JPH1036264A - コリダリン誘導体含有ｈｓｐ４７合成抑制剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 コラーゲン合成を抑制することによって、細
胞外マトリックス産生の亢進の病態を示す病気を治療す
ることができる、分子量４７キロダルトンの熱ショック
タンパク質の合成抑制剤を提供する。 【解決手段】 下記一般式（Ｉ）で表されるコリダリン
誘導体を有効成分として含有する。 【化１】 （式中、Ｒ¹ 、Ｒ² 、Ｒ³ 、Ｒ⁴ 、及びＲ⁵ は、炭素数
１〜３のアルキル基）

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、コリダリン誘導体
を有効成分として含有する、分子量が４７キロダルトン
（ｋＤ）の熱ショックタンパク質（以下、ＨＳＰ４７と
称する）の合成抑制剤に関する。本発明のＨＳＰ４７合
成抑制剤は、特に、臓器内のコラーゲンの合成を抑制す
ることにより肝硬変、間質性肺疾患、慢性腎不全（又は
慢性腎不全に陥いる疾患）、心肥大、術後の瘢痕や熱傷
性瘢痕、交通事故等の後に生じるケロイドや肥厚性瘢
痕、強皮症、動脈硬化、又は関節リウマチなどの細胞外
マトリックス（細胞外基質）産生亢進の病態を示す病気
の患者の生理学的状態を有効に改善させ、肝硬変、間質
性肺疾患、慢性腎不全（又は慢性腎不全に陥いる疾
患）、心肥大、術後の瘢痕や熱傷性瘢痕、交通事故等の
後に生じるケロイドや肥厚性瘢痕、強皮症、動脈硬化、
又は関節リウマチなどの細胞外マトリックス産生亢進の
病態を示す病気を効果的に治療することができる。

【０００２】

【従来の技術】近年、コラーゲンなどの細胞外マトリッ
クスの産生の亢進の病態を示す病気が大きな問題となっ
ている。ここでいう細胞外マトリックス産生の亢進の病
態を示す病気とは、例えば肝硬変、間質性肺疾患、慢性
腎不全（又は慢性腎不全に陥いる疾患）、心肥大、術後
の瘢痕や熱傷性瘢痕、交通事故等の後に生じるケロイド
や肥厚性瘢痕、強皮症、動脈硬化、又は関節リウマチな
どを含む。

【０００３】例えば、死亡者がわが国だけでも年間約２
万人にものぼるといわれている肝硬変は、肝臓が結合組
織の増殖のため固くなる病気の総称で、種々の慢性肝疾
患の終末像であるといわれ、肝全体にわたるびまん性の
肝線維症である。すなわち、炎症などの肝傷害が長期に
及ぶ慢性肝炎においては、線維芽細胞や伊東細胞などの
細胞外マトリックス（特にＩ型コラーゲン）産生の著し
い亢進を伴い肝臓は線維化する。肝の線維化が慢性的に
進行すると、ますます正常な肝再生は妨害され、肝細胞
に置き換わり、線維芽細胞とＩ型コラーゲンを主体とす
る細胞外マトリックスが肝組織のかなりの部分を占め、
多くの凝小葉からなる肝硬変に至る。肝硬変の進行に伴
い、線維隔壁が肝全体に進展し、その結果生じる血流の
異常は、肝実質細胞の変性を更に押し進める一因にもな
り、肝硬変における悪循環が続くことになり、更にはア
ルコール、ウイルス、自己免疫等種々の原因によって、
肝臓中に多量の膠質線維が生成され、肝細胞の壊死と機
能消失とが生じ、肝硬変患者は遂には死に至る。Ｉ型コ
ラーゲンは正常肝では全タンパク質量の約２％を占める
が、肝硬変となると１０〜３０％を占めるようになる。

【０００４】また、間質性肺疾患は、肺胞及び肺胞管の
みならず、しばしば呼吸細気管支や終末気管支も巻き込
む下部気道の慢性炎症（肺胞炎 alveolitis)とその結果
である間質の線維化と肺胞内線維化を特徴とする疾患群
である。ここでいう間質性肺疾患とは、例えば、間質性
肺炎、肺線維症などのびまん性間質性肺疾患、特発性肺
線維症、透過性肺水腫、膠原病肺、サルコイドーシスな
どを含む。間質性肺疾患においては、線維化組織では細
胞外マトリックスの過剰な産生と蓄積が認められてい
る。すなわち、間質性肺疾患の肺線維化組織では、肥大
した間質に著明なＩ型及び III型コラーゲンの集積がみ
られており、特に III型コラーゲンは、線維化の早期に
肥厚した肺胞中隔に集積し、病期が進行し、後期にはＩ
型コラーゲンが増加し、主要なコラーゲンとなる。基底
膜は早期に破壊されており、肺胞腔側へのコラーゲン線
維の侵入が観察される。

【０００５】また、慢性腎不全とは慢性腎炎症候群の結
果、腎機能の荒廃により体内の恒常性が維持できなくな
った状態である。慢性腎不全の進行を病理学的にみると
糸球体硬化と間質線維化の進行である。糸球体硬化症
は、メサンギウム領域を中心とした細胞外マトリックス
の増生である。メサンギウム硬化症の成分は正常と比較
し、著明にIV型コラーゲンなどの糸球体基底膜の成分が
増加し、また間質成分であるＩ型コラーゲンも硬化症部
位に一致して増生している。すなわち、慢性に経過する
糸球体硬化に対しては、細胞外マトリックスの産生亢進
が大きな要因である。ここで慢性腎不全に陥いる疾患と
は、例えばＩｇＡ腎症、巣状糸球体硬化症、膜性増殖性
腎炎、糖尿病性腎症、慢性間質性腎炎、慢性糸球体腎炎
などを含む。

【０００６】また、心筋細胞は高度に分化した細胞で、
分裂して増殖する能力を持ち合わせていない。したがっ
て、心臓に何らかの負荷が加わると、心筋細胞はその一
つ一つが肥大して収縮力を増大させ、心機能を保とうと
する。更に、負荷が長時間持続すると、虚血の要因を中
心に多彩な障害が蓄積され、負荷に対する代償機構に破
綻をきたし、心筋の収縮力は急激に低下し、心臓のポン
プ機能は損なわれて、心不全に陥いることが知られてお
り、心肥大は我が国における心不全の成因として最も大
きな部分を占めている。また、心肥大の形成は、心不全
発症の最大の危険因子になるばかりでなく、虚血性心疾
患や重篤な心室性不整脈の合併率が有意に高くなり、生
命予後を独立に規定する要因になっている。心肥大進展
時には個々の心筋細胞が著しく肥大するだけでなく、そ
の心筋細胞をしっかり束ねるために、間質の線維化が促
進され、細胞外マトリックスであるコラーゲンが増加す
る。また、心筋炎・心筋虚血などにより心筋細胞を失う
と、コラーゲンが生合成され間隙を置換する。間質の線
維化が過剰に進展すると、その結果、心筋は固くなり、
拡張が障害される。更に、筋小体機能も低下して心筋の
拡張期の弛緩も障害される。その他、術後の瘢痕や熱傷
性瘢痕、あるいは強皮症、動脈硬化等の細胞外マトリッ
クス産生亢進の病態を示す病気は、何らかの原因により
コラーゲン合成の異常亢進が起こり、線維化が進んで組
織の硬化変化を生ずることが主要な成因と考えられてい
る。

【０００７】また、血管新生においても基底膜及び基底
膜中のコラーゲン合成が、重要な役割をはたすことが指
摘されている（Maragoudakis, E., Sarmonika, M., and
Panoutsacopoulous, M., "J. Pharmacol. Exp. The
r.", 244 : 729, 1988 ; Ingber, D. E., Madri, J.
A., and Folkman, J., "Endocrinology", 119 : 1768,
1986）。血管新生による疾患としては、例えば、糖尿
病性網膜症、後水晶体線維増殖症、角膜移植に伴う血管
新生、緑内症、眼腫瘍、トラコーマ、幹せん、化膿性肉
芽腫、血管腫、線維性血管腫、肥大性はん痕、肉芽、リ
ューマチ性関節炎、浮腫性硬化症、アテローム性動脈硬
化症、各種腫瘍などが知られている。このようにコラー
ゲンなどの細胞外マトリックスの産生の亢進の病態を示
す病気が大きな問題となっているにもかかわらず、従来
では副作用や薬理効果等の種々の面で満足すべき細胞外
マトリックス合成抑制剤（例えば、コラーゲン合成抑制
剤）は未だ開発されていなかったのである。

【０００８】一方、熱ショックタンパク質（heat shock
protein；ＨＳＰ、ストレスタンパク質ともいう）は、
細胞を何らかのストレス、例えば熱、重金属、薬剤、ア
ミノ酸類似体、又は低酸素（低濃度酸素）などで刺激す
ることにより、細胞に発現される一群のタンパク質であ
る。熱ショックタンパク質は、自然界に普遍的に存在し
ており、細菌、酵母、植物、昆虫、及びヒトを含む高等
動物により産生される。ＨＳＰは、その種類は多種多様
であるが、分子量の大きさからＨＳＰ９０ファミリー
（例えば、９０ｋＤ又は１１０ｋＤのＨＳＰなど）、Ｈ
ＳＰ７０ファミリー（例えば、７０〜７３ｋＤのＨＳＰ
など）、ＨＳＰ６０ファミリー（例えば、５７〜６８ｋ
ＤのＨＳＰなど）、低分子ＨＳＰファミリー（例えば、
２０ｋＤ、２５〜２８ｋＤ、又は４７ｋＤのＨＳＰな
ど）の４ファミリーに大別することができる。なお、本
明細書においては、特定分子量を有するＨＳＰを、ＨＳ
Ｐとその直後に記載する数字とによって示すものとし、
例えば、分子量４７ｋＤのＨＳＰを『ＨＳＰ４７』と称
するものとする。以上のように、ＨＳＰには多くの種類
が存在するが、これらは分子量だけでなく、構造、機
能、又は性質などもそれぞれ異なるものである。ストレ
スへの応答に加えて、これらのタンパク質の中には構成
的に合成されるものがあり、正常な環境の下で、タンパ
ク質のフォールディング、アンフォールディング、タン
パク質サブユニットの会合、タンパク質の膜輸送のよう
な、必須の生理的な役割を演じていることが示されてい
る。熱ショックタンパク質としてのこれらの機能は、分
子シャペロンと称される。

【０００９】ＨＳＰ４７は、永田等によって１９８６年
に発見されたタンパク質で、分子量４７キロダルトンの
塩基性タンパク質（ｐＩ＝９．０）である。ＨＳＰ４７
の発現が増大するにつれて、コラーゲンの合成も増加す
ることが様々な細胞で示されている（"J. Biol. Che
m.", 261 : 7531, 1986 ; "Eur. J. Biochem.", 206 :
323, 1992 ; "J. Biol. Chem.", 265 : 992, 1990 ;
"J. Clin. Invest.", 94：2481, 1994）。すなわち、Ｈ
ＳＰ４７は、細胞内で小胞体内でのプロコラーゲンのプ
ロセシング、三重鎖ヘリックス形成、あるいは小胞体か
らゴルジ装置へのプロコラーゲン輸送・分泌という局面
で、コラーゲンの特異的分子シャペロンとして機能して
いるとされているので、増大したＨＳＰ４７発現は、細
胞外マトリックスにおけるコラーゲン分子の蓄積を刺激
する。このようにコラーゲン結合熱ショックタンパク質
であるＨＳＰ４７は、発現と同様に機能においても、細
胞外マトリックスタンパク質であるコラーゲンに密接に
関連した熱ショックタンパク質である。

【００１０】

【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、上記事
情に鑑み、肝硬変、間質性肺疾患、慢性腎不全（又は慢
性腎不全に陥いる疾患）、心肥大、術後の瘢痕や熱傷性
瘢痕、交通事故等の後に生じるケロイドや肥厚性瘢痕、
強皮症、動脈硬化、又は関節リウマチなどの細胞外マト
リックス産生亢進の病態を示す病気の患者の生理学的状
態を有効に改善させ、肝硬変、間質性肺疾患、慢性腎不
全（又は慢性腎不全に陥いる疾患）、心肥大、術後の瘢
痕や熱傷性瘢痕、交通事故等の後に生じるケロイドや肥
厚性瘢痕、強皮症、動脈硬化、又は関節リウマチなどの
細胞外マトリックス産生亢進の病態を示す病気を効果的
に治療することのできる、細胞外マトリックス合成抑制
剤を提供するために、種々検討を重ねてきた。

【００１１】上記したように、肝硬変、間質性肺疾患、
慢性腎不全（又は慢性腎不全に陥いる疾患）、心肥大、
術後の瘢痕や熱傷性瘢痕、交通事故等の後に生じるケロ
イドや肥厚性瘢痕、強皮症、動脈硬化、又は関節リウマ
チなどの線維症は臓器内の細胞外マトリックスの著しく
増加した病態が主病変と理解されている。肝硬変、間質
性肺疾患、慢性腎不全（又は慢性腎不全に陥いる疾
患）、心肥大、術後の瘢痕や熱傷性瘢痕、交通事故等の
後に生じるケロイドや肥厚性瘢痕、強皮症、動脈硬化、
又は関節リウマチなどの細胞外マトリックス産生亢進の
病態を示す病気に伴う線維化は、コラーゲン生合成増加
やコラーゲン分解能の低下により生ずると考えられてい
る。例えば、肝の線維化において、Ｉ型、 III型、IV型
コラーゲンの合成活性化が起こるが、特に主要成分であ
るＩ型コラーゲンの合成活性化が重要な意味をもつ。

【００１２】こうした状況下で、本発明者らは、意外に
も、エンゴサクの成分であるコリダリン、又はその誘導
体が、病態を示す組織の細胞におけるＨＳＰ４７の合成
を特異的に抑制することを見出した。すなわち、コリダ
リン誘導体を投与することにより、細胞内でのＨＳＰ４
７の合成を抑制し、臓器内でのコラーゲン合成を抑制
し、ひいては肝硬変、間質性肺疾患、慢性腎不全（又は
慢性腎不全に陥いる疾患）、心肥大、術後の瘢痕や熱傷
性瘢痕、交通事故等の後に生じるケロイドや肥厚性瘢
痕、強皮症、動脈硬化、又は関節リウマチなどの細胞外
マトリックス産生亢進の病態を示す病気の治療が可能で
あることを見出したのである。本発明はこうした知見に
基づくものであり、肝硬変、間質性肺疾患、慢性腎不全
（又は慢性腎不全に陥いる疾患）、心肥大、術後の瘢痕
や熱傷性瘢痕、交通事故等の後に生じるケロイドや肥厚
性瘢痕、強皮症、動脈硬化、又は関節リウマチなどの細
胞外マトリックス産生の亢進の病態を示す病気を効果的
に治療することのできるＨＳＰ４７合成抑制剤であっ
て、細胞内でのコラーゲンの成熟及び輸送過程に重要な
役割を果たしているコラーゲン特異的な分子シャペロン
であるＨＳＰ４７の合成抑制剤を提供することを目的と
する。

【００１３】

【課題を解決するための手段】従って、本発明は、式
（Ｉ）：

【化３】 （式中、Ｒ¹ 、Ｒ² 、Ｒ³ 、Ｒ⁴ 、及びＲ⁵ は、それぞ
れ独立して、炭素数１〜３のアルキル基である）で表さ
れるコリダリン誘導体を有効成分として含有することを
特徴とする、分子量４７キロダルトンの熱ショックタン
パク質の合成抑制剤に関する。

【００１４】

【発明の実施の形態】以下、本発明について詳細に説明
する。本発明の合成抑制剤は、有効成分として前記式
（Ｉ）で表されるコリダリン誘導体を含有する。炭素数
１〜３のアルキル基とは、例えば、メチル基、エチル
基、ｎ−プロピル基、又はｉ−プロピル基である。前記
式（Ｉ）で表される化合物において、Ｒ¹ 、Ｒ² 、
Ｒ³ 、Ｒ⁴ 、及びＲ⁵ は、それぞれ独立して、同一又は
異なる前記の炭素数１〜３のアルキル基であることがで
きる。前記式（Ｉ）で表されるコリダリン誘導体には、
立体異性体が存在し、それらの任意の純粋の立体異性体
又はそれらの混合物を、本発明の合成抑制剤の有効成分
として用いることができる。

【００１５】本発明の合成抑制剤において有効成分とし
て使用することのできるコリダリン誘導体としては、式
（II）：

【化４】 で表されるコリダリン（ｃｏｒｙｄａｌｉｎｅ）が好ま
しい。コリダリンは、例えば、エンゴサク等の生薬に含
まれている。コリダリンには、立体異性体が存在し、コ
リダリンの任意の純粋の立体異性体又はそれらの混合物
を、本発明の合成抑制剤の有効成分として用いることが
できる。

【００１６】本発明の合成抑制剤に含有されるコリダリ
ン誘導体は、化学合成によって、又は天然物から抽出し
て精製することによって、調製することができる。ある
いは、市販品を用いてもよい。本発明の合成抑制剤にお
いて有効成分として用いるコリダリン誘導体を、天然物
から抽出する場合には、例えば、コリダリン誘導体を含
有する植物の全体又は一部分（例えば、全草、葉、根、
根茎、茎、根皮、若しくは花）をそのまま用いて、又は
簡単に加工処理（例えば、乾燥、切断、湯通し、蒸気加
熱、若しくは粉末化）したもの（例えば、生薬）を用い
て抽出する。抽出条件は一般的に植物抽出に用いられる
条件ならば特に制限はない。コリダリンを含有する植物
としては、これに限定するものではないが、例えば、コ
リダリス・ツルトシャニノビイ・ベッセル・ホルマ・ヤ
ンフスオ・ワイ・エイチ・チョウ・エ・シー・シー・ヒ
ュー（Ｃｏｒｙｄａｌｉｓ ｔｕｒｔｓｃｈａｎｉｎｏ
ｖｉｉ Ｂｅｓｓｅｒ ｆｏｒｍａ ｙａｎｈｕｓｕｏ
Ｙ．Ｈ．Ｃｈｏｕ ｅｔ Ｃ．Ｃ．Ｈｓｕ）又はオオ
バエンゴサク（Ｃｏｒｙｄａｌｉｓ ｔｅｒｎａｔａ
Ｎａｋａｉ）等を使用することができる。

【００１７】本発明におけるコリダリンを生薬から抽出
する場合、これに限定するものではないが、例えば、エ
ンゴサクから抽出することが好ましい。エンゴサク（延
胡索：Ｃｏｒｙｄａｌｉｓ Ｔｕｂｅｒ）とは、コリダ
リス・ツルトシャニノビイ・ベッセル・ホルマ・ヤンフ
スオ・ワイ・エイチ・チョウ・エ・シー・シー・ヒュー
若しくはオオバエンゴサク又はその同属植物、すなわち
ケシ目（Ｐａｐａｖｅｒａｃｅａｅ）に属する植物の塊
茎を意味し、それらの部分を単独であるいは任意に組み
合わせて用いることができる。

【００１８】本発明による合成抑制剤において有効成分
として用いることのできるエンゴサク抽出物は、前記の
コリダリンを含有していればよく、従って、エンゴサク
の粗抽出物を用いることができる。本発明で用いること
のできるエンゴサク抽出物の製造方法としては、エンゴ
サクを、水（例えば、冷水、温水、又は熱湯）によって
抽出するか、又は有機溶媒を用いて抽出することによっ
て、得ることができる。有機溶媒としては、例えば、炭
素数１〜６のアルコール（例えば、メチルアルコール、
エチルアルコール、ｎ−プロピルアルコール、イソプロ
ピルアルコール、若しくはブチルアルコール）、エステ
ル（例えば、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸プロピル、
若しくは酢酸ブチル）、ケトン（例えば、アセトン若し
くはメチルイソブチルケトン）、エーテル、石油エーテ
ル、ｎ−ヘキサン、シクロヘキサン、トルエン、ベンゼ
ン、炭化水素のハロゲン誘導体（例えば、四塩化炭素、
ジクロロメタン、若しくはクロロホルム）、ピリジン、
グリコール（例えば、プロピレングリコール、若しくは
ブチレングリコール）、ポリエチレングリコール、又は
アセトニトリルなどを用いることができ、これらの有機
溶媒を単独、又は適宜組み合わせ、一定の比率で混合
し、更には無水又は含水状態で用いることができる。好
ましくは、クロロホルム及び／又はエーテル等が望まし
い。水抽出又は有機溶媒抽出の方法としては、通常の生
薬抽出に用いられる方法を用いることができ、例えば、
（乾燥）エンゴサク１重量部に対し、水又は有機溶媒３
〜３００重量部を用いて、攪拌しながら、その沸点以下
の温度で加熱還流、常温で超音波抽出、あるいは冷浸す
ることが望ましい。抽出工程は、通常は５分〜７日間、
好ましくは１０分〜６０時間実施し、必要に応じて、攪
拌等の補助的手段を加えることにより、抽出時間を短縮
することができる。

【００１９】抽出工程終了後、濾過又は遠心分離等の適
当な方法により、水又は有機溶媒抽出液から、不溶物を
分離して粗抽出物を得ることができる。なお、本発明の
合成抑制剤において、天然物より抽出、分画したコリダ
リンを用いる場合には、前記の粗抽出物を特に精製する
ことなく、そのまま使用してもよい。常法による水抽出
物又は有機溶媒抽出物の他に、前記の粗抽出物を各種有
機溶媒又は吸着剤等により、更に処理した精製抽出物
も、本発明の合成抑制剤の有効成分として用いることが
できる。これらの粗抽出物及び各種の精製処理を終えた
精製抽出物を含むエンゴサク抽出物は、抽出したままの
溶液を用いても、溶媒を濃縮したエキスを用いても良い
し、溶媒を留去し乾燥した粉末、更には結晶化して精製
したもの、あるいは粘性のある物質を用いても良く、ま
たそれらの希釈液を用いることもできる。こうして得ら
れたエンゴサク抽出物は、エンゴサクに含まれるコリダ
リンを含み、同時に原料のエンゴサクに由来する不純物
を含んでいる。

【００２０】本発明の合成抑制剤は、コリダリン誘導
体、又はコリダリン誘導体を含有する植物の抽出物、例
えば、コリダリン誘導体を含有する生薬の抽出物（特に
は、エンゴサク抽出物）を、それ単独で、又は好ましく
は製剤学的若しくは獣医学的に許容することのできる通
常の担体と共に、動物、好ましくは哺乳動物（特にはヒ
ト）に投与することができる。投与剤型としては、特に
限定がなく、例えば、散剤、細粒剤、顆粒剤、錠剤、カ
プセル剤、懸濁液、エマルジョン剤、シロップ剤、エキ
ス剤、若しくは丸剤等の経口剤、又は注射剤、外用液
剤、軟膏剤、坐剤、局所投与のクリーム、若しくは点眼
薬などの非経口剤を挙げることができる。これらの経口
剤は、例えば、ゼラチン、アルギン酸ナトリウム、澱
粉、コーンスターチ、白糖、乳糖、ぶどう糖、マンニッ
ト、カルボキシメチルセルロース、デキストリン、ポリ
ビニルピロリドン、結晶セルロース、大豆レシチン、シ
ョ糖、脂肪酸エステル、タルク、ステアリン酸マグネシ
ウム、ポリエチレングリコール、ケイ酸マグネシウム、
無水ケイ酸、又は合成ケイ酸アルミニウムなどの賦形
剤、結合剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、流動性促進
剤、希釈剤、保存剤、着色剤、香料、矯味剤、安定化
剤、保湿剤、防腐剤、又は酸化防止剤等を用いて、常法
に従って製造することができる。例えば、コリダリン１
重量部と乳糖９９重量部とを混合して充填したカプセル
剤などである。

【００２１】非経口投与方法としては、注射（皮下、静
脈内等）、又は直腸投与等が例示される。これらのなか
で、注射剤が最も好適に用いられる。例えば、注射剤の
調製においては、有効成分としてのコリダリン誘導体、
又はコリダリン誘導体を含有する植物の抽出物、例え
ば、コリダリン誘導体を含有する生薬の抽出物（特に
は、エンゴサク抽出物）の他に、例えば、生理食塩水若
しくはリンゲル液等の水溶性溶剤、植物油若しくは脂肪
酸エステル等の非水溶性溶剤、ブドウ糖若しくは塩化ナ
トリウム等の等張化剤、溶解補助剤、安定化剤、防腐
剤、懸濁化剤、又は乳化剤などを任意に用いることがで
きる。また、本発明の合成抑制剤は、徐放性ポリマーな
どを用いた徐放性製剤の手法を用いて投与してもよい。
例えば、本発明の合成抑制剤をエチレンビニル酢酸ポリ
マーのペレットに取り込ませて、このペレットを治療す
べき組織中に外科的に移植することができる。

【００２２】本発明の合成抑制剤は、これに限定される
ものではないが、コリダリン誘導体を、０．０１〜９９
重量％、好ましくは０．１〜８０重量％の量で含有する
ことができる。また、コリダリン誘導体を含有する植物
の抽出物、例えば、コリダリン誘導体を含有する生薬の
抽出物（特には、エンゴサク抽出物）を有効成分として
含有する本発明の合成抑制剤は、その中に含まれるコリ
ダリン誘導体が前記の量範囲になるように適宜調整し
て、調製することができる。なお、コリダリン誘導体を
含有する植物の抽出物、例えば、コリダリン誘導体を含
有する生薬の抽出物（特には、エンゴサク抽出物）を有
効成分として含有する合成抑制剤を、経口投与用製剤と
する場合には、製剤学的に許容することのできる担体を
用いて、製剤化することが好ましい。本発明の合成抑制
剤を用いる場合の投与量は、病気の種類、患者の年齢、
性別、体重、症状の程度、又は投与方法などにより異な
り、特に制限はないが、コリダリン誘導体量として通常
成人１人当り１ｍｇ〜１０ｇ程度を、１日１〜４回程度
にわけて、経口的に又は非経口的に投与する。更に、用
途も医薬品に限定されるものではなく、種々の用途、例
えば、機能性食品や健康食品として飲食物の形で与える
ことも可能である。

【００２３】

【作用】上記したように、本発明の合成抑制剤に含有さ
れるコリダリン誘導体は、細胞内のＨＳＰ４７合成を特
異的に抑制する作用があるので、前記コリダリン誘導体
を投与すると細胞内でのＨＳＰ４７生合成が特異的に減
少し、コラーゲンの生合成が抑制される。その結果、細
胞外マトリックス産生も抑制されることになる。従っ
て、前記コリダリン誘導体は、コラーゲンの増加を伴う
細胞外マトリックス産生亢進の病態を示す病気、例えば
肝硬変、間質性肺疾患、慢性腎不全（又は慢性腎不全に
陥いる疾患）、心肥大、術後の瘢痕や熱傷性瘢痕、交通
事故等の後に生じるケロイドや肥厚性瘢痕、強皮症、動
脈硬化、又は関節リウマチなどの予防及び治療に使用す
ることができる。すなわち、本発明の合成抑制剤は、コ
ラーゲン特異的シャペロンであるＨＳＰ４７の合成を抑
制することによりコラーゲンの合成を抑制する。

【００２４】また、前記のように、血管新生において
も、基底膜及び基底膜中のコラーゲン合成が重要な役割
をはたすことが指摘されているので、本発明の合成抑制
剤は、血管新生の異常増殖に基づく多くの疾患の予防治
療薬として極めて有用であり、先に述べたような各疾
患、すなわち糖尿病性網膜症、後水晶体線維増殖症、角
膜移植に伴う血管新生、緑内症、眼腫瘍、トラコーマ、
乾せん、化膿性肉芽腫、血管腫、線維性血管腫、肥大性
はん痕、肉芽、リューマチ性関節炎、浮腫性硬化症、ア
テローム性動脈硬化症及び各種腫瘍などに用いることが
できる。更に、Ｉ型コラーゲンとフィブロネクチンを基
本骨格とする間質（interstitial stroma)が癌の転移に
おいて、離脱した癌細胞が近傍の脈管に侵入するまでの
ガイド役を果たすことが、明らかとなっているので〔"B
IOTHERAPY", 7 (8) : 1181, 1993〕、本発明の合成抑制
剤を投与することにより、癌の転移を抑制することも可
能である。

【００２５】

【実施例】以下、実施例によって本発明を具体的に説明
するが、これらは本発明の範囲を限定するものではな
い。実施例１：抗ＨＳＰ４７ポリクローナル抗体の作製 （１）抗ＨＳＰ４７ポリクローナル抗体の調製 ヒトＨＳＰ４７のＮ末端から２〜１６番目のアミノ酸配
列に対応するアミノ酸１５個からなるペプチド〔以下、
ヒトＨＳＰ４７ペプチド（２−１６）と称する〕を自動
ペプチド合成装置（ＰＳＳＭ−８システム，島津製作
所）を用いて作製し、スクシニミジル４−（ｐ−マレイ
ミドフェニル）ブチレート〔ＳＭＰＢ：Succinimidyl 4
-(p-maleimidophenyl)butyrate〕を架橋剤として用い、
常法（"Biochemistry", 18：690, 1979)によりラクトグ
ロブリンと結合させ、感作抗原を作製した。この感作抗
原１５０μｇを含むリン酸緩衝生理食塩水〔組成：ＫＣ
ｌ＝０．２ｇ／ｌ，ＫＨ₂ ＰＯ₄ ＝０．２ｇ／ｌ，Ｎａ
Ｃｌ＝８ｇ／ｌ，Ｎａ₂ ＨＰＯ₄ （無水）＝１．１５ｇ
／ｌ：以下ＰＢＳ（−）と称する：コスモバイオ，カタ
ログ番号320-01〕０．２ｍｌと、等量のフロイント完全
アジュバント（ヤトロン，カタログ番号RM606-1)とを混
和し、得られた混合液０．２ｍｌを、ルーラット（６週
齢，雌性：日本クレア）の皮下に投与し、免疫した。同
様の方法で第２次及び第３次免疫を繰り返した後、アジ
ュバント（Hunter's TiterMax ; CytRx Corporation,米
国ジョージア州）を用いて６回免疫感作を行った。感作
動物より採血し、常法により血清を分離して採取し、以
下に示す酵素抗体法（ＥＬＩＳＡ法）及びウェスタンブ
ロット法によって血清中の抗体価を測定した。

【００２６】（２）酵素抗体法（ＥＬＩＳＡ法）による
抗ＨＳＰ４７ポリクローナル抗体特性の評価 前項（１）で調製したヒトＨＳＰ４７ペプチド（２−１
６）をＰＢＳ（−）に溶解し、１０μｇ／ｍｌの濃度の
ペプチド溶液を調製し、リジットアセイプレート（ファ
ルコン，カタログ番号3910）の各ウェルに前記ペプチド
溶液を５０μｌずつ滴下した。最も外側のウェルにはＰ
ＢＳ（−）５０μｌのみを入れ、湿潤下で４℃にて一晩
放置した後、前記ペプチド溶液を捨て、ＰＢＳ（−）を
用いて各ウェルを洗浄した後、１％ウシ血清アルブミン
（以下、ＢＳＡと略称する）を含むＰＢＳ（−）１００
μｌを各ウェルに入れ、室温下で１時間放置した。ＰＢ
Ｓ（−）で３回洗浄した後、前項（１）で取得したルー
ラット血清５０μｌを各ウェルに入れ、１時間室温にて
放置した。ＰＢＳ（−）で３回洗浄した後、各ウェルに
２次抗体としてペルオキシダーゼ標識抗ラットＩｇＧ５
０μｌを入れ、室温下で１時間放置した。ＰＢＳ（−）
で２回洗浄した後、過酸化水素水４μｌを加えた０．１
Ｍクエン酸バッファー（ｐＨ４．５）１０ｍｌにｏ−フ
ェニレンジアミン（ＯＰＤ）タブレット（シグマ，カタ
ログ番号P8287)１個（１０ｍｇ）を溶解して調製した基
質液１００μｌずつを各ウェルに滴下し、室温にて遮光
下で３０分間放置した後、各ウェルの４９２ｎｍの吸光
度をマイクロプレートリーダー（東ソー，ＭＰＲ−Ａ４
ｉ型）にて測定した。抗体価の上昇が確認された血清を
抗ヒトＨＳＰ４７ポリクローナル抗体として以下の実施
例に用いた。

【００２７】（３）ウェスタンブロット法による抗ＨＳ
Ｐ４７ポリクローナル抗体特性の評価 Ｌａｅｍｍｌｉのバッファー系（Laemmli, N. K., "Nat
ure", 283 : pp. 249-256, 1970)を用いて、ＨｅＬａ細
胞のライセートのドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動を、以下の方法に従って
行った。濃縮ゲルの調製は次のように行った。蒸留水
６．１ｍｌ、０．５Ｍトリス（バイオ・ラッド，カタロ
グ番号161-0716）−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）２．５ｍｌ、
１０％ＳＤＳ（バイオ・ラッド，カタログ番号161-030
1）１００μｌ、及び３０％アクリルアミド（バイオ・
ラッド，カタログ番号161-0101）／Ｎ，Ｎ’−メチレン
ビスアクリルアミド（バイオ・ラッド，カタログ番号16
1-0201）１．３ｍｌを混合して、１５分間脱気し、１０
％過硫酸アンモニウム（バイオ・ラッド，カタログ番号
161-0700）５０μｌ及びＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメ
チルエチレンジアミン（以下、ＴＥＭＥＤと略称する）
（バイオ・ラッド，カタログ番号161-0800）１０μｌを
加えて、濃縮ゲルを調製した。また、分離ゲルの調製は
次のように行った。蒸留水４．０４５ｍｌ、１．５Ｍト
リス−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）２．５ｍｌ、１０％ＳＤＳ
１００μｌ、及び３０％アクリルアミド／Ｎ，Ｎ’−メ
チレンビスアクリルアミド３．３ｍｌをゆっくり混合し
て、１５分間アスピレータで脱気し、１０％過硫酸アン
モニウム５０μｌ、及びＴＥＭＥＤ５μｌを加えた。泳
動バッファーとしては、トリス９．０ｇ、グリシン（バ
イオ・ラッド，カタログ番号161-0717）４３．２ｇ、及
びＳＤＳ３．０ｇに蒸留水を加えて６００ｍｌにし、こ
れを蒸留水で５倍希釈したものを用いた。サンプルバッ
ファーは、蒸留水２ｍｌ、２Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ
６．８）５００μｌ、ＳＤＳ０．３２ｇ、β−メルカプ
トエタノール８００μｌ、及び０．０５％（ｗ／ｖ）ブ
ロモフェノールブルー（バイオ・ラッド，カタログ番号
161-0404）４００μｌを混合したものを用いた。

【００２８】５％二酸化炭素条件下で、３７℃で、１０
％非働化ウシ胎児血清（以下、ＦＢＳと略称する）を含
むＭＥＭ培地中でＨｅＬａ細胞を培養し、そのライセー
トを調製した。得られたＨｅＬａ細胞ライセートのＳＤ
Ｓ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った後、０．
４５μｍニトロセルロース膜（Schleicher & Schuell，
カタログ番号401196）にゲルを密着させ、タンパク質転
写装置（Trans-Blot Electrophoretic Transfer Cell：
バイオ・ラッド）を用いて、室温にて１００Ｖで、３時
間ブロッティングを行った。ブロッティングバッファー
としては０．０２５Ｍトリス及び０．１９２Ｍグリシン
よりなりｐＨ８．５に調整されたトリスグリシンバッフ
ァー（Tris Gly Running and Blotting Buffer；Enprot
ech,米国マサチューセッツ州，カタログ番号SA100034）
にメチルアルコールを２０％になるように加えて調製し
たバッファーを用いた。ブロッティング後、５％スキム
ミルク（雪印乳業）を含むＰＢＳ（−）溶液にニトロセ
ルロース膜を室温にて３０分間浸し、ブロッキングを行
った。ブロッキング後、スクリーナーブロッター（サン
プラテック）を用いて、前項（１）で取得したルーラッ
ト血清を１次抗体として、１次抗体反応を行った。１次
抗体反応は、２％スキムミルク（雪印乳業）を含むＰＢ
Ｓ（−）にて１０倍希釈した前記ルーラット血清２００
μｌで、室温にて１２０分間行った。１次抗体反応終了
後、スロー・ロッキング・シェイカーを用いて、ＰＢＳ
（−）で５分間の振盪を２回、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０
（バイオ・ラッド，カタログ番号170-6531）を含むＰＢ
Ｓ（−）溶液で１５分間の振盪を４回、更にＰＢＳ
（−）で５分間の振盪を２回行うことにより、ニトロセ
ルロース膜を洗浄した。洗浄終了後、ペルオキシダーゼ
標識ヤギ抗ラットＩｇＧ抗体（Southern Biotechnolog
y，カタログ番号3030-05)を、２％スキムミルクを含む
ＰＢＳ（−）溶液で５０００倍に希釈した溶液５ｍｌを
用いて、２次抗体反応を２時間行った。反応終了後、Ｐ
ＢＳ（−）溶液、及び０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰ
ＢＳ（−）溶液で、１次抗体反応後の洗浄と同じ条件下
にてニトロセルロース膜の洗浄を行った。

【００２９】余分なＰＢＳ（−）溶液を除去した後、ウ
ェスタンブロッティング検出試薬（ECL Western blotti
ng detection reagent；アマーシャム，カタログ番号RP
N2106)をニトロセルロース膜上に振りかけ、１分間室温
にて静置した後、余分な検出試薬を除去し、ニトロセル
ロース膜をラップに包み、反応面をＸ線フィルム（コダ
ック X-OMAT, AR,カタログ番号165 1454）に密着させて
露光させた。現像後、ＨＳＰ４７に相当する分子量４７
キロダルトン付近のバンドを測定することによって、抗
ＨＳＰ４７ポリクローナル抗体の反応性の検討を行っ
た。抗体価の上昇が確認された血清を、抗ヒトＨＳＰ４
７ポリクローナル抗体として、以下の実施例に用いた。

【００３０】実施例２：ヒト培養癌細胞のＨＳＰ発現量
の測定 （１）ヒト培養癌細胞の培養 前立腺癌細胞株ＤＵ １４５（ＡＴＣＣ ＨＴＢ ８
１）を、１０％非働化ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地
中で、５％二酸化炭素条件下で、熱ショック処理時以外
は、３７℃で培養した。

【００３１】（２）コリダリン処理及び熱ショック処理 播種２日後の前立腺癌細胞株ＤＵ １４５の培地中に、
最終濃度２０μＭになるように前記式（II）で表される
コリダリン（松浦薬業）を添加し、２４時間培養した。
その後、４５℃にて１５分間熱ショック処理をしてか
ら、３７℃にて終夜培養した。対照試験は、コリダリン
を添加しないこと以外は前記と同様に実施した。

【００３２】（３）ヒト培養癌細胞でのＨＳＰ発現量の
測定 前項（２）で処理した各細胞を、以下に示す方法により
ホモジナイズし、ＨＳＰ発現量をウェスタンブロット法
にて測定した。すなわち、前項（２）で処理した細胞を
ＰＢＳ（−）で洗浄した後、ライシスバッファー（ｌｙ
ｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ）〔１．０％ＮＰ−４０、０．１
５Ｍ塩化ナトリウム、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ
８．０）、５ｍＭ−ＥＤＴＡ、２ｍＭ−Ｎ−エチルマレ
イミド、２ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオリド、
２μｇ／ｍｌロイペプチン及び２μｇ／ｍｌペプスタチ
ン〕１ｍｌを加え、氷上で２０分間静置した。その後、
４℃で１２０００ｒｐｍにて、２０分間、遠心を行っ
た。遠心後の上清１０μｌをＰＢＳ（−）７９０μｌに
加え、更にプロテインアッセイ染色液（Dye Reagent Co
ncentrate : バイオラッド，カタログ番号500-0006）２
００μｌを加えた。５分間、室温にて静置した後、５９
５ｎｍで吸光度を測定してタンパク質定量を行った。タ
ンパク質定量を行った試料を用いて、Ｌａｅｍｍｌｉの
バッファー系にて、等量のタンパク質を含むライセート
のＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った。電
気泳動後、実施例１で述べた方法に従って、ブロッティ
ング及びそれに続くブロッキングを行った。すなわち、
タンパク質転写装置（Trans-Blot Electrophoretic Tra
nsfer Cell：バイオ・ラッド）を用いて、室温にて１０
０Ｖにて、０．４５μｍニトロセルロース膜（Schleich
er & Schuell，カタログ番号401196）にゲルを密着さ
せ、３時間ブロッティングを行った。ブロッティングバ
ッファーとしては、前記実施例１（３）で用いたバッフ
ァーと同じものを用いた。ブロッティング後、ニトロセ
ルロース膜を１０％スキムミルク（雪印乳業）−ＰＢＳ
（−）溶液に室温にて３０分間、インキュベートし非特
異的結合をブロックした。

【００３３】ブロッキング後、ニトロセルロース膜の上
で、実施例１で製造した抗ヒトＨＳＰ４７ラットポリク
ローナル抗体により、１次抗体反応を行った。その後、
ＰＢＳ（−）で５分間ずつ、溶液を取り替えて２回の洗
浄をスロー・ロッキング・シェイカーによって行い、更
にＰＢＳ（−）−０．１％Ｔｗｅｅｎ２０（バイオ・ラ
ッド，カタログ番号170-6531）溶液で１５分間ずつ、溶
液を取り替えて４回の洗浄を行った。最終的に、ＰＢＳ
（−）で５分間ずつ、２回の洗浄を行った。洗浄終了
後、ペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ラットＩｇＧ抗体（So
uthern Biotechnology，カタログ番号3030-05)を、２％
スキムミルクを含むＰＢＳ（−）溶液で５０００倍に希
釈して調製した抗体溶液５ｍｌを用いて、２時間、２次
抗体反応を行った。反応終了後、ニトロセルロース膜に
関して、ＰＢＳ（−）溶液で５分間ずつ溶液を変えて２
回、更にＰＢＳ（−）−０．１％Ｔｗｅｅｎ２０溶液で
１５分間ずつ溶液を変えて５回の洗浄をスロー・ロッキ
ング・シェイカーにより行った。最後にＰＢＳ（−）溶
液で５分間ずつ２回の洗浄を行った。余分なＰＢＳ
（−）溶液を除去した後、ウェスタンブロッティング検
出試薬（ECL Westernblotting detection reagent；Ame
rsham，カタログ番号RPN2106)をニトロセルロース膜上
に振りかけ、１分間インキュベートした後、余分な検出
試薬を除去し、ニトロセルロース膜をラップに包み、反
応面をＸ線フィルム（コダック X-OMAT,AR,カタログ番
号165 1454）に密着させて露光し、現像してＨＳＰ４７
の有無の検討を行った。

【００３４】その結果、対照試験、すなわち、コリダリ
ンを添加しなかった前立腺癌細胞株ＤＵ １４５では、
分子量約４７ｋＤのバンドが一本検出された。なお、分
子量は、分子量マーカー（ウシカーボニックアンヒドラ
ーゼ、卵白オバルブミン、及びウシ血清アルブミン）に
より決定した。コリダリンを添加した前立腺癌細胞株Ｄ
Ｕ １４５では、対照試験に比べて分子量約４７ｋＤの
バンドの濃度が有意に薄くなった。すなわち、コリダリ
ンは、ＨＳＰ４７の発現を抑制する合成抑制剤の活性を
有するものと結論づけられ、この事実は、コリダリンが
細胞外マトリックス産生の亢進に抑制的に働くことを示
している。

【００３５】

【発明の効果】以上詳述したように、本発明の合成抑制
剤は、例えば、肝硬変、間質性肺疾患、慢性腎不全（又
は慢性腎不全に陥いる疾患）、心肥大、術後の瘢痕や熱
傷性瘢痕、交通事故等の後に生じるケロイドや肥厚性瘢
痕、強皮症、動脈硬化、又は関節リウマチなどの細胞外
マトリックス産生の亢進の病態を示す病気に罹患した細
胞にみられるコラーゲン合成亢進を改善する作用を有す
る。従って、本発明による合成抑制剤を投与することに
より、臓器、組織の線維化、硬化が阻止され、その結
果、前記病気の患者の生理学的状態を有効に改善させ、
前記病気を効果的に治療することができる。また、本発
明の合成抑制剤は、血管新生の異常増殖を伴う各種疾患
の予防治療にも有用である。更に、Ｉ型コラーゲンとフ
ィブロネクチンを基本骨格とする間質が、癌の転移にお
いて離脱した癌細胞が近傍の脈管に侵入するまでのガイ
ド役を果たすことが、明らかとなっているので、本発明
の合成抑制剤を投与することにより、癌の転移を抑制す
ることも可能である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ａ６１Ｋ 31/47 ＡＣＶ Ａ６１Ｋ 31/47 ＡＣＶ 35/78 ＡＢＧ 35/78 ＡＢＧＣ ＡＤＡ ＡＤＡ Ｃ０７Ｄ 455/03 Ｃ０７Ｄ 455/03

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 式（Ｉ）： 【化１】 （式中、Ｒ¹ 、Ｒ² 、Ｒ³ 、Ｒ⁴ 、及びＲ⁵ は、それぞ
   れ独立して、炭素数１〜３のアルキル基である）で表さ
   れるコリダリン誘導体を有効成分として含有することを
   特徴とする、分子量４７キロダルトンの熱ショックタン
   パク質の合成抑制剤。
2. 【請求項２】 式（Ｉ）： 【化２】 （式中、Ｒ¹ 、Ｒ² 、Ｒ³ 、Ｒ⁴ 、及びＲ⁵ は、それぞ
   れ独立して、炭素数１〜３のアルキル基である）で表さ
   れるコリダリン誘導体を含有する植物の抽出物を有効成
   分として含有することを特徴とする、分子量４７キロダ
   ルトンの熱ショックタンパク質の合成抑制剤。
3. 【請求項３】 エンゴサクの抽出物を有効成分として含
   有することを特徴とする、分子量４７キロダルトンの熱
   ショックタンパク質の合成抑制剤。