JPH10206427A - 免疫測定法 - Google Patents
免疫測定法Info
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- JPH10206427A JPH10206427A JP738697A JP738697A JPH10206427A JP H10206427 A JPH10206427 A JP H10206427A JP 738697 A JP738697 A JP 738697A JP 738697 A JP738697 A JP 738697A JP H10206427 A JPH10206427 A JP H10206427A
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- Japan
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- antigen
- measured
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- Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 大きな分子にも利用できる蛍光偏光解消度を
用いる免疫測定法を提供する。 【解決手段】 測定対象の抗原または抗体を含む測定試
料、磁性粒子表面上に結合した測定対象の抗原または抗
体に対応する抗体または抗原、ならびに、蛍光標識され
た抗原または抗体とを混合して抗原抗体反応させた後、
磁力によって磁性粒子を固定し、蛍光偏光解消度の変化
を測定することを特徴とする免疫測定法。
用いる免疫測定法を提供する。 【解決手段】 測定対象の抗原または抗体を含む測定試
料、磁性粒子表面上に結合した測定対象の抗原または抗
体に対応する抗体または抗原、ならびに、蛍光標識され
た抗原または抗体とを混合して抗原抗体反応させた後、
磁力によって磁性粒子を固定し、蛍光偏光解消度の変化
を測定することを特徴とする免疫測定法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は抗原あるいは抗体の
測定法に関するもので、特に蛍光偏向解消度を利用した
ホモジニアスイムノアッセイに関するものである。
測定法に関するもので、特に蛍光偏向解消度を利用した
ホモジニアスイムノアッセイに関するものである。
【０００２】
【従来の技術】生体成分を検出する方法には様々なもの
がある。例えば抗原性を有するような物質であれば、特
定の成分に対して親和性を有する抗体を作成することが
可能であり、そのような抗体を使用して特定の生体成分
を高感度で測定することが可能である。このような方法
はイムノアッセイと呼ばれ、生体成分の検出に広く用い
られている。
がある。例えば抗原性を有するような物質であれば、特
定の成分に対して親和性を有する抗体を作成することが
可能であり、そのような抗体を使用して特定の生体成分
を高感度で測定することが可能である。このような方法
はイムノアッセイと呼ばれ、生体成分の検出に広く用い
られている。
【０００３】イムノアッセイでは抗原抗体反応でとらえ
た成分を様々な方法で検出することによって、その成分
の存在を明らかにすることができる。そのような検出の
ための物質としてはラジオアイソトープや酵素、蛍光色
素や発光試薬などが使用されている。
た成分を様々な方法で検出することによって、その成分
の存在を明らかにすることができる。そのような検出の
ための物質としてはラジオアイソトープや酵素、蛍光色
素や発光試薬などが使用されている。
【０００４】試料中の抗原濃度を測定するイムノアッセ
イ法として最も一般的な方法はサンドイッチ法と呼ばれ
ている。これは２種類の抗体を使用し、片方を何らかの
固相に結合し、もう片方に何らかの標識を行ったものを
用意する。固相の抗体と標識物を結合した抗体は試料中
の抗原と反応して抗原を挟み込んだサンドイッチのよう
な形で固相に結合することになる。固相に結合できなか
った標識抗体を除去した後、固相に残存した標識体の量
を測定することによって試料中の抗原濃度を知ることが
できる。
イ法として最も一般的な方法はサンドイッチ法と呼ばれ
ている。これは２種類の抗体を使用し、片方を何らかの
固相に結合し、もう片方に何らかの標識を行ったものを
用意する。固相の抗体と標識物を結合した抗体は試料中
の抗原と反応して抗原を挟み込んだサンドイッチのよう
な形で固相に結合することになる。固相に結合できなか
った標識抗体を除去した後、固相に残存した標識体の量
を測定することによって試料中の抗原濃度を知ることが
できる。
【０００５】サンドイッチ法においては固相に結合した
標識抗体と結合しなかった標識体とを何らかの方法で分
離する必要がある。この操作をＢ／Ｆ分離といい、この
操作を行うようなイムノアッセイをへテロジニアスイム
ノアッセイと呼んでいる。ヘテロジニアスなイムノアッ
セイは感度が高く、試料の影響もあまり受けない良い方
法ではあるが、Ｂ／Ｆ分離という操作が煩雑であり手間
がかかる。現在全自動のイムノアッセイ装置の多くがこ
のようなヘテロジニアスな方法を採用しており、洗浄操
作を行うために大がかりで高価な機構を備えている。
標識抗体と結合しなかった標識体とを何らかの方法で分
離する必要がある。この操作をＢ／Ｆ分離といい、この
操作を行うようなイムノアッセイをへテロジニアスイム
ノアッセイと呼んでいる。ヘテロジニアスなイムノアッ
セイは感度が高く、試料の影響もあまり受けない良い方
法ではあるが、Ｂ／Ｆ分離という操作が煩雑であり手間
がかかる。現在全自動のイムノアッセイ装置の多くがこ
のようなヘテロジニアスな方法を採用しており、洗浄操
作を行うために大がかりで高価な機構を備えている。
【０００６】一方、Ｂ／Ｆ分離を行わずにイムノアッセ
イを行う方法も数多く考案されておりそれらはホモジニ
アスイムノアッセイと呼ばれている。この方法ではＢ／
Ｆ分離を行う必要がないので、手技が単純であり自動化
した場合も機械が簡単につくれるという利点がある。し
かしながらホモジニアスイムノアッセイは多くの場合あ
まり検出感度が高くない。また試料が最後まで存在する
ため試料の影響を大きく受けるという欠点があった。特
に感度の面ではヘテロジニアスイムノアッセイにかなわ
ない。
イを行う方法も数多く考案されておりそれらはホモジニ
アスイムノアッセイと呼ばれている。この方法ではＢ／
Ｆ分離を行う必要がないので、手技が単純であり自動化
した場合も機械が簡単につくれるという利点がある。し
かしながらホモジニアスイムノアッセイは多くの場合あ
まり検出感度が高くない。また試料が最後まで存在する
ため試料の影響を大きく受けるという欠点があった。特
に感度の面ではヘテロジニアスイムノアッセイにかなわ
ない。
【０００７】ホモジニアスイムノアッセイの１つの方法
として、蛍光偏光解消度を利用した方法が考案され実用
化されている。この方法はハプテンなどの低分子に蛍光
色素を結合する。低分子に結合した蛍光色素は液体中で
その分子運動が大きい。この蛍光色素標識抗原が抗体と
反応し抗原抗体複合物を形成するとその分子量が大きく
なり全体としての分子運動が小さくなる。このとき標識
している蛍光物質の蛍光偏光を測定することにより分子
運動の変化を知ることができる。この系に試料中の抗原
が入ってくることにより、抗体と結合する蛍光色素標識
抗原の量は少なくなり、試料全体の蛍光色素分子の運動
量は大きくなる。この変化を蛍光偏光度を測定すること
により知ることができるので、試料中の抗原の測定に利
用できる。この方法はホモジニアスイムノアッセイとし
て簡単な操作で測定できることから薬物などの測定に広
く利用されている。しかしながらこの方法は蛍光色素を
標識した分子の分子運動が抗体と結合することによって
大きく変化する必要があるため、ハプテンのような低分
子にしか利用できないという欠点があった。
として、蛍光偏光解消度を利用した方法が考案され実用
化されている。この方法はハプテンなどの低分子に蛍光
色素を結合する。低分子に結合した蛍光色素は液体中で
その分子運動が大きい。この蛍光色素標識抗原が抗体と
反応し抗原抗体複合物を形成するとその分子量が大きく
なり全体としての分子運動が小さくなる。このとき標識
している蛍光物質の蛍光偏光を測定することにより分子
運動の変化を知ることができる。この系に試料中の抗原
が入ってくることにより、抗体と結合する蛍光色素標識
抗原の量は少なくなり、試料全体の蛍光色素分子の運動
量は大きくなる。この変化を蛍光偏光度を測定すること
により知ることができるので、試料中の抗原の測定に利
用できる。この方法はホモジニアスイムノアッセイとし
て簡単な操作で測定できることから薬物などの測定に広
く利用されている。しかしながらこの方法は蛍光色素を
標識した分子の分子運動が抗体と結合することによって
大きく変化する必要があるため、ハプテンのような低分
子にしか利用できないという欠点があった。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】従来の蛍光偏光解消度
の測定系ではハプテンなどの低分子の抗原しか測定する
ことができなかった。より大きな抗原分子を測定しよう
としても抗体との反応における分子量の変化が小さくな
り、検出しようとする蛍光偏光解消度の変化が小さくな
りその結果検出できないという問題があった。この欠点
を解消すべく鋭意研究を行った結果、抗体あるいは抗原
を磁性を有する粒子上に結合し、蛍光物質を結合した抗
原あるいは抗体との免疫反応を行った後に磁石によりそ
の磁性粒子の運動を完全に停止することによって、最大
限の蛍光偏光解消度が得られることを見いだし本発明を
完成した。またこの方法に使用する蛍光物質として、従
来使用していたような短い蛍光寿命を持つ物質ではな
く、長い蛍光寿命を有する蛍光物質を使用することによ
り、従来では蛍光偏光度では測定することがで不可能だ
と考えられてきたサンドイッチイムノアッセイについて
も大きなシグナルの変化が得られることが判明した。
の測定系ではハプテンなどの低分子の抗原しか測定する
ことができなかった。より大きな抗原分子を測定しよう
としても抗体との反応における分子量の変化が小さくな
り、検出しようとする蛍光偏光解消度の変化が小さくな
りその結果検出できないという問題があった。この欠点
を解消すべく鋭意研究を行った結果、抗体あるいは抗原
を磁性を有する粒子上に結合し、蛍光物質を結合した抗
原あるいは抗体との免疫反応を行った後に磁石によりそ
の磁性粒子の運動を完全に停止することによって、最大
限の蛍光偏光解消度が得られることを見いだし本発明を
完成した。またこの方法に使用する蛍光物質として、従
来使用していたような短い蛍光寿命を持つ物質ではな
く、長い蛍光寿命を有する蛍光物質を使用することによ
り、従来では蛍光偏光度では測定することがで不可能だ
と考えられてきたサンドイッチイムノアッセイについて
も大きなシグナルの変化が得られることが判明した。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明は、測定対象の抗
原または抗体を含む測定試料、磁性粒子表面上に結合し
た測定対象の抗原または抗体に対応する抗体または抗
原、ならびに、蛍光標識された抗原または抗体とを混合
して抗原抗体反応させた後、磁力によって磁性粒子を固
定し、蛍光偏光解消度の変化を測定することを特徴とす
る免疫測定法を提供する。
原または抗体を含む測定試料、磁性粒子表面上に結合し
た測定対象の抗原または抗体に対応する抗体または抗
原、ならびに、蛍光標識された抗原または抗体とを混合
して抗原抗体反応させた後、磁力によって磁性粒子を固
定し、蛍光偏光解消度の変化を測定することを特徴とす
る免疫測定法を提供する。
【００１０】本発明の方法では、抗体あるいは抗原を表
面に結合した磁性粒子と、蛍光物質を結合した抗原ある
いは抗体を用い、試料中の測定対象物との間で、粒子表
面を固相と考えたサンドイッチイムノアッセイあるいは
競合イムノアッセイを行うことにより、粒子表面に蛍光
標識物を結合する。反応終了後に溶液中の磁性粒子を磁
石を使用してその動きを完全に停止することにより粒子
表面に結合した蛍光物質の分子運動をほぼ完全に停止す
ることができる。溶液中の分子に結合している蛍光物質
の分子運動は大きいが、粒子表面の蛍光物質の分子運動
はほとんどない。この差を蛍光偏光度を測定することに
よって知り、そこから試料中に存在している測定対象物
の濃度を知ることのできる免疫測定法である。
面に結合した磁性粒子と、蛍光物質を結合した抗原ある
いは抗体を用い、試料中の測定対象物との間で、粒子表
面を固相と考えたサンドイッチイムノアッセイあるいは
競合イムノアッセイを行うことにより、粒子表面に蛍光
標識物を結合する。反応終了後に溶液中の磁性粒子を磁
石を使用してその動きを完全に停止することにより粒子
表面に結合した蛍光物質の分子運動をほぼ完全に停止す
ることができる。溶液中の分子に結合している蛍光物質
の分子運動は大きいが、粒子表面の蛍光物質の分子運動
はほとんどない。この差を蛍光偏光度を測定することに
よって知り、そこから試料中に存在している測定対象物
の濃度を知ることのできる免疫測定法である。
【００１１】本発明で使用できる磁性粒子は、例えば粒
径０．１μｍ〜１００μｍ、好ましくは粒径０．２μｍ
〜１０μｍのＮｉ，Ｃｏあるいはそれらの合金からなる
強磁性体で自発磁化のない粒子であり、例えば市販のダ
イナビーズTM（ベリタス社製）などを使用できる。
径０．１μｍ〜１００μｍ、好ましくは粒径０．２μｍ
〜１０μｍのＮｉ，Ｃｏあるいはそれらの合金からなる
強磁性体で自発磁化のない粒子であり、例えば市販のダ
イナビーズTM（ベリタス社製）などを使用できる。
【００１２】本発明の測定対象は抗原または抗体であ
り、抗原としてはタンパク質、糖質などの従来の蛍光偏
光解消度を利用する方法では測定できない高分子のもの
が特に適しており、例えば、副腎皮質ホルモン、甲状腺
ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、チロキシンなどのホル
モン、グロブリン、アルブミンなどの血漿タンパク質な
どを挙げることができる。また、抗体はモノクローナル
抗体またはポリクローナル抗体のいずれであってもよ
い。
り、抗原としてはタンパク質、糖質などの従来の蛍光偏
光解消度を利用する方法では測定できない高分子のもの
が特に適しており、例えば、副腎皮質ホルモン、甲状腺
ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、チロキシンなどのホル
モン、グロブリン、アルブミンなどの血漿タンパク質な
どを挙げることができる。また、抗体はモノクローナル
抗体またはポリクローナル抗体のいずれであってもよ
い。
【００１３】磁性粒子表面には、測定すべき抗原または
抗体に対応する、すなわちこれと特異的に結合する抗体
または抗原を結合する。磁性粒子表面に抗原または抗体
を結合させる方法は常法を用いることができ、例えばＰ
ＢＳなどの緩衝液中に調製したに磁性粒子に抗原または
抗体を加えて反応させ、遠心処理を行い、ＢＳＡを含む
ＰＢＳ中に分散させて得ることができる。あるいは、ビ
オチン−アビジンまたはストレプトアビジン、リガンド
−レセプターなどの特異的結合を利用して抗原または抗
体を磁性粒子表面に結合させることもできる。例えば、
ダイナビーズＳＴＡTM（ベリタス社製）は粒子表面にス
トレプトアビジンが結合されており、この場合には粒子
に結合すべき抗原または抗体をビオチンで標識すること
により磁性粒子表面上に結合させることができる。
抗体に対応する、すなわちこれと特異的に結合する抗体
または抗原を結合する。磁性粒子表面に抗原または抗体
を結合させる方法は常法を用いることができ、例えばＰ
ＢＳなどの緩衝液中に調製したに磁性粒子に抗原または
抗体を加えて反応させ、遠心処理を行い、ＢＳＡを含む
ＰＢＳ中に分散させて得ることができる。あるいは、ビ
オチン−アビジンまたはストレプトアビジン、リガンド
−レセプターなどの特異的結合を利用して抗原または抗
体を磁性粒子表面に結合させることもできる。例えば、
ダイナビーズＳＴＡTM（ベリタス社製）は粒子表面にス
トレプトアビジンが結合されており、この場合には粒子
に結合すべき抗原または抗体をビオチンで標識すること
により磁性粒子表面上に結合させることができる。
【００１４】一方、蛍光標識された抗原または抗体を調
製する。本発明の蛍光偏光解消度を利用する免疫測定法
では蛍光寿命が蛍光偏光解消度に大きく影響するので蛍
光物質の選択が重要である。蛍光寿命が１μ秒よりも長
い蛍光物質を用いて蛍光標識することが好ましく、例え
ば希土類錯体を挙げることができる。希土類錯体として
はユーロピウム、ガドリウム、テルビウム、ジスプロシ
ウム、ホルミウム、エルビウムなどの金属の蛍光キレー
ト化合物が好ましく、例えばＥｕ3+（ＢＣＰＤＡ）
n（式中、ｎは２または３；ＢＣＰＤＡは4,7-ビス（ク
ロロスルフォニル）-1,10-フェナントロリン-2,9-ジカ
ルボン酸）、あるいは特開平２−８８９６９号、特開平
１−１２７９５７号、特開昭６４−４７９５２号、特表
平６ー５１０２９６号に記載のものを使用できる。
製する。本発明の蛍光偏光解消度を利用する免疫測定法
では蛍光寿命が蛍光偏光解消度に大きく影響するので蛍
光物質の選択が重要である。蛍光寿命が１μ秒よりも長
い蛍光物質を用いて蛍光標識することが好ましく、例え
ば希土類錯体を挙げることができる。希土類錯体として
はユーロピウム、ガドリウム、テルビウム、ジスプロシ
ウム、ホルミウム、エルビウムなどの金属の蛍光キレー
ト化合物が好ましく、例えばＥｕ3+（ＢＣＰＤＡ）
n（式中、ｎは２または３；ＢＣＰＤＡは4,7-ビス（ク
ロロスルフォニル）-1,10-フェナントロリン-2,9-ジカ
ルボン酸）、あるいは特開平２−８８９６９号、特開平
１−１２７９５７号、特開昭６４−４７９５２号、特表
平６ー５１０２９６号に記載のものを使用できる。
【００１５】本発明の免疫測定法は競合法またはサンド
イッチ法により実施できる。例えば、競合法を用いて抗
原タンパク質を測定する場合には、抗原タンパク質に対
応する抗体を磁性粒子表面に結合させ、一方、蛍光物質
で標識した抗原を調製する。また、サンドイッチ法を用
いて抗原タンパク質を測定する場合には、適当な第二抗
体を蛍光標識する。このような抗体の作製方法、および
抗体または抗原を蛍光物質で標識する方法は常法により
行うことができる。
イッチ法により実施できる。例えば、競合法を用いて抗
原タンパク質を測定する場合には、抗原タンパク質に対
応する抗体を磁性粒子表面に結合させ、一方、蛍光物質
で標識した抗原を調製する。また、サンドイッチ法を用
いて抗原タンパク質を測定する場合には、適当な第二抗
体を蛍光標識する。このような抗体の作製方法、および
抗体または抗原を蛍光物質で標識する方法は常法により
行うことができる。
【００１６】このようにして調製した磁性粒子表面上に
結合した抗原または抗体、蛍光標識した抗原または抗体
と、測定対象の抗原または抗体を含む測定試料とを透明
チューブ（セル）中で混合して抗原抗体反応をさせた
後、蛍光偏光解消度を測定する。次いで、磁力によって
磁性粒子を固定して再度蛍光偏光解消度を測定する。こ
れによって蛍光偏光解消度の変化が得られる。
結合した抗原または抗体、蛍光標識した抗原または抗体
と、測定対象の抗原または抗体を含む測定試料とを透明
チューブ（セル）中で混合して抗原抗体反応をさせた
後、蛍光偏光解消度を測定する。次いで、磁力によって
磁性粒子を固定して再度蛍光偏光解消度を測定する。こ
れによって蛍光偏光解消度の変化が得られる。
【００１７】本発明の方法では、磁力によって磁性粒子
を固定することにより、偏光解消度のＳ／Ｎが向上し、
大きな分子であっても測定感度が向上する。なお、磁性
粒子の固定には永久磁石または電磁石を使用できる。永
久磁石の場合には、抗原抗体反応を行っている間は磁石
を反応セルから離しておき、反応終了後セルに近づけて
磁性粒子をセルの側面に捕捉する。また、電磁石の場合
には、セルに接した形で配置した電磁石を反応終了後に
作用させて磁界を発生させて磁性粒子をセルの側面に捕
捉する。
を固定することにより、偏光解消度のＳ／Ｎが向上し、
大きな分子であっても測定感度が向上する。なお、磁性
粒子の固定には永久磁石または電磁石を使用できる。永
久磁石の場合には、抗原抗体反応を行っている間は磁石
を反応セルから離しておき、反応終了後セルに近づけて
磁性粒子をセルの側面に捕捉する。また、電磁石の場合
には、セルに接した形で配置した電磁石を反応終了後に
作用させて磁界を発生させて磁性粒子をセルの側面に捕
捉する。
【００１８】蛍光偏光解消度の測定は公知の装置を用い
て行うことができ、例えばＪＩＭＣＯ ＭＡＣ−ＩＩ、
ＩＢＦー１２９などの装置を使用することができる。蛍
光偏光解消度の測定装置の概略を図１に示す。
て行うことができ、例えばＪＩＭＣＯ ＭＡＣ−ＩＩ、
ＩＢＦー１２９などの装置を使用することができる。蛍
光偏光解消度の測定装置の概略を図１に示す。
【００１９】蛍光偏光解消度による測定の利点として以
下の点が挙げられる：１）沈殿や遠心分離操作を要せず
に反応混合物をそのまま測定できるので操作が簡単であ
る、２）ラジオイムノアッセイや酵素抗体法に比べて測
定が迅速であり、秒単位〜数分以内で測定可能である、
３）ラジオアイソトープに匹敵する感度で測定が可能で
ある、４）基質成分の安定性が高く、保存後の再現性も
高い、５）放射能を使用しないので安全である、６）短
時間にデータが得られるので、同一試料の経時的測定が
できる。
下の点が挙げられる：１）沈殿や遠心分離操作を要せず
に反応混合物をそのまま測定できるので操作が簡単であ
る、２）ラジオイムノアッセイや酵素抗体法に比べて測
定が迅速であり、秒単位〜数分以内で測定可能である、
３）ラジオアイソトープに匹敵する感度で測定が可能で
ある、４）基質成分の安定性が高く、保存後の再現性も
高い、５）放射能を使用しないので安全である、６）短
時間にデータが得られるので、同一試料の経時的測定が
できる。
【００２０】この方法を用いることにより、従来では蛍
光偏光度では測定できなかったような分子量の大きい抗
原の測定ができるようになったばかりでなく、サンドイ
ッチ法の検出にも利用できるようになり、より簡便で高
感度なホモジニアスの免疫測定法を提供することができ
る。
光偏光度では測定できなかったような分子量の大きい抗
原の測定ができるようになったばかりでなく、サンドイ
ッチ法の検出にも利用できるようになり、より簡便で高
感度なホモジニアスの免疫測定法を提供することができ
る。
【００２１】
【実施例】実施例１：競合法を用いる甲状腺ホルモンＴ
３の測定 （１）抗Ｔ３抗体結合磁性粒子の調製 磁性粒子としてはダイナビーズを用いた。使用した粒子
は粒径４μｍ〜５μｍのダイナビーズＳＴＡであり、こ
の粒子表面にはストレプトアビジンが結合している。
３の測定 （１）抗Ｔ３抗体結合磁性粒子の調製 磁性粒子としてはダイナビーズを用いた。使用した粒子
は粒径４μｍ〜５μｍのダイナビーズＳＴＡであり、こ
の粒子表面にはストレプトアビジンが結合している。
【００２２】抗体としてはスクリプス社の抗Ｔ３モノク
ローナル抗体ＭＴ２３１を使用した。抗体には同仁化学
のＮＨＳ−Ｂｉｏｔｉｎを使用してビオチンを標識し
た。抗体に１０倍量の分子数のＮＨＳ−Ｂｉｏｔｉｎを
添加し、室温で３時間反応後、未反応のＮＨＳ−Ｂｉｏ
ｔｉｎをファルマシア社製のゲルろ過カラムＰＤ−１０
を使用して分離した。調製したビオチン標識抗体は０．
ｌｍｇ／ｍｌのＢＳＡを含む０．１ＭＰＢＳに保存し、
使用時に適宜希釈して使用する。
ローナル抗体ＭＴ２３１を使用した。抗体には同仁化学
のＮＨＳ−Ｂｉｏｔｉｎを使用してビオチンを標識し
た。抗体に１０倍量の分子数のＮＨＳ−Ｂｉｏｔｉｎを
添加し、室温で３時間反応後、未反応のＮＨＳ−Ｂｉｏ
ｔｉｎをファルマシア社製のゲルろ過カラムＰＤ−１０
を使用して分離した。調製したビオチン標識抗体は０．
ｌｍｇ／ｍｌのＢＳＡを含む０．１ＭＰＢＳに保存し、
使用時に適宜希釈して使用する。
【００２３】ダイナビーズＳＴＡ１ｍｌ当たり、ビオチ
ン標識抗体１００μｇを添加し、３７℃で３時間反応さ
せる。その後１２０００ｒｐｍの遠心処理を行い、上清
に残っている未反応のビオチンン標識抗体を除去し、最
初の磁性粒子分散液の１０倍量のｌｍｇ／ｍｌＢＳＡを
含む０．１ＭＰＢを加えて分散し、抗Ｔ３抗体結合磁性
粒子を調製した。
ン標識抗体１００μｇを添加し、３７℃で３時間反応さ
せる。その後１２０００ｒｐｍの遠心処理を行い、上清
に残っている未反応のビオチンン標識抗体を除去し、最
初の磁性粒子分散液の１０倍量のｌｍｇ／ｍｌＢＳＡを
含む０．１ＭＰＢを加えて分散し、抗Ｔ３抗体結合磁性
粒子を調製した。
【００２４】（２）ユーロピウム標識Ｔ３の調製 ユーロピウム標識Ｔ３はＴ３に分子数で２倍のユーロピ
ウムキレート（イソシアナトフェニル−ＥＤＴＡ−Ｅｕ
3+）を添加し、室温で２時間反応させた。反応後のサン
プルはＨＰＬＣで分離し、ユーロピウム標識体を得た。
なお、イソシアナトフェニル−ＥＤＴＡ−Ｅｕ3+はイソ
チオシアネート基を介して１級アミノ基と共有結合を生
じるため、水溶液中でＴ３とこの物質とを混合すること
により、ユーロピウムキレートを標識したＴ３を得るこ
とができる。
ウムキレート（イソシアナトフェニル−ＥＤＴＡ−Ｅｕ
3+）を添加し、室温で２時間反応させた。反応後のサン
プルはＨＰＬＣで分離し、ユーロピウム標識体を得た。
なお、イソシアナトフェニル−ＥＤＴＡ−Ｅｕ3+はイソ
チオシアネート基を介して１級アミノ基と共有結合を生
じるため、水溶液中でＴ３とこの物質とを混合すること
により、ユーロピウムキレートを標識したＴ３を得るこ
とができる。
【００２５】（３）蛍光偏光解消法を用いたＴ３の測定 透明のセルに抗Ｔ３抗体を結合させた磁性粒子溶液１０
μｌ、適当に希釈したＴ３−ユーロピウム標識体１０μ
ｌ、種々の濃度を有するＴ３試料１０μｌ、１ｍｇ／ｍ
ｌＢＳＡと０．６ｍｇ／ｍｌＡＮＳを含む溶液７０μｌ
を添加した。
μｌ、適当に希釈したＴ３−ユーロピウム標識体１０μ
ｌ、種々の濃度を有するＴ３試料１０μｌ、１ｍｇ／ｍ
ｌＢＳＡと０．６ｍｇ／ｍｌＡＮＳを含む溶液７０μｌ
を添加した。
【００２６】３７℃で１０分間反応後、自作の蛍光偏光
解消度測定装置で測定を行った。結果を図２中に実線で
に示す。Ｔ３濃度の変化とともに偏光解消度の値も変化
し、Ｔ３が測定可能であることを示している。またこの
装置のセルの横に、磁石をセットした場合の測定結果を
同じく図２中に破線でに示す。セルの横に磁石をセット
することにより、偏光解消度のＳ／Ｎが向上し、Ｔ３の
測定感度が上昇することが認められた。なお、図２は、
抗原Ｔ３を含まないときの解消度を１としたときと比較
した相対蛍光偏光解消度を示す。
解消度測定装置で測定を行った。結果を図２中に実線で
に示す。Ｔ３濃度の変化とともに偏光解消度の値も変化
し、Ｔ３が測定可能であることを示している。またこの
装置のセルの横に、磁石をセットした場合の測定結果を
同じく図２中に破線でに示す。セルの横に磁石をセット
することにより、偏光解消度のＳ／Ｎが向上し、Ｔ３の
測定感度が上昇することが認められた。なお、図２は、
抗原Ｔ３を含まないときの解消度を１としたときと比較
した相対蛍光偏光解消度を示す。
【００２７】実施例２：サンドイッチ法を用いる甲状腺
刺激ホルモン（ＴＳＨ）の測定 （１）抗ＴＳＨ抗体結合磁性粒子の調製 磁性粒子としては実施例１と同じストレプトアビジンを
結合した磁性粒子ダイナビーズＳＴＡを使用した。
刺激ホルモン（ＴＳＨ）の測定 （１）抗ＴＳＨ抗体結合磁性粒子の調製 磁性粒子としては実施例１と同じストレプトアビジンを
結合した磁性粒子ダイナビーズＳＴＡを使用した。
【００２８】抗体としてはスクリプス社の抗ＴＳＨモノ
クローナル抗体ＭＴ０１１を使用した。
クローナル抗体ＭＴ０１１を使用した。
【００２９】抗体へのビオチン標識は実施例１と同じよ
うにＮＨＳ−Ｂｉｏｔｉｎを使用して行い、抗体１分子
当たり子の１０分子のＮＨＳ−Ｂｉｏｔｉｎを添加して
室温で３時間反応した。その後ＰＤ−１０によるゲルろ
過を行いビオチン標識抗ＴＳＨ抗体を得た。
うにＮＨＳ−Ｂｉｏｔｉｎを使用して行い、抗体１分子
当たり子の１０分子のＮＨＳ−Ｂｉｏｔｉｎを添加して
室温で３時間反応した。その後ＰＤ−１０によるゲルろ
過を行いビオチン標識抗ＴＳＨ抗体を得た。
【００３０】抗体は０．ｌｍｇ／ｍｌのＢＳＡを含む
０．１ＭＰＢＳに保存し、使用時に適宜希釈して使用す
る。
０．１ＭＰＢＳに保存し、使用時に適宜希釈して使用す
る。
【００３１】ダイナビーズＳＴＡ１ｍｌ当たり、ビオチ
ン標識抗体１００μｇを添加し、３７℃で３時間反応さ
せる。
ン標識抗体１００μｇを添加し、３７℃で３時間反応さ
せる。
【００３２】１２０００ｒｐｍの遠心処理を行い、上清
に残っている未反応のビオチン標識抗体を除去し、最初
の磁性粒子分散液の１０倍量のｌｍｇ／ｍｌＢＳＡを含
む０．１ＭＰＢを加えて分散し、抗ＴＳＨ抗体結合磁性
粒子を調製した。
に残っている未反応のビオチン標識抗体を除去し、最初
の磁性粒子分散液の１０倍量のｌｍｇ／ｍｌＢＳＡを含
む０．１ＭＰＢを加えて分散し、抗ＴＳＨ抗体結合磁性
粒子を調製した。
【００３３】（２）ユーロピウム標識抗ＴＳＨ抗体の調
製 サンドイッチ法での測定を行うため第二抗体としてバイ
オスライド社製の抗ＴＳＨポリクローナル抗体（ヤギ）
を使用し、これをユーロピウム（イソシアナトフェニル
−ＥＤＴＡ−Ｅｕ3+）で標識した。抗体溶液に分子数で
１０倍量のユーロピウムを添加し室温で３時間反応し、
ＰＤ−１０でゲルろ過してユーロピウム標識抗ＴＳＨ抗
体を得た。なお、抗体へのユーロピウムの標識にはＤＥ
ＬＦＩＡｌａｂｅｌｌｉｎｇ ｋｉｔを用いた（1244-3
02: Wallac Oy, Turku, Finland）。標識方法はJournal
of Immunological Methods 190(1996), 171-183の方法
に準じて行った。
製 サンドイッチ法での測定を行うため第二抗体としてバイ
オスライド社製の抗ＴＳＨポリクローナル抗体（ヤギ）
を使用し、これをユーロピウム（イソシアナトフェニル
−ＥＤＴＡ−Ｅｕ3+）で標識した。抗体溶液に分子数で
１０倍量のユーロピウムを添加し室温で３時間反応し、
ＰＤ−１０でゲルろ過してユーロピウム標識抗ＴＳＨ抗
体を得た。なお、抗体へのユーロピウムの標識にはＤＥ
ＬＦＩＡｌａｂｅｌｌｉｎｇ ｋｉｔを用いた（1244-3
02: Wallac Oy, Turku, Finland）。標識方法はJournal
of Immunological Methods 190(1996), 171-183の方法
に準じて行った。
【００３４】（３）蛍光偏光解消法を用いたＴＳＨの測
定 透明のセルに抗ＴＳＨ抗体を結合させた磁性粒子溶液１
０μｌ、種々の濃度を有するＴＳＨ試料１０μｌ、１ｍ
ｇ／ｍｌＢＳＡと０．６ｍｇ／ｍｌＡＮＳを含む溶液７
０μｌを添加した。
定 透明のセルに抗ＴＳＨ抗体を結合させた磁性粒子溶液１
０μｌ、種々の濃度を有するＴＳＨ試料１０μｌ、１ｍ
ｇ／ｍｌＢＳＡと０．６ｍｇ／ｍｌＡＮＳを含む溶液７
０μｌを添加した。
【００３５】３７℃で１０分間反応後、ユーロピウム標
識抗ＴＳＨ抗体溶液１０μｌを添加し３７℃で１０分間
反応した。
識抗ＴＳＨ抗体溶液１０μｌを添加し３７℃で１０分間
反応した。
【００３６】その後自作の蛍光偏光解消度測定装置で測
定を行った。結果を図３中に実線でに示す。Ｔ３の時と
は異なりＴＳＨでは濃度の変化と共に偏光解消度の値は
ほとんど変化しなかった。そこでこの装置のセルをセッ
トする場所の横に、磁石をセットして測定を行ったとこ
ろ同じく図３中に破線で示すように偏光解消度に変化が
みられた。これは、セルの横に磁石をセットすることに
より、偏光解消度のＳ／Ｎが向上し、普通の状態では検
出できなかったＴＳＨの反応が検出できるようになった
ことを示す。なお、図３は、抗原ＴＨＳを含まないとき
の解消度を１としたときと比較した相対蛍光偏光解消度
を示す。
定を行った。結果を図３中に実線でに示す。Ｔ３の時と
は異なりＴＳＨでは濃度の変化と共に偏光解消度の値は
ほとんど変化しなかった。そこでこの装置のセルをセッ
トする場所の横に、磁石をセットして測定を行ったとこ
ろ同じく図３中に破線で示すように偏光解消度に変化が
みられた。これは、セルの横に磁石をセットすることに
より、偏光解消度のＳ／Ｎが向上し、普通の状態では検
出できなかったＴＳＨの反応が検出できるようになった
ことを示す。なお、図３は、抗原ＴＨＳを含まないとき
の解消度を１としたときと比較した相対蛍光偏光解消度
を示す。
【図１】蛍光偏光解消度の測定装置の概略図である。
【図２】競合法を用いた甲状腺ホルモンＴ３の測定結果
を示す。
を示す。
【図３】サンドイッチ法を用いた甲状腺刺激ホルモンＴ
ＳＨの測定結果を示す。
ＳＨの測定結果を示す。
Claims (4)
- 【請求項１】 測定対象の抗原または抗体を含む測定試
料、磁性粒子表面上に結合した測定対象の抗原または抗
体に対応する抗体または抗原、ならびに、蛍光標識され
た抗原または抗体とを混合して抗原抗体反応させた後、
磁力によって磁性粒子を固定し、蛍光偏光解消度の変化
を測定することを特徴とする免疫測定法。 - 【請求項２】 蛍光寿命がｌμ秒よりも長い蛍光物質を
用いて前記蛍光標識を行う請求項１記載の免疫測定法。 - 【請求項３】 前記蛍光物質が希土類錯体である請求項
２記載の免疫測定法。 - 【請求項４】 前記希土類錯体がユーロピウムキレート
である請求項３記載の免疫測定法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP00738697A JP3647587B2 (ja) | 1997-01-20 | 1997-01-20 | 免疫測定法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP00738697A JP3647587B2 (ja) | 1997-01-20 | 1997-01-20 | 免疫測定法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH10206427A true JPH10206427A (ja) | 1998-08-07 |
| JP3647587B2 JP3647587B2 (ja) | 2005-05-11 |
Family
ID=11664500
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP00738697A Expired - Fee Related JP3647587B2 (ja) | 1997-01-20 | 1997-01-20 | 免疫測定法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3647587B2 (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2003081243A1 (fr) * | 2002-03-27 | 2003-10-02 | Matsushita Electric Industrial Co., Ltd. | Procede de polarisation fluorescente, trousse mise en oeuvre par ce procede et biocapteur |
| JP2007155603A (ja) * | 2005-12-07 | 2007-06-21 | Kyoto Institute Of Technology | 蛍光偏光解消法による分析方法 |
| JP2007529752A (ja) * | 2004-03-18 | 2007-10-25 | トランス テック ファーマ，インコーポレイテッド | 蛍光偏光アッセイ |
| JP2014531029A (ja) * | 2011-10-20 | 2014-11-20 | コーニンクレッカ フィリップス エヌ ヴェ | 培養期間を用いた磁性粒子の検出 |
-
1997
- 1997-01-20 JP JP00738697A patent/JP3647587B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2003081243A1 (fr) * | 2002-03-27 | 2003-10-02 | Matsushita Electric Industrial Co., Ltd. | Procede de polarisation fluorescente, trousse mise en oeuvre par ce procede et biocapteur |
| JP2007529752A (ja) * | 2004-03-18 | 2007-10-25 | トランス テック ファーマ，インコーポレイテッド | 蛍光偏光アッセイ |
| JP2007155603A (ja) * | 2005-12-07 | 2007-06-21 | Kyoto Institute Of Technology | 蛍光偏光解消法による分析方法 |
| JP4632156B2 (ja) * | 2005-12-07 | 2011-02-16 | 国立大学法人京都工芸繊維大学 | 蛍光偏光解消法による分析方法 |
| JP2014531029A (ja) * | 2011-10-20 | 2014-11-20 | コーニンクレッカ フィリップス エヌ ヴェ | 培養期間を用いた磁性粒子の検出 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3647587B2 (ja) | 2005-05-11 |
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