない組成物を提供する。以下詳細に指摘されるように、本発明を実施することにより、商業的なデンプン液化工程に重要な利点が付与される。理論により束縛することを望むものではないが、顆粒状デンプン中に存在するが、現在までその成分として同定されていない特定の組成物が、α−アミラーゼによるデンプンの低ｐＨ液化に関連する問題の原因であると考えられる。単離組成物の元素分析から、この組成物はフィテートの形態からなると思われる。低ｐＨ液化問題の原因である組成物の驚くべき同定により、原因である組成物を不活化および／または除去でき、したがって、よく知られ特色のあるα−アミラーゼにより、低ｐＨ値、ｐＨ4.5ほどで顆粒状デンプンを効率的に液化することができる。以下に記載するように、最初に本発明は、α−アミラーゼを含有する商業的に生存可能な系により使用することのできる、低ｐＨでのデンプン液化に取り組む。さらに、本発明では、例外的な低ｐＨ安定性特性を有する特に設計された変異体または野生型の酵素を使用すること、または酸化防止剤の添加もしくは酸中和のような高価な方法を必要としない。本発明自体は、さらなる目的および付随する利点とともに、以下の詳細な記載および図面を参照することによりよく理解されよう。発明の詳細な説明「液化」または「液化する」は、デンプンがより短い鎖を有する粘性の小さいデキストリンに転化される工程を意味する。一般的に、この工程には、α−アミラーゼの添加と同時かまたはそれに続いてデンプンのコ化が含まれている。「浸漬液」は、浸漬工程中に浸漬された穀物穀粒から抽出された液体を意味する。浸漬液は、穀物の可溶性成分の大部分を含有している。「顆粒状デンプン」または「デンプン顆粒」は、穀物の湿式磨砕工程に典型的な浸漬、機械式分解、分離、スクリーニング、逆流水洗および遠心分離工程により、外皮、繊維、タンパク質、胚芽および溶解性物質を除去した後に残留する食用穀物の水不溶性成分を意味する。顆粒状デンプンは、ほとんど排他的に充填されたデンプン分子（すなわち、アミロペクチンおよびアミロース）を含有する完全なデンプン顆粒からなる。トウモロコシにおいては、顆粒状デンプン成分は、約99％のデンプンからなる。残りの１％は、タンパク質、灰分、繊維および顆粒に密接に関連する微量成分からなる。顆粒状デンプンの充填構造は、デンプンを加水分解するα−アミラーゼの能力をひどく阻害する。デンプンのコ化を用いて顆粒を分裂させ、可溶性デンプン溶液を形成し、酵素的加水分解を促進させる。「デンプン溶液」は、顆粒状デンプンを加熱することにより生じた水溶性のケル化デンプンを意味する。約72℃より高い温度まで顆粒を加熱すると、顆粒状デンプンが解離して、開放されたデンプン分子の水性混合物を形成する。この混合物は、例えば、イエローデント(yellow dent)トウモロコシにおいては約75％のアミロペクチンおよび約25％のアミロースからなり、粘性の水溶液を形成する。グルコースまたは果糖を形成する商業工程においては、この粘性溶液は、液化されて可溶性デキストリン溶液を形成するデンプン溶液である。「酵素阻害組成物」または「ＥＩＣ」は、低ｐＨ液化中にデンプン溶液のα− アミラーゼ加水分解を阻害するように作用する顆粒状デンプン中の組成物を意味する。低ｐＨでα−アミラーゼを阻害するように作用する、コ化されたデンプン顆粒から抽出された組成物（ＥＩＣ）の化学分析により、ＥＩＣはフィテートの形態からなることが分かった。酵素阻害組成物を構成するフィテートの形態は、フィテートのマグネシウム、鉄、カリウム、マンガン、亜鉛および／またはカルシウムの塩であると考えられている。「処理」は、低ｐＨ、例えば、5.7より低いｐＨでのデンプンの酵素的加水分解中に酵素阻害組成物により生じる影響を減少または除去する顆粒状デンプンまたはデンプン溶液の処理を意味する。このような処理は、例えば、酵素阻害組成物がα−アミラーゼのデンプン加水分解活性特性を不安定化、不活化または他の様式により減少させるのを防ぐように作用する化合物を顆粒状デンプンまたはデンプン溶液に添加すること；顆粒状デンプンまたはデンプン溶液に、低ｐＨ液化の前に酵素阻害組成物の阻害特性を除去または著しく減少させる条件または分離技術を施すこと；または非ＥＩＣ化合物にＥＩＣを化学的に修飾することにより、酵素阻害組成物を溶液から除去する化合物を添加することを含んでいる。「α−アミラーゼ」は、α（１−４）グリコシド結合、例えば、デンプンにおいてはアミロペクチンまたはアミロース高分子を開裂または加水分解する酵素活性を意味する。適切なα−アミラーゼは、天然のα−アミラーゼ並びにデンプンの液化に有用な組換えまたは変異体アミラーゼである。本発明において好ましいアミラーゼは、バチルス属、特にバチルスリケニホルミス、バチルスアミロリケファシエンスまたはバチルスステアロサーモフィルス(Bacillus stearothermoph ilus)由来のα−アミラーゼである。本発明によるデンプン処理によって、液化反応、すなわち、デンプン、アミロペクチンまたはアミロースの酵素的加水分解を、従来技術の液化方法とは対照的に、6.0未満のｐＨ、または5.0末満のｐＨでさえも効率的に実施することができる。好ましくは、液化反応は、約4.5から約5.7までの間、より好ましくは約4.5 から約5.5までの間、そして最も好ましくは約4.5から約5.2までの間のｐＨで行われる。本発明の好ましい実施の形態においては、α−アミラーゼの添加の前の熱処理により顆粒状デンプンまたはデンプン溶液を処理して、その中に存在する酵素阻害組成物を不活化している。この実施の形態において、好ましくは、酵素阻害組成物を確実に不活化する加熱後にα−アミラーゼを顆粒状デンプンまたはデンプン溶液に加えて、最初に酵素阻害組成物がα−アミラーゼに影響を与えないようにする。しかしながら、処理工程と同時にα−アミラーゼを添加することも本発明の範囲に含まれるものと考える。次いで、このスラリーを、当業者によく知られているように、デンプンを液化するのに適切な時間、適切なｐＨおよび適切な温度で保温する。本発明によると、酵素阻害組成物は、液化前、すなわち、α− アミラーゼの添加前にデンプン溶液を加熱することにより、α−アミラーゼ活性を阻害する能力を著しく減少させることができる。あるいは、低温、例えば、60℃から90℃までの温度でデンプン溶液をアミラーゼとともに最初に保温して、液化を完了する前にデンプンまたはゲル化されたデンプン溶液から酵素阻害組成物を放出させることも本発明の範囲内にあると考えられる。その後、デンプンを続いて液化するのに十分な適切な時間に亘り適切な温度までデンプンの温度を上昇させることによりデンプンを液化する。好ましくは、温度を約80℃から約115℃まで間の温度まで上昇させる。酵素不活化組成物の不活化は、低温保温中、または液化中の温度を上昇させて保持している間に行ってもよい。この実施の形態においては、低温α−アミラーゼ保温中または続いての液化の最中またはその後に追加のα−アミラーゼを加えてもよい。本発明の他の実施の形態の場合のように、この実施の形態により、5.7未満のｐＨ値で効率的に液化を行うことができる。別の好ましい実施の形態において、酵素阻害組成物の酵素阻害特性を除去し、したがって、デンプンから酵素阻害組成物を除去するように、酵素阻害組成物を化学的に修飾または分解する組成物により顆粒状デンプンまたはデンプン溶液を処理する。好ましくは、液化の前に、デンプン顆粒またはデンプン溶液にフィテート分解酵素を加える。好ましいフィテート分解酵素は、フィターゼまたは酸性ホスファターゼからなる。フィテートのイノシットおよび無機ホスフェートへの転化を触発する、微生物により産生される酵素の多くがフィターゼとして広く知られている。フィターゼ産生微生物は、枯草菌、シュードモナス、サッカロミセスセレビシアエ、黒色アスペルギルス、黒色アスペルギルスバー、アワモリ(awa mori)、アスペルギルステレウス(terreus)、アスペルギルスフィクウム(ficuum) を含む、細菌および糸状菌類並びに酵母からなる。好ましくは、フィターゼはアスペルギルスフィクウム由来である。微生物源からのそのようなフィターゼ酵素の精製は、業界で知られている技術により行われる。例えば、Ullah等のPrepara tive Biochemistry ，18(4),443-458頁、(1988)に、アスペルギルスフィクウム由来のフィターゼの精製が記載されており、これをここに引用する。顆粒状デンプンまたはデンプン溶液に加えられるフィテート分解酵素の濃度は、この溶液中の酵素阻害組成物を著しく分解するのに効果的でなければならない。もちろん、適切なフィテート分解酵素濃度の決定は、ｐＨ、温度、反応時間、特定の酵素活性および顆粒状デンプンまたはデンプン溶液が得られる穀物の種類に依存する。しかしながら、フィテート分解酵素活性の最適条件は、当業者により容易に確かめられる。好ましくは、フィテート分解酵素の濃度は、デンプン１グラム当たりフィターゼ約0.1単位から約100単位まで（フィターゼ単位）である。さらに好ましくは、フィターゼ分解酵素の濃度は、デンプン１グラム当たりフィターゼ約１単位から約25単位までである。１フィターゼ単位（フィテート分解活性）は、37℃で１分当たり0.042ＭＭｇ−Ｋフィテートから１μモルの無機リン（Ｐ）を遊離させる酵素の量として定義される（ミズーリ州、セントルイスのシグマケミカル社）。フィテート分解酵素を顆粒状デンプンまたはデンプン溶液のいずれかに加えることが考えられている。デンプンが顆粒状形態にあるかまたは溶液中に可溶性であるかにかかわらず、本発明の目的にはフィテート分解酵素が効果的であると考えられている。実際に、フィテート分解酵素を顆粒状デンプンに、すなわち、ゲル化前に加えることは、本発明による溶液を処理するのに効果的であることが分かった。あるいは、コ化中またはその後に、フィターゼをデンプン溶液に加えても差し支えない。別の好ましい実施の形態によると、酵素阻害組成物を液化前に不活化するおよび／または顆粒状デンプンまたはデンプン溶液から除去する。酵素阻害組成物の除去は、フィチン酸またはフィテート塩を含有する化合物を溶液から除去するのに効果的な、従来技術で公知の化学的または機械的分離方法であっても差し支えない。適切な分離方法の例としては、クロマトグラフィー、イオン交換、精密濾過および遠心分離が挙げられる。特に好ましい工程は、ｐＨ依存性フィテート沈殿または熱処理とその後の濾過または遠心分離による除去からなる。また好ましくは、高温遠心分離または高温濾過により酵素阻害組成物の除去を行う。処理中の顆粒状デンプンまたはデンプン溶液のｐＨは、酵素阻害組成物を除去または不活化できるｐＨである。処理工程はどのようなｐＨレベルで行っても差し支えないが、湿式磨砕工程からの顆粒状デンプン粒のｐＨレベルを望ましくなく調節する必要がなくなるので、約４から約６までの間のｐＨで処理を行うことが効率的である。好ましくは、ｐＨは、約4.5から約5.7までの間、より好ましくは、約4.5から約5.5までの間、そして最も好ましくは、約4.5から約5.2までの間である。処理工程のｐＨをこれらの範囲に維持することにより、処理工程のｐＨは、湿式磨砕された穀物デンプン処理流のｐＨに良好に相互関係を示し、したがって、湿式磨砕されたトウモロコシのｐＨを調節することに関連する過剰なコストが避けられる。処理工程の温度は、酵素阻害組成物の除去または不活化に適した温度であり、選択された処理の特定の様式に依存してもよい。処理工程がフィターゼの添加からなる場合には、特定の酵素の加水分解活性に適した温度を選択すべきである。微生物フィターゼに関しては、適切な温度は一般的に、約20℃から約60℃までの間、そして好ましくは約30℃から約40℃までの間である。しかしながら、例えば、100-110℃の温度でフィテートを加水分解できる耐熱性フィターゼ酵素の開発が、特に本発明の範囲内にあるように考えられ、好ましい。処理工程が熱処理と、必要に応じてその後の濾過または遠心分離からなる場合には、温度は、デンプンのコ化温度よりも高く、好ましくは約80℃から約150℃までの間、より好ましくは約90℃から約110℃までの間、そして最も好ましくは約95℃から約110℃までの間にあるべきである。処理工程の時間は、選択された処理の特定の種類により変更してもよい。処理工程がフィターゼの添加からなる場合には、処理時間は、加えられるフィターゼ酵素の特異的活性および保温の温度に依存する。微生物フィターゼに関して、処理時間は、条件に依存して、好ましくは約１時間から約24時間まで、より好ましくは約３時間から約６時間までである。処理工程が、熱処理と、必要に応じてのその後の濾過または遠心分離による顆粒状デンプンまたはデンプン溶液からの酵素阻害組成物の除去からなる場合には、処理時間は、好ましくは約10秒から約60 分まで、より好ましくは約３分から約10分までである。顆粒状デンプンからのフィテートの不活化は、熱のような適切な条件下で実質的に瞬間であってもよく、したがって、処理時間は技術的拘束のみにより制限されてよいと考えられる。熱処理後に、遠心分離または濾過を用いて、この業界で公知の手段により不活化されたフィテートを溶液から分離してもよい。遠心分離を用いて処理中にデンプンからフィテートを分離する場合には、少なくとも2000×ｇのｇ力で、好ましくは約5000×ｇから約10,000×ｇまでの間のｇ力で遠心分離を行う。処理条件は、使用する穀物または磨砕の種類により影響を受けてもよい。例えば、比較的高濃度の酵素阻害組成物を含有する穀物には、低濃度の酵素阻害組成物を有する穀物のものよりも長い処理を必要とするかもしれない。異なる野菜中のフィチン酸含有量の変動レベルがLehrfield,J.のAgric．Food Chem.,42巻,272 6-2731頁(1994)に開示されており、これをここに引用する。乾燥磨砕工程による液化のために穀物を調製する場合には、繊維分画およびタンパク質分画のために、湿式磨砕工程におけるよりも、多量のフィテートが存在しそうである。したがって、乾燥磨砕したデンプンの処理には、湿式磨砕したデンプンよりもより厳重な条件が必要となるかもしれない。顆粒状デンプンまたはデンプン溶液を処理して酵素阻害組成物を不活化および／または除去するのと同時、またはその後に、α−アミラーゼをデンプンに加えて、デンプンを分子量のより小さいデキストリンに液化する。このように、α− アミラーゼを用いて液化するのと同時またはその後に、顆粒状デンプンまたはデンプン溶液を処理することも、本発明の範囲に含まれるものと考えられる。液化は、α−アミラーゼを用いたどのようなよく知られた液化技術により行っても差し支えない。本発明による液化工程中のｐＨは、好ましくは約5.7未満、より好ましくは5.3末満、そして最も好ましくは約4.5から約５までの間にある。以下の実施例は、本発明を使用することにより得られる利点を示すものであり、それらを限定するものではない。しかしながら、当業者は、上述した開示により、条件、穀物、温度、酵素等を置き換えることができる。実施例実施例１ α−アミラーゼの活性を測定するための検定ヨードとともに青色の複合体を形成するデンプンの能力およびデンプンがより短いデキストリン分子に加水分解されたときのこの色の消失に依存する検定により、α−アミラーゼの活性を測定した。α−アミラーゼの活性は、デンプンのコ精化の明確な状態を示す色の変化を生じさせるのに必要な消化時間に関して定義された。以下の試薬を用いた：リン酸塩緩衝液−リン酸二水素カリウム（340ｇ）および水酸化ナトリウム（25.3ｇ）を水に溶解させ、約２リットルに希釈した。緩衝液を室温まで冷却し、ｐＨを6.2±0.1に調節した。緩衝液をメスフラスコ中で２リットルに希釈した。デンプン基質−10グラム（乾燥物質）の可溶性リンターデンプンを50ｍｌの水中に懸濁させ、約300ｍｌの熱湯中で洗浄した。懸濁液を再度沸騰させて、一定に撹拌しながら５分間に亘り沸騰させた。デンプン溶液を一定に撹拌しながら室温まで冷却し、125ｍｌのリン酸塩緩衝液を加えた。この溶液を水で500ｍｌまで希釈した。デンプン基質は毎日新鮮なものを作成した。原料ヨウ素溶液−ヨウ素結晶（5.5ｇ）およびヨウ化カリウム（11.0ｇ）を水中に溶解させ、250ｍｌまで容積的に希釈した。溶液は光から遠ざけた。希釈ヨウ素溶液−ヨウ化カリウム（20ｇ）および２ｍｌの原料ヨウ素溶液を水中に溶解させ、500ｍｌまで容積的に希釈した。溶液は毎日新鮮なものを作成した。酵素希釈溶液−塩化カルシウム（11.1ｇ）を４リットルの水に溶解させた。全ての試薬に用いた水は、蒸留したものか、脱イオンしたものであった。未知のα−アミラーゼ試料を酵素希釈溶液により10-15ＬＵ／ｍｌ（以下に定義するように）の間に希釈した。多くの市販のα−アミラーゼ配合物に関して、適切な希釈は2000倍であることが分かった。希釈ヨウ素溶液の５ミリリットルのアリコートを13×100ｍｍの試験管中に分配し、23×200ｍｍの試験管中に10ｍｌのデンプン基質を配置した。全ての試験管を30℃の水浴中に配置した。特別のα −アミラーゼカラーディスクを備えたヘリゲコンパレータ（カタログ番号620-s5 ）を用いて読取りを行った。５ミリリットルの希釈酵素（30℃である）をデンプン基質と混合し、計時を開始した。適切な時間間隔で、例えば、反応の初期には１分間隔および反応の後期には15秒間隔で、酵素基質混合物の１ｍｌのアリコートを、温度が調節された希釈ヨウ素溶液を含有する試験管に移した。デンプンヨウ素溶液を混合して、13ｍｌの精密角管に移し、ヘリゲコンパレータ内の標準α −アミラーゼカラーディスクと比較した。終了時点の時間が近づくと、0.25秒間隔で試料を採取した。試料の色およびカラーディスクを一致させるのに必要な時間を記録し、活性（１グラムまたは１ｍｌ当たりのリケフォン(liquefons)）を以下の式により計算した：ここで、ＬＵ＝リケフォン単位Ｖ＝酵素の容積（５ｍｌ）ｔ＝コ精化時間（分）Ｄ＝希釈因子：希釈容積÷希釈酵素のミリリットルまたはグラム実施例２デンプン液化条件− 液化したデンプンＤＥ（ブドウ糖当量）の測定 5.5インチの高さで約10インチの直径のコイル中に曲げられた、0.24インチの直径（0.21インチの内径）で50フィートのステンレス鋼管からなる反応器を用いて、デンプンの液化を行った。コイルには、先端から４フィートのところに11.5 インチの直列スタティックミキサ（コールパーマーG-044669-60番）が取り付けられていた。コイルの後端には、約20ｐｓｉの分解圧力に設定されたスワゲロク (Swagelok)直列調節可能圧力開放弁（SS-4CA-3番）が取り付けられていた。デンプンスラリーを、ピストン計量型ポンプにより約70ｍｌ／分の速度でコイルに供給した。105.5℃に加熱されたグリセロール−水浴中に浸漬することにより、コイルを加熱した。浴中の温度は、循環加熱器／温度制御装置（フィッシャーサイエンティフィックモデル7305）を用いて保持した。顆粒状デンプンは、トウモロコシ湿式磨砕器から得て、２日以内に用いた。デンプンの別の供給源として、インディアナ州、ハモンドのアメリカンメイズプロダクツ社から、ＬＯ−ＤＥＸ（登録商標）10（トウモロコシデンプンの制限された加水分解により製造された水溶性精製デキストリン）を購入した。ここで使用したＬＯ−ＤＥＸ10は、約9.5の初期ＤＥを有していた。デンプンまたはマルトデキストリンを脱イオン水により約30-35％乾燥固体の所望の固体レベル希釈し、必要に応じてｐＨを2.5％のＮａＯＨまたは６％のＨＣｌにより調節した。カルシウムをＣａＣｌ₂・２Ｈ₂Ｏの形態で加えた。典型的な液化条件は：デンプンまたはＬＯ−ＤＥＸ10 30％−35％固体カルシウム 40-60ｐｐｍ（30ｐｐｍ追加）ｐＨ 5.0-6.0 α−アミラーゼ炭水化物１ｇ当たり12-14ＬＵ（乾燥基準）酵素およびＣａＣｌ₂・２Ｈ₂Ｏの形態のカルシウムを含有するデンプンまたはＬＯ−ＤＥＸ10を約70ｍｌ／分で反応器中に導入した。反応器の温度は、グリセロール−水浴中に反応器を浸漬することにより、105.5℃に保持した。デンプン試料を反応器から95℃の第２段階の液化浴に移して、90分間保持した。Standard Analytical Method of the Member Companies of the Corn Refiners Associat ion，Inc.，Sixth ed.，Analytical Procedure Cmmittee(1980)に記載されている方法にしたがって、試料のブドウ糖当量（ＤＥ）を測定することにより、第２段階液化の直後にデンプン液化の程度を測定した。実施例３フィテートのＨＰＬＣ分析以下のように、ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）によりフィテートの分析を行った。ミリポア／ウォータース、モデル510ウォータース自動勾配制御装置と、ポロス20ＰＩ／Ｍ樹脂（パーセプティブバイオシステム）が充填された 250ｍｍの4.6ｍｍ（内径）のカラムと、ディオネクス陰イオン阻害器およびディオネクスＳＲＳ制御装置が備え付けられたディオネクス導電率検出器とからなるＨＰＬＣシステムを用いた。市販のフィテート、トウモロコシグルテン流由来のＥＩＣ、粉にひかれた全トウモロコシ、浸漬液、粉にひかれた全小麦粉、粉にひかれた米、および顆粒状デンプン由来のＥＩＣの試料を脱イオン水により10-200 ｍｇ／Ｌフィテートの間に希釈して、濾過して不溶性物質を除去した。20-500ｍｌの間の試料を（フィテートの濃度に依存して）カラム中に注入して、1.3ｍｌ／分の流速で２分間に亘りカラムを水で洗浄した。２分後、０から40ｍＭのＮａＯＨの線形勾配を開始し、1.3ｍｌ／分の流速で次の20分間に亘り処理した。フィテートは、約15分後にカラムから溶離した。ナトリウムフィテート（シグマケミカル社、Ｐ8810番）の一連の線形希釈を用いて導電率検出器の応答を校正した。各々の供給源からのＥＩＣは、市販のフィテートと同一の溶離ピークとなることが分かった。実施例４トウモロコシグルテン流からのＥＩＣの単離以下のように、トウモロコシ湿式磨砕装置内のトウモロコシ内胚乳分別中に製造されたタンパク質が豊富なデンプン流（トウモロコシグルテン流と呼ばれる）から、α−アミラーゼを不活化または阻害する組成物を単離した。不溶性タンパク質およびデンプン顆粒を遠心分離（15分間に亘り約6000×ｇ）によりトウモロコシグルテン分画（約18.6％の固体）から除去した。上澄みを、ワットマン３番濾紙に通す真空濾過によりさらに透明にした。濾液を、5,000の分子量で区別したポリスルホン中空繊維カートリッジ（Ａ／Ｇテクノロジー社、モデルUFP-5-D- 4）を用いた限外濾過により分別した。限外濾過段階からの約1200ｍｌの濾液を、１ＮのＮａＯＨを添加することによりｐＨ９に調節した。形成された沈殿物を遠心分離（10分間に亘り約6000×ｇ）により回収し、水中の再懸濁により洗浄した。遠心分離（10分間に亘り約6000×ｇ）により沈殿物を洗浄水から回収した後、沈殿物を約500ｍｌの水中で再懸濁させ、３ＭのＨＣｌを滴下で加えて、ｐＨをゆっくりと５に調節することにより溶解させた。溶液をワットマン３番濾紙に通して、不溶解物質を除去して、濾液を約４℃に冷却した。２倍の容積のエタノール（４℃で）を濾液に加えて、形成された沈殿物をフリット化ガラスフィルタに通す濾過により回収した。沈殿物を冷たいエタノールで洗浄し、回収し、室温で真空中に配置して、乾燥させた。 1200ｍｌの限外濾過により、3.04ｇのＥＩＣが得られた。実施例５低ｐＨでの液化中におけるＥＩＣによるα−アミラーゼの阻害実施例４で単離したＥＩＣ（０から200ｍｇ／リットル）を、50ｐｐｍのカルシウムを含有する35％のＬＯ−ＤＥＸ10（ｐＨ5.2）に加えた。α−アミラーゼ（B.licheniformisにより産生され、カリフォルニア州、サウスサンフランシスコのジェネンカーインターナショナル社から市販されている、スペザイムＡＡ２０）を12ＬＵ／ｇ炭水化物の率で加え、必要に応じて、2.5％のＮａＯＨまたは６％のＨＣｌを加えることにより、溶液のｐＨをｐＨ5.2に調節し、維持した。実施例２に記載した反応器系を用いて、溶液を加水分解した。ＬＯ−ＤＥＸ10の加水分解の程度を、２回目の停止の直後にブドウ糖当量（ＤＥ）により測定した。表１は、ＥＩＣの濃度が増加するにつれ、液化されたＬＯ−ＤＥＸ10の最終ＤＥ（初期ＤＥ9.5）が減少することを示している。これは、α−アミラーゼの阻害が増大したことを示している。この実施例から分かるように、ＥＩＣの存在により、ｐＨ5.2でのα−アミラーゼの効率が減少する。実施例６ α−アミラーゼのＥＩＣ阻害のｐＨ依存性実施例４で単離したＥＩＣ（200ｍｇ／リットル）を、50ｐｐｍのカルシウムを含有する35％のＬＯ−ＤＥＸ10に加え、ｐＨを約6.0または5.2に調節した。α −アミラーゼ（B．licheniformisにより産生され、ジェネンカーインターナショナル社から市販されている、スペザイムＡＡ２０）を12ＬＵ／ｇ炭水化物の率で加え、必要に応じて、2.5％のＮａＯＨまたは６％のＨＣｌを加えることにより、溶液のｐＨをｐＨ5.2または6.0に調節し、維持した。実施例２に記載した反応器系および方法を用いて、溶液を加水分解した。同一であるが、ＥＩＣを含有しない対照を、試験試料と同時にｐＨ5.2および6.0で作成した。ＬＯ−ＤＥＸ10の加水分解の程度を、２回目の停止の直後にブドウ糖当量（ＤＥ）により測定した。結果を表２に示す。これから分かるように、ＬＯ−ＤＥＸ10の加水分解中のＥＩＣによるα−アミラーゼの阻害は、ｐＨ依存性である。ｐＨ6.0では、200ｍｇ／ＬのＥＩＣを添加しても、たった約６％のみしかＤＥの結果が減少しなかった。ｐＨ5.2では、ＤＥの結果は、約65％減少した。実施例７ＥＩＣの元素分析実施例４におけるようにトウモロコシグルテン分画から単離したＥＩＣに、原子吸光分光分析法により元素分析を行った（テネシー州、ノックスビルのギャルブレイスラボラトリー社）。結果を表３に示す。この分析は、フィチン酸のマグネシウム、マンガン、亜鉛または鉄の塩の混合物であるという分析と矛盾していなかった。その結果、ＥＩＣについて、実施例３に記載したようなＨＰＬＣ分析によりフィテート含有量に関して分析した。この分析は、ＥＩＣの陰イオン成分が実質的にフィテートからなることを示した。実施例８粉にひかれた全トウモロコシからのＥＩＣの単離 250ｇの粉にひかれた全トウモロコシを500ｇの脱イオン水中に懸濁させ、得られたスラリーのｐＨを６％のＨＣｌにより４に調節した。このスラリーを約８時間に亘り撹拌し、次いで、約10時間に亘り放置した。スラリーをワットマン３番の濾紙を用いた濾過により分離し、濾液（約310ｇ）を１ＭのＮａＯＨでｐＨ９に調節した。生成した沈殿物を0.45ｍの精密濾過膜に通す濾過により回収し、水で洗浄した。沈殿物を水中に懸濁させて溶液とし、ｐＨを６％のＨＣｌをゆっくりと添加することにより５に調節した。溶液を濾過して不溶性物質を除去し、約４℃に冷却した。２倍の容積の冷たいエタノールを加え、形成した沈殿物を遠心分離により回収した。この沈殿物を冷たいエタノールで１度洗浄し、室温の真空下で１晩乾燥させた。 250ｇの粉にひかれた全トウモロコシから、0.772ｇのＥＩＣを回収した。実施例３のように、ＥＩＣを、その特徴的なフィテートの存在に関して、ＨＰＬＣ分析により確認した。ｐＨ5.2でＬＯ−ＤＥＸ10の液化混合物に単離したＥＩＣを加え、α−アミラーゼが阻害されたか否かを求めることにより、ＥＩＣの同定を行った。ＣａＣｌ₂・２Ｈ₂Ｏの形態で50ｐｐｍのカルシウムイオンを含有する35 ％のＬＯ−ＤＥＸ10に粉にひかれた全トウモロコシからのＥＩＣ（200ｍｇ／リットル）を加え、ｐＨを約5.2に調節した。α−アミラーゼ（B．licheniformis により産生され、ジェネンカーインターナショナル社から市販されている、スペザイムＡＡ２０）を12ＬＵ／ｇ炭水化物の率で加え、必要に応じて、2.5％のＮａＯＨまたは６％のＨＣｌを加えることにより、溶液のｐＨをｐＨ5.2に調節した。実施例２に記載した反応器系および方法を用いて、溶液を加水分解した。同一であるが、ＥＩＣを含有しない対照を、試験試料と同時にｐＨ5.2で作成した。ＬＯ−ＤＥＸ10の加水分解の程度を、２回目の停止の直後にブドウ糖当量（ＤＥ）により測定した。下記の表４に示した試験の結果は、上述したトウモロコシグルテン流から単離したＥＩＣを用いたときに得られた結果と一致している。粉にひかれた全トウモロコシから単離したＥＩＣのＨＰＬＣ分析は、実施例３のように行った。15ｍｇ／ＬのＥＩＣ溶液100マイクロリットルをＨＰＬＣカラムに注入し、フィテートとして溶離時間により同定されたたった１つの陰イオンピークが物質中に認められた。ＨＰＬＣ分布は、トウモロコシグルテン分画から単離したＥＩＣのものと実質的に同一であった。実施例９トウモロコシ浸漬液からのＥＩＣの単離ロコシ浸漬液、すなわち、蒸発浸漬水濃縮物を遠心分離により浄化した。１リットルの浄化液を、５ＭのＮａＯＨを加えることにより、ｐＨ4.2から8.1に調節した。得られた沈殿物を遠心分離により採集し、水中に懸濁させて沈殿物を洗浄し、再度遠心分離により採集した。沈殿物を約400ｍｌの水中に懸濁させ、６％のＨＣｌをゆっくりと添加することにより、スラリーのｐＨを約４に調節した。沈殿物が溶解した後、溶液をワットマン３番濾紙に通して濾過し、不溶性物質を除去し、濾液を約４℃に冷却した。２倍の容積の氷冷したエタノールを加えることにより、ＥＩＣが溶液から沈殿し、遠心分離により採集した。沈殿物を冷たいエタノールで１度洗浄し、遠心分離により採集し、室温で真空乾燥させた。１リットルの重いトウモロコシ浸漬液から、23.3ｇのＥＩＣを回収した。ｐＨ 5.2でのＬＯ−ＤＥＸ10の加水分解中のα−アミラーゼ不活化の評価およびフィテートのＨＰＬＣ分析により、ＥＩＣを同定した。 α−アミラーゼを用いた液化へのトウモロコシ浸漬液からのＥＩＣの影響を求めるために、ＣａＣｌ₂・２Ｈ₂Ｏの形態で50ｐｐｍのカルシウムイオンを含有する35％のＬＯ−ＤＥＸ10に200ｍｇ／リットルを加え、ｐＨを約5.2に調節した。 α−アミラーゼ（B．licheniformisにより産生され、ジェネンカーインターナショナル社から市販されている、スペザイムＡＡ２０）を12ＬＵ／ｇ炭水化物の率で加え、必要に応じて、2.5％のＮａＯＨまたは６％のＨＣｌを加えることにより、溶液のｐＨをｐＨ5.2に調節した。実施例２に記載した反応器系および方法を用いて、溶液を加水分解した。同一であるが、ＥＩＣを含有しない対照を比較のためにｐＨ5.2で作成した。ＬＯ−ＤＥＸ10の加水分解の程度を、２回目の停止の直後にブドウ糖当量（ＤＥ）により測定した。ＥＩＣを加えないことを除いて同一の対照をｐＨ5.2で作成した。結果を表５に示しす。これらの結果は、上述したトウモロコシグルテン流から単離したＥＩＣを用いたときに得られた結果と一致している。トウモロコシ浸漬液から単離したＥＩＣのＨＰＬＣ分析を実施例３に記載したように行った。200ｍｇ／ＬのＥＩＣ溶液100マイクロリットルをＨＰＬＣカラムに注入し、フィテートとして溶離時間により同定されたたった１つの陰イオンピークが物質中に認められた。ＨＰＬＣ分布は、トウモロコシグルテン分画から単離したＥＩＣのものと実質的に同一であった。実施例１０顆粒状トウモロコシデンプン中のＥＩＣの同定トウモロコシ湿式磨砕からの顆粒状トウモロコシデンプンスラリーをワットマン３番濾紙で濾過して、デンプン顆粒から水を分離した。顆粒状デンプンを脱イオン水中に再懸濁させ、再度濾過して、不溶性デンプンから水溶性成分を除去した。次いで、顆粒状デンプンを水中に再懸濁させて、35％の固体まで希釈した。 B．licheniformisからのα−アミラーゼ（12ＬＵ／ｇ炭水化物）（ジェネンカーインターナショナル社から市販されているスペザイムＡＡ２０）およびカルシウム（50ｐｐｍ）を加え、実施例２に記載したように、ｐＨ5.2で顆粒状デンプンスラリーを液化した。トウモロコシデンプンスラリーの最初の濾過より回収した水を用いてＬＯ−ＤＥＸ10を溶解させ、35％の固体溶液を調製した。α−アミラーゼ（12ＬＵ／ｇ炭水化物）およびＣａＣｌ₂・２Ｈ₂Ｏ（50ｐｐｍ）として加えられるカルシウムイオンを加え、実施例２に記載したようにｐＨ5.2で溶液を液化した。トウモロコシデンプンスラリーからの濾過水ではなくむしろ、脱イオン水中に溶解したＬＯ −ＤＥＸ10を含有する対照を同時に液化した。ＨＰＬＣによりＥＩＣに特徴的なフィテートの存在について分析したときに、顆粒状デンプンスラリーからの濾過水中には、ＥＩＣは検出されなかった。しかしながら、ｐＨ６で液化した顆粒状トウモロコシデンプンのＨＰＬＣ分析では、実施例４においてトウモロコシグルテンから単離したＥＩＣと同一の物質の存在を示す溶離ピークが検出された。ＨＰＬＣ分析は、30重量％固体の液化顆粒状デンプン１リットル当たり30から40ｍｇのフィテートの存在が示された。顆粒状デンプン濾過水と混合したマルトデキストリン中のα−アミラーゼの液化結果と、脱イオン水と混合したＬＯ−ＤＥＸ10中のα−アミラーゼの液化結果とを比較すると、顆粒状デンプン中に存在するＥＩＣは、洗浄により除去できないことを確認された。したがって、下記の表６に示したように、これらの実験結果は、デンプン液化中にα−アミラーゼの不活化の原因であるＥＩＣは、溶液中で遊離しておらず、デンプン顆粒に会合していることを示唆している。実施例１１ＥＩＣのフィターゼによる不活化実施例４において単離した20ｍｌのＥＩＣを30分間に亘りｐＨ2.5、37℃で500 単位のフィターゼ（シグマケミカル社のA．ficuum、P9792から）により処理した。10ｍｌの処理ＥＩＣをＬＯ−ＤＥＸ10に加えて、ＣａＣｌ₂・２Ｈ₂Ｏとして加えられた50ｐｐｍのカルシウムイオンおよび200ｍｇ／ｌのＥＩＣを含有する35 ％のＬＯ−ＤＥＸ10溶液１リットルを得た。B．licheniformis由来のα−アミラーゼ（ジェネンカーインターナショナル社から市販されているスペザイムＡＡ２０）を12ＬＵ／ｇ炭水化物の率で加えて、上述した実施例２に記載した反応器系および方法を用いて、ｐＨ5.2で溶液を液化した。ＥＩＣを加えていないＬＯ− ＤＥＸ10および200ｍｇ／ｍｌの未処理ＥＩＣを含有するＬＯ−ＤＥＸI0からなる対照を同時に液化した。表７に示したように、フィターゼ処理により、ＥＩＣを不活化し、したがって、α−アミラーゼを阻害する能力を防いだ。実施例１２顆粒状トウモロコシデンプンのフィターゼ処理ＣａＣｌ₂・２Ｈ₂Ｏとして加えられた約50ｐｐｍのカルシウムイオンを含有する34％の顆粒状トウモロコシデンプン１リットルにフィターゼ（ミズーリ州、セントルイスのシグマケミカル社から得られる250単位／ｍｌのA．ficcum５ｍｌ、製品番号P9792からの）を加え、37℃、ｐＨ4.0で５時間に亘り保温した。保温後、顆粒状デンプンスラリーのｐＨを5.2に調節して、B．licheniformisからの12 ＬＵ／ｇ炭水化物のα−アミラーゼ（ジェネンカーインターナショナル社から市販されているスペザイムＡＡ２０）を顆粒状デンプンスラリーに加えた。この混合物を実施例２に記載した反応器系を用いて液化した。フィターゼにより処理しなかった34％の顆粒状トウモロコシデンプンスラリーを用いたｐＨ5.2の対照液化を同時に行った。第２の試験において、ＣａＣｌ₂・２Ｈ₂Ｏとして加えられた約50ｐｐｍのカルシウムイオンを含有する35％の顆粒状トウモロコシデンプンスラリー１リットルとともに55℃、ｐＨ5.15で６時間に亘りフィターゼ（小麦からの、シグマケミカル社P1259、160単位）を保温した。保温後、顆粒状デンプンスラリーのｐＨをｐＨ5.5に調節して、B．licheniformisからの12ＬＵ／ｇ炭水化物のα−アミラーゼ（ジェネンカーインターナショナル社から市販されているスペザイムＡＡ２０）をスラリーに加えた。この混合物を実施例２に記載した反応器系および方法を用いて液化した。フィターゼにより処理しなかった35％の顆粒状トウモロコシデンプンスラリーを用いたｐＨ5.5の対照液化を同時に行った。表８に示すように、液化前に顆粒状トウモロコシデンプンをフィターゼ処理することにより、α−アミラーゼの低ｐＨでデンプンを加水分解する能力が増大する。実施例１３ＥＩＣを含有するマルトデキストリンの熱濾過実施例４のように単離したＥＩＣ（200ｍｇ／リットル）を、ＣａＣｌ₂・２Ｈ₂ Ｏの形態で加えられる50ｐｐｍのカルシウムを含有する35％の重量／重量ＬＯ −ＤＥＸ10に加え、ｐＨを約5.2に調節した。この溶液を２部に分けた。一方を約100℃に加熱して、熱い間に直ちにワットマン３番の濾紙に通して真空濾過した。他方を室温で（例えば、20-25℃）ワットマン３番の濾紙に通して真空濾過した。α−アミラーゼ（B．licheniformisにより産生され、ジェネンカーインターナショナル社から市販されている、スペザイムＡＡ２０）を12ＬＵ／ｇ炭水化物の率で加え、必要に応じて、2.5％のＮａＯＨまたは６％のＨＣｌを加えることにより、各々の溶液のｐＨをｐＨ5.2に調節した。実施例２に記載した反応器系および方法を用いて、各々の溶液を加水分解した。ＬＯ−ＤＥＸ10の加水分解の程度を、２回目の停止の直後にブドウ糖当量（ＤＥ）により測定した。加水分解の前に採取した両方の溶液の試料を、実施例３に記載したように、フィテートに関して分析した。表９に示すように、約100℃でのＥＩＣ含有ＬＯ−ＤＥＸ10の濾過により、溶液から約75％のＥＩＣが除去される。その結果、ｐＨ5.2での液化中にわずかしかα−アミラーゼが不活化されず、得られた水解物のＤＥは実質的に大きかった。実施例１４玄米からのＥＩＣの単離小さなコーヒーミルを用いて、バスマチ(Basmati)玄米（ランドバーグミルスから市販されている）を微粉のコンシステンシーまで粉にひいた。200グラムの粉にひかれた米を500ｍｌの脱イオン水に加えて、６％のＨＣｌによりｐＨを約３に調節した。時折撹拌しながらスラリーを30時間に亘り放置し、次いで、ワットマン３番の濾紙に通す真空濾過により分別した。１ＭのＮａＯＨを加えることにより、濾液のｐＨを９に調節し、発生した沈殿物を遠心分離により回収した。沈殿物を水で１度洗浄し、遠心分離により再度回収し、水中に再懸濁させた。６％のＨＣｌを滴下して加えることにより、懸濁液のｐＨをゆっくりと約５に調節し、懸濁液を撹拌して、沈殿物を溶解させた。５ｍの精密濾過膜に通す濾過により不溶解物質を除去して、濾液を約４℃に冷却した。２倍の容積の冷たいエタノールを濾液に加えて、形成した沈殿物を遠心分離により回収した。沈殿物を冷たいエタノールで１度洗浄し、室温の真空下で乾燥させた。 200グラムの粉にひかれた米から、0.3571ｇのＥＩＣが得られた。ｐＨ5.2でのＬＯ−ＤＥＸ10の加水分解中のα−アミラーゼの不活化の評価およびフィテートに関するＨＰＬＣ分析により、ＥＩＣを同定した。ＣａＣｌ₂・２Ｈ₂Ｏとして加えられる50ｐｐｍのカルシウムイオンを含有する 35％のＬＯ−ＤＥＸ10に、粉にひかれた米からのＥＩＣ（200ｍｇ／リットル）を加え、ｐＨを約5.2に調節した。B．licheniformis由来のα−アミラーゼ（ジェネンカーインターナショナル社から市販されている、スペザイムＡＡ２０）を 12ＬＵ／ｇ炭水化物の率で加え、必要に応じて、2.5％のＮａＯＨまたは６％のＨＣｌを加えることにより、溶液をｐＨ5.2に調節した。実施例２に記載した反応器系および方法を用いて、溶液を加水分解した。ＬＯ−ＤＥＸ10の加水分解の程度を、２回目の停止の直後にブドウ糖当量（ＤＥ）により測定した。これらの試験の結果を表１０に示す。粉にひかれた米から単離したＥＩＣのＨＰＬＣ分析を実施例３に記載したように行った。15ｍｇ／ＬのＥＩＣ溶液100マイクロリットルをＨＰＬＣカラムに注入し、フィテートとして溶離時間により同定されたたった１つの陰イオンピークが試料中に認められた。ＨＰＬＣ分布は、トウモロコシグルテン分画から単離したＥＩＣのものと実質的に同一であった。実施例１５全小麦粉からのＥＩＣの単離 12ｍＭのＤ，Ｌ−ジチオトレイトール（シグマケミカル社）を含有する500ｍｌの脱イオン水に200グラムの市販の全小麦粉（アローヘッドミルスから市販されている）を加えた。６％のＨＣｌによりスラリーのｐＨを約３に調節して、時折撹拌しながら、約30時間に亘りスラリーを室温で放置した。このスラリーを遠心分離により分別した。１ＭのＮａＯＨを加えることにより、濾液のｐＨを９に調節し、形成した沈殿物を遠心分離により回収した。沈殿物を水により１度洗浄し、遠心分離により再度回収し、水中に再懸濁させた。６％のＨＣｌを滴下により加えて、懸濁液のｐＨをゆっくりと約５に調節し、懸濁液を撹拌して沈殿物を溶解させた。５ｍの精密濾過膜に通す濾過により、不溶解物質を除去し、濾液を約４℃に冷却した。２倍の容積の冷たいエタノールを濾液に加え、形成した沈殿物を遠心分離により回収した。沈殿物を冷たいエタノールにより１度洗浄し、室温の真空下で乾燥させた。 200グラムの全小麦粉から、0.385ｇのＥＩＣが得られた。ｐＨ5.2でのＬＯ− ＤＥＸ10の加水分解中のα−アミラーゼの不活化の評価およびフィテートに関するＨＰＬＣ分析により、ＥＩＣを同定した。 50ｐｐｍのカルシウムを含有する35％のＬＯ−ＤＥＸ10に、全小麦粉からのＥＩＣ（150ｍｇ／リットル）を加え、ｐＨを約5.2に調節した。B．licheniformis 由来のα−アミラーゼ（ジェネンカーインターナショナル社から市販されている、スペザイムＡＡ２０）を12ＬＵ／ｇ炭水化物の率で加え、必要に応じて、2.5 ％のＮａＯＨまたは６％のＨＣｌを加えることにより、溶液のｐＨをｐＨ5.2に調節した。実施例２に記載した反応器系および方法を用いて、溶液を加水分解した。比較のためにＥＩＣを含有しない対照を同一条件下で作成した。ＬＯ−ＤＥＸ 10の加水分解の程度を、２回目の停止の直後にブドウ糖当量（ＤＥ）により測定した。これらの試験の結果を表１１に示す。全小麦粉から単離したＥＩＣのＨＰＬＣ分析を実施例３に記載したように行った。15ｍｇ／ＬのＥＩＣ溶液100マイクロリットルをＨＰＬＣカラムに注入し、フィテートとして溶離時間により同定されたたった１つの陰イオンピークが試料中に認められた。ＨＰＬＣ分布は、トウモロコシグルテン分画から単離したＥＩＣのものと実質的に同一であった。実施例１６ 95 ℃への加熱によるＥＩＣの沈殿 50ｐｐｍのカルシウムイオン（ＣａＣｌ₂・２Ｈ₂Ｏとして加えられる）を含有する35％の重量／重量のＬＯ−ＤＥＸI0に、実施例４のように単離したＥＩＣ（ 200ｍｇ／Ｌ）を加え、2.5％のＮａＯＨによりｐＨを5.2に調節した。ＬＯ−ＤＥＸ10の溶液を２部に分けた。一方の溶液を実施例２に記載した反応器に通過させることにより、約６分間に亘り95℃に加熱した。反応器に通過させた後、12ＬＵ／ｇの炭水化物の速度で溶液にα−アミラーゼ（B．licheniformisにより産生され、ジェネンカーインターナショナル社から市販されている、スペザイムＡＡ２０）を加えた。次いで、溶液を90分間に亘り95℃で保温した。90分間の保温の直後にＬＯ−ＤＥＸ10の加水分解の程度をブドウ糖当量（ＤＥ）により測定した。もう一方のＥＩＣ含有マルトデキストリン溶液にα−アミラーゼ（12ＬＵ／ｇ、B．licheniformisにより産生され、ジェネンカーインターナショナル社から市販されている、スペザイムＡＡ２０）を添加し、温度が95℃であったことを除いて、実施例２に記載したように反応器系に通した。次いで、この溶液を90分間に亘り95℃で保温した。90分間の保温の直後に、ＬＯ−ＤＥＸ10の加水分解の程度をブドウ糖当量（ＤＥ）により測定した。比較のために、同一であるがＥＩＣを含有しない対照をｐＨ5.2で同時に作成した。表１２に示すように、試験の結果は、液化中にα−アミラーゼを不活化するＥＩＣの能力を加熱により低減できることを示している。実施例１７ 105.5 ℃への加熱によるマルトデキストリンからのＥＩＣの沈殿 50ｐｐｍのカルシウムイオン（ＣａＣｌ₂・２Ｈ₂Ｏとして加えられる）を含有する35％の重量／重量のＬＯ−ＤＥＸ10に、実施例４のように単離したＥＩＣ（ 200ｍｇ／Ｌ）を加え、2.5％のＮａＯＨによりｐＨを5.2に調節した。ＬＯ−ＤＥＸ10の溶液を２部に分けた。一方の溶液を実施例２に記載した反応器に通過させることにより、約６分間に亘り105.5℃に加熱した。反応器に通過させた後、1 2ＬＵ／ｇの炭水化物の率で溶液にα−アミラーゼ（B．licheniformisにより産生され、ジェネンカーインターナショナル社から市販されている、スペザイムＡＡ２０）を加えた。次いで、溶液を90分間に亘り95℃で保温した。90分間の保温の直後にＬＯ−ＤＥＸ10の加水分解の程度をブドウ糖当量（ＤＥ）により測定した。もう一方のＥＩＣ含有マルトデキストリン溶液にα−アミラーゼ（12ＬＵ／ｇ、B．licheniformisにより産生され、ジェネンカーインターナショナル社から市販されている、スペザイムＡＡ２０）を添加し、105.5℃の温度で、実施例２に記載したように反応器系に通した。次いで、この溶液を90分間に亘り95℃で保温した。90分間の保温の直後に、ＬＯ−ＤＥＸ10の加水分解の程度をブドウ糖当量（ＤＥ）により測定した。比較のために、同一であるがＥＩＣを含有しない対照をｐＨ5.2で同時に作成した。表１３に示すように、試験の結果は、液化中にα−アミラーゼを不活化するＥＩＣの能力をα−アミラーゼの添加の前の加熱により低減できることを示している。ＥＩＣを加えずに、熱処理を行わない対照と比較した場合、ＥＩＣを加え、熱処理を行った後に観察されたＤＥの増加の原因は、ＬＯ−ＤＥＸ10中にＥＩＣが存在することであると考えられている。もちろん、上述した好ましい実施の形態に、幅広い変更を行っても差し支えない。したがって、上述した詳細な記載は、本発明の範囲を定義するのは、全ての同等のものを含む請求の範囲であるものと理解されよう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＦＩ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＲ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＵ，ＶＮ (72)発明者ミッチンソン，コリンアメリカ合衆国カリフォルニア州 94080 サウスサンフランシスコキンボールウェイ 180 ジェネンコアインターナショナルインコーポレーテッド内 (72)発明者ソルヘイム，リーフピーアメリカ合衆国カリフォルニア州 94080 サウスサンフランシスコキンボールウェイ 180 ジェネンコアインターナショナルインコーポレーテッド内

Claims

【特許請求の範囲】１．デンプンを液化する方法であって、 (a) 前記デンプンを液化する前または同時に該デンプンを処理して、該デンプン中に存在する酵素阻害組成物を不活化および／または除去して、処理デンプンを形成し、 (b) 該デンプンにα−アミラーゼを加え、 (c) 該処理デンプンを液化するのに効果的な時間と温度で該処理デンプンを反応させる各工程からなることを特徴とする方法。２．前記工程(a)が、フィテート分解活性を有する酵素を前記デンプンに添加する工程からなることを特徴とする請求の範囲１記載の方法。３．前記フィテート分解活性を有する酵素が、前記α−アミラーゼと同時に添加されることを特徴とする請求の範囲２記載の方法。４．前記フィテート分解活性を有する酵素が、デンプン１グラム当たり約0.1から約100までの間のフィターゼ単位濃度で添加されることを特徴とする請求の範囲２記載の方法。５．前記工程(a)が、前記α−アミラーゼの添加の前に、前記デンプンを約80℃ から約150℃までの間の温度に加熱して前記酵素阻害組成物を不活化する工程からなることを特徴とする請求の範囲１記載の方法。６．遠心分離により前記酵素阻害組成物を除去する工程を含むことを特徴とする請求の範囲５記載の方法。７．前記遠心分離が、前記デンプンの温度の上昇に続いて、または同時に行われることを特徴とする請求の範囲６記載の方法。８．前記工程(b)が前記工程(a)と同時に行われることを特徴とする請求の範囲１記載の方法。９．前記工程(b)が前記工程(a)に続いて行われることを特徴とする請求の範囲１記載の方法。 10．前記工程(c)が6.0未満のｐＨで行われることを特徴とする請求の範囲１記載の方法。 11．前記工程(c)が約4.5から約5.7までの間のｐＨで行われることを特徴とする請求の範囲１記載の方法。 12．前記工程(c)が約4.5から約5.2までの間のｐＨで行われることを特徴とする請求の範囲１記載の方法。 13．前記工程(a)の前に、約60℃から約90℃までの間の温度でα−アミラーゼを前記デンプンに加えて、該デンプンから前記酵素阻害組成物を開放することを特徴とする請求の範囲９記載の方法。 14．前記工程(a)が、前記酵素阻害組成物を不活化するのに十分な時間と温度で前記デンプンを加熱することにより、前記α−アミラーゼの添加後に熱処理を行って該デンプンから該酵素阻害組成物を開放する工程からなることを特徴とする請求の範囲13記載の方法。 15．加水分解酵素を不活化する方法であって、該加水分解酵素を含有する水性混合物に酵素阻害組成物を添加する工程からなることを特徴とする方法。 16．前記加水分解酵素がα−アミラーゼからなることを特徴とする請求の範囲13 記載の方法。 17．前記酵素阻害組成物がフィテートまたはその塩からなることを特徴とする請求の範囲14記載の方法。 18．5.0未満のｐＨでのα−アミラーゼおよび水性デンプンの混合物からなる組成物であって、酵素阻害組成物を実質的に含まないことを特徴とする組成物。