JPH10505900A - 診断および治療的応用に使用するための多−相組成物を有する容器 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 超音波および磁気共鳴造影のような診断用造影および治療的応用に有用な、水性脂質懸濁液および水性安定化相とは実質的に分離しているガス相を含んで成る容器が開示されている。

Description

【発明の詳細な説明】 診断および治療的応用に使用するための多−相組成物を有する容器 関連出願 本出願は、1993年11月30日に出願された米国特許出願第159,687号の一部継続 出願であり、次にこれは1993年6月11日に出願された米国特許出願第076,239号の 一部継続出願であり、次にこれは両方とも1991年6月18日に出願された米国特許 出願第717,084号および同716,899号の一部継続出願であり、次にこれらは1990年 8月20日に出願された米国特許出願第569,828号の一部継続出願であり、次にこれ は1989年12月22日に出願された米国特許出願第455,707号の一部継続出願である 。 また本出願は、1993年11月30日に出願された米国特許出願第160,232号の一部 継続出願であり、次にこれは1993年6月11日に出願された米国特許出願第076,250 号の一部継続出願であり、次にこれは両方とも1991年6月18日に出願された米国 特許出願第717,084号および同716,899号の一部継続出願であり、次にこれらは19 90年8月20日に出願された米国特許出願第569,828号の一部継続出願であり、次に これは1989年12月22日に出願された米国特許出願第455,707号の一部継続出願で ある。 さらに本出願は、1994年3月11日に出願された米国特許出願第212,533号の一部 継続出願であり、次にこれは両方とも1993年6月11日に出願された米国特許出願 第076,239号および同076,250号の一部継続出願である。米国特許出願第076,239 号および076,250号の親出願は、上記に説明する。 これら各出願の優先権はこれにより請求され、そして各々の開示は全部、引用 により本明細書に編入する。 発明の背景 超音波は他の診断法に優る、多数の重要な意味のある利点を提供する診断造影 法である。核医学およびＸ−線のような造影法とは異なり、超音波は患者をイオ ン化照射の有害作用に暴露しない。さらに、超音波は比較的高価ではなく、そし て移動式の検査として行うことができる。 超音波造影では、音響が患者または動物に変換器を介して伝達する。音波が体 内を通って伝わるとき、それらは組織および流体からの界面と会う。体内の組織 および流体の音響特性に応じて、超音波の音波は一部または全部反射するか、ま たは吸収される。音波が界面により反射される時、それらは変換器中の受信器に より検出され、そして画像を作成するように処理される。体内の組織および流体 の音響特性は、生成した画像に現れるコントラストを決定する。 磁気共鳴造影（ＭＲＩ）は比較的新しい造影法であり、これはＸ−線とは異な り、イオン化照射を利用しない。コンピューター連動断層撮影法のように、ＭＲ Ｉは身体の断面画像を作成できるが、ＭＲＩには任意の走査平面（中心面、冠状 面、矢状面または直交面）で画像を作成できるという更なる利点がある。 ＭＲＩは磁場、高周波エネルギーおよび磁場勾配を利用して、身体の画像を作 成する。組織間のコントラストおよび信号強度の差異は、主に組織のＴ１および Ｔ２緩和値、およびプロトン密度（実際には、遊離水含量）を反映している。 近年、診断用超音波およびＭＲＩ法は進歩した。しかし、種々の技術的改良に もかかわらず、超音波およびＭＲＩは多くの観点で、特に肝臓および脾臓、腎臓 、心臓および血流測定を含む脈管の疾患の造影および検出に関して、未だに不完 全な道具である。これらの領域を検出し、そ してそのような測定を行う能力は、組織または流体と周辺の組織または流体との 間の音響特性（超音波）またはＴ１およびＴ２信号強度（ＭＲＩ）の差異に依存 する。したがって、組織または流体と周辺の組織または流体との間のこれらの差 異を増加させ、そして超音波および磁気共鳴造影および疾患の検出を向上させる コントラスト剤が熟考された。このような努力の結果、新規で、かつより良いコ ントラスト剤が開発された。これにもかかわらずそのような多くのコントラスト 剤で再度生じた問題の１つは、長期の保存に問題を生じる使用期限の安定性であ った。 本発明は、超音波または磁気共鳴造影法のような応用、ならびに他の使用に応 用するための優れたガス−充填リポソームコントラスト剤を、使用前に撹拌して 作成する、水性の脂質懸濁液相および実質的に水性の脂質懸濁液相とは分離され ているガス相を含んで成る便利な容器を提供することにより、これらの、および 他の関心事を取扱う。そのようなコントラスト剤は使用直前に調製されるので、 使用期限の安定性の問題が回避される。 発明の要約 本発明は、（ｉ）水性の脂質懸濁液相および（ii）水性の脂質懸濁液相とは実 質的に分離しているガス相を含んで成る容器を提供する。使用前に、容器中の内 容物を撹拌し、これにより例えば超音波または磁気共鳴造影、ならびに治療的応 用に使用するためのコントラスト剤として優れた利用性を有するガス−充填リポ ソーム組成物を作成できる。使用直前にコントラスト剤を調製するための本発明 の能力は、多くの従来のコントラスト剤で経験するような使用期限の安定性の問 題を回避する。本発明の自蔵式ユニットは、容易な滅菌が可能である。 本発明のこれらの、および他の観点および利点は、以下でさらに詳細に考察す る。 図面の簡単な説明 図１は、脂質の水性懸濁液および実質的に分離されているガスの頭隙を満たし た容器の横断面である。 図２は、図１の容器を撹拌するために使用できる撹拌デバイスの図解であり、 これにより水性脂質懸濁液およびガスを混合し、そして超音波または磁気共鳴造 影用のコントラスト剤を生成する。 図３は、図１に示す容器および図２に示す撹拌デバイスを使用して生成したガ ス−充填リポソームの顕微鏡写真である。 発明の詳細な説明 本発明の容器は、水性脂質懸濁液相および実質的に分離しているガス相を含ん で成る。使用前に、この容器および内容物を撹拌し、脂質およびガス相を混合し て、ガスを封入したガス−充填リポソームを生成することができる。生成したガ ス−充填リポソームは、特に超音波または磁気共鳴造影を使用する診断造影用の 優れたコントラスト増強剤を提供する。 広範な脂質を、水性脂質懸濁液相に使用できる。所望により、脂質は飽和また は不飽和であってよく、そして直鎖または分枝状でよい。そのような脂質は例え ば、好ましくは約１２個の炭素原子から約２２個の炭素原子の間の広い範囲の炭 素原子を含む脂肪酸分子を含んで成ることができる。イソプレノイド単位、フェ ニル基および／またはステロール部分（例えばコレステロール、硫酸コレステロ ールおよびその同族体）から成る炭化水素基も、同様に使用できる。脂質は両親 媒性ポリマー ポ リエチレングリコール（ＰＥＧ）もしくはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）また はその誘導体（インビボ ターゲッティング用に）のようなポリマー鎖、または ポリリシンもしくはポリアルギニンのような荷電アミノ酸（負に荷電した化合物 に結合するために）、または米国特許第4,310,505号明細書に記載されたような 炭化水素(インビボ ターゲッティング用に)、または糖脂質(インビボ ターゲッ ティング用に)、または抗体および他のペプチドおよびタンパク質(インビボ タ ーゲッティング用に)等を、所望により有するものでよい。そのようなターゲッ ティング用または結合用化合物を、単に水性脂質懸濁液相に加えるか、または脂 質に特別に化学的に付加することができる。脂質はまた、それ自体が薬剤、遺伝 物質または他の治療物質のような他の化学的に結合できるように、所望によりア ニオン性またはカチオン性脂質であってよい。 適当な脂質および特に適当な脂質の種類の例には；ジオレオイルホスファチジ ルコリン、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジ ルコリン(DPPC)およびジステアロイルホスファチジルコリンのようなホスファチ ジルコリン；ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン(DPPE)、ジオレオ イルホスファチジルエタノールアミンおよびN-スクシニル-ジオレオイルホスフ ァチジルエタノールアミンのようなホスファチジルエタノールアミン；ホスファ チジルセリン；ホスファチジルグリセロール；スフィンゴリピッド；ガングリオ シドGM1のようなグリコリピッド；グルコリピッド；スルファチド；グリコスフ ィンゴリピッド；ジパルミトイルホスファチジン酸(DPPA)のようなホスファチジ ン酸；パルミチン脂肪酸；ステアリン脂肪酸；アラキドン脂肪酸；ラウリン脂肪 酸；ミリスチン脂肪酸；ラウロレイン脂肪酸；フィゼテリ ン脂肪酸；ミリストオレイン脂肪酸；パルミトレイン脂肪酸；ペトロセリン脂肪 酸；オレイン脂肪酸；イソラウリン脂肪酸；イソミリスチン脂肪酸；イソパルミ チン脂肪酸；イソステアリン脂肪酸；コレステロールおよびコレステロールヘミ スクシネート、コレステロールサルフェートおよびコレステリル-(4'-トリメチ ルアンモニオ)-ブタノエートのようなコレステロール誘導体；ポリオキシエチレ ン脂肪酸エステル；ポリオキシエチレン脂肪酸アルコール；ポリオキシエチレン 脂肪酸アルコールエーテル；ポリオキシエチレン化ソルビタン脂肪酸エステル； グリセロール ポリエチレングリコール オキシステアレート；グリセロール ポ リエチレングリコール リシノレート；エトキシル化大豆ステロール；エトキシ ル化ひまし油；ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン脂肪酸ポリマー；ポ リオキシエチレン脂肪酸ステアレート；12-(((7'-ジエチルアミノクマリン-3-イ ル)-カルボニル)-メチルアミノ)-オクタデカン酸；N-[12-(((7'-ジエチルアミノ -クマリン-3-イル)-カルボニル)-メチル-アミノ)-オクタデカノイル]-2-アミノ- パルミチン酸；1,2-ジオレオイル-sn-グリセロール；1,2-ジパルミトイル-sn-3- スクシニルグリセロール；1,3-ジパルミトイル-2-スクシニル-グリセロール；な らびに1-ヘキサデシル-2-パルミトイル-グリセロホスホエタノールアミンおよび パルミトイルホモシステイン；ラウリルトリメチルアンモニウム ブロミド(ラウ リル-＝ドデシル-)；セチルトリメチルアルモニウムブロミド(セトリル-＝ヘキ サデシル-)；ミリスチルトリメチルアンモニウムブロミド(ミリスチル-＝テトラ デシル-)；アルキルがC₁₂、C₁₄またはC₁₆アルキルであるようなアルキルジメチ ルベンジルアンモニウムクロライド；ベンジルジメチルドデジルアンモニウム ブロミド；ベンジルジ メチルドデシルアンモニウム クロライド、ベンジルジメチルヘキサデシルアン モニウム ブロミド；ベンジルジメチルヘキサデシルアンモニウム クロライド； ベンジルジメチルテトラデシルアンモニウム ブロミド；ベンジルジメチルテト ラデシルアンモニウム クロライド；セチルジメチルエチルアンモニウム ブロミ ド；セチルジメチルエチルアンモニウムクロライド；セチルピリジニウム ブロ ミド；セチルピリジニウム クロライド；N-[1-2,3-ジオレオイルオキシ)-プロピ ル]-N,N,N-トリメチルアンモニウム クロライド(DOTMA)；1,2-ジオレオイルオキ シ-3-(トリメチルアンモニオ)プロパン(DOTAP)；および1,2-ジオレオイル-e-(4' -トリメチルアンモニオ)-ブタノイル-sn-グリセロール(DOTB)を含む。 当業者はいったん本開示事項を身に付すれば明らかであるように、前述の脂質 の一覧は例示であり、そして他の有用な脂質、脂肪酸および誘導体ならびにそれ らの組み合わせを使用でき、そしてそのようなさらなる化合物も本明細書で使用 する用語、脂質の範囲内にあるものとする。当業者はそのような脂質および／ま たはそれらの組み合わせが、容器を撹拌したときに、ガス相からガスをその内部 空間に封入するリポソーム（すなわち、内部空間を有する脂質球）を形成するこ とを認識するだろう。このリポソームは１つの脂質相（脂質単層）、２つの脂質 相（脂質二重層）または２つより多くの脂質層（脂質多重層）から成ることがで きる。 一般的に、ゲル状である脂質が好ましく、すなわち特に撹拌中は、脂質物質の ゲル状態から液体結晶状態への相転移温度（Ｔｍ）未満が好ましい。種々の脂質 のゲル状態から液体結晶状態への相転移温度は周知である。そのような温度は、 周知技法により容易に算出することもできる。 以下の表１は、Derek Marsh,“CRC 脂質二重層の ハンドフック(CRC Handbook of Lipid Bi1ayers)”、第139頁、ＣＲＣ出版、ボカ ラトン、フロリダ州（1990 ）の引用であるが、例えば種々の代表的な飽和ホスホコリン脂質に関して、主鎖 の相転移温度を表している。 本発明の好適な態様では、水性脂質相はさらにポリマー、好ましくは両親媒性 ポリマー、そして好ましくは脂質に直接結合している（すなわち、化学的に結合 している）ポリマーを含んで成る。好ましくは両親媒性ポリマーは、ポリエチレ ングリコールまたはその誘導体である。最も好ましい組み合わせは、ポリエチレ ングリコール（PEG）、特に平均分子量が約5,000のPEGに結合した脂質ジパルミ トイルホスファチジルエタ ノールアミン(DPPE)である(DPPE-PEG5000)。PEGまたは他のポリマーは、DPPEま たは他の脂質に、アミド、カルバメートまたはアミン結合のような共有結合を介 して結合できる。あるいは、エステル、エーテル、チオエステル、チオアミドま たはジスルフィド（チオエステル）結合をPEGまたは他のポリマーと共に使用し て例えば、ポリマーをコレステロールまたは他のリン脂質に結合できる。特に好 適な脂質の組み合わせは、DPPC、DPPE-PEG5000およびDPPA、特に約82％：８％： 10％（モル％）比のDPPC:DPPE-PEG5000:DPPAである。 水性相を調製するために、脂質を水（好ましくは蒸留水）、通常の（生理的） 塩溶液、リン酸緩衝化塩溶液または当業者には周知な他の水性を基本とする溶液 と混合することができる。 広範な種々のガスを、本発明のガス相に使用できる。好ましくはガスは水性の 脂質懸濁相中で実質的に不溶性である。実質的に不溶性とは、ガスが20℃、そし て１気圧の水中で溶解度を約18mlのガス／kg水以下に維持することを意味する。 このように、実質的に不溶性のガスは窒素ガスよりも低い溶解度を有する。好ま しくは溶解度は20℃かつ1気圧で、約15mlガス/kg水以下であり、より好ましくは 約10mlガス/kg水以下である。1つの好適な種類のガスでは、上記温度および圧力 で溶解度は約0.001から約18mlのガス／kg水の間、または約0.01から約15mlのガ ス／kg水の間、または約0.1から約10mgのガス／kg水の間、または約1から約８mg のガス／kg水の間、または約2−6ml／kg水の間である。ペルフルオロカーボンガ スおよびフッ素化ガスサルファヘキサフルオリドは、例えば20℃および１気圧で 、10mlのガス／kg水よりも溶解度が低く、したがって好ましい。本明細書で定義 するような実質的に不溶性ではないガスは、 可溶性ガスと言う。 他の適当な実質的に不溶性または溶解性のガスは、限定するわけではないがヘ キサフルオロアセトン、イソプロピルアセチレン、アレン、テトラフルオロアレ ン、三弗化ホウ素、1,2-ブタジエン、1,3-ブタジエン、1,2,3-トリクロロブタジ エン、2-フルオロ-1,3-ブタジエン、2-メチル-1,3-ブタジエン、ヘキサフルオロ -1,3-ブタジエン、ブタジイン、1-フルオロブタン、2-メチルブタン、デカフル オロブタン（ペルフルオロブタン）、デカフルオロイソブタン（ペルフルオロイ ソブタン）、1-ブテン、2-ブテン、2-メチル-1-ブテン、3-メチル-1-ブテン、ペ ルフルオロ-1-ブテン、ペルフルオロ-1-ブテン、ペルフルオロ-2-ブテン、4-フ ェニル-3-ブテン-2-オン、2-メチル-1-ブテン-3-イン、硝酸ブチル、1-ブチン、 2-ブチン、2-クロロ-1,1,1,4,4,4-ヘキサフルオロブチン、3-メチル-1-ブチン、 ペルフルオロ-2-ブチン、2-ブロモ-ブチルアルデヒド、カルボニルスルフィド、 クロトノニトリル、シクロブタン、メチルシクロブタン、オクタフルオロシクロ ブタン(ペルフルオロシクロブタン)、ペルフルオロイソブタン、3-クロロシクロ ペンテン、シクロプロパン、1,2-ジメチルシクロプロパン、1,1-ジメチルシクロ プロパン、エチルシクロプロパン、メチルシクロプロパン、ジアセチレン、3-エ チル-3-メチルジアジリジン、1,1,1-トリフルオロジアゾエタン、ジメチルアミ ン、ヘキサフルオロジメチルアミン、ジメチルエチルアミン、ビス-(ジメチルホ スフィン)アミン、2,3-ジメチル-2-ノルボルナン、ペルフルオロジメチルアミン 、ジメチルオキソニウム クロライド、1,3-ジオキソラン-2-オン、1,1,1,1,2-テ トラフルオロエタン、1,1,1-トリフルオロエタン、1,1,2,2-テトラフルオロエタ ン、1,1,2-トリクロロ-1,2,2-トリフルオ ロエタン、1,1-ジクロロエタン、1,1-ジクロロ-1,2,2,2-テトラフルオロエタン 、1,2-ジフルオロエタン、1-クロロ-1,1,2,2,2-ペンタフルオロエタン、2-クロ ロ-1,1-ジフルオロエタン、1-クロロ-1,1,2,2-テトラフルオロエタン、2-クロロ -1,1-ジフルオロエタン、クロロエタン、クロロペンタフルオロエタン、ジクロ ロトリフルオロエタン、フルオロエタン、ニトロペンタフルオロエタン、ニトロ ソペンタフルオロ-エタン、ペルフルオロエタン、ペルフルオロエチルアミン、 エチルビニルエーテル、1,1-ジクロロエチレン、1,1-ジクロロ-1,2-ジフルオロ- エチレン、1,2-ジフルオロエチレン、メタン、メタン-スルホニル-クロライド- トリフルオロ、メタン-スルホニル-フルオリド-トリフルオロ、メタン-(ペンタ フルオロチオ)トリフルオロ、メタン-ブロモ-ジフルオロ-ニトロソ、メタン-ブ ロモ-フルオロ、メタン-ブロモ-クロロ-フルオロ、メタン-ブロモ-トリフルオロ 、メタン-クロロ-ジフルオロ-ニトロ、メタン-クロロ-ジニトロ、メタン-クロロ -フルオロ、メタン-クロロ-トリフルオロ、メタン-クロロ-ジフルオロ、メタン- ジブロモ-ジフルオロ-、メタン-ジクロロ-ジフルオロ、メタン-ジクロロ-フルオ ロ、メタン-ジフルオロ、メタン-ジフルオロ-イオド、メタン-ジシラノ、メタン -フルオロ、メタン-ヨードメタン-ヨード-トリフルオロ、メタン-ニトロ-トリフ ルオロ、メタン-ニトロソ-トリフルオロ、メタン-テトラフルオロ、メタン-トリ クロロ-フルオロ、メタン-トリフルオロ、メタンスルフェニルクロライド-トリ フルオロ、2-メチルブタン、メチルエーテル、メチルイソプロピルエーテル、メ チルラクテート、メチルニトリット、メチルスルフィド、メチルビニルエーテル 、ネオペンタン、窒素（Ｎ₂）、亜酸化窒素、1,2,3-ノナデカン-トリカルボン酸 -2-ヒドロキシトリメチルエステル、 1-ノネン-3-イン、酸素（Ｏ₂）、酸素１７（¹⁷Ｏ₂）、1,4-ペンタジエン、n-ペ ンタン、ドデカフルオロペンタン（ペルフルオロペンタン）、テトラデカフルオ ロヘキサン（ペルフルオロヘキサン）、ペルフルオロイソペンタン、ペルフルオ ロネオペンタン、2-ペンタノン-4-アミノ-4-メチル、1-ペンテン、2-ペンテン{ シス}、2-ペンテン{トランス}、1-ペンテン-3-ブロモ、1-ペンテン-ペルフルオ ロ、フタル酸-テトラクロロ、ピペリジン-2,3,6-トリメチル、プロパン、プロパ ン-1,1,1,2,2,3-ヘキサフルオロ、プロパン-1,2-エポキシ、プロパン-2,2-ジフ ルオロ、プロパン-2-アミノ、プロパン-2-クロロ、プロパン-ヘプタフルオロ-1- ニトロ、プロパン-ヘプタフルオロ-1-ニトロソ、ペルフルオロプロパン、プロペ ン、プロピル-1,1,1,2,3,3-ヘキサフルオロ-2,3-ジクロロ、プロピレン1-クロロ 、プロピレン-クロロ-｛トランス｝、プロピレン-2-クロロ、プロピレン-3-フル オロ、プロピレン-ペルフルオロ、プロピン、プロピン-3,3,3-トリフルオロ、ス チレン-3-フルオロ、サルファヘキサフルオリド、サルファ(ジ)-デカフルオロ(S₂ F₁₀)、トルエン-2,4-ジアミノ、トリフルオロアセトニトリル、トリフルオロメ チルペルオキシド、トリフルオロメチルスルフィド、六弗化タングステン、ビニ ルアセチレン、ビニルエーテル、ネオン、ヘリウム、クリプトン、キセノン（特 にルビジウム リッチ過分極化キセノンガス）、二酸化炭素、ヘリウムおよび空 気を含む。フッ素化ガス（すなわち、サルファヘキサフルオリドのような１つ以 上のフッ素分子を含むガス）、フルオロカーボンガス（すなわち、フッ素化炭素 またはガスであるフッ素化ガス）、およびペルフルオロカーボンガス（すなわち 、ペルフルオロプロパンおよびペルフルオロブタンのような完全にフッ素化され たフルオロカーボンガス）が好 ましい。 本発明のガス相中にほとんどすべてのガスを理論的には使用できるが、生成す るコントラスト媒質に望まれる特性を最適にするために、そして特定の診断応用 に合うように特定のガスを選択できる。例えば、あるガスは他のガスよりも安定 なガス−充填リポソームを振盪時に生成し、このようなガスが好ましいと判明し た。特定のガスがより良い画像を超音波またはＭＲＩのような診断造影で提供す ることも判明した。 ガス−充填リポソームの安定性増大の例として、二酸化炭素＜酸素＜空気＜窒 素＜ネオン＝ヘリウム＜ペルフルオロカーボン ガスであることが判明した。こ れらの、ならびに他の理由から、フッ素化ガス、特にペルフルオロカーボンガス が好ましい。 本発明において数種の可溶性ガスがガス相として十分に機能する場合もあるが 、特に撹拌によるコントラスト剤の生成時には、実質的に不溶性ガスが高溶解性 ガスよりも、より高い安定性を生じる傾向にある。また本発明に従い、そのよう な不溶性ガスを有するガス相は水性脂質相から撹拌前に実質的に分離しておくこ とが容易であろう。すなわち、既に定義した実質的に不溶性のガスが好ましい。 超音波画像の質およびその画像の持続時間は、水性環境中でのガスの溶解度と 相関する。ガスの溶解度が減少すれば、一般的に超音波ではより良い解像度およ び長期の継続時間を提供する。 さらに、撹拌で生成するガス−充填リポソームのサイズは、水性環境中でのガ スの溶解度と相関し、より大きな溶解度のガスでより大きなガス−充填リポソー ムが生成することが一般的に観察された。またリポソームのサイズは、ガスとリ ポソーム内壁との相互作用により影響を受け 得ると考えられる。特に、界面での相互作用は張力に影響を及ぼし、その結果、 内部ガスのリポソームの内部脂質壁に対する外向きの力に影響を及ぼすと思われ る。張力の低下は、内部ガスが作用する力の減少により、より小さいリポソーム を可能とし、すなわち水性環境がリポソームの外側に作用する力でガス−充填リ ポソームを縮ませる。 水性溶媒中のガスの溶解度は、Henryの法則を使用することにより予測でき、 なぜならそれは一般的に最高約１気圧まで、かつわずかに可溶性のガスに応用で きるからである(Daniels,FおよびAlberty,R.A.,物理化学(Physical Chemistry) 、第３版、ウィリー アンド サンズ社(Wiley & Sons Inc.)、ニューヨーク、196 6)。一例として、大気は25℃で１kgの水に18.68mlの溶解度を有し、窒素は25℃ で約18.8mlKg^-1の溶解度を維持する。一方、サルファーヘキサフルオリドは25℃ で約5.4mlkg^-1の溶解度を保持する。 まとめると、フッ素化ガス、フルオロカーボンガスおよびペルフルオロカーボ ンガスが、安定性、不溶性および生成するリポソームのサイズの点から好ましい 。特に好適なものは、フッ素化ガスサルファヘキサフルオリドおよびペルフルオ ロカーボンガス、ペルフルオロプロパン、ペルフルオロブタン、ペルフルオロシ クロブタン、ペルフルオロメタン、ペルフルオロエタンおよびペルフルオロペン タン、特にペルフルオロプロパンおよびペルフルオロブタンである。 ５個未満の炭素原子を有するペルフルオロカーボンは、室温でガスであること に注目すべきである。例えばペルフルオロペンタンは、約27℃まで液体である。 この温度より高いと、これは容器の頭隙を占めるだろう。しかしペルフルオロペ ンタンは室温でも頭隙（すなわち、バイアル 中の脂質懸濁液相の上）を満たすために使用できることが実証された。頭隙を満 たすように算出した液体ペルフルオロペンタンの規定値を選択し、そして液体を 容器に低温（例えば−20℃）で加え、そして次に容器を吸引し（頭隙の空気を効 果的に除去する）、そして容器の密閉することにより、ペルフルオロペンタンは １気圧で沸点より低い温度で液相から気相へ転移するだろう。すなわち、室温で 頭隙の一部または全部がガスで満たされる。当業者には認識できるように、液相 から気相への転移温度の減少は、通常の経験則による予想を使用して予測するこ とができる。特に圧力が半分に減少する毎に、沸点は約10℃減少する。あるいは Boyleの法則に基づく理想ガスの法則に基づく関係を使用して、圧力低下の関数 として温度の低下を算出することができる。頭隙をペルフルオロペンタンで満た すための別の方法は、初めに頭隙を吸引し、そして次に頭隙をペルフルオロペン タンガスを27℃より高い温度で満たすことである。もちろん、この方法はペルフ ルオロペンタンだけに限定されず、すべてのペルフルオロカーボンガス、ならび にガスの沸点が知られていればすべてのガスに一般的に応用される。 所望により、２種以上の異なるガスを頭隙を一緒に充填するために使用できる 。ガスの混合物は、生成するガス−充填リポソームの広範な応用に（超音波造影 、ＭＲ造影等の応用のような）、多くの利点を有することができる。少量の実質 的に不溶性ガスを可溶性ガスと混合して、組み合わせにより予想されるよりも高 い安定性を提供することができることが判明した。例えば、少量のペルフルオロ カーボンガス（一般的に例えば少なくとも約１モル％で）を、空気、窒素、酸素 、二酸化炭素または他のより可溶性ガスと混合できる。撹拌後に生じる、生成し たガス− 充填リポソームコントラスト剤は、空気、窒素、酸素、二酸化炭素、または他の より可溶性ガス単独よりも安定であり得る。 さらにガスの混合物を使用することは、ガス−充填リポソームのサイズを相補 するために使用でき、そうしなければインビボで生じるのはインビボ注入する純 粋なペルフルオロカーボンガス含有リポソームである。幾つかのペルフルオロカ ーボンガスは酸素のような他のガスを吸着または吸収する傾向があることが判明 した。したがってもしペルフルオロカーボンガスを静脈に注射すれば、循環して いる血液中に溶解している酸素または他の可溶性ガスを取り込むことができる。 生成する気泡はこの取り込みの結果、インビボで成長できる。この現象の知識を 用いて準備すれば、ペルフルオロカーボンガスを空気、窒素、酸素、二酸化炭素 のような可溶性ガスと前混合し、これによりペルフルオロカーボンの吸着または 吸収特性を飽和させることができる。この結果、これにより血流中でのガス−充 填リポソームの膨張の可能性を防ぐまたは排除さえする。これはリポソームが10 μMよりも大きなサイズに成長すると、血流中に投与された時に危険な塞栓を生 じ得る可能性がある、という事実の観点から極めて重大である。頭隙にペルフル オロカーボンガスよりも可溶性のガスをペルフルオロカーボンガスと一緒に充填 することにより、ガス−充填リポソームは一般的にインビボに注入された後にサ イズが増すことはない。したがって本発明の結果、リポソームの膨張に由来する 塞栓形成の問題は、そのような膨張が排除されるか、または有意に防げるような リポソームを生成することにより回避できる。 したがって本発明に従い、所望により実質的に不溶性のガスは可溶性ガスと組 み合わせて、高度に効果的かつ安定なガス−充填リポソームを 効率的に生成できる。 以下の表２は、頭隙ガスとして変動する割合の実質的に不溶性のペルフルオロ プロパン（ＰＦＰ）および空気を使用して調製したガス−充填リポソームの試料 分析を提供する。ガスを脂質水性相と、3300RPMで60秒間撹拌することにより混 合した。光学整粒器（Optical Particle Sizer、パーティクルサイジングシステ ムズ:Particle Sizing Systems、サンタバーバラ、カリフォルニア州）を、ガス −充填リポソームのサイズおよび総数を分析するために使用した。５マイクロリ ットルの試料容量を各分析で使用し、各測定には４つの試料を使用した。 表２に示すように、ガスのわずか20％がＰＦＰ（実質的な不溶性ガス）であり 、そしてガスの80％が空気（可溶性ガスの混合物）であるときでさえ、空気単独 （０％ＰＦＰ）を使用した時に生成したリポソームの100倍以上が生成された。 さらに空気単独（０％ＰＦＰ）を使用した時、リポソームはより一層不安定であ り、そしてより大きな画分は10ミクロンより大きかった。しかし20％ＰＦＰおよ び80％空気のリポソームは、80％ＰＦＰおよび20％空気のリポソームならびに他 の中間ＰＦＰ濃度試料と丁度同じように安定であり、そして80％空気を含む20％ ＰＦＰのリポソームは、20％空気を含む80％ＰＦＰのように多くのガス−充填リ ポソームを生成した。 表２において、ＳＴＤｅｖ＝標準偏差、そしてＣＶ＝変動係数。また表２にお いて、Ｅ＋は特定数に関する指数を表し、例えば5.45E+0.5＝5.45×10⁵。 要するに、可溶性ガスであるほとんどのガスとともに、わずかに少量の比較的 不溶性ガス（ＰＦＰのような）が、リポソーを安定化する為に必要であることが 分かった。以下の式 により算出できるような２つ以上のガスの組み合わせの効果的溶解度は、可溶性 ガスの溶解度とはわずかに異なるだけであるが、わずか少量不溶性ガスを加える ことで、一層高いガス−充填リポソーム数およびガス−充填リポソーム安定性と なる。 任意の操作原理に結び付けることを意図するわけではないが、実質的に不溶性 のガスは膜安定化効果に重要であると考える。事実、実質的に不溶性ガス（ＰＦ Ｐのような）は脂質膜に対してバリヤーとして作用し、可能であれば膜の内表面 上に層を効果的に形成し、これが可溶性ガス（空気、窒素等のような）が出て行 くことを遅らせる、と考えられる。この知見はわずかに少量の実質的に不溶性の ガス（例えば、ペルフルオロカーボンまたは他のフッ素化ガス）および空気また は窒素のような主要なより生物適合性ガス（毒性の可能性が低い）を使用して、 ほとんどのリポソーム容量を構成できるので、驚くべきことであり、かつ有用の 両方である。 任意の混合物中の実質的に不溶性ガスおよび可溶性ガスの量は、当業者が認識 するように大変広範である。しかし典型的には、総ガス量の少なくとも約0.01％ が実質的に不溶性ガスであり、より好ましくは少なくとも約0.1％、さらにより 好ましくは少なくとも約１％、そして最も好ましくは少なくとも約10％が実質的 に不溶性ガスである。実質的に不溶性ガスの適当な範囲は、さらに使用する可溶 性ガス、脂質の種類、特定の応用等のような様々な因子に依存して変動する。例 示的範囲は、約0.01％から約99％の間の実質的に不溶性ガス、好ましくは約１％ から約95 ％の間、より好ましくは約10％から約90％の間、そして最も好ましくは約30％か ら約85％の間の不溶性ガスを含む。 診断用の磁気共鳴造影（ＭＲＩ）に使用するような診断用超音波造影の外の使 用のために、強力な常磁性酸素17ガス（¹⁷Ｏ₂）、ネオン、キセノン（特にルビ ジウム リッチ 過分極化キセノンガス）または酸素（より強力ではないが、これ もまた常磁性）は、例えば頭隙を満たすために好ましく使用できるるが、他のガ スも使用できる。最も好ましくは¹⁷Ｏ₂ガス、ネオン、ルビジウムリッチ過分極 過化キセノンガスまたは酸素ガスを、例えばペルフルオロカーボンガスのような 実質的に不溶性のガスと組み合わせる。常磁性ガスは当該技術分野で周知であり 、そして適当な常磁性ガスは、当業者には容易に明らかである。ＭＲＩへの応用 に最も好適なガスは、単独または他のガスと組み合わせて使用するにせよ、¹⁷Ｏ₂ である。 ガスを組み合わせて使用することにより、¹⁷Ｏ₂または他の常磁性ガスは最適 なコントラストを提供し、そしてペルフルオロカーボンは撹拌後に封入されたガ ス内で¹⁷Ｏ₂を安定化する。ペルフルオロカーボンガスを加えないと、¹⁷Ｏ₂のよ うなガスはその溶解度ゆえに静脈注入後に脂質封入から外へ拡散するので一般的 により効果が低い。さらに¹⁷Ｏ₂ガスは大変高価である。ペルフルオロカーボン ガスと¹⁷Ｏ₂ガスとを組み合わせることにより、生成物の効力が大きく増大し、 そして経費がかかる¹⁷Ｏ₂ガスのより効率的使用を通じて経費は下がる。同様に 、例えばネオンのような所望の常磁性を有する他のガスを、ペルフルオロカーボ ンガスと混合することができる。 以下の表３から、広範な種々のガスをＭＲ造影法に使用できることが 明らかである。表３において、ガス−充填リポソーム中の種々のガスに関するＲ ２（1/T2/mmol/L.sec^-1）を表す。表３に示すように、種々のガス−充填リポソ ームの緩和に劇的な差異があり、より高いＲ２緩和値はそのリポソームがＭＲ造 影剤としてより効果的であることを示している。示したガスの中で、空気が最高 のＲ２値を有する。空気は空気中の酸素の常磁性効果により、最高であると考え られる。しかし純粋な酸素は、効果が幾分低く、酸素のより高い溶解性およびリ ポソーム周囲の水性環境中への酸素の平衡化によるものであろう。空気を用いる と、窒素（空気は約80％が窒素である）がリポソーム中の酸素の安定化を助ける 。窒素は空気よりも水への溶解度が低い。上記のように、ＰＦＰまたは他のペル フルオロカーボンガスを、空気、酸素、¹⁷Ｏ₂またはルビジウムリッチ過分極化 キセノンのような、より磁性的に活性なガスと混合することができる。そのよう に行うと、安定な高度に磁性的に活性なガス−充填リポソームを調製できる。 容器の頭隙は所望により、周囲圧、減圧または加圧下でガスを用いて充填する ことができる。 本発明の容器では、ガス相は実質的に水性脂質懸濁液相とは分離している。実 質的に分離しているとは、約50％未満のガスが撹拌前に水性脂質相と混合される ことを意味する。好ましくは約40％未満、より好ましくは約30％未満、さらによ り好ましくは約20％未満、そして最も好ましくは約10％未満のガスを水性脂質相 と混合する。ガス相は容器を撹拌し、そしてガス相および水性脂質相が混合され てガス−充填リポソームの水性懸濁液を形成するまで、実質的に水性脂質相と分 離しておく。この様 式では、超音波または磁気共鳴造影用の優れたコントラスト剤が生成される。さ らに、コントラスト剤は使用直前に調製されるので、使用期限安定性の問題は最 小である。 撹拌は広範な様々な方法で行うことができ、そして機械的および／または手動 による撹拌、ならびに超音波処理（音波）のような他の手段を含むことができる 。機械的および／または手動の撹拌が好ましい。撹拌は例えば、振盪、撹拌(sti rring)、ボルテックス処理、振動等により行える。好ましくは図２に表すような 撹拌デバイスを使用できる。特に図２に機械的撹拌デバイス(10)を表す。撹拌は 開始−停止ボタン(11)を使用して行い、そして止めることができる。撹拌デバイ ス(10)はまた、種々のスピード(RPM)調整を提供するノブ(12)を含んで成る。ノ ブ(12)を時計回りに回すことにより、撹拌速度（RPMで）が上がる。逆にノブ(12 )を反時計回りに回すことにより、撹拌速度が下がる。本発明の容器内容物は、 容器を撹拌デバイス(10)のハウジングモジュール(13)に置くことにより撹拌でき る。ハウジングモジュール(13)は、撹拌デバイス(13)の撹拌手段として役立つ。 撹拌のために容器をしっかりとハウジングモジュール中に確実に置くために、ス クリュー(14)を使用する。 本発明に使用する容器は、種々の異なる形状をとることができる。所望により 、図１に示すように、容器(1)は本体(2)およびキャップ(3)を有し、実質的に互 いに分離しているガスの頭隙(4)および脂質の水性懸濁液(5)を含む。あるいは容 器は所望により１つ以上のフィルターを取り付けた予め充填したシリンジ状態で もよい。この場合は、シリンジに水性相および予め選択したガスの頭隙を満たす 。このシリンジは一般的に、長軸が振盪方向に対して垂直に配置されている振盪 デバイスに取り 付けられる。振盪後、ガス−充填リポソームがシリンジ中で生成され、直ぐに使 用できる。好ましくは容器は、図１に示すような容器、シリンジまたは別の種類 の容器であるにかかわらず、その内容物と一緒に滅菌される。 種々の異なる材料を、本発明の容器を製造するために使用でき、ガラス、珪硼 酸ガラス、珪酸ガラス、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリテトラフルオロエ チレン、ポリアクリレート、ポリスチレンまたは他のプラスチックのようなシリ ンジを含む。シリンジを含む好適な容器は、ガス不浸透性またはガスを充填する 前に外部ガス不浸透性バリアー内に包まれている。もちろん、容器内に予め選択 したガスの完全性を維持することが望ましい。ガスを詰める能力を有するシリン ジ材料の例は、限定するわけではないが珪酸ガラスまたは珪硼酸ガラスであり、 シリカ−融合シリンジまたはルアー−ロック型(luer-lock type)シリンジ、およ びテフロン−チップまたはテフロン−被覆プランジャーが付いている。 当業者は本開示の物質から準備をはじめれば、種々の添加物を本発明の水性脂 質懸濁相にその相を安定化するために、または撹拌時にガス−充填リポソームを 安定化するために使用できると認識するだろう。所望により、これらの添加物を 撹拌前に水性脂質相に加えるか、または撹拌そしてガス−充填リポソームの調製 物の生成後に組成物中に加えることができる。もちろんそのような添加物は、当 業者には明らかであるように、生成したガス−充填リポソームの特定の応用目的 に依存する。 本発明に使用できる多数の安定化剤は入手可能であり、キサンタンガム、アカ シア、寒天、アガロース、アルギン酸、アルギン酸塩、アルギン酸ナトリウム、 カラゲーナン、デキストラン、デキストリン、ゼラチ ン、グアガム、トラガカント、イナゴマメ、バッソリン(Bassorin)、カラヤ、ア ラビアガム、ペクチン、カゼイン、ベントナイト、未精製ベントナイト、精製ベ ントナイト、ベントナイトマグマ、コロイド状、セルロース、セルロース（微結 晶）、メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセ ルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース 、カルボキシメチルセルロース カルシウム、カルボキシメチルセルロース ナト リウム、カルボキシメチルセルロース ナトリウム12、ならびに他の天然の、ま たは修飾された天然のセルロース、ポリソルベート、カルボマー 934Ｐ、珪酸マ グネシウムアルミニウム、モノステアリン酸アルミニウム、ポリエチレンオキシ ド、ポリビニルアルコール、ポビドン、ポリエチレングリコール、プロピレング リコール、ポリビニルピロリドン、二酸化珪素、コロイド状二酸化珪素を含む。 ペルフルオロオクチルブロミド(PFOB)、ペルフルオロオクチルヨージド、ペル フルオロトリプロピルアミンおよびペルフルオロトリブチルアミンを、安定化剤 として脂質相に使用することができる。５個の炭素原子よりも大きいペルフルオ ロカーボンは一般的に、体温で液体であり、そしてそのようなペルフルオロカー ボンは安定化剤としても高度に好ましい。適当なペルフルオロカーボンには、ペ ルフルオロヘキサン、ペルフルオロペプタン、ペルフルオロオクタン、ペルフル オロデカリン、およびペルフルオロドデカリンを含む。さらに過フッ素化脂質ま たは部分フッ素化脂質も、安定化を助けるために使用できる。当業者には明らか であるように、本発明に記載した広範な種々の脂質の過フッ素化または部分フッ 素化同族体を使用できる。炭化水素脂質に関するそれらの比較 的疎水的な性質により、そのような過フッ素化または部分フッ素化脂質は、安定 性という観点からさらに利点を提供する。過フッ素化または部分フッ素化脂質の 例は、F₆C₁₁ホスファチジルコリン(PC)およびF₈C₅PCである。そのような同族体 は、例えばSantaellaら、Federation of European Biochemical Societies(FEBS ) 、第336巻、第3号、第418-484頁、(1993)に記載されており、その開示は全部、 引用により本明細書に編入する。 ピーナッツ油、キャノーラ油、オリーブ油、ベニバナ油、トウモロコシ油、ア ーモンド油、綿実油、ペルジック(persic)油、ゴマ油、ダイズ油、鉱物油、鉱物 軽油、オレイン酸エチル、ミリスチルアルコール、イソプロピルミリステート、 イソプロピルパルミテート、オクチルドデカノール、プロピレングリコール、グ リセロール、スクワレン、または他の任意の消化性であると知られている市販の 油のような広範な種々の生物適合性油も、安定化を補助するために使用できる。 これらには、レシチン、スフィンゴミエリン、コレステロール、硫酸コレステロ ールおよびトリグリセリドを含んでよい。 安定化は広範な種々の粘稠改質剤（すなわち、粘度改質剤）を加えることによ っても行うことができ、これは本発明に従い安定化剤として役立つことができる 。この種類の化合物は限定するわけではないが；１）炭化水素およびそれらのリ ン酸化およびスルホン化誘導体；２）400から8000の分子量範囲のポリエーテル ；３）ジ−およびトリヒドロキシアルカン、および800から8000の間の分子量範 囲のそれらのポリマーを含む。リポソームは、限定するわけではないが、アカシ ア、コレステロール、ジエタノールアミン、グリセリルモノステアレート、ラノ リンアル コール、レシチン、モノ−およびジグリセリド、モノエタノールアミン、オレイ ン酸、オレイルアルコール、ポリオキサマー、ポリオキシエチレン50ステアレー ト、ポリオキシ35キャスター油、ポリオキシル10オレイルエーテル、ポリオキシ ル20セトステアリルエーテル、ポリオキシル40ステアレート、ポリソルベート20 、ポリソルベート40、ポリソルベート60、ポリソルベート80、プロピレングリコ ールジアセテート、プロピレングリコールモノステアレート、ラウリル硫酸ナト リウム、ステアリン酸ナトリウム、モノラウリル酸ソルビタン、モノオレイン酸 ソルビタン、モノパルミチン酸ソルビタン、モノステアリン酸ソルビタン、ステ アリン酸、トロールアミン、乳化ワックス、プルロニック F61、プルロニック F 64およびプルロニック F68から成る乳化および／または可溶化剤と組み合わせて 使用できる。 加えることができる他の薬剤は、グリセロール、プロピレングリコール、ポリ ビニルアルコール、ポリエチレングリコールを始めとするポリアルコール類のよ うな増強剤、グルコース、マンニトール、ソルビトール、塩化ナトリウム等を含 む。 所望により、抗菌剤および／または保存剤を組成物中に含むことがてきる。そ のような薬剤は、安息香酸ナトリウム、すべての四級アンモニウム塩、アジ化ナ トリウム、メチルパラベン、プロピルパラベン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウ ム、ソルビン酸ナトリウム、アスコルビルパルミテート、ブチル化ヒドロキシア ニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、クロロブタノール、デヒドロ酢酸、エ チレンジアミン四酢酸(EDTA)、モノチオグリセロール、安息香酸カリウム、メタ 重亜硫酸カリウム、ソルビン酸カリウム、重亜硫酸ナトリウム、二酸化硫黄およ び有機 水銀塩を含む。 所望により浸透圧を制御するために、浸透剤を使用できる。適当な浸透的に活 性な物質は、単糖類、二糖類、糖アルコール、アミノ酸および種々の合成化合物 のような生理的に適合性のある化合物を含む。適当な単糖類または糖アルコール は、例えばエリスロース、トレオース、リボース、アラビノース、キシロース、 アロース、アルトロース、グルコース、マンノース、イドース、ガラクトース、 タロース、トレハロース、リブロース、フルクトース、ソルビトール、マンニト ールおよびセドヘプチュロースを含み、好適な単糖はフルクトース、マンノース 、キシロース、アラビノース、マンニトールおよびソルビトールである。適当な 二糖類は、例えばラクトース、スクロース、マルトースおよびセルビオースを含 む。適当なアミノ酸は、例えばグリシン、セリン、トレオニン、システイン、チ ロシン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リシン、 アルギニンおよびヒスチジンを含む。合成化合物は、例えばグリセロール、プロ ピレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコール、ポリエチ レングリコールおよびポリビニル−ピロリドンを含む。様々な他の適当な浸透圧 的に活性な物質も、同様に当業者には周知であり、そして本明細書で使用するよ うな浸透圧的に活性な薬剤という用語の範囲内にあるものとする。 上記に考察したような種々のポリマーは、種々の異なる目的および使用のため にも加えることができる。 当業者は特定の最終的な使用に応じて、上記の懸濁剤のような広範囲の添加物 量を、必要に応じて、または所望により本発明の水性脂質懸濁液相に使用できる ことを認識するだろう。そのような添加物を一般的に、 生成するコントラスト組成物の0.01容量％から95容量％の間で含んで成るが、よ り高い、または低い量を使用してもよい。一般的なガイダンスとして、懸濁剤は 典型的には少なくとも約0.5容量％、より好ましくは少なくとも約１容量％、さ らにより好ましくは少なくとも約10容量％で存在する。一般的に懸濁剤は典型的 には約50容量％未満、より好ましくは約40容量％未満、さらにより好ましくは約 30容量％未満の量で存在する。例えば、典型的な懸濁剤の量は約20容量％である 。また典型的には一般的に好ましい浸透性範囲にするために、約25g/l未満、よ り好ましくは約20g/l未満、さらにより好ましくは約15g/l未満、より一層好まし くは10g/l未満の浸透的に活性な物質を使用でき、そして場合によっては浸透的 に活性な物質を使用しない場合もある。最も好適な浸透的に活性な物質の範囲は 、一般的に約0.002g/lから約10g/lの間である。これらの、ならびに他の適当な 添加物の範囲は、いったん本発明を入手すれば当業者には容易に明らかである。 種々の治療薬および／または診断薬も、望ましい治療薬または診断薬を相に単 に加えることにより、水性脂質懸濁液相に包含することができる。適当な治療薬 および診断薬、ならびにそれらの適当な量は、いったん本開示から手掛ければ当 業者には容易に明らかである。これらの薬剤を脂質膜中または上に取り込むか、 または生成したリポソーム中にカプセル化できる。 さらに、ＭＲＩのために生成するガス−充填リポソームの磁性効果を向上させ るために、例えば常磁性または超常磁性コンラスト剤のような１つ以上のＭＲＩ コンラスト増強剤を加えることができる。有用なＭＲＩコンラスト増強剤には、 鉄（Fe⁺³）、銅（Cu⁺²）およびマンガン（Mn ⁺² ）を含む遷移金属のような常磁性イオン、ならびにガドリニウム（Gd⁺³）およ びジスポロシウム（Dy⁺³）のようなランタニド、ニトロキシド、酸化鉄（Fe₃O₄ ）、硫酸鉄ならびにヒドロキシアパタイトで置換されたマンガン（Mn⁺²）のよう な常磁性粒子を含む。同様に、クロミウム（Cr⁺³）、ニッケル（Ni⁺²）、コバル ト（Co⁺²）およびユーロピウム（Eu⁺²）は、使用できる他の常磁性イオンの例で ある。ニトロキシド基または常磁性を持つ不対電子スピンを維持する任意の他の 原子のような、他のコンラスト増強剤を使用できる。理想的には、コントラスト 増強剤を撹拌前に水性脂質相に加え、そして撹拌後にこのコントラスト増強剤を ガス−充填リポソーム内または上に取り込むように設計するが、リポソーム調製 後に添加することも可能である。生成したガス−充填リポソームは、緩和を大い に増大させることができ、特に磁気共鳴造影に効果的なコントラスト剤を提供す る。例としてマンガン（Mn⁺²）は、水性脂質相にホスファチジルコリンまたはホ スファチジルセリンを使用する時、脂質の主基上に取り込まれる。所望により、 金属は例えばUngerら、米国特許第5,312,617号明細書（その内容は全部、引用に より本明細書に編入される）に示されているような脂溶性化合物を使用してキレ ート化することができる。そのような脂溶性化合物はリポソーム膜中に容易に取 り込まれるので、大変有用である。酸化鉄および他の粒子が、リポソーム面中ま たは上へ最適に取り込まれるためには、それらは一般的に小さく、好ましくは約 １μ未満、より好ましくは約200nm未満、そして最も好ましくは100nm未満である べきである。取り込みを向上するために、脂肪性または親液性化合物で被覆した 酸化鉄は、それらが発泡面の脂質コートに取り込まれる傾向があるので使用でき る。 水性脂質懸濁相が、自然にはゲル化しない脂質ポリマーおよび金属のゲル化を 引き起こす、またはゲル化を増強する材料を含むことができることも、本発明の 範囲であり、多価金属カチオン、糖およびポリアルコールのようなゲル化剤を使 用できる。ゲル化剤として有用な多価金属カチオンの例には、カルシウム、亜鉛 、マンガン、鉄およびマグネシウムを含む。有用な糖はグルコース、ガラクトー ス、フルクトース、アラビノース、アロースおよびアルトロースのような単糖、 マルトース、シュクロース、セロビオースおよびラクトースのような二糖、なら びに澱粉のような多糖である。好ましくは単純な糖であり、すなわち単糖または 二糖である。本発明に有用なポリアルコールゲル化剤は、例えばグリシドール、 イノシトール、マンニトール、ソルビトール、ペンタエリスリトール、ガラクチ トールおよびポリビニルアルコールを含む。最も好ましくは、本発明に使用する ゲル化剤はシュクロースおよび／またはカルシウムである。本発明の様々な組成 物中に使用できる特定のゲル化剤は、いったん本開示から準備すれば当業者には 明らかであろう。脂質の組み合わせ、例えばホスファチジン酸とカルシウムまた はマグネシウム塩、ならびにアルギン酸、ヒアルロン酸またはカルボキシメチル セルロースのようなポリマーを脂質を安定化するために使用できる。二価カチオ ンが脂質とポリマーとの間に金属ブリッジを形成し、脂質／ポリマー系内でガス −充填リポソームを安定化すると予想される。同様に、キトサン（またはキチン を基本とした物質）、ポリリシン、ポリエチレンイミンおよびアルギン酸（また はその誘導体）またはヒアルロン酸の混合物を含む懸濁液を調製できる。 撹拌の速度、水性脂質相を含んで成る脂質の量、および密閉容器のサ イズは、任意のガス−充填リポソームの最終的なサイズに影響を及ぼすことがで きる。さらに、そのような試薬の比率がガス−充填リポソームのサイズ分布にも 同様に重要であることが判明した。振盪速度、バイアルのサイズおよび脂質濃度 と共に考慮した時に、ガス−充填リポソーム界面および水性環境中での表面張力 は、ガス−充填リポソームの最終的なサイズのさらなる決定因子であると考えら れる。 水性相およびガスの頭隙を充填した滅菌容器では、撹拌後のリポソームのサイ ズを変化させ、これにより所望のサイズ分布のリポソーム生成物を得るために、 どのように変化が容易かつ簡単になされるかが見いだされた。さらにフィルター は振盪後のコントラスト剤のサイズ分布をさらに規定するために使用できる。以 下では本発明の組成物中のどのような変化が、リポソームのサイズを変化させる ために使用できるか、という再考を提供する。 第一に水性相中の種々の物質は、生成するガス−充填リポソームのサイズを制 御するために重要であり得ることが判明した。表４は、水性相および窒素の頭隙 で充填された滅菌容器を振盪することにより生成したリポソームのサイズを表す 。すべての場合で、リポソームサイズはパーティクル サイジング システム モ デル770 ライト オブスキュレーション整粒器（パーティクル サイジング シ ステムズ、サンタバーバラ、カリフォルニア州）により測定した。データから明 らかなように、水性相中の脂質の比率は生成するガス−充填リポソームのサイズ 分布に影響を及ぼす。特別に、以下の表４は平均リポソームサイズに対する脂質 組成の効果を表す。 表５は、定めた脂質組成混合物の濃度の平均リポソームサイズに対する依存性 を実証している。表５に示すように、脂質の総濃度中の変動も振盪後のリポソー ムのサイズに重要な影響を及ぼす。これらの実験において、３種の脂質成分の比 率は一定に保たれ、水性中の脂質濃度は0.5から5.0mgml^-1の間で変動した。使用 したガスは窒素であった。水性相中の脂質濃度が1.0mgml^-1であるとき、ペルフ ルオロブタンの頭隙を有する超音波診断用に最適なサイズの泡が生成した。 リポソームのサイズは、例えば脂質のような安定化媒質濃度に加えて、頭隙中 のガス組成にも依存し得る。例えば、1.0mgml^-1脂質濃度で、窒素を使用した時 、5.0mgml^-1濃度の脂質とペルフルオロブタンを用いた時とおよそ同じ直径のガ ス−充填リポソームを生成することが判明した。しかし、より高濃度で少し大き なガス−充填リポソームに歪んだ分布を生じ得ることが判明した。この現象はよ り高脂質濃度で、ガス−充填リポソームの安定性の増大を反映している傾向があ る。したがって高濃度の脂質が、水性相中での安定化剤として作用することによ り安定性に寄与するか、あるいはより高濃度の脂質がガスの回りにより多くのラ メラを提供してリポソームをよい安定にするかのいずれかであり、そしてこれは より大きな割合で大きなリポソームが存続することを可能にすると考えられる。 さらに、ガス頭隙のサイズもガス−充填リポソームのサイズに影響させるために 使用できることが判明した。水性相のサイズと比較して、比例的により多くのガ スを含有するより大きな頭隙は、より小さなサイズの頭隙よりも一般的に大きな リポソームを生成するだろう。 撹拌の速度は、正しいサイズのリポソームを生成するために重要である。１分 あたり100から10,000回転(RPM)の間の撹拌速度をリポソームを作成するために使 用できるが、定めたサイズのリポソームを迅速かつ再現性よく作成するという意 味においては最適がある。本明細書にて使用する時、１回転という用語は、１回 の前後、上下、右左、回転等の運動 を言い、ここでこの運動はある点から始まり、そしてその元の点で終わる（すな わち戻る）。表３は82モル％のジパルミトイルホスファチジルコリン（DPPC）と 10モル％のジパルミトイル−ホスファチジン酸（DPPA）と８モル％のジパルミト イルホスファチジル−エタノールアミン−PEG5000(DPPE-PEG5000)の水性相およ びペルフルオロプロパンガスを含んで成る頭隙から生成されたリポソームのサイ ズを示す。この調製物を、Wig-L-Bug(商標)(クレセント デンタル:Crescent Den tal Mfg.,リオン、イリノイ州)で２分間振盪した。水性脂質相および頭隙ガスを 充填した２mlの琥珀色バイアル(ウィートン インダストリーズ：Wheaton Indust ries、ミリビル、ニュージャージー州、実際の容量は3.7ml)を使用して、本発明 の多−相容器をWig-L-Bug(商標)上に置き、そして速度をCo-Palmerモデル08210 ピストルグリップタコメーター(コード-パルモア、ニール、イリノイ州)を通し て測定した。表６は結果を表し、そして生成する平均リポソームサイズに対する 撹拌速度の効果を示している。 実際、所望サイズのリポソームを生成するための最適スピードがあることが見 いだされた。最適なスピードで、ガス−充填リポソームは５分未満、さらに１ま たは２分以内、そしてさらには３０秒以下で大変迅速 に形成する。振盪法および運動が、正しい大きさのリポソームを形成するには重 大であることに注目される。特に最適な大きさのリポソームは振盪の往復運動が 孤形状に生じる時、生じることが判明した。孤形運動の程度は２°から２０°間 であることが好ましい。より一層好ましくは、孤形運動の程度は４°から１０° 間である。さらに一層好ましくは、孤形運動の程度は５°から８°間である。最 も好ましくは、孤形運動の程度は６°から７°間である。本発明のさらなる態様 では、ＲＰＭ数は好ましくは約500から約10,000、より好ましくは約1000から約5 000の間であり、そして最も好ましくは約2500から約4000の間である。 撹拌する液体内容物が利用できる頭隙のサイズ、形および量も、最適な大きさ のガス−充填リポソームの形成に極めて重要であることも見いだされた。例えば 、3.7mlの実際容量(ウィートン 300 珪硼酸ガラス、ウィートンインダストリー ズ、ミルビレ、ニュージャージー州、２mlサイズと言う、直径×高さ＝15mm×32 mm)を使用する時、ガス−含有頭隙の容量は好ましくは全バイアル容量の約10％ から約60％の間であることは、本発明で見いだされたことである。一般的にバイ アル中のガス−含有頭隙は、全バイアル容量の約10％から約80％の間であるが、 特別な状況および所望の応用に応じて、より多い、または少ないガスが適当かも しれない。より好ましくは頭隙は、全容量の約30％から約70％の間を含んで成る 。ガス−含有頭隙の容量が全バイアル容量の約60％を含んで成ることが一般的に 最も好ましい。 これゆえに、本発明の上記考察から最適サイズは撹拌の強度および動き、なら びにバイアルのサイズ、形および充填容量を含む様々な因子に依存することが明 らかである。 塗料混合機、卓上型振盪機およびボルテックスのような種々の撹拌デバイスを ガス−充填リポソームを調製するために使用でき、振盪のジオメトリーおよび速 度がガス−充填リポソームの生成を最適化するためには重要である。Wig-L-Bug( 商標)は撹拌のための最も好適なデバイスである。 滅菌容器のサイズ、容器のジオメトリーおよび振盪装置に対する容器の方向は 、すべてガス−充填リポソームサイズの決定に重要である。振盪デバイス、例え ばWig-L-Bug(商標)は、一般的に滅菌容器の重量が特定レベルを越えると、より 一層ゆっくりと振盪する。標準的なWig-L-Bug(商標)は、10mlバイアルよりも２m lバイアル(実際の容量は3.7ml)をより早く振盪する。この実験は10mlの透明バイ アル(ウィートン インダストリーズ、ミルビレ、ニュージャージー州)および２m l(実際の容量は3.7ml)の琥珀色のバイアル(ウィートン インダストリーズ、ミル ビレ、ニュージャージー州)を使用して行った。再度、コード−パルマーピスト ン グリップ タコメーター（コード−パルマー、ニレ、イリノイ州）を使用して 、振盪速度を測定した。表７に結果を掲載する。 表７は電気振盪機の振盪速度の、振盪に使用するバイアルのサイズに対する依 存性を示している。 一般的に本発明は滅菌容器で行われ、ここで水性相はすでにビンの中に存在し ている。しかし選択した応用のために、滅菌媒質を容器中に乾燥または凍結乾燥 状態で保存することができる。この場合、水溶液（例えば、滅菌リン酸緩衝塩溶 液）を振盪直前に滅菌容器に加える。そのように行うと、上記のようにガス−充 填リポソームを生成するように、水溶液中の再水和した滅菌媒質が再度、振盪中 にガス頭隙と相互作用するだろう。乾燥または凍結乾燥懸濁媒質の再水和は、必 ず生成物をさらに複雑にし、そして一般的には望ましくないが、特定の調製物で は生成物の使用期限をさらに延長するために有用であり得る。例えば、シクロホ スホアミド、ペプチドおよび遺伝物質（ＤＮＡのような）のような特定の治療薬 は、長期間の水性保存で加水分解するかもしれない。水性相および頭隙を形成す るために、すでに凍結乾燥した振盪前の試料の再水和は、そうしなければ十分な 使用期限をもたないかもしれない化合物を含有するガス−充填リポソームの生成 を、現実的に可能にできる。 これまでにガス−充填リポソームのサイズを決定する種々のパラメーターを説 明した。リポソームのサイズは生成物の効力を最大にし、かつ毒性を最小にする 意味で重要である。さらにリポソームは効力を最大にし、かつ肺へ入るような悪 い組織的相互作用を最小にする両方が可能なように、できるかぎり柔軟であるべ きである。本発明は大変薄く取り扱い易い膜を持つ所望サイズのリポソームを作 成する。リポソーム膜が大変薄く、そして取り扱い易いので（例えば、わずか１ mgml^-1脂質を膜を安定化するために要する）、より大きな直径のガス−充填リポ ソームが肺高血圧症を生じることなく使用できることが判明した。例えば肺高血 圧症の兆候無しに、ブタに最高５回、必要な診断造影剤の投与量を投与 した。対照として、より小さい直径のアルブミン被覆気泡をこのような動物によ り低い投与量で投与した時、重篤な肺高血圧症を引き起こす。本発明のリポソー ムは大変柔軟かつ変形可能であるので、肺の毛細管を通って容易にするりと入る 。さらに本脂質に採用する被覆技術（例えば、ポリエチレングリコール保持脂質 ）は、肺との悪い相互作用を下げると同時に、生成物のインビトロおよびインビ ボ安定性および効力を増大させる。 一般的な超音波コントラスト媒質として使用するために、ガス−充填リポソー ムのサイズは、ガス−充填リポソームがレイリー散乱型(Rayleigh scattering r egime)となるような周波数の時、後方散乱または超音波効果が６乗まで半径に比 例するので、できるかぎり大きい（閉塞効果を生じない）べきである。またＭＲ Ｉにも、本発明のより大きなリポソームが好ましい。毒性効果の可能性がより少 ない、より大きなリポソームサイズを調製および使用するための本発明の能力は 、他の生成物と比較してその効力が増大する。 超音波コントラストに影響を及ぼす更なるパラメーターは、リポソーム膜の弾 性である。弾性が大きくなると、コントラスト効果が大きくなる。本リポソーム は脂質の超−薄膜により被覆されているので、弾性は裸のガスと同様であり、そ して反射およびコントラスト効果が最大になる。 本発明の撹拌手順は、滅菌容器内の水性相およびガス頭隙からリポソームを容 易に生成する。本発明は超音波または磁気共鳴造影法用に高度に望ましいリポソ ームを生成するために十分である。しかし選択した応用のために、フィルターを 使用してより一層均一なサイズ分布および望 ましい直径を有するリポソームを生成できる。例えばガス−充填リポソームの調 和現象を利用して、超音波に対してインビボ圧力を測定するためには、サイズが 狭い範囲内にある大変厳しく規定したリポソーム直径を有することが有用になる かもしれない。これはリポソーム（水性相およびガス頭隙を有する容器を振盪す ることにより生成される）を定めたサイズのフィルターを通して注入することに より容易に達成される。生成したリポソームは、フィルター膜中のフィルターの 孔サイズの近似値よりは小さい。上記のように、多数の超音波またはＭＲＩ応用 のために、できる限り大きなガス−充填リポソームを有することが望ましい。し かし特定の応用には、より小さなガス−充填リポソームが望ましいかもしれない 。例えば腫瘍または他の疾患組織の標的化において、ガス−充填リポソームは管 空間中に留まり、そして組織間隙に入ることが必要であるかもしれない。さらに 小さいガス−充填リポソームは、このような応用に有用であり得る。これらのよ り小さなガス−充填リポソーム（例えば、好ましくは直径が１ミクロン未満）は 大部分、水性相中の化合物（組成および濃度）ならびに頭隙（ガス組成および頭 隙の容量）を変化させることにより生成できるが、フィルターを通す注入によっ ても生成できる。実質的に均一サイズの大変小さいガス−充填リポソームは、例 えば0.22ミクロンフィルターを通して注入することにより生成される。生成する ナノメーターサイズのガス−充填リポソームは、次に標的化に望ましい特性を有 するすとができる。 上記の脂質懸濁液の例は、懸濁液の大きさにそれほどの変化無くオートクレー ブを介して滅菌することもできる。コントラスト媒質の滅菌は、オートクレーブ および／または撹拌工程の前または後のいずれかに行わ れる滅菌濾過により、あるいは当業者に周知な他の手段により行うことができる 。 容器を水性相および予め選択したガスの頭隙で充填した後、密閉ビンを無期限 に保存できる。沈殿する粒子、破裂するガス−充填リポソームはなく、あるいは ガス−充填リポソーム、粒子、コロイドまたは乳液間の望ましくない相互作用は 無い。水性相およびガス頭隙を満たした容器の使用期限は、水性相中の化合物の 安定性にのみ依存する。これらの長期使用期限および滅菌可能性の特性は、従来 技術に優る実質的利点を本発明に付与する。超音波コントラスト媒質の技術分野 に大変よくある粒子の凝集および沈殿を伴うような安定性の問題に、本明細書で は取り組んだ。 本発明の多−相容器の撹拌により生成するガス−充填リポソームは、超音波ま たは磁気共鳴造影のような診断造影用にコントラスト剤として優れた利用性を有 することが判明した。このリポソームは一般的に患者の造影に有用であり、かつ ／または患者内の疾患組織の存在を診断するために特に有用である。造影法は本 発明のガス−充填リポソームを患者に投与し、そして次に超音波または磁気共鳴 造影を使用して患者をスキャンニングして、患者の内部領域および／または領域 中の任意の疾患組織の可視画像を得ることにより行える。患者の領域とは、患者 の全身または患者の特定領域または一部分を意味する。リポソームコントラスト 剤は、脈管、心臓、肝臓および脾臓の画像を提供するために、ならびに胃腸管領 域または他の体腔の造影に、あるいは当業者には容易に明らかな組織の特性決定 、血液プール造影等のような他の方法に使用できる。任意の様々な型の超音波ま たは磁気共鳴造影デバイスが本発明の実施に使 用でき、デバイスの特定の型またはモデルが、本発明の方法に不可欠であること はない。 本発明のガス−充填リポソームは、当業者が認識するように種々の疾患、疾病 または病気を処置するために、患者に様々な治療物質を送達するためにも使用で きる。 また、磁気的に活性なリポソームをＭＲＩによる圧力を予想するために使用で きる。リポソームは内部帯磁性が増大し、したがってＴ₂緩和が増加するが、Ｔ₂ ★緩和はさらに一層増加する。静電場勾配がスピンエコー実験で主に補正される 効果により(パルスをリフォーカスする180°無線周波数による)、静電場効果が 補正されない所ではリポソームの効果はＴ₂★加重パルス配列よりもＴ₂でより少 なく記録される。圧力が増すと、リポソームまたはリポソーム粉砕（より可溶性 ガスに関して）の損失を生じ、ならびにリポソーム直径の減少を生じる。したが って1/T₂は圧力上昇に伴い減少する。圧力の解除後、残りの幾つかのリポソーム は再度−広がり、そして1/T₂は再度、わずかに増加する。約80％のＰＦＰと20％ の空気から成るリポソームは、圧力の解除後にベースラインに戻る圧力で、増大 した安定性および1/T₂のわずかな下降を表す（すなわちリポソームは安定である が、わずかな1/T₂圧力効果を示す）。勾配エコー画像が得られ、そしてシグナル 強度が測定される時、これらの効果はより一層注目される。シグナル強度は圧力 上昇で増加する（1/T₂★は圧力減少で増加する）。実験を比較的迅速に行ったの で（Ｔ₂を測定するためよりも勾配エコー造影を行うために1/10の時間未満を要 する）。圧力に対する暴露期間はさらに少なく、窒素−充填リポソームは圧力解 除後にほぼベースラインに戻る（すなわち、リポソームの損失は大変少 ない）。したがって、勾配エコーに関するシグナル強度は、周囲圧力に戻った時 点でほぼベースラインに戻る。ＭＲＩによる圧力測定のために、リポソームを圧 力上昇でばらばらになるように、あるいは安定であるが、リポソーム直径が圧力 上昇で減少するように、いずれかに設計できる。ＭＲＩについては、リポソーム 半径は1/T₂★に影響するので、この関係はＭＲＩによる圧力を予想するために使 用できる。 当業者が認識するように、ガス−充填リポソームの患者への投与は、例えば注 射で静脈内または動脈内に、経口的に、または直腸に、様々な様式で行うことが できる。有用な投与量および投与の特定の様式は、年齢、体重ならびに特定の哺 乳類およびそのスキャンニングまたは処置する領域、ならびに使用する特定のコ ントラスト媒質または治療薬に大変依存するだろう。典型的には投与量は低いレ ベルから始めて、そして所望のコントラスト増強または治療効果が達成されるま で増加する。患者は任意の種類の哺乳類でよいが、最も好ましくはヒトである。 以下の実際の実施例は、どのように本発明が使用されたか、ならびに本発明が 特別に有用性を持つ幾つかの分野を説明するものである。これらの実施例は単に 例示であり、そして添付の請求の範囲を限定すると考えるべきではない。実施例 実施例１ 窒素ガス−充填リポソームの形成 ガス−充填脂質二重層を、通常の(生理)塩溶液:プロピレングリコール：グリ セロール(8:1:1、容量：容量：容量)を含有する６mlの希釈剤を有する２つの20m lバイアル中で調製した。これに終濃度５mgml^-1で、 82:10:8(モル％)のモル比のジパルミトイルホスファチジルコリン（DPPC）：ジ パルミトイルホスファチジン酸（DPPA）：ジパルミトイルホスファチジルエタノ ールアミン−PEG5000混合物を加えた。次に試料を気密に密閉し、そして圧力を 隔壁キャップにより維持した。これらを次にパージし、そして少なくとも３回、 窒素ガス（99.98％、アリゾナウェルデイング社：Arizona Welding Co.、タクソ ン、アリゾナ州）を排気した。次に試料を121℃で15分間、バーンステット モデ ルC57835蒸気滅菌器中（バーンステッド／サーモリン社：Barnstead/Thermolyne Corporation、ダブーク、アイオワ州）でオートクレーブ処理するか、またはNu clepore 0.22μmフィルター(コスター：costar、プリーサントン、カリフォルニ ア州)を１−３回通すことにより滅菌濾過のいずれかを行った。試料を次にオー トクレーブから取り出し、そしてほぼ周辺温度に冷却した。試料を次にWig-L-Bu gボルテックサー(クレセント デンタルMfg社、リオン、イリノイ州）で２分間、 ボルテックス処理した。生成した混合物は、泡に似ているガス−充填二重層を形 成するために十分であった。このガス−充填二重層を次に３つの方法、パーティ クルサイジングシステムズ モデル770 ライト オブスキュレーション 検出器（ パーティクルサイジングシステムズ、サンタバーバラ、カリフォルニア州）、カ リブレーション接眼鏡が付いたReichert-Jung モデル 150 光学顕微鏡(ケンブリ ッジインスツルメンツ:Cambridge Instruments、バッファロー、NY)、およびコ ールターモデル(コールターインダストリーズ：Coulter Industries、ルートン ベッズ、英国)により整粒した。試料は、少なくとも95％の粒子が10ミクロンよ り小さい、約5-7ミクロンの平均数重量サイズを示した。実施例２ ペルフルオロペンタンガス−充填リポソームの形成 ガス−充填脂質二重層を、通常の(生理)塩溶液:プロピレングリコール：グリ セロール(8:1:1、容量：容量：容量)を含有する６mlの希釈剤を有する２つの20m lバイアル中で調製した。これに終濃度が１mgml-1から５mgml^-1の間で変動する 、重量比で82:10:8(重量:重量:重量)のジパルミトイルホスファチジルコリン（D PPC）：ホスファチジン酸：ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン−P EG5000混合物を加えた。この混合物に50μL(30.1μmoles)のペルフルオロペンタ ン(PCR、ゲインズビレ、フィラデルフィア州)を加えた。試料を-20℃とし、そし て気密に密閉し、そして圧力を隔壁キャップにより維持した。試料を次に121℃ で15分間、バーンステット モデルC57835蒸気滅菌器中（バーンステッド／サー モリン社、ダブーク、アイオワ州）でオートクレーブ処理した。試料を次にオー トクレーブから取り出し、そして約40℃に冷却した。試料を次にWig-L-Bug（商 標）ボルテックサー(クレセント デンタルMfg社、リオン、イリノイ州)で２分間 、ボルテックス処理した。生成した混合物は、泡に似ているガス−充填二重層を 形成するために十分であった。この泡の容量および高さを記録し、そして１つの 試料を−20℃の冷凍庫（ケンモアブランド:Kenmore Brand、シェアーズ-ローブ ック:Sears-Roebuck、シカゴ、イリノイ州）に置いた。次に試料は３時間後に取 り出し、その時点でおよそ90％の元の容量が保持されたことを記録した。この試 料を冷凍庫に一晩(約17時間)置き、そして取り出した時に元の容量の50％が維持 されていることが見いだされた。対照として使用した残りのバイアルは、30℃で 同じ時間インキューベーター中に維持された。容量 の損失は起こらないことが分かり、ガス−充填二重層内のガスの冷却で凝縮し、 これによりガス容量が減少したことを示している。最後に、冷たい試料を30℃の インキューベーターに置き、ここで約45分後に元の泡容量の20％が元に戻ったこ とが分かった。これは凝縮したガスがもう一度揮発し、そしてガス−充填リポソ ームのサイズに膨らんだことを示している。実施例３ ペルフルオロプロパンガス−充填リポソームの形成 実施例１に記載と同じ方法を繰り返したが、使用したガスはペルフルオロプロ パン（99.99％、アルコンサージカル：Alcon Surgical、フォート ワース、テキ サス州）であり、そして使用したバイアルサイズは２mlの琥珀色のバイアル(実 際の容量＝3.7ml)(ウィートン、ミルビレ、ニュージャージー州)である点は異な った。バイアルに1.5mlの脂質／希釈賦形剤混合物を満たした。工程は実施例１ と同じ方法を介して整粒したが、今回は95％より多くの粒子が10ミクロン未満の ４−６ミクロンのサイズを生成した。実施例４ ペルフルオロブタンガス−充填リポソームの形成 実施例１に記載と同じ方法を繰り返したが、使用したガスはペルフルオロブタ ン（97＋％、フルラ社：Flura Corporation、ナッシュビレ、テネシー州）であ り、そして使用したバイアルサイズは２mlの琥珀色のバイアル(実際の容量＝3.7 ml)(ウィートン、ミルビレ、ニュージャージー州)である点は異なった。バイア ルに1.5mlの脂質／希釈賦形剤混合物を満たした。工程は実施例１と同じ方法を 介して整粒したが、今回は95 ％より多くの粒子が10ミクロン未満の４−６ミクロンのサイズを生成した。実施例５ ペルフルオロシクロブタンガス−充填リポソームの形成 実施例１に記載と同じ方法を繰り返したが、使用したガスはペルフルオロシク ロブタン（99.8％、ファルツ アンド バウワ一社：Pfaltz & Bauer、ウォーター ヴェリー、コネクチカット州）であり、そして使用したバイアルサイズは２mlの 琥珀色のバイアル(実際の容量＝3.7ml)(ウィートン、ミルビレ、ニュージャージ ー州)である点は異なった。バイアルに1.5mlの脂質／希釈賦形剤混合物を満たし た。工程は実施例１と同じ方法を介して整粒したが、今回は95％より多くの粒子 が10ミクロン未満の４−６ミクロンのサイズを生成した。実施例６ サルファヘキサフルオリドガス−充填リポソームの形成 実施例１に記載と同じ方法を使用したが、使用したガスはサルファヘキサフル オリド（99.99％、アルコン サージカル、フォート ワース、テキサス州）であ り、そして使用したバイアルサイズは２mlの琥珀色のバイアル(実際の容量＝3.7 ml)(ウィートン、ミルビレ、ニュージャージー州）である点は異なった。バイア ルに1.5mlの脂質／希釈賦形剤混合物を満たした。工程は実施例１と同じ方法を 介して整粒したが、今回は95％より多くの粒子が10ミクロン未満の４−６ミクロ ンのサイズを生成した。実施例７ インビトロ音響減衰試験を使用した圧力下のペルフルオロブタンガス −充填リポソームの安定性 ペルフルオロブタンガス−充填脂質二重層は、実施例４に記載のように調製し た。脂質濃度が１mgml^-1から５mgml^-1の間で変動する試料を、200μLのアリコー トに取り、そして通常の生理塩溶液を希釈剤として10,000:1に希釈した。試料を 始めにマグネチックスターラーを用いて混合して均一とし、そして次に止めた。 変換器の原点から約25cmに位置するステンレス綱板を完全反射板として使用した 。使用した変換器は5.0MHzの広帯域の非-焦点浸漬型変換器であった(パナメトリ ックス:Panametrics、ウァルトハム、マサチューセッツ州)。すべてのデータを4 88.2GPIB板(ナショナル インスツルメンツ、オースチン、テキサス州)を介して 転送し、そしてGateway200080486プロセッサーで処理した。 ガス−充填脂質二重層のサンプリングに先立ち、ベースライン調整を通常な塩 溶液のみで行った。調整条件が確立した直後に、200μLのアリコートを塩溶液に 加え、そしてデータを周囲温度（20℃）で90秒間蓄積した。音響の減衰（図４を 参照）は、2.0±0.5dBcm^-1の減衰で90秒間一定であった。第二試料を得、これに より試料の圧力が120mmHgに上昇し、そして減衰を記録した。周囲温度の実験の ように、減衰は90秒間の試験時間にわたって少しの変動も無く一定であったが、 減衰は約0.9dBcm^-1間であった。別の試料を37℃の一定温度で測定した。再度90 秒間にわたって、減衰は一定であり、そしてその減衰はおよそ0.9dbcm^-1であっ た。最後の試料を37℃および120mmHg圧で測定した。今回は減衰が90秒間にわた って時間経過に従い直線的に0.9dBcm^-1から0.4dBcm^-1へと減少した。これは窒素 −充填脂質二重層よりも、この組成物の安定性が増したことを実証している。実施例８ インビトロ音響減衰試験を使用する、圧力下での窒素ガス−充填リポソームの 安定性 実施例７と同一の実験を行ったが、ガス−充填脂質二重層は実施例１に記載の 窒素ガスである点が異なった。減衰は周囲温度(20℃)およびヒト体温(37℃)の両 方で安定な減衰であり意味があったが、内容物の希釈物を120mmHg圧に暴露する と減衰は急にベースライン調整値に下がった。これは窒素−充填脂質二重層が、 圧力下ではペルフルオロブタン−充填脂質二重層に比べて安定性を欠くことを示 していた。実施例９ ペルフルオロシクロブタンガス−充填リポソームの数重量平均サイズに対する 脂質濃度の効果 ペルフルオロシクロブタンガス−充填脂質二重層は、３種の脂質組成物濃度を 除き、実施例５に記載のように調製した。この組成物は通常の（生理的）塩溶液 ：プロピレングリコール：グリセロール（8:1:1、容量：容量：容量）から成っ た。これに、終濃度が１mgml^-1から5mgml^-1の間で変動する82:10:8(モル％)のモ ル比のジパルミトイルホスファチジルコリン(DPPC):ジパルミトイルホスファチ ジン酸(DPPA):ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン-PEG5000(DPPE-P EG5000)の混合物を加えた。試料は２mlバイアル(実際の容量＝3.7ml)(ウィート ンイノダストリーズ、ミルビレ、ニュージャージー州)中で調製し、そしてパー ティクル サイジング システムズ モデル770ライトオブスキュレーションサイジ ングシステムで整粒した。以下の表で結果を記載する。 表９は脂質濃度の、例としてペルフルオロシクロブタンを使用したペ ルフルオロカーボンガス−充填脂質二重層の平均サイズに対する効果を実証して いる。 実施例１０ 実質的に不溶性ガス−充填リポソームを使用して、血流力学的変化が無いこと の証明 実施例３、４、５および６に記載のような脂質混合物を含むガス−充填脂質二 重層の試料を、ペルフルオロプロパン(PFP)、ペルフルオロシクロブタン(PFCB) 、ペルフルオロブタン(PFB)およびサルファヘキサフルオリド(SHF)を使用して、 １mgml^-1および3mgml^-1の全脂質濃度を用いて調製した。造影は体重約28kgの雑 種のイヌについて、５メガヘルツの変換器を装備したモデル5200S 音響造影超音 波機を使用して行った。動物をペントバルビタールナトリウムを用いて静かにさ せ、部屋の換気を行い、そして肺動脈圧、全身の動脈圧および脈拍を監視した。 心臓の造影は短軸位で行い、そして動物は１kgあたり５マイクロリットル巨丸薬 PFP、PFCB、PFBを受容し、1mgml^-1および3mgml^-1脂質濃度の両方を試験した。各 注射の間を少なくとも15分間あけ、残存する任意のコントラス トを除去した。すべてのペルフルオロカーボン充填リポソーム（PFP、PFCBおよ びPFB）は、１mgml^-1脂質で心筋潅流増強を示したが、PFBは他よりもより強力で あった。PFPは3mgml^-1で向上した。SHF充填リポソームは１mlの脂質あたり１mg の濃度では、実証できるほどの心筋潅流増強を示さなかったが、１mlの脂質あた り３mgの濃度で顕著な心筋増強を示した。 上記の実験を実際に別のイヌで繰り返し、そして同じ結果を得た。 ペルフルオロプロパン充填リポソームを使用して、血流力学的実験を別のイヌ で行った。動物はキログラムあたり最高300マイクロリットルの巨丸薬を急速に 多回受容し、すなわちイヌの造影よりも50回高い。多回投与が薬剤の血流力学的 に高い安定性を示すことにもかかわらず、動物は任意の血流力学的パラメーター に変化が全くないことを示した。実施例１１ Balb/c マウスを対象とした毒性試験に基づく治療率(ウインドゥ)の証明 毒性試験は、体重約20から25グラムのBalb/c マウスを対象とした行った。ペ ルフルオロプロパン(PFP)、ペルフルオロシクロブタン(PFCB)、ペルフルオロブ タン(PFB)およびサルファヘキサフルオリド(SHF)の試料をトラップするリポソー ムの１mgml^-1脂質濃度のLD₅₀は、急速な巨丸薬の投与を介して試験した。各PFCB 、PFBおよびPFP試料のLD₅₀は、それぞれ12mlkg^-1よりも大きく、SHFガス−充填 脂質二重層に関しては30mgkg^-1よりも大きく、これらの超音波診断に有用な生成 物についてそれぞれ2,400-１および6,000−１より大きい治療指数を示している 。実施例１２ 超音波コントラスト剤としてのペルフルオロペンタンガス−充填リポソームの 使用 ニュージーランド ホワイトウサギを、1cckg^-1のラビットミックス(8:5:2、 容量:容量:容量、キシラジン、20mgml^-1:ケタミン、10mgml^-1:アセプロマジン、 100mgml^-1)の筋肉注射で麻酔をかけた。ウサギをAcoustic Imaging モデル5200 診断用超音波およびAcoustic Imaging モデル5200S診断用 Color Doppler イン スツルメント(アコースティック イメージング、フォエニックス、アリゾナ州) で造影した。ウサギには23Gバタフライカテーテルを介して、縁の耳静脈に注射 した。ウサギは0.01cckg^-1から0.1cckg^-1の範囲のペルフルオロペンタン−充填 脂質二重層を、5-10秒の期間にわたって投与された。7.5MHzの変換器を使用した 長軸の画像は、すべての4つの心室および心筋の明るい画像を20分から１時間に わたって明らかにした。変換器を次に肝臓領域に移動し、ここで明るいコントラ ストが肝臓静脈、肝門部静脈ならびに肝臓洞に観察された。変換器を次に腎臓上 に置き、これは髄質と皮質領域中のコントラスト、ならびに腎臓動脈の脈管構造 を明らかにした。診断用超音波変換器を次にカラードップラーと交換し、そして 継続し、動物体内のすべての脈管化組織にわたって明るいコントラストが観察さ れた。実施例１３ ガス−充填リポソームの数およびサイズに対する、種々の濃度のペルフルオロ プロパンおよび空気の効果 ２mlのバイアル(実際のサイズは3.7ml)(ウィートン、インダストリー、ミリバ レ、ニュージャージー州)中の、重量比が8:1:1の通常の塩溶液:グリセロール:プ ロピレングリコール中の多数の脂質溶液試料（1m g/mL;82:10:8モル％比のDPPC:DPPA:DPPE-PEG-5000）を、４つのキュービックフ ットキャパシティーを持つ変更したEdward モデル SO4凍結乾燥機入れ、そして 減圧にした。次にバイアルの頭隙に20％の空気を含む80％ PFP、40％の空気を含 む60％ PFP、50％の空気を含む50％ PFP、80％の空気を含む20％ PFP、または10 0％の空気を封入した。種々の試料の頭隙中のガスの割合は、ヒューレットパッ カード(Hewlett Packard)Chem(商標)ソフトワードと接続したヒューレット パッ カードガスクロマトグラフ モデル 1050Lのガスクロマトグラフィーによりで確 認した。検出モードはフレイム（Flame）イオン化検出であった。次に試料をWig -L-Bug(商標)を使用して3,300RPMで60秒間振盪し、そして整粒し、そしてリポソ ーム数をすでに記載した光学的粒子整粒機で測定した。結果を上記表２に表す。 本明細書で引用または参照とした各特許および公報は、その全部を本明細書に 編入する。 本明細書で示し、そして記載したものに加えて、本発明の様々な変更態様が前 述の記載から当業者には明らかであろう。そのような変更態様も添付の請求の範 囲内にあるものと考える。

【手続補正書】特許法第１８４条の８ 【提出日】１９９６年１１月４日 【補正内容】 請求の範囲 １．水性脂質懸濁相および該脂質懸濁相から実質的に分離しているガス相を含ん で成り、該ガス相がフッ素化ガスを含んで成る組成物を含む容器。 ３．上記フッ素化ガスがペルフルオロカーボンガスである、請求の範囲第１項に 記載の容器。 ４．上記ペルフルオロカーボンガスが、ペルフルオロプロパン、ペルフルオブタ ン、ペルフルオシクロブタン、ペルフルオロエタン、ペルフルオロペンタンおよ びペルフルオロメタンから成る群から選択される、請求の範囲第３項に記載の容 器。 ５．上記ペルフルオロカーボンガスが、ペルフルオロプロパン、ペルフルオブタ ンおよびペルフルオペンタンロから成る群から選択される、請求の範囲第４項に 記載の容器。 ６．上記フッ素化ガスがサルファヘキサフルオリドである、請求の範囲第２項に 記載の容器。 ７．上記ガスが常磁性ガスである、請求の範囲第１項に記載の容器。 ８．上記常磁性ガスが、酸素、ネオン、キセノンおよび酸素17から成る群から選 択される、請求の範囲第１項に記載の容器。 ９．上記ガス相が、空気、窒素、酸素、ネオン、ヘリウム、クリプトン、キセノ ンおよび酸素17から成る群から選択されるガスを含んで成る、請求の範囲第１項 に記載の容器。 １０．上記ガス相が、ペルフルオロプロパン、ペルフルオブタン、ペルフルオシ クロブタン、ペルフルオロメタン、ペルフルオロエタン、ペルフルオロペンタン 、サルファヘキサフルオリド、空気、窒素、酸素、ネ オン、ヘリウム、クリプトン、キセノンおよび酸素17から成る群から選択される ガスを含んで成る、請求の範囲第１項に記載の容器。 １１．上記ガス相が実質的に不溶性ガスを含んで成る、請求の範囲第１項に記載 の容器。 １２．上記ガス相が、可溶性ガスと組み合わせた実質的に不溶性ガスを含んで成 る、請求の範囲第１項に記載の容器。 １３．上記のフッ素化ガスがサルファヘキサフルオリドおよびペルフルオロカー ボンガスから成る群から選択される、請求の範囲第１項に記載の容器。 １４．上記の可溶性ガスが空気、酸素、二酸化炭素および窒素から成る群から選 択される、請求の範囲第１３項に記載の容器。 １５．上記水性脂質懸濁相が、リン脂質から成る群から選択される脂質を含んで 成る、請求の範囲第１項に記載の容器。 １６．上記リン脂質が、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジパルミトイル ホスファチジン酸およびジパルミトイルホスファチジルエタノールアミンから成 る群から選択される、請求の範囲第１５項に記載の容器。 １７．上記水性脂質懸濁液がさらに、標的化リガンドを含んで成る、請求の範囲 第１項に記載の容器。 １８．上記標的化リガンドがポリエチレングリコールである、請求の範囲第１７ 項に記載の容器。 １９．上記リン脂質が、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジパルミトイル ホスファチジン酸およびジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン−PEG5 000から成る群から選択される、請求の範囲第１５項 に記載の容器。 ２０．上記リン脂質が、約82％:10％:8％のモルパーセント比のジパルミトイル ホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジン酸およびジパルミトイル ホスファチジルエタノールアミン−PEG5000から成る群から選択される、請求の 範囲第１９項に記載の容器。 ２１．上記水性脂質懸濁相がさらに懸濁剤を含んで成る、請求の範囲第１項に記 載の容器。 ２２．上記水性脂質懸濁相がさらに粘性改質剤を含んで成る、請求の範囲第１項 に記載の容器。 ２３．上記粘性改質剤がグリセロール、プロピレングリコールおよびポリビニル アルコールから成る群から選択される、請求の範囲第２２項に記載の容器。 ２４．上記水性脂質懸濁相がさらに治療薬または診断薬を含んで成る、請求の範 囲第１項に記載の容器。 ２５．上記診断薬がＭＲＩコントラスト増強剤である、請求の範囲第２４項に記 載の容器。 ２６．上記ＭＲＩコントラスト増強剤が常磁性イオンである、請求の範囲第２５ 項に記載の容器。 ２７．上記水性脂質懸濁相がさらにポリマーを含んで成る、請求の範囲第１項に 記載の容器。 ２８．上記容器が滅菌されている、請求の範囲第１項に記載の容器。 ２９．実質的に不溶性ガスを可溶性ガスと組み合わせて含んで成る、ガス−充填 リポソーム。 ３０．上記の実質的に不溶性ガスがサルファヘキサフルオリドおよびペ ルフルォロカーボンガスから成る群から選択される、請求の範囲第２９項に記載 のガス−充填リポソーム。 ３１．上記可溶性ガスが、空気、酸素、窒素および二酸化炭素から成る群から選 択される、請求の範囲第２９項に記載のガス−充填リポソーム。 ３２．上記の実質的に不溶性ガスがペルフルオロカーボンガスであり、そして上 記可溶性ガスが、空気、酸素、窒素および二酸化炭素から成る群から選択される 、請求の範囲第２９項に記載のガス−充填リポソーム。 ３５．上記脂質が単層脂質を含んで成る、請求の範囲第１項に記載の容器。 ３６．上記脂質がリン脂質である、請求の範囲第３５項に記載の容器。 ３７．上記脂質がリン脂質であり、そして上記フッ素化ガスがサルファヘキサフ ルオリドである、請求の範囲第３５項に記載の容器。 ３８．上記脂質がリン脂質であり、そして上記フッ素化ガスがペルフルオロプロ パンである、請求の範囲第３５項に記載の容器。 ３９．上記脂質がリン脂質であり、そして上記フッ素化ガスがペルフルオロペン タンである、請求の範囲第３５項に記載の容器。 ４０．上記ポリマーがポリエチレングリコールである、請求の範囲第２８項に記 載の容器。 ４１．上記組成物がさらにポリエチレングリコールを含んで成る、請求の範囲第 ３６項に記載の容器。 ４２．上記脂質が二重層脂質を含んで成る、請求の範囲第１項に記載の容器。 ４３．上記脂質がリン脂質である、請求の範囲第４２項に記載の容器。 ４４．上記脂質がリン脂質であり、そして上記フッ素化ガスがサルファ ヘキサフルオリドである、請求の範囲第４２項に記載の容器。 ４５．上記脂質がリン脂質であり、そして上記フッ素化ガスがペルフルオロプロ パンである、請求の範囲第４２項に記載の容器。 ４６．上記脂質がリン脂質であり、そして上記フッ素化ガスがペルフルオロペン タンである、請求の範囲第４２項に記載の容器。 ４７．上記組成物がさらにポリエチレングリコールを含んで成る、請求の範囲第 ４３項に記載の容器。 ４８．上記脂質が多重層脂質を含んで成る、請求の範囲第１項に記載の容器。 ４９．上記脂質がリン脂質である、請求の範囲第４８項に記載の容器。 ５０．上記脂質がリン脂質であり、そして上記フッ素化ガスがサルファヘキサフ ルオリドである、請求の範囲第４８項に記載の容器。 ５１．上記脂質がリン脂質であり、そして上記フッ素化ガスがペルフルオロプロ パンである、請求の範囲第４８項に記載の容器。 ５２．上記脂質がリン脂質であり、そして上記フッ素化ガスがペルフルオロペン タンである、請求の範囲第４８項に記載の容器。 ５３．上記組成物がさらにポリエチレングリコールを含んで成る、請求の範囲第 ４９項に記載の容器。 ５４．１つ以上の脂質から形成されている、請求の範囲第３０項に記載のガス− 充填リポソーム。 ５５．上記リポソームが１つの脂質単層を含んで成る、請求の範囲第５４項に記 載のガス−充填リポソーム。 ５６．上記脂質がリン脂質である、請求の範囲第５５項に記載のガス−充填リポ ソーム。 ５７．上記脂質がリン脂質であり、そして上記の実質的に不溶性ガスがペルフル オロプロパンである、請求の範囲第５５項に記載のガス−充填リポソーム。 ５８．上記脂質がリン脂質であり、そして上記の実質的に不溶性ガスがペルフル オロペンタンである、請求の範囲第５５項に記載のガス−充填リポソーム。 ５９．上記脂質がリン脂質であり、そして上記の実質的に不溶性ガスがサルファ ヘキサフルオリドである、請求の範囲第５５項に記載のガス−充填リポソーム。 ６０．さらにポリエチレングリコールを含んで成る、請求の範囲第５６項に記載 のガス−充填リポソーム。 ６１．上記リポソームが１つの脂質二重層を含んで成る、請求の範囲第５４項に 記載のガス−充填リポソーム。 ６２．上記脂質がリン脂質である、請求の範囲第６１項に記載のガス−充填リポ ソーム。 ６３．上記脂質がリン脂質であり、そして上記の実質的に不溶性ガスがペルフル オロプロパンである、請求の範囲第６１項に記載のガス−充填リポソーム。 ６４．上記脂質がリン脂質であり、そして上記の実質的に不溶性ガスがペルフル オロペンタンである、請求の範囲第６１項に記載のガス−充填リポソーム。 ６５．上記脂質がリン脂質であり、そして上記の実質的に不溶性ガスがサルファ ヘキサフルオリドである、請求の範囲第６１項に記載のガス−充填リポソーム。 ６６．さらにポリエチレングリコールを含んで成る、請求の範囲第６２項に記載 のガス−充填リポソーム。 ６７．上記リポソームが１つの脂質多重層を含んで成る、請求の範囲第５４項に 記載のガス−充填リポソーム。 ６８．上記脂質がリン脂質である、請求の範囲第６７項に記載のガス−充填リポ ソーム。 ６９．上記脂質がリン脂質であり、そして上記の実質的に不溶性ガスがペルフル オロプロパンである、請求の範囲第６７項に記載のガス−充填リポソーム。 ７０．上記脂質がリン脂質であり、そして上記の実質的に不溶性ガスがペルフル オロペンタンである、請求の範囲第６７項に記載のガス−充填リポソーム。 ７１．上記脂質がリン脂質であり、そして上記の実質的に不溶性ガスがサルファ ヘキサフルオリドである、請求の範囲第６７項に記載のガス−充填リポソーム。 ７２．さらにポリエチレングリコールを含んで成る、請求の範囲第８６項に記載 のガス−充填リポソーム。 ７３．脂質被覆微小球である、請求の範囲第２９項に記載のガス−充填リポソー ム。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｂ６５Ｄ 81/20 Ａ６１Ｂ 5/05 ３８３ (72)発明者 イエローヘア， デイビツド アメリカ合衆国アリゾナ州85746トウーソ ン・サウスビアプロモントリオ7350

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．水性脂質懸濁相および該脂質相から実質的に分離しているガス相を含んで成 る容器。 ２．上記ガス相がフッ素化ガスを含んで成る、請求の範囲第１項に記載の容器。 ３．上記フッ素化ガスがペルフルオロカーボンガスである、請求の範囲第２項に 記載の容器。 ４．上記ペルフルオロカーボンガスが、ペルフルオロプロパン、ペルフルオブタ ン、ペルフルオシクロブタン、ペルフルオロエタン、ペルフルオロペンタンおよ びペルフルオロメタンから成る群から選択される、請求の範囲第３項に記載の容 器。 ５．上記ペルフルオロカーボンガスが、ペルフルオロプロパンおよびペルフルオ ブタンから成る群から選択される、請求の範囲第４項に記載の容器。 ６．上記フッ素化ガスがサルファヘキサフルオリドである、請求の範囲第２項に 記載の容器。 ７．上記ガスが常磁性ガスである、請求の範囲第１項に記載の容器。 ８．上記常磁性ガスが、酸素、ネオン、キセノンおよび酸素17から成る群から選 択される、請求の範囲第１項に記載の容器。 ９．上記ガス相が、空気、窒素、酸素、ネオン、ヘリウム、クリプトン、キセノ ンおよび酸素17から成る群から選択されるガスを含んで成る、請求の範囲第１項 に記載の容器。 １０．上記ガス相が、ペルフルオロプロパン、ペルフルオブタン、ペルフルオシ クロブタン、ペルフルオロメタン、ペルフルオロエタン、ペル フルオロペンタン、サルファヘキサフルオリド、空気、窒素、酸素、ネオン、ヘ リウム、クリプトン、キセノンおよび酸素17から成る群から選択されるガスを含 んで成る、請求の範囲第１項に記載の容器。 １１．上記ガス相が実質的に不溶性ガスを含んで成る、請求の範囲第１項に記載 の容器。 １２．上記ガス相が、可溶性ガスと組み合わせた実質的に不溶性ガスを含んで成 る、請求の範囲第１項に記載の容器。 １３．実質的に不溶性ガスがペルフルオロカーボンガスである、請求の範囲第１ 項に記載の容器。 １４．上記の可溶性ガスが空気、酸素、二酸化炭素および窒素から成る群から選 択される、請求の範囲第１３項に記載の容器。 １５．上記水性脂質懸濁相が、リン脂質から成る群から選択される脂質を含んで 成る、請求の範囲第１項に記載の容器。 １６．上記リン脂質が、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジパルミトイル ホスファチジン酸およびジパルミトイルホスファチジルエタノールアミンから成 る群から選択される、請求の範囲第１５項に記載の容器。 １７．上記水性脂質懸濁液がさらに、標的化リガンドを含んで成る、請求の範囲 第１項に記載の容器。 １８．上記標的化リガンドがポリエチレングリコールである、請求の範囲第１７ 項に記載の容器。 １９．上記リン脂質が、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジパルミトイル ホスファチジン酸およびジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン−PEG5 000から成る群から選択される、請求の範囲第１５項 に記載の容器。 ２０．上記リン脂質が、約82％:10％:8％のモルパーセント比のジパルミトイル ホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジン酸およびジパルミトイル ホスファチジルエタノールアミン−PEG5000から成る群から選択される、請求の 範囲第１９項に記載の容器。 ２１．上記水性脂質懸濁相がさらに懸濁剤を含んで成る、請求の範囲第１項に記 載の容器。 ２２．上記水性脂質懸濁相がさらに粘性改質剤を含んで成る、請求の範囲第１項 に記載の容器。 ２３．上記粘性改質剤がグリセロール、プロピレングリコールおよびポリビニル アルコールから成る群から選択される、請求の範囲第２２項に記載の容器。 ２４．上記水性脂質懸濁相がさらに治療薬または診断薬を含んで成る、請求の範 囲第１項に記載の容器。 ２５．上記診断薬がＭＲＩコントラスト増強剤である、請求の範囲第２４項に記 載の容器。 ２６．上記ＭＲＩコントラスト増強剤が常磁性イオンである、請求の範囲第２５ 項に記載の容器。 ２７．上記水性脂質懸濁相がさらにポリマーを含んで成る、請求の範囲第１項に 記載の容器。 ２８．上記容器が滅菌されている、請求の範囲第１項に記載の容器。 ２９．実質的に不溶性ガスを可溶性ガスと組み合わせて含んで成る、ガス−充填 リポソーム。 ３０．上記の実質的に不溶性ガスがペルフルオロカーボンガスである、 請求の範囲第２９項に記載のガス−充填リポソーム。 ３１．上記可溶性ガスが、空気、酸素、窒素および二酸化炭素から成る群から選 択される、請求の範囲第２９項に記載のガス−充填リポソーム。 ３２．上記の実質的に不溶性ガスがペルフルオロカーボンガスであり、そして上 記可溶性ガスが、空気、酸素、窒素および二酸化炭素から成る群から選択される 、請求の範囲第２９項に記載のガス−充填リポソーム。 ３３．上記リポソームが脂質単層を含んで成る、請求の範囲第２９項に記載のガ ス−充填リポソーム。 ３４．上記リポソームが脂質二重層を含んで成る、請求の範囲第２９項に記載の ガス−充填リポソーム。