JPH11194128A - 免疫測定用担体及びそれを用いた免疫測定用固相の調製方法 - Google Patents

免疫測定用担体及びそれを用いた免疫測定用固相の調製方法

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JPH11194128A
JPH11194128A JP36801897A JP36801897A JPH11194128A JP H11194128 A JPH11194128 A JP H11194128A JP 36801897 A JP36801897 A JP 36801897A JP 36801897 A JP36801897 A JP 36801897A JP H11194128 A JPH11194128 A JP H11194128A
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water
organic solvent
carrier
microplate
immunoassay
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JP36801897A
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Toshiaki Kumazawa
俊明 熊澤
Hiroaki Tagami
浩明 田上
Yoshiyasu Kitani
孔保 木谷
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Srl KK
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Srl KK
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 マイクロプレートのウェルに、抗原や抗体等
の免疫活性物質を効率良く固相化することを可能にする
こと。 【解決手段】 マイクロプレートのウェルを、該マイク
ロプレートの材料を溶解しない水溶性有機溶媒で処理し
た後、乾燥させて成る免疫測定用担体を提供した。

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】
【発明の属する技術分野】免疫測定法にはラテックス粒
子を用いその凝集の度合から測定を行うものや、ガラス
ビーズ等にリガンドを固相化して生理活性物質を反応さ
せ、これに対する抗体に酵素や放射性物質を標識したも
のを用いる酵素免疫測定(EIA)法や放射免疫測定
(RIA)法等がある。EIA法やRIA法ではそれぞ
れ酵素に対する基質から発色の度合を測定したり、ガン
マカウンタで放射線の強度を測定する。測定感度は、R
IA法>EIA法>ラテックス凝集法の順番となる。し
かし、測定に要する反応時間は測定感度の逆の順位とな
る。
【0002】従来、EIA法はガラスビーズ等を担体と
して用いているが、独立した反応容器が必要であり、B
F分離の際にも数mlの洗浄液が必要なことから操作性
に問題があった。そこで登場したのが96個のウェルを
備えたマイクロプレートだった。マイクロプレートは現
在、免疫測定の分野で非常に広く用いられており、通
常、ポリスチレンでできている。ポリスチレンは抗体等
をよく吸着するのでポリスチレン製のマイクロプレート
のウェルは、免疫測定用担体として優れている。例え
ば、ガラスビーズの場合には1μg/mlの濃度の抗原
液を固相化するのに1ml程度の抗原液が必要である
が、マイクロプレートでは100μl程度でよい。
【0003】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、ポリス
チレン製のマイクロプレートといえども、固相化に必要
とするリガンドの量に対し、実際に固相化されたリガン
ドは添加量の数パーセントから数10パーセントでしか
ない。従って、固相化効率を向上させることが望まれて
おり、もしこれが向上すれば、測定感度を向上させるこ
とができるか、あるいは、測定時間を短縮することがで
きる。
【0004】従って、本発明の目的は、マイクロプレー
トのウェルに、抗原や抗体等の免疫活性物質を効率良く
固相化することを可能にすることである。
【0005】
【課題を解決するための手段】本願発明者らは、鋭意研
究の結果、マイクロプレートのウェルを、水溶性有機溶
媒で処理した後、乾燥させることにより、抗体や抗原等
の固相化効率が有意に向上することを見出し、本発明を
完成した。
【0006】すなわち、本発明は、マイクロプレートの
ウェルを、該マイクロプレートの材料を溶解しない水溶
性有機溶媒で処理した後、乾燥させて成る免疫測定用担
体を提供する。また、本発明は、上記本発明の免疫測定
用担体と、免疫活性物質とを接触させて該免疫活性物質
を前記免疫測定用担体に固相化することから成る、免疫
測定用固相の調製方法を提供する。
【0007】
【発明の実施の形態】本発明に用いられるマイクロプレ
ートは、特に限定されず、市販のものであってよい。特
に、ポリスチレン製のものが抗原や抗体等の吸着性に優
れているので好ましい。ポリスチレン製のマイクロプレ
ートは広く市販されているので、それらを利用すること
ができる。γ線を照射したマイクロプレートも利用する
ことができる。
【0008】本発明で言う「水溶性有機溶媒」とは、水
を10v/v %以上溶解することができる有機溶媒を意味
し、好ましくは水を20v/v %以上溶解することができ
る有機溶媒である。なお、水溶性有機溶媒は、マイクロ
プレートの材料を溶解するものであってはならない。本
発明に用いることができる水溶性有機溶媒の好ましい例
として、メタノール、エタノール、プロパノール(n-,i
so- )、ブタノール(n-, sec-, tert-)、のような炭素
数1〜4の脂肪族アルコールを挙げることができるが、
これらに限定されるものではなく、上記した「水溶性有
機溶媒」の定義に当てはまり、かつ、マイクロプレート
の材料を溶解しないものはいずれも用いることができ
る。また、複数の有機溶媒を混合して用いることも可能
である。これらのうち、プロパノール、2−プロパノー
ルが最も好ましい。なお、これらの水溶性有機溶媒は、
水を全く含まない状態で使用するのが最も好ましいが、
水をさらに10v/v%以上溶解することができるので
あれば、水を含んでいてもよい。もっとも、水の量は少
ないほど好ましく、20v/v%以下が好ましく、さら
に好ましくは10v/v%以下である。
【0009】水溶性有機溶媒による処理は、マイクロプ
レートのウェルに水溶性有機溶媒を入れることにより、
あるいは、マイクロプレートを水溶性有機溶媒中に浸漬
したりすることにより行うことができる。処理は、水溶
性有機溶媒が液体である状態を維持できるいずれの温度
でも行うことができ、従って、室温で行うのが最も簡便
である。
【0010】処理後、マイクロプレートのウェルを乾燥
させる。乾燥は、水溶性有機溶媒の除去が達成されれば
よく、通常、室温ないし120℃で30秒ないし20分
間程度、好ましくは30秒ないし10分間程度行うこと
ができる。また、乾燥は乾燥機内で行ってもよいが、乾
燥時間を10分間以下にするのであれば、室内で行って
もよい。
【0011】乾燥後、直ちに免疫活性物質を固相化す
る。乾燥後の担体を空気中に放置すると、空気中の水分
が再度担体表面に付着するので、できるだけ速やかに固
相化処理に移ることが好ましく、室内に放置する場合、
水性有機溶媒による処理から固相化処理までの時間は1
0分間以下が好ましく、さらに好ましくは5分間以下で
ある。なお、担体にリガンドを結合させる直前に水溶性
有機溶媒処理を行うことが好ましいが、水溶性有機溶媒
で処理したマイクロプレートを乾燥器内や真空包装内に
収容して湿気を遮断することにより、保存や輸送が可能
である。また、水溶性有機溶媒中に浸漬した状態で保存
や輸送を行うことも可能である。
【0012】担体に固相化される免疫活性物質(本明細
書において「リガンド」ということがある)は、抗原抗
体反応を行うことができるあらゆる物質を意味し、抗原
及び抗体のみならず、それらの断片、例えばハプテンや
抗体のFab フラグメント、F(ab')2 フラグメント等をも
包含する。また、固相化は、リガンドを緩衝液中に溶解
した溶液と担体とを接触させることにより行うことがで
きる。この場合、固相化反応は、従来と同様、室温で1
5分間〜2時間程度、4℃なら一夜程度で行うことがで
きる。また、固相化に用いるリガンド溶液の濃度は、リ
ガンドの種類や測定すべき検体中の物質の種類や濃度に
応じて適宜選択することが可能であるが、通常0.5〜
200μg/ml程度である。
【0013】本発明の免疫測定用担体は、固相担体を用
いて行う免疫測定を行う方法のいずれにも用いることが
でき、これを用いた免疫測定方法自体は基本的に従来と
同様である。すなわち、本発明の免疫測定用担体には、
上記のようにリガンドを固相化する。このようなリガン
ドを本発明の免疫測定用担体に固相化したものは従来と
同様、例えばサンドイッチ法等に用いることができる。
【0014】サンドイッチ法に用いる場合、従来と同
様、リガンドを固相化した本発明の担体を、カゼインや
ウシ血清アルブミン(BSA)等のタンパク質でブロッ
キング後、検体と反応させる。次いで、担体を洗浄後、
第2抗体を反応させ、洗浄後、固相に残っている第2抗
体を測定する。第2抗体の測定は、予め第2抗体を酵
素、蛍光色素、ビオチン、放射性物質等で標識してお
き、これらの標識を検出することにより行うことができ
る。なお、本発明の免疫測定用担体は、サンドイッチ法
に限らず、リガンドを固相化して用いるあらゆる免疫測
定に利用可能である。
【0015】下記実施例に具体的に示されるように、マ
イクロプレートのウェルを水溶性有機溶媒で処理するこ
とにより、免疫測定の感度が有意に上昇し、従って、同
じ測定条件で同程度の感度を達成するのに必要なリガン
ドの量を有意に減少させることができる。リガンドは高
価であるので、リガンドの量を減少できることは大きな
利点である。
【0016】水溶性有機溶媒による処理を行うことによ
り、なぜ免疫測定の感度が向上するのかは確認されてい
ないが、おそらく有機溶媒が蒸発する際に、マイクロプ
レートのウェルの表面に付着している水が分離レベルで
除去されるために、固相化できるリガンドの量が増大す
ることに起因すると推測される。
【0017】
【実施例】以下、実施例により、本発明をより具体的に
説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定される
ものではない。
【0018】実施例1 (1) マイクロプレートの処理 市販のポリスチレン製マイクロプレート(NUNC社製
468667マキシソープ)の各ウェルに100μlの
2−プロパノールを8連ピペットで滴下した。室温で5
分間放置し、2−プロパノールを蒸発させた。蒸発の完
了は、2−プロパノール臭を感じないことから確認し
た。
【0019】(2) 抗体固相の確認 ペルオキシダーゼ標識抗ヒトIgG抗体(ジャクソン社
製)を下記表1に示す抗体量となるように0.01M
PBS pH7で希釈して、上記マイクロプレートの各
ウェルに100μl添加した。室温で1時間固相化後、
各ウェルを300μlの0.05% Tween20(商品名)
0.01M PBS pH7 で4回洗浄してBF分離をした。
【0020】ペルオキシダーゼに対する基質であるテト
ラメチルベンジジン(TMB)の溶液200μlを添
加、室温で5分間反応させ、2N硫酸を100μl添加
して酵素反応を停止した。市販のマイクロプレートリー
ダー(日本インターメッドマイクロプレートリーダーN
J2001)を用いて450nmでの吸光度を測定し
た。結果を下記表1に示す。
【0021】比較例1 実施例1において、2−プロパノールによる処理を行わ
ないことを除き、実施例1と同じ処理を行った。結果を
下記表1に示す。
【0022】
【表1】
【0023】表1に示されるように、2−プロパノール
で処理したウェルを用いた場合には、2−プロパノール
で処理しなかったウェルを用いた場合よりも有意に測定
感度が向上した。
【0024】実施例2 (1) 市販のポリスチレン製マイクロプレート(NU
NC社製468667マキシソープ)の各ウェルに60
μlの2−プロパノールを8連ピペットで滴下した。室
温で10分間放置し、2−プロパノールを蒸発させた。
蒸発の完了は、2−プロパノール臭を感じないことから
確認した。
【0025】(2) C型肝炎ウイルス(HCV)コアペ
プチド抗原の固相化 上記マイクロプレートの各ウェルにアミノ酸40個で合
成したHCVコアペプチドを0.01M PBS pH
7で1μg/mlの濃度の調製、100μlを各ウェル
へ加えて固相化した。固相化は室温で1時間行った。3
00μlの0.05% Tween20(商品名)0.01M PBS pH
7 で3回洗浄し、200μlの0.01%ゼラチン0.01
M PBS pH7 を室温で1時間反応させ、ブロッキングし
た。
【0026】(3) HCVコア抗体の測定 他の手法でHCVコアが陽性及び陰性を示した血清を用
いて測定を行った。血清サンプルは、10%ヤギ血清1
%BSA0.05%Tween 20 0.01M PBS pH7で50倍に
希釈した。希釈した血清サンプルは各ウェルは100μ
l添加した。室温で30分間反応後、300μlの0.
05% Tween20(商品名)0.01M PBS pH7 で5回洗浄し
た。さらに、TMB基質溶液を100μl添加して室温
で15分間反応後、2N硫酸を100μl添加した。市
販のマイクロプレートリーダー(日本インターメッドマ
イクロプレートリーダーNJ2001)を用いて490
nmでの吸光度を測定した。その結果、陰性サンプルで
は吸光度は0.215であり、陽性サンプルでは吸光度
は1.568であった。
【0027】比較例2 2−プロパノールでウェルを処理しないことを除き、実
施例2と全く同じ操作を行った。
【0028】その結果、陰性サンプルでは吸光度は0.
214であり、陽性サンプルでは吸光度は1.356で
あった。
【0029】実施例2と比較例2の比較から、本発明に
よれば、測定感度が約16%向上した。
【0030】
【発明の効果】本発明によれば、従来のマイクロプレー
トよりも固相化効率の優れたマイクロプレートから成る
免疫測定用担体が提供された。本発明の免疫測定用担体
を用いることにより、免疫測定の感度を有意に向上させ
ることができる。

Claims (5)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 マイクロプレートのウェルを、該マイク
    ロプレートの材料を溶解しない水溶性有機溶媒で処理し
    た後、乾燥させて成る免疫測定用担体。
  2. 【請求項2】 前記水溶性有機溶媒は、炭素数1〜4の
    脂肪族アルコールである請求項1記載の免疫測定用担
    体。
  3. 【請求項3】 前記水溶性有機溶媒はプロパノールであ
    る請求項2記載の免疫測定用担体。
  4. 【請求項4】 前記マイクロプレートは、ポリスチレン
    から成る請求項1ないし3のいずれか1項に記載の免疫
    測定用担体。
  5. 【請求項5】 請求項1ないし4のいずれか1項に記載
    の免疫測定用担体と、免疫活性物質とを接触させて該免
    疫活性物質を前記免疫測定用担体に固相化することから
    成る、免疫測定用固相の調製方法。
JP36801897A 1997-12-27 1997-12-27 免疫測定用担体及びそれを用いた免疫測定用固相の調製方法 Pending JPH11194128A (ja)

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