JP2008069143A - 関節リウマチ治療用植物抽出物 - Google Patents
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- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
Abstract
【解決手段】プレクトランサスアンボイニクス(Lour.)Spreng(PA)の粗抽出物または抽出物を含む関節リウマチに対する治療用薬物を提供する。該PA粗抽出物が、PAを直接搾汁することにより得られる粗抽出物、また、PA抽出物が、PAを極性溶媒に浸漬し、濃縮した後、カラム分離により得られる抽出物である。
【選択図】なし
Description
1.非ステロイド系抗炎症剤(NSAID):例えば、有効に炎症を抑制し、痛みの作用を軽減することができるアスピリン、インドメタシン、またはナプロキセン。
2.抗リウマチ薬(ARD):疾患修飾性抗リウマチ薬(DMARD)と称され、例えば、状態を抑制し、免疫異常を改善することができる金製剤、ヒドロキシクロロキン、メトトレキセート(MTX)、またはペニシラミン。
3.ステロイド薬:副腎皮質ステロイドと称され、抗炎症性であって、免疫抑制剤として使用することができる。
採りたてのPA植物を採取し、清浄水で洗浄した後、汁抽出器で圧搾して搾り汁を得た。次にPA搾り汁を凍結乾燥し、乾燥粉末を得、それをクロロホルムまたはメタノールなどの適当な溶媒に溶かし、PA粗抽出物を得た。
一定量の乾燥PAを適量の高極性溶媒に浸漬、ろ過した後、適量の高極性溶媒に再度浸漬した。この後、PA抽出液を、減圧下で回転濃縮機により元の容量の2〜3%まで濃縮し、溶媒中に希釈した後、カラム中で分離した。場合によっては、高極性から低極性まで異なる溶媒の4区分(高極性溶媒、準高極性溶媒、中極性溶媒、および低極性溶媒とする)を使用し、連続的に溶出することができた。高極性溶媒、準高極性溶媒、中極性溶媒、および低極性溶媒は、上記に定義した通りである。カラム分離法では、メタノールによりすでに処理されているDIAIONカラムを使用するのが好ましい。例えば、乾燥PAと同量のDIAIONを秤量し、メタノールに浸漬した後、カラムに充填した。充填後、該DIAIONを、1〜2倍の容量のメタノールで、次に5〜6倍の容量の脱イオン蒸留水で洗浄した。洗浄を終了し、充填が完了した。
機器および器具:
高速液体クロマトグラフ
ポンプ:Spectra−Physics P4000
検出器:UV/VIS Spectra−Physics Spectra System UV600OLP
オートサンプラー:Thermo Separation Pruducts AS3500
ソフトウェア:Thermo Separation Pruducts Chrom Quest
システム制御:Thermo Separation Pruducts SN4000
クロマトグラフカラム:COSMOSIL、4.6×250mm、5C18−MS
流量:1.0ml/分 圧力限界:250kgf/cm2
試料注入:10μl
PDA条件:
サンプリング:0.64秒
波長範囲:190〜370nm
uv波長:254nm
採りたてのPA1.25kgを秤量、清浄水で洗浄した後、汁抽出器により圧搾して搾り汁を得た。容量シリンダーを使用し、搾り汁の容量を測定し、そこから1050mlを取り出して凍結乾燥し、乾燥粉末19gを得た(収率1.5%)。HPLCパターンを図1に示す。
[試験動物]
生後8週、および体重約155〜165gの試験動物Lewisラットは全て、国立実験動物センターから購入した。12時間明所/12時間暗所のサイクル、室温23±1℃、適度な湿度、および良好な空気調節の動物小屋で、該動物を飼育し、水および飼料は無制限に与えた。さらに、実施中は、全ての試験動物が、国際実験動物機構の標準規制の基準に従った。
1.コラーゲンII型(Sigma C−1188):ウシの気管軟骨から得た
2.完全フロイントアジュバント:CFA(BD BBL(登録商標)231131)
3.不完全フロイントアジュバント:IFA(BD BBL(登録商標)263910)
4.ラットの腫瘍壊死因子(TNF−α)、インターロイキン6(IL−6)、およびインターロイキン1β(IL−1β)(R&D、Duoset)のELISAキット
5.ラットのC反応性タンパク質(CRP):ELISAキット(BD(登録商標)Pharmingen557825)
6.インドメタシン(Johnson Chemical Pharmacy Corporation、Sanchung City、Taipei Countyから市販)
7.採りたての中国薬草PAを直接圧搾して搾汁を得、減圧下で濃縮してPAの濃縮溶液を形成した後、それぞれ希釈して、高濃度の生薬22.5g/kg(PA−H)および低濃度の生薬4.5g/kg(PA−L)とした。最後に、該溶液を、それぞれの実体重に基づいてラットに経口で直接投与した。
1.シリンジ:1ml、3ml、および5ml(Terumo)
2.天秤
3.ノギス(Vernier Caliper)(Mitutoyo Corporation)
4.3方向ピストン管
5.発振器(Vortex)
6.ELISA読取機(Dynex、Thermo Labsystems)
1.抗原処方および免疫注射
1.体重の観察:3日毎の計量により表示
2.RA試験の評価:最大関節炎指数(MAI)で評価
3.関節腫脹速度:ノギスにより測定(15〜28日目に関節炎発現)
4.リウマチ因子(RF)
5.急性炎症C反応性タンパク質(CRP)
6.サイトカイン:TNF−α、IL−1βおよびIL−6(炎症性サイトカイン)
−RA試験の評価
0:関節炎の症状が起こらない。
1:足裏および足根部が赤みを示し、僅かに腫脹している。
2:足根および足関節部が赤く、中程度に腫脹している。
3:足根および足関節部が赤く、激しく腫脹している。
4:関節が硬く、骨が変形している。
平均MAI=各ラットの四肢において記録されたMAIの合計(0:CIAが起こらない、16:最高点)/4/各群のラット総数
ラット足裏部の厚さの変化をノギス(週2回)により測定したが、各ラットにつき、それぞれ2本の前足の各足裏中央に1部位、およびそれぞれ2本の各後ろ足に3部位(足関節部、足裏部、および趾根部)を含む、合計8種の測定部位があった。
1.コラーゲンを、濃度40μg/mlまでコーティング緩衝液に配合、そのうち0.1mlを96ウェルマイクロプレートにそれぞれ添加し、終夜4℃で保管した。
2.トリス緩衝液で3回洗浄後、1%のBSAを含むブロッキング緩衝液0.2mlを各ウェルに添加した。反応が室温で2時間続いた後、再度トリス緩衝液で3回洗浄した。
3.血清試料を0.05%のTween20(1/20または1/40)を含むトリス緩衝液で適当に希釈し、血清試料0.1mlを96ウェルマイクロプレートの各ウェルに添加した。反応が室温で2時間続いた後、再度トリス緩衝液で3回洗浄した。
4.コーティングした抗ラット免疫グロブリンM(IgM)をセイヨウワサビ過酸化酵素(HRP)と合わせ、適度に希釈(1/12000)した後、96ウェルマイクロプレートに添加した。反応が室温で2時間続いた後、再度トリス緩衝液で3回洗浄した。
5.テトラメチルベンジジン(TMB)0.1mlを呈色反応用の各ウェルに直接添加後、停止溶液を添加して反応を停止させた。最後に、吸収(O.D)値を波長450nmで読み取った。
1.CRP ELISAキットは事前にコーティングしたマイクロプレートであったので、適当に希釈した血清試料0.1mlを直接添加することができた。室温で1時間反応させた後、洗浄緩衝液で4回洗浄した。
2.ウサギ抗ラットC反応性タンパク質(CRP)をHRP Abと合わせ、洗浄緩衝液で100倍に希釈後、0.1mlを各ウェルに添加した。室温で1時間反応させた後、洗浄緩衝液で4回洗浄した。
3.TMB0.1mlを呈色反応用の各ウェルに添加し、約5〜10分後、停止溶液を添加して反応を停止させた。最後に、O.D値を波長450nmで読み取った。
(腹腔細胞の培養およびサイトカインの分析)
1.二酸化炭素で安楽死させた後、ラット腹腔の外皮を剪刀で切り取り、腹腔全体を露出させた。
2.HBSS緩衝液を、10mlシリンジによりバッチ式で腹腔に注入し、全容量を約20ml/ラットにした。
3.腹部をそっと揉んだ後、ラットの腹腔を開いた。剪刀を使用して、約2cmの切込みを腹腔に入れた。腹腔浸出細胞(PEC)液(細胞液約10〜15mlを回収することができた)をシリンジで引き出し、50ml遠心管に入れた。
4.該液を5分間1500rpmで遠心した後、上澄みを除去した。HBSS緩衝液10mlを添加して洗浄し、次に遠心した後で、上澄みを除去した。
5.細胞密度を、(抗生物質を含む)新鮮な培養液で2×106細胞/mlに調整した。
6.細胞懸濁液を、0.5ml/ウェルで48ウェルプレートに分けた。
7.さらにリポ多糖類(LPS)0.5ml(20μg/ml)を別途添加して、最終密度を10μg/mlにした。
8.最後に、37℃のインキュベーターの中に24時間置いた。上澄みを回収し、−20℃で保存した。サイトカインTNF−α、IL−6、およびIL−1βの濃度を、ELISAキットを使用して分析した。
I.ラットの体重変化
動物試験では、薬物の投与および他の外力の適用が共に、直接または間接的に体重の変化に影響する。したがって、体重を直接観察することは、外見上の最も重要な指標である。体重の測定結果によると、およそ20日目後、コラーゲンにより誘発された関節炎の症状が生じ、正常のラットと比較して、体重は図3に示すように有意に減少することが示されるが、PA−Hおよびインドメタシンを投与したラットの群では、体重の減少が効果的に避けられ、正常の群と同様の成長曲線である。さらに、体重減少の現象は、PA−Lを投与した群では効果的に阻止できなかった。
材料および方法の項で記述したように、最大関節炎指数(MAI)は、試験採点法の基準として5段階差があり、外観指標の1つである。図4に示すように、コラーゲンにより誘発されたラットの関節炎は、およそ35日目でピークに達するが、PAおよびインドメタシンを投与したラットの群では、関節炎指数が効果的に減少することができた。その中で、PA−Hおよびインドメタシンの結果が最も好ましい。
関節炎の症状は、ラットに2回目の二次抗原注入後およそ20日目で連続的に生じ、四肢の関節部位をノギスで実際に測定した。関節腫脹率(8つの測定部位から得られた平均)は、39日目に20%から最高61%まで増加し、図5に示すように、正常の群(P<0.01)と比較して有意な差がある。PAおよびインドメタシンを投与している点から、PA−HおよびPA−Lは共に関節腫脹を有効に抑制でき、PA−Hおよびインドメタシンの効果も依然として非常に好ましく、PA−Hがインドメタシンと同様の抗炎症効果がある可能性を示唆している。
RAが発現する間、現れる自己抗体がいくつかある。しかし、臨床診断では、患者の血清に自己抗体が存在しているか否かは、RAか否かを決定する際の主な基準であり、RFの自己抗体が最も重要である。したがって、本試験におけるCIAの動物モデルもRFを重要な生化学指標としている。過去の研究では、ヒトまたはラットの血清中のRFは、ELISA法(Vittecoqら、2001;Jonssonら、1986)を使用して分析をすることができると指摘していた。本研究では、過去の分析法に基づいて一部改善をし、ラット血清RF分析のための科学技術の基盤を再構築した。分析結果により、図6に示すように、2回の抗原注入後20日目で、ラットの血清RFの力価は全てピークに達することが示されているが、20日目と比較して、PAおよびインドメタシンを投与した群の血清RF値は、35日目にそれぞれ33%および47%減少し、45日目には、それぞれ39%および51%さらに減少した。そのうえ、本研究の知見では、陰性対照群の血清RF値は、20日目から徐々に減少する傾向があり、したがって関節炎の症状がラットにおいてコラーゲンにより誘発された後、症状は軽減し、時間と共に回復する傾向さえもあることが示唆され、その結果、疾患発現の「最盛期」は20日目〜45日目であると考えられる。
血清CRPは主に肝臓によって作られ、全身性炎症反応を起こす指標であり、急性炎症中、血清に現れる最も重要な反応物である。RA患者血清中のCRP濃度、ならびにIL−1およびTNF−αの生成は、関節炎障害の発現に密接に関係していることが、一部の文献で言及されている(Nakamu、関節リウマチ、2000)。本研究の結果によると、2回の抗原免疫注射後、ラット血清中のCRP濃度は、図7に示すように有意に増加し、35日目でピークに達し、正常の群(P<0.01)と比較して有意差を有することが示されている。さらに、35日目にPA−Hおよびインドメタシンを連続的に投与した後、CIAラットでは血清CRP濃度を効果的に抑制できることが判明したが、45日目でもまだ同様の効果があるため、PA−Hを投与すると、インドメタシンと同様の臨床的抗炎症剤投与の治療効果があることを示唆している。PA−Lを投与しても、有意な炎症抑制効果は全くない。
PA抗腫脹または抗炎症効果があるか否かを評価する、上記のいくつかの重要な生化学指標の他に、RA症状が生じる前後のラットの状態変化をさらに容易に理解するために、本研究は炎症反応におけるサイトカイン分泌の効果もさらに調査するが、TNF−α、IL−6、およびIL−1βなどの炎症性サイトカインは最も重要な指標である。即ち体内のこれらサイトカインの量が炎症反応に密接に関係している。本研究の結果により、CIAラットにPA−Hを与えることで、PECがTNF−αおよびIL−1β(図8に示すように)、ならびにIL−6(図9に示すように)を分泌するのを有意に抑制できることが実証されている。そのうえ、インドメタシンを投与すると、PECが炎症性サイトカインを分泌するのを抑制する効果がなかったので、インドメタシン効果のメカニズムはこれを対象としていなかったと考えられ、したがって、抗腫脹または抗炎症剤の使用におけるPAの適用価値がさらに重視される。
PAの乾燥材料を2kg取り、10倍の高濃度エタノールに24時間浸漬し、ろ過した後、再度10倍の高濃度エタノールに24時間浸漬した。この後、PA抽出液を、回転濃縮機による減圧下、元の容量の2〜3%まで濃縮、乾燥して粉末にし、PA−EtOHと命名する。重量は30g、収率は1.5%であった。
本動物試験において、使用した試験動物および器具は、実施例2で開示したものと同じである。
1.コラーゲンII型(Sigma C−1188):ウシの気管軟骨から得た
2.完全フロイントアジュバント:CFA(BD BBL(登録商標)231131)
3.不完全フロイントアジュバント:IFA(BD BBL(登録商標)263910)
4.インターロイキン6(IL−6)およびインターロイキン1β(IL−1β)(R&D、Duoset)のELISAキット
5.Celebrex(CBX)
6.実施例3のPA抽出物(PA−EtOH、PA−Fl、PA−F、PA−F3、およびPA−F4)を、それぞれ実際の体重に基づき、ラットに直接経口投与した。
1.抗原処方および免疫注射
動物試験計画を図11に示す。ウシコラーゲンII型を、0.1M酢酸溶液に溶解し、完全に溶解するまで攪拌し、濃度1.5および3mg/mlの溶液に処方し、後で使用するために4℃で保存した。一次免疫注射として、CII溶液100μlを等量のCFAで乳化し、乳化が完了した後、ラットの尾根部に皮下注射(200μl/ラット)した。一次免疫化後、ラットの体重を3日毎に記録し、四肢に腫脹が起こるか否かを見つけるためにラットを観察した。約15日後、二次免疫化を行った。CII溶液100μlを等量のIFAで乳化し、乳化が完了した後、ラットの尾根部に皮下注射(200μl/ラット)した。およそ18日目から、関節炎の症状が観察され(CIAラット)、PAおよびCBXを19日目から38日目まで投与した。
I.ラットの体重変化
図12に示すように、各群における正常のラットおよびCIAラットの体重間に、明確な差はなかった。蒸留水を投与した対照群と比較して、PA−EtOH、PA−F2、およびPA−F4を投与したラットの方が、体重が重い。
図13に示すように、コラーゲンにより誘発されたラットの関節炎指数は、およそ31日目でピークに達するが、PA−EtOH、PA−F1、PA−F2、PA−F3、PA−F4、およびCBXを投与したラット群では、関節炎指数を効果的に減少することができた。その中で、PA−F1およびCBXの結果が最も好ましい。
関節炎の症状は、ラットの二次免疫注射後およそ20日目で連続的に生じ、四肢の関節部位をノギスで実際に測定した。関節腫脹率は引き続き増加し、27日目に最高64%に達した。図14に示すように、正常の群と比較して有意な差がある。しかし、PA−EtOH、PA−F1、PA−F2、PA−F3、PA−F4、およびCBXを投与したラットは全て、関節腫脹の抑制効果を示した。その中でPA−F1およびCBXの効果は依然として最も好ましく、PA−F1がCBXと同様の抗炎症効果を有し得ることを示している。
分析結果により、図15に示すように、2回の免疫注射後18日目で、ラットの血清RFの力価は全て、ピークに達することが示されている。しかし、PA−F2およびCBXを投与した群では、PA−F2によりRF値が30日目に約34%、37日目に約44%減少する一方、CBX治療により、RF値が30日目に約52%、37日目に約66%減少し、18日目と比較して、血清RF値はそれぞれ有意に減少した。
本研究結果により、PA−F2、PA−F3、およびPA−F4をCIAラットに与えることで、PECがIL−6を分泌するのを(図16に示すように)有意に抑制し、PA−F1、PA−F2、およびCBXをCIAラットに与えることで、PECがIL−1βを分泌するのを(図17に示すように)有意に抑制することが実証されている。
I.TNF−αおよびIL−1βの濃度決定方法
[目的]
ラットのマクロファージRAW264.7細胞培養におけるTNF−αおよびIL−1βの濃度を測定し、それにより、LPS誘発α合成を抑制できる活性成分を選別した。
1.機器
(1)ELISA読取機
(2)遠心分離機
(1)担体タンパク質非含有のヤギ抗ラットTNF−αまたはIL−1β抗体:リン酸緩衝生理食塩水(PBS)中0.8μg/ml
(2)ビオチン化ヤギ抗ラットTNF−αまたはIL−1β抗体:希釈剤中150ng/ml
(3)希釈剤中の組換ラットTNF−αまたはIL−1β:2000pg/ml
(4)ストレプトアビジンHRP
(1)PBS:塩化ナトリウム137mM、塩化カリウム2.7mM、リン酸水素二ナトリウム(Na2HPO4)8.1mM、リン酸二水素カリウム(KH2PO4)1.5mM、pH7.2〜7.4
(2)洗浄緩衝液:PBS中、0.05%Tween20
(3)ブロッキング緩衝液:PBS中、1%BSA、5%ショ糖、0.05%アジ化ナトリウム(NaN3)
(4)希釈剤:PBS中、1%BSA
(5)基質溶液:1:1の発色試薬Aと発色試薬B(R&D 系統#DY999)との混合物
(6)停止溶液:2N硫酸
(1)グリース試薬:5%リン酸中の1%スルファニルアミドおよび0.1%N−(1−ナフチル)−エチレンジアミン
(2)標準液:亜硝酸ナトリウム
(3)免疫促進剤:リポ多糖類(LPS)
(4)活性調節剤:ニトロ−L−アルギニンメチルエステル(L−NAME)、インドメタシン
(5)培養液:DMEM中10%ウシ胎児血清(FCS)
(6)PBS
(7)トリプシン
5.細胞:RAW264.7
1.細胞培養およびプレーティング:
(1)T−75中の古い培養液を取り出し、PBSで1〜2回洗浄、トリプシン3mlを添加し、37℃で3分間反応させた後、培地7ml(10%FCSを添加したDMEM)を添加してトリプシン作用を中止させた。
(2)1000rpmで遠心分離機を使用し、4℃で10分間遠心分離して、トリプシン含有培地を除去した。培地10mlを添加し、完全に混合して、細胞を数えた。
(3)RAW264.7細胞を、細胞密度5×105細胞/ウェルで、24ウェルプレートに播種し、5%二酸化炭素中、37℃でインキュベートした。
(1)L−NAMEおよびインドメタシン(活性調節剤)、ならびに試料を、LPS1μg/mlを含むフェノールを含有しない培養液に添加した。
(2)古い培養液を取り出し、LPSおよび活性調節剤を含む新鮮培地または試料に変えた。これを3回繰り返した。5%二酸化炭素中、37℃で18〜24時間インキュベートした。
(1)捕獲抗体100λ(PBS中0.8μg/mlまで希釈)を、96ウェルプレートの各ウェルに添加し、室温でシールして、終夜インキュベートした。
(2)遊離している捕獲抗体を除去した後、洗浄緩衝液で3回洗浄した。ブロッキング緩衝液300λを添加、室温で少なくとも1時間インキュベートし、非特異的結合を減少させた。
(3)細胞懸濁液を回収、遠心分離機を使用し、4℃で10分間、10krpmで遠心分離した後、−20℃で保存した。
(1)ブロッキング緩衝液を除去した後、洗浄緩衝液で3回洗浄した。適当に希釈した細胞培養または標準液100λ(最高濃度は2000pg/mlであった)を添加し、室温で2時間インキュベートした。
(2)細胞培養または標準液を除去した後、洗浄緩衝液で3回洗浄した。検出抗体100λ(溶媒に100ng/mlまで希釈)を添加し、室温で2時間インキュベートした。
(3)遊離している検出抗体を除去した後、洗浄緩衝液で3回洗浄した。ストレプトアビジンHRPの希釈作用溶液100λを添加し、室温で20分間、遮光してインキュベートした。
(4)遊離しているストレプトアビジンHRPを除去した後、洗浄緩衝液で3回洗浄した。基質溶液100λを添加し、室温で20分間、遮光してインキュベートした。
(5)停止溶液100λを添加し、穏やかに振盪して完全に混合した。
(6)O.D値を波長450nmで読み取った後、540nmまたは570nmの較正が推奨された、あるいは570nm(または540nm)での読み取り値を、450nmでの読み取り値から直接減じた。
[目的]
ラットのマクロファージRAW264.7細胞培養における亜硝酸(NO)の濃度を測定し、それによりLPS誘発NO合成を抑制することができる活性成分を選別した。
1.機器
(1)ELISA読取機
(2)遠心分離機
2.薬物
(1)グリース試薬:5%リン酸中1%スルファニルアミドおよび0.1%N−(1−ナフチル)−エチレンジアミン
(2)標準液:亜硝酸ナトリウム
(3)免疫促進剤:リポ多糖類(LPS)
(4)活性調節剤:ニトロ−L−アルギニンメチルエステル(L−NAME)、インドメタシン
(5)培養液:DMEM中10%ウシ胎児血清(FCS)
(6)PBS
(7)トリプシン
3.細胞:RAW264.7
1.細胞培養およびプレーティング:
(1)T−75中の古い培養液を取り出し、PBSで1〜2回洗浄、トリプシン3mlを添加し、37℃で3分間反応させた後、培地7ml(10%FCSを添加したDMEM)を添加して、トリプシンの作用を中止させた。
(2)1000rpmで遠心分離機を使用し、4℃で10分間遠心分離して、トリプシン含有培地を除去した。培地10mlを添加し、完全に混合して、細胞を数えた。
(3)RAW264.7細胞を、細胞密度5×105細胞/ウェルで、24ウェルプレートに播種し、5%二酸化炭素中、37℃でインキュベートした。
(1)L−NAMEおよびインドメタシン(活性調節剤)、ならびに試料を、LPS1μg/mlを含むフェノールを含有しない培養液に添加した。
(2)古い培養液を取り出し、LPSおよび活性調節剤を含む新鮮培地または試料に変えた。これを3回繰り返した。5%二酸化炭素中、37℃で18〜24時間インキュベートした。
(3)細胞懸濁液を回収、遠心分離機を使用し、4℃で10分間、10krpmで遠心分離した後、−20℃で保存した。
(1)標準液の処方:亜硝酸ナトリウム100μM/mL(培養液に溶解)を配合し、2倍ずつに希釈して、それぞれ濃度が50、25、12.5、6.25、3.13、および1.56μM/mLの標準液を合計7種得た。
(2)該標準液または細胞培養の上澄みを、グリース試薬と1:1で混合し、室温で15分間、遮光してインキュベートした。
(3)O.D値を波長550nmで読み取った。
RAW264.7細胞を、細胞密度105細胞/ウェルで、24ウェルプレートに播種し、終夜(16〜24時間)インキュベートした。活性調節剤および試験試料は、LPS1μg/mlを含むフェノールを含有しない培養液にそれぞれ添加した。古い培地を除去した後、試験試料およびLPSを含む新鮮培地1mlを添加して、同時インキュベーションした。24時間後、遠心分離機を使用し、1000rpmで10分間それらを遠心分離した。上澄みを吸出し、−20℃で保存するか、または上澄みの中のPGE2含有量を、PGE2Correlate−EIAキット(Amersham RPN222)を使用して直接定量化した。
Claims (11)
- 治療有効量のプレクトランサスアンボイニクス(Lour.)Sprengの粗抽出物または抽出物と、薬学上許容可能な担体とを含む、関節リウマチの治療用薬剤組成物。
- カプセル、錠剤、散剤、軟膏、水薬、またはスプレーの形態を有する、請求項1に記載の薬剤組成物。
- 前記プレクトランサスアンボイニクス(Lour.)Spreng粗抽出物が、プレクトランサスアンボイニクス(Lour.)Sprengを直接搾汁することにより得られる粗抽出物である、請求項1に記載の薬剤組成物。
- 前記プレクトランサスアンボイニクス(Lour.)Spreng抽出物が、プレクトランサスアンボイニクス(Lour.)Sprengを極性溶媒に浸漬し、濃縮した後、カラム分離により得られる抽出物である、請求項1に記載の薬剤組成物。
- 前記抽出物が、
高極性溶媒で洗浄し、溶出緩衝液を回収することと、
乾燥材料容量の約5〜10倍の容量の準高極性溶媒で洗浄し、溶出緩衝液を回収することと、
乾燥材料容量の約5〜10倍の容量の中極性溶媒で洗浄し、溶出緩衝液を回収するステップことと、
乾燥材料容量の約5〜10倍の容量の低極性溶媒で洗浄し、溶出緩衝液を回収すること
によってカラム分離を受ける、請求項4に記載の薬剤組成物。 - 関節リウマチ治療用薬物の製造における、プレクトランサスアンボイニクス(Lour.)Sprengの粗抽出物または抽出物の使用。
- 前記薬物が、カプセル、錠剤、散剤、軟膏、水薬、またはスプレーの形態を有する、請求項8に記載の使用。
- 前記プレクトランサスアンボイニクス(Lour.)Spreng粗抽出物が、プレクトランサスアンボイニクス(Lour.)Sprengを直接搾汁することにより得られる粗抽出物である、請求項8に記載の使用。
- 前記プレクトランサスアンボイニクス(Lour.)Spreng抽出物が、プレクトランサスアンボイニクス(Lour.)Sprengを極性溶媒に浸漬し、濃縮した後、カラム分離により得られる抽出物である、請求項8に記載の使用。
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